Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Paraffine-ingebedde specimens formaline-vaste vormen een waardevolle bron van moleculaire biomarkers voor ziekten bij de mens. Hier presenteren we een laboratorium gebaseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol, in eerste instantie ontworpen met vers bevroren RNA, en geoptimaliseerd voor de analyse van gearchiveerde microRNAs uit weefsels tot 35 jaar opgeslagen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

– Gearchiveerd, klinisch ingedeeld formaline-vaste kunnen paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels voorzien nucleïnezuren retrospectieve moleculaire studies van de ontwikkeling van kanker. Met behulp van niet-invasieve of vooraf kwaadaardige laesies van patiënten die later het ontwikkelen van invasieve ziekte, kunnen gen expressie analyses helpen identificeren van vroege moleculaire veranderingen die naar cancer risk predisponeren. Het is goed beschreven dat nucleïnezuren verhaald FFPE weefsels ernstige fysieke schade en chemische wijzigingen, die bemoeilijken hun analyse en in het algemeen vereist aangepast tests hebben ondergaan. MicroRNAs (miRNAs), maar die een kleine klasse vertegenwoordigen van RNA-moleculen die slechts tot ~ 18-24 nucleotiden, is aangetoond dat langdurige opslag weerstaan en hebben met succes is geanalyseerd in FFPE monsters. Hier presenteren we een 3' barcoded complementaire DNA (cDNA) bibliotheek voorbereiding protocol specifiek geoptimaliseerd voor de analyse van kleine RNAs geëxtraheerd uit gearchiveerde weefsels, die onlangs werd aangetoond als robuust en zeer reproduceerbaar, wanneer met behulp van gearchiveerd klinische monsters opgeslagen tot 35 jaar. De voorbereiding van deze bibliotheek is goed aangepast aan de multiplex analyse van gevaar/gedegradeerd materiaal waar RNA samples (maximaal 18) zijn afgebonden met individuele 3' barcoded adapters en vervolgens samen gebundeld voor verdere enzymatische en biochemische preparaten vóór de analyse. Alle purifications worden uitgevoerd door polyacrylamide gelelektroforese (pagina), waarmee de grootte-specifieke selecties en verrijking van barcoded kleine RNA soorten. Dit cDNA Bibliotheek voorbereiding is goed aangepast aan minuut RNA ingangen, als een pilot polymerase-kettingreactie (PCR) vaststelling van een specifieke versterking cyclus toelaat te produceren optimale hoeveelheden materiaal voor het rangschikken van de volgende generatie (NGS). Deze aanpak is geoptimaliseerd voor het gebruik van aangetaste FFPE RNA uit monsters van maximaal 35 jaar gearchiveerd en biedt zeer reproduceerbaar NGS-gegevens.

Introduction

miRNAs zijn opmerkelijk goed bewaard in formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) exemplaren1,2,3. Vorige werk heeft aangetoond dat de uitdrukking van deze korte regelgevende niet-coderende één gestrande molecules van RNA met succes kan worden geëvalueerd met behulp van totaal RNA van FFPE monsters en relevante gen expressie gegevens in vergelijking met de originele fresh weefsels4,5,6,7,8. In vergelijking met grote messenger RNAs, die hebben aangetoond dat kritisch worden beïnvloed door FFPE weefsel verwerking (formaldehyde, hitte, uitdroging, enz.), endogene RNases, en de leeftijd van de specimens, de geringe omvang van miRNAs (~ 18-24 nucleotiden) verschijnt ze resistent tegen afbraak en veerkrachtig voor langere termijn opgeslagen, ook aangetoond door miRNA expressie studies die beter te presteren dan high-throughput mRNA studies in gearchiveerde exemplaren9te maken. miRNA expressie studies met behulp van gearchiveerde klinische monsters, die meestal in kleinschalige analyses zijn uitgevoerd, hebben aangetoond dat één of multiplexed kwantitatieve PCR-testen, verschillende soorten technologieën van microarray, en meest recent NGS kan worden gebruikt ter beoordeling van de expressie van bewaarde miRNAs na optimalisering van deze testen10,11,12,13,14.

Gezien het feit dat disregulatie van miRNA expressie geassocieerd met de ontwikkeling van een verscheidenheid van menselijke maligniteiten is geweest en dat er potentieel een enorm aanbod van klinisch is geannoteerde gearchiveerde exemplaren, is duidelijk geworden dat deze kleine RNA moleculen vormen een veelbelovende bron van potentiële kanker biomarkers15,16,17,18. Het gebruik van een high-throughput gen expressie technologie zoals NGS heeft het voordeel van een globale beoordeling van alle miRNA afschriften in vergelijking met gerichte technologieën zoals PCR en/of microarrays19. Om deze reden is een geoptimaliseerde, betaalbare en gemakkelijk toepasbare protocol voorbereiding cDNA Bibliotheek van kleine RNAs van oudere gearchiveerde exemplaren voor NGS geoptimaliseerd zodat grootschalige retrospectieve studies20.

Wij eerder vastgestelde een gelijktijdige RNA/DNA-extractie-protocol voor afzonderlijke terugwinning van RNA en DNA uit oudere gearchiveerde exemplaren, die wij beter te presteren dan hedendaagse commerciële kits21gevonden. Met behulp van dit protocol extractie te verkrijgen van totaal RNA van FFPE weefsels gearchiveerd voor langere periode van tijd, wij de voorbereiding van cDNA bibliotheken voor NGS van miRNAs in klinische monsters bewaard tot 35 jaar geoptimaliseerd. Bovendien, in een onlangs gepubliceerde studie waar we bereid cDNA bibliotheken van klinisch geclassificeerde ductaal carcinoma in situ (DCIS) exemplaren, we geïdentificeerd differentially uitgedrukte miRNAs die werden gevalideerd door kwantitatieve PCR, die aangegeven dat specifieke miRNA expressie verandert kan in DCIS laesies van patiënten die de ontwikkeling van kanker van de borst in vergelijking met DCIS laesies van patiënten die geen borstkanker ontwikkelen opgespoord worden.

Gelet op de kosten van commerciële kits voor voorbereiding van kleine RNA-cDNA bibliotheken, het potentieel voor hun stopzetting, evenals het gebruik van/octrooi beschermd reagentia die niet kan worden geoptimaliseerd, we besloten aan te passen een eerder gepubliceerde laboratorium gebaseerde en kit-gratis 3' barcoded cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE exemplaren, waardoor gelijktijdige analyse van 1822monsters. Dit protocol biedt een ideale en robuuste stapsgewijze procedure met visuele en technische evaluatie controleposten, die kritisch zijn voor de aanpassing aan FFPE RNA exemplaren waren, en heeft een sterk potentieel voor toepassing naar andere bronnen van gecompromitteerde of moeilijk RNA om materiaal te gebruiken. Van het protocol van het oorspronkelijke toepasbaarheid werd verbeterd door vervanging van radioactief gelabelde grootte markeringen met TL (bvSYBR Gold) aantoonbaar RNA grootte markeringen gebruikt tijdens de selectie van ligaturen bibliotheken op grote polyacrylamide gels. Dit geoptimaliseerd protocol is afhankelijk van de afbinding van 3' barcoded adapters met 18 afzonderlijke FFPE RNA-modellen, die dan samengevoegd samen te ondergaan adapter afbinding 5', omgekeerde-transcriptie en een pilot PCR-analyse voor op maat van versterking van de definitieve cDNA bibliotheek voorafgaand aan grootschalige PCR versterking, reiniging, en NGS op een hoge doorvoersnelheid sequencer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van alle reagentia en Primers

  1. Bestel alle inleidingen en adapters, zoals beschreven in Figuur 1.
  2. Bereiden de kalibrator cocktail voorraad, die in elke afzonderlijke afbinding zal worden verrijkt.
    1. Resuspendeer de vervoerder oligonucleotide (Figuur 1) naar 0,5 µM met RNase-gratis water. Resuspendeer de 10 kalibrator oligonucleotides (Figuur 1) naar 100 µM met 0,5 µM vervoerder oligonucleotide oplossing.
    2. Combineer 10 µL van elk van de 10 kalibratoren in een gesiliconiseerd microcentrifuge te verkrijgen van een 100 µM cocktail kalibrator voorraad, en bereid een 0.026 nM-oplossing om op te slaan bij-20 ° C.
  3. Verdun de 20 unieke, gelyofiliseerd, adenylated 3' adapters met RNase-gratis water met een eindconcentratie van 50 µM (Figuur 1).
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om te bereiden 2.5 µL aliquots van elke adapter in individuele gesiliconiseerd buizen en bewaar ze bij-80 ° C voor maximaal 2 jaar.
  4. Resuspendeer de desalted 19 nt-3' adapter en 24 nt-3' adapter grootte markering oligonucleotides tot 250 ng/mL (Figuur 1).
  5. Resuspendeer de HPLC gezuiverde 5' adapter aan 100 µM met RNAse-gratis water. Resuspendeer de 5' en 3' PCR inleidingen tot 100 µM met behulp van RNase-gratis water (Figuur 1).
    Opmerking: Aliquot alle oligonucleotides in hoeveelheden die nodig zijn voor 1-2 experimenten en winkel bij-80 ° C.
  6. Bereiden de polyacrylamide denaturering (PAA) gel laden kleurstof door het combineren van 98,8% formamide, 1% (v/v) 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 en 0,2% bromophenol blauw, en 1 mL aliquots vastgesteldop-80 ° C.
    1. Bereid de 0.5 M nb-2H2 EDTA-oplossing door het 18,6 g nb2H2 EDTA poeder toevoegen aan 50 mL water nuclease-vrij. NaOH pellets te bereiken pH 8,0 toevoegen. Stel het volume tot 100 mL te verkrijgen van een 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 stamoplossing.
    2. Weeg 15 mg bromophenol blauw in een aparte 15 mL-buis. Voeg 600 µL nuclease-gratis water. Voeg 14.25 mL-geïoniseerde formamide. Voeg 150 µL van de 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 oplossing.
    3. Aliquot de PAA eindoplossing 15 ml in 1 mL aliquots bij-80 ° C.
  7. Voorbereiden van de 5 x agarose gel laden kleurstof door het combineren van 0,2% bromophenol blauw, 0,2% xyleen cyanol FF 50 mM nb2H2 EDTA, pH 8,0 en 20% densiteitgradiënt Type-400.
    1. Resuspendeer 1,86 g nb2H2-EDTA in 50 mL nuclease-gratis water in een bekerglas van 400 mL op een magneetroerder bij kamertemperatuur (RT). NaOH pellets te bereiken een pH 8,0 toevoegen. Voeg nuclease-gratis water tot 100 mL om te verkrijgen van een 50 mM nb2H2 EDTA-oplossing.
    2. Weeg bromophenol blauw poeder 20 mg, 20 mg xyleen cyanol FF poeder en 2 g densiteitgradiënt Type-400 poeder, en resuspendeer in 5 mL 50 mM nb2H2 EDTA.
    3. Vortex de buis met de drie kleurstoffen en voeg 5 mL 50 mM nb2H2 EDTA. Meng de 5 x agarose gel laden kleurstof, bereiden 1 mL aliquots en opslaan bij-80 ° C.

2. instellen van de 3' Barcoded Adapter Ligations met 18 afzonderlijke RNA Samples

  1. Identificeren van 18 afzonderlijke exemplaren van het RNA (pre-aliquoted op 100 ng in 9,5 µL van nuclease-gratis water in 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buizen), en zet de buizen op ijs te ontdooien gedurende 10 minuten.
  2. De 10 x RNA Ligase Buffer (zonder ATP) vers bereiden.
    1. Combineren in een 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis, 343 µL van RNase-gratis water, 500 µL van Tris 1 M pH 7.5, 100 µL van 1 M MgCl2, 50 µL van 20 mg/mL bovien serumalbumine en 7 µL van 14 M 2-mercaptoethanol. Meng door flicking de buis, centrifuge voor 2 s op 2.000 x g en RT en instellen op ijs.
      Opmerking: Alle stappen in dit protocol die aangeven "centrifuge voor 2 s" worden uitgevoerd in de microcentrifuge van een benchtop op RT en een topsnelheid van 2.000 x g oplossingen op de bodem van de buizen.
  3. Bereiden van 50% waterige DMSO voorraad door toevoeging van 1 mL van RNase-vrij water tot 1 mL van DMSO in een 2 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis, de buis wikkel in aluminiumfolie en opslaan op RT.
  4. Ontdooi de 0.026 nM kalibrator cocktail op het ijs voor 10 min. de afbinding Master Mix voorbereiden door te combineren in de volgende volgorde in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL gesiliconiseerd: 40 µL van 10 x RNA Ligase Buffer en 120 µL van 50% waterige DMSO met behulp van een precisiepipet 200 mL , en voeg 10 µL van 0.026 nM kalibrator cocktail met behulp van een precisiepipet 10 µL. Flick de 1,5 mL-buis te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s, en stel het op ijs.
  5. 8,5 µL van afbinding Master Mix toevoegen aan elk van de 18 individueel aliquoted FFPE RNA monsters, zachtjes flick de buizen, centrifuge voor 2 s, en winkel op ijs.
  6. Ontdooi 2.5 µL aliquots van elk van de 18, 3' barcoded adapters en leg ze op het ijs te ontdooien voor 20 min.
    1. Gebruik een pipet 3-µL 1 µL van elke adapter overbrengen naar de overeenkomstige FFPE RNA monsters met RNA en Afbinding Master Mix (d.w.z., 9,5 µL + 8,5 µL).
    2. Niet op en neer Pipetteer, gewoon afzien in de vloeistof en het puntje uitlichten. Zorg ervoor dat tips tussen FFPE RNA monsters wijzigen. Sluit elke buis, flick om te mengen, centrifuge voor 2 s, en instellen op ijs.
  7. Het denatureren van de reacties door het plaatsen van de 18 buizen op een warmte blok bij 90 ° C gedurende 1 min en vervolgens onmiddellijk plaats op ijs.
  8. Bereid de afbinding enzym oplossing door verdunning 10 µL van afgeknotte K227Q T4 RNA Ligase 2 met 10 µL van RNase-vrij water in een verse 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis.
  9. Gebruik een pipet 3 µL 1 µL van het enzym verdunde afbinding overbrengen naar elk van de 18 RNA monsters (niet Pipetteer op en neer, en wijzigen van tips tussen elke buis). Stand van de 18 ligations op ijs en plaatsen in een koude kamer van 4 ° C voor een overnachting incubatie van 18u.

3. de zuivering van de ligaturen kleine RNAs

  1. Deactiveren van de afbinding reacties door de 18 buizen voor 1 min op een warmte blok bij 90 ° C te plaatsen en ga vervolgens terug om ijs gedurende ten minste 2 minuten om af te koelen.
  2. Bereiden de neerslag Master Mix door toevoeging van 1 µL van blauwe kleurstof covalent gekoppeld aan glycogeen om 26 µL van 5 M RNase-gratis NaCl in een verse gesiliconiseerd microcentrifuge buis.
    1. Pipetteer 1.2 µL van de neerslag Master Mix in elk van de 18 buizen. 63 µL van 100% ethanol toevoegen aan elk van de 18 buizen. Sluit elke buis, flick te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s, en plaats de buizen op ijs. De inhoud van alle 18 buizen combineren in een enkele 1,5 mL gesiliconiseerd buis.
    2. Sluit de buis, driemaal aan mix, centrifuge voor 2 s en op ijs voor 60 min te precipiteren omkeren.
  3. Een groot (16 x 20 cm2) 15% polyacrylamidegel voorbereiden door pagina.
    1. Gegoten twee gesiliconiseerd glasplaten (behandeld met een veilig alternatief voor silane coatings) 0,1 cm spacers.
    2. Combineer 9 mL systeem verdunningsmiddel, 18 mL systeem concentraat, 3 mL buffer systeem, 240 µL van APS (9%) en 12 µL van TEMED in een tube van 50 mL.
    3. Breng de pagina gel oplossing tussen de glasplaten met behulp van een precisiepipet 30 mL, invoegen van een 14-well kam (0,1 cm dik) en laat de gel gedurende 30 minuten op RT stollen.
  4. Centrifugeer de 1.5-mL-buis met de gebundelde ligations bij 16.000 x g- en 4 ° C gedurende 60 minuten.
  5. Verwijder de kam. Reinig de putten rijkelijk met RNase-gratis water met behulp van een spuit fles met een 200 µL tip op het einde te bereiken binnen de putten en un-gepolymeriseerde acrylamide (één goed tegelijk) boven een gootsteen te dwingen. Instellen van de 15% pagina op een gel-apparaat, de reservoirs Vul met 0,5 x Tris-boraat EDTA (FSME) oplossing, en vooraf de gel gedurende 30 minuten op 450 V worden uitgevoerd.
  6. Herstellen van de buis met gebundelde ligations van de centrifuge en zorgvuldig drogen de RNA-pellet.
    1. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een 1 mL pipet tip maar wat vloeistof op de bodem verlaten. Kantelen van de buis en gebruik een 20 mL pipet te verwijderen van de resterende bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de pellet. Vacuüm zuignap de buis met behulp van een pipet van Pasteur met een 10-µL tip op het einde, zonder te raken de pellet.
    2. Resuspendeer de pellet RNA in 20 µL van RNase-gratis water door de buis flicking. Voeg 20 µL van PAA gel laden oplossing resuspendeer de RNA, flick om te mengen, centrifuge voor 2 zat RT, en de buis vastgesteldop 90 ºC voor 1 min en vervolgens onmiddellijk op ijs.
  7. Vervang de 0.5 x TBE van het apparaat van de gel met vers 0.5 markeringen voor x TBE en laden de ladder, grootte, en ligaturen miRNAs in het midden van de gel, 2-lege wells verlaten aan beide zijden (Figuur 2).
  8. Stel de gel bij 450 V (35 mA) voor 60 min, onderbreken de termijn gedurende 10 minuten te koelen, en opnieuw uit te voeren op 520 V (25 mA) voor een andere 60 min. de 15 uncast % pagina door het verwijderen van een van de glazen platen.
  9. Licht spuiten de gel zittend op de glasplaat met fluorescente kleurstof oplossing (10 µL) in 25 mL 0,5 x TBE, en laat het zitten voor 5 min in het donker.
  10. Leg het glas met de gel op een blauwe licht transilluminator, en uitlijnen van zowel 19 nt en 24 nt grootte markeringen met een liniaal om de besnijdenis van de ligaturen kleine RNAs (Figuur 2). Accijnzen van de gel.
  11. Plaats de verwijderde gel in een 0,5 mL-buis, ontworpen om het fragment gel segmenten, veilig gepositioneerd in een 1.5-mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 3 minuten op RT. resuspendeer de gefragmenteerde gel met 300 µL van 400 mM NaCl-oplossing, sluit u de buis en zegel met de paraffine-film.
  12. De buis aangezet door agitatie op een thermomixer op 1100 rpm in een koude kamer van 4 ° C voor een overnachting incubatie (16-17 h).

4. Afbinding van de 5'-Adapter

  1. Breng de oplossing kwantitatief en gefragmenteerde gel met een 5 µm filter tube zit in een tube van 1,5 mL gesiliconiseerd zegel met paraffine film en Centrifugeer gedurende 5 min op 2300 x g en RT.
  2. 950 µL van 100% ethanol toevoegen aan de gefilterde oplossing, sluit u de buis, omdraaien om te mixen, Centrifugeer gedurende 2 s, verzegelen van de buis met paraffine film en ingesteld op het ijs gedurende 1 uur.
  3. Voorbereiden van een 12%-pagina gel zoals beschreven in stap 3.3, maar combineren 12.6 mL verdunningsmiddel, 14,4 mL concentraat, 3 mL buffer, 240 µL APS en 12 µL van TEMED in een tube van 50 mL. Pre draaien de 12% pagina gel gedurende 30 minuten op 450 V (~ 35 mA) in 0,5 x TBE.
  4. Centrifugeer de gezuiverde oplossing voor kleine RNA bij 16.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C.
  5. Pipetteer zorgvuldig uit de bovendrijvende vloeistof met behulp van een pipet 1 mL te verwijderen van het grootste deel van de oplossing en een 200 mL-pipet te verwijderen van de resterende oplossing, zonder te raken de pellet te gebruiken.
  6. Met behulp van een pipet van Pasteur met een tip 10 mL aan haar einde verbonden met de kolf van een vacuüm, zorgvuldig drogen van de pellet zonder aan te raken.
  7. Resuspendeer de pellet in 9 µL van RNase-gratis water zonder pipetteren op en neer, maar door het licht flicking de buis, Centrifugeer gedurende 2 s, en stel de buis op ijs.
  8. Voorbereiden van de 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP) vers door het combineren van 500 µL van 1 M Tris pH 7.5, 1 M MgCl2, 50 µL van 20 mg/mL 100 µL geacetyleerd BSA, 200 µL van 10 mM ATP, 7 µL van 2-mercaptoethanol 14 M , en 143 µL van RNase-gratis water.
  9. Mix van de 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP) door flicking de buis en Centrifugeer gedurende 2 s tot het verzamelen van de oplossing aan de onderkant van de buis.
  10. De 5' adapter afbinding instellen door toe te voegen 2 µL van 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP), 1 µL van 100 µM 5' adapter, en 6 µL 50% waterige DMSO aan de 9 µL, 3' barcoded kleine RNA oplossing.
  11. Flick de buis licht te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s tot het verzamelen van de oplossing plaats de buis op een warmte blok bij 90 ° C gedurende 1 minuut en terug op het ijs gedurende ten minste 2 minuten.
  12. Voeg 2 µL van T4 RNA Ligase 1 in de oplossing (niet Pipetteer omhoog en omlaag), flick van de buis, centrifuge voor 2 s, en zitten de buis in drijvende rack in een waterbad 37 ° C gedurende 60 minuten.
  13. Gelijktijdig, ingesteld op twee ligations tussen de 19 nt-3' adapter en de 5'-adapter, en twee ligations tussen de 24 nt-3'-adapter en de 5'-adapter.
    1. Combineer 2 µL van de 19nt-3' adapter (250 ng/µL) of 24 nt-3' adapter (250 ng/µL) met: 2 µL van de 5' adapter (100 µM), 2 µL van 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP), 6 µL van 50% waterige DMSO, 6 µL van RNase-gratis water , en 2 µL van T4 RNA Ligase 1 in een 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis.
    2. Flick de buizen te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s, en stel de buizen bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
  14. 20 µL van PAA denaturering Buffer toevoegen aan alle ligations (gezuiverd van kleine RNAs, 2 ligations met 19nt-3' adapter en 2 ligations met 24nt-3' adapter).
    1. Meng door flicking de buizen, centrifuge voor 2 s, en Incubeer de buizen op een warmte blok bij 90 ° C gedurende 1 min. overdracht alle buizen aan ijs, en bereiden een ladder (3 mL ladder met 20 µL van PAA).
  15. Leegmaken van het bovenste reservoir van het gel-apparaat met de pre run 12% gel pagina en voeg verse 0.5 x TBE oplossing onder het niveau van de putten (putten worden geleegd met een lange, dunne uiteinde pipet).
    1. Geladen de monsters met een dunne Pipetteer tip, zoals beschreven in Figuur 3.
    2. Gebruik verse 0,5 x TBE te vullen individuele putten naar de top van de gel.
    3. Toevoegen van verse 0,5 x TBE naar het reservoir boven de putten en start de Elektroforese van de 12% pagina gedurende 60 minuten op 450 V (~ 35 mA).
    4. Het onderbreken van de run door het uitschakelen van de generator voor 10 min de gel om af te koelen. Opnieuw starten van de generator en uitvoeren van de gel gedurende 60 minuten op 520 V (~ 25 mA).
  16. Stoppen met de generator, leegmaken van de reservoirs door het omkeren van het apparaat boven een gootsteen en uncast 12% pagina door het verwijderen van een van de glazen platen.
  17. Zitten van het glas met de platte gel, spray de gel met 10 µL van de fluorescente kleurstof in 25 mL 0,5 x TBE, incubeer in het donker voor 5 min. lag het glas met de gel op een blauwe lichte transilluminator en uitlijnen van zowel de 19 nt en beide de 24 nt grootte markeerders met een liniaal om de besnijdenis van de ligaturen kleine RNAs (Figuur 3).
    1. De gel accijnzen en breng het verwijderde gel stuk in een tube van 0,5 mL gel breaker. Sluit de dop van de tube gel breker, set in een 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis, en veilig met paraffine film. Verwijderen van de gel breaker buis, 300 µL van 300 mM NaCl en 1 µL van 100 µM 3' PCR Inleiding aan de geplette gel stukken in een tube van 1,5 mL toevoegen.
    2. Het zegel van de buis met paraffine film op agitatie op een thermomixer bij 1100 tpm bij 4 ° C en 's nachts (17-18 h) in een koude kamer.

5. omgekeerde transcriptie van de 5' afgebonden en 3' Barcoded gezuiverd kleine RNAs

  1. De buis van de thermomixer en het filter ophalen zuiveren de oplossing met een buis 5 µM filter.
    1. Gebruik een pipet 1 mL overbrengen van de oplossing op een 5 µM filter buis ingevoegd in een 1,5 mL gesiliconiseerd RNase-gratis collectie buis. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten op 2300 x g en RT.
    2. Negeren van de filter-buis en 950 µL van 100% ethanol toevoegen aan de collectie tube van de 1,5 mL microcentrifuge met de gefilterde oplossing. Omkeren van de buis aan de mix, centrifuge voor 2 s en op ijs voor 60 min. neerslag het RNA pellet door centrifugeren van de buis op 16.000 x g- en 4 ° C gedurende 1 uur.
  2. Droog de RNA-pellet.
    1. Open het GLB en verwijder voorzichtig het supernatant met een 1 mL Pipet, wat vloeistof op de bodem verlaten.
    2. Gebruik een pipet 20 µL te verwijderen van alle resterende bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de pellet. Kantel de buis zodat elke oplossing om te zitten aan de andere kant van de pellet.
    3. Gebruik een pipet van Pasteur met een tip van de ongefilterde Pipetteer 10 mL gecombineerd het supernatant en drogen van de pellet met behulp van een vacuüm.
  3. Resuspendeer de pellet RNA in 5.6 µL van RNase-gratis water.
    1. Ontdooiing van de omgekeerde transcriptie reagentia op het ijs voor 15 min. Set up een omgekeerde transcriptie reactie door 3 µL van 5 x Buffer, 4.2 µL van 10 x deoxynucleotide trifosfaat (dNTPs) (elk 2 mM) en 1,5 µL van dithiothreitol (DTT) toe te voegen aan de 5.6 µL van RNase-vrij geresuspendeerde pellet.
    2. Zachtjes flick de buis om te mengen van de reactie en Centrifugeer gedurende 2 s tot het verzamelen van de oplossing. Instellen van de reactie op een warmte blok bij 90 ° C gedurende precies 30 s en vervolgens overdracht direct op een thermomixer bij 50 ° C.
    3. Laat de buis op de thermomixer gedurende 2 minuten, zodat de temperatuur gelijk. Voeg 0,75 µL van het enzym reverse transcriptie direct in de oplossing, flick voorzichtig te mengen en reeks de buis onmiddellijk terug op de thermomixer bij 50 ° C gedurende 30 minuten.
  4. Na 30 min, door de buis te overbrengen in een blok van warmte bij 95 ° C gedurende 1 min om te stoppen met omgekeerde transcriptie. 95 µL van RNase-gratis water rechtstreeks toevoegen aan de omgekeerde transcriptie, flick van de buis te mengen en zet deze dan direct op ijs gedurende 2 minuten.
  5. Label van de buis met de cDNA voorraad bibliotheek en bibliotheek-ID.

6. proefprojecten PCR en grootschalige PCR versterking

  1. Bereiden van vers 10 x PCR buffer door toe te voegen 304 µL van RNase-gratis water, 125 µL van 2 M KCl, 50 µL van 1 M Tris pH 8.0, 10 µL van MgCl, 1 M2, 5 µL van 1% Triton X-100 en 6 µL van 1 M 2-mercaptoethanol in een buis gesiliconiseerd microcentrifuge , en houden op RT.
  2. Monteren van de Pilot PCR reactie door het combineren van 67 µL van RNase-gratis water, 10 µL van 10 x PCR Buffer, 10 µL van 10 x dNTPs, 0,5 µL van 100 µM 5' PCR primer, 0,5 µL van 100 µM 3' PCR Inleiding, 10 µL van cDNA voorraad bibliotheek en 2 µL van 50 x Taq Polymerase.
    1. Opzetten van twee PCR cycli op een thermocycler als volgt: bestand 1: 94 ° C gedurende 45 s, 50 ° C voor 85 s, en 72 ° C gedurende 60 s voor 10 cycli, houden bij 4 ° C; Bestand 2: 94 ° C gedurende 45 s, 50 ° C voor 85 s, en 72 ° C gedurende 60 s voor 2 cycli, houden bij 4 ° C. Instellen van de Pilot PCR-reactie in de thermocycler en bestand 1 beginnen.
    2. Op het einde van het bestand 1, open de PCR-buis en met behulp van een pipet 20 µL, 12 µL van de overdracht van de Pilot PCR-reactie in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 3 µL van 5 x gel laden kleurstof, Meng door omhoog en omlaag pipetteren, sluit de buis , en geef deze het label "10 cycli".
    3. Sluit de Pilot PCR buis en File 2 start op een thermocycler. Op het einde van het bestand 2, open PCR buis gebruiken een 20 mL pipet voor het overbrengen van 12 µL van oplossing in 1.5-mL microcentrifuge buis met 3 µL van 5 x gel laden kleurstof en geef deze het label "12 cycli".
    4. Herhaal de stappen die zijn beschreven in stap 6.2.2 en 6.2.3 12 µL PCR producten om van te verzamelen de Pilot PCR reactie op PCR cycles 14, 16, 18 en 20. 3 µL van 5 x gel laden kleurstof toevoegen aan elk van de 12 µL PCR aliquots, en naar de 20 nt ladder met 3 µL van ladder en 9 µL van RNase-gratis water.
  3. Bereiden van een 2,5% agarose gel met 0,5 x TBE.
    1. Weeg 2,5 g van agarose in een bekerglas van schoon en voeg 100 mL 0,5 x TBE. Verwarm de oplossing in een magnetron tot het kookt. Verwijder de oplossing uit de magnetron, swirl van de fles om te mengen de agarose toevoegen 4 μL van ethidiumbromide (10 mg/mL) en breng de oplossing over in een 7 x 10 cm2 elektroforese lade, gesloten aan beide uiteinden met tape.
    2. Instellen van een 8-well kam en laat de agarose gel stollen op RT. Transfer de gestolde agarose gel op een apparaat van de elektroforese gevuld met 0,5 x TBE.
  4. Laden van de ladder en PCR monsters op de agarose gel, en voer het gedurende 30 minuten op 120 V.
  5. Evalueren van de gel op een UV-doos identificeren van de optimale PCR cyclus (figuur 4A).
    Opmerking: De grootte van de verwachte PCR-bands wordt weergegeven in figuur 4B.
    1. Observeren van de twee bands van PCR in elk van de verschillende putten (bovenste band: DNA library, lagere band: inleidingsdimeer).
    2. Identificeren van de voldoende cyclus van PCR voor de versterking van cDNA door het selecteren van de cyclus waar de cDNA bibliotheek zichtbaar is, maar de inleidingsdimeer zijn nauwelijks waarneembaar.
      Opmerking: In het algemeen de passende PCR cyclus is ingeschakeld tussen de 12 – 16 cycli. Op figuur 4Ais het voldoende PCR cyclus voor deze bibliotheek 14.
  6. De grootschalige PCR reacties (6 x 100 µL) instellen voor agarose gel bibliotheek zuivering.
    1. Voorbereiding van een verse buis 10 x PCR Buffer volgende stap 6.1.
    2. Bereiden de grootschalige PCR Master Mix in een 1,5 mL-buis door het combineren van 435.5 µL van RNase-gratis water, 65 µL van 10 x PCR buffer, 65 µL van 10 x dNTPs, 3.25 µL van 5' PCR Inleiding, 3.25 µL van het PCR primers 3', en pipetteren omhoog en omlaag als u wilt mengen.
    3. Pipetteer 88 µL van het PCR Master Mix in zes 0,5 mL PCR buizen. Breng 10 µL van cDNA voorraad bibliotheek (opgeslagen op ijs), voeg 2 µL van 50 x Taq polymerase in elk van de 6 PCR buizen en Pipetteer te mengen.
    4. Een negatieve PCR reactiebuis voor te bereiden door het combineren van 77 µL van RNase-gratis water, 10 µL van 10 x PCR buffer 10 µL van 10 x dNTPs, 0,5 µL van het PCR Inleiding 5', 0,5 µL van het PCR Inleiding 3' en 2 µL van 50 x Taq polymerase en Pipetteer te mengen.
    5. Plaats de PCR-buizen in de thermocycler met behulp van de PCR cyclus beschreven in stap 6.2.1 en stel het optimale aantal amplificatie cycli. Bereiden van een 2,5% agarose gel met behulp van 0,5 x TBE, zoals beschreven in stap 6.3.
  7. Na PCR versterking, Pipetteer 9 µL van elke buis PCR in zes 1,5 mL microcentrifuge buizen met 3 µL van 5 x gel laden kleurstof.
    1. Bereid 20 nt ladder door 3 mL ladder samenvoegen 9 µL van RNase-gratis water en toevoegen 3 µL gel laden kleurstof in een 1,5 mL-buis.
    2. Laden van de ladder, negatieve PCR controle en 6 PCR producten op de agarose gel, en draaien van de gel gedurende 30 minuten op 120 V.
    3. Controleer of de uniformiteit van de PCR-amplifications tussen de rijstroken op een UV-doos (neem een afbeelding).
    4. Combineer 3 PCR reacties in twee 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis (3 x 91 µL), 27 µL van 5 M NaCl en 950 µL van 100% ethanol toevoegen. Omkeren van de buizen te mengen en hen bij-20 ° C's nachts te precipiteren van de PCR producten te stellen.

7. cDNA Bibliotheek zuivering en evaluatie

  1. Centrifugeer beide buisjes met de PCR reacties bij 16.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C.
  2. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet 1 mL, dan kantelen van de buis met de pellet op de bovenzijde en vloeistof aan de lagere kant en gebruik van een pipet van Pasteur verbonden met de kolf van een vacuüm met een badkuip en vloeistof met een 10 mL tip aan het einde van de Pipet van Pasteur gecombineerd.
  3. Instellen van de PmeI digest.
    1. Resuspendeer één van de PCR-pellets met 17,5 µL nuclease-gratis water, en overdracht van de geresuspendeerde pellet aan de tweede PCR-pellet. 2 µL van 10 x Buffer en 0,5 µL van PmeI enzym toevoegen en instellen van de Digesten in een waterbad gedurende 2 uur bij 37 ° C.
    2. Bereiden van een 2,5% agarose gel met behulp van 0,5 x TBE (stap 6.3). Voeg 6 µL van 5 x gel laden kleurstof de verteerbaar. Pipetteer 13 µL van elke digest in twee aangrenzende putten van het agarose gel, de 20 nt grootte ladder op de einde-putten te laden en uitvoeren van de gel voor 90 min op 150 V (Figuur 4 d).
    3. De bovenste PCR bands uit de gel op de UV-doos accijnzen, breng de gel stukken in een tube van vers woog 1,5 mL microcentrifuge en wegen van de gel stukken op een schaal.
  4. Zuiveren van de verwijderde PCR versterkte cDNA bibliotheek met behulp van een gel extractie kit na instructies van de fabrikant. Kwantificeren van de cDNA bibliotheek met behulp van een instrument, na instructies van de fabrikant en DNA kwantificering assay.
  5. Evalueren van de grootte en de zuiverheid van de cDNA bibliotheek met een hoog-gevoeligheids DNA-chip op een Bioanalyzer (Figuur 5). Volgorde de cDNA bibliotheek met behulp van een systeem met hoge gegevensdoorvoer. Het gegevensbestand van de FASTQ overbrengen in de pijpleiding van de RNAworld voor de adapter trimmen en aanpassing aan het menselijk genoom te identificeren van de miRNA sequenties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals beschreven in de methode hier, een totaal van 18 afzonderlijke FFPE RNA monsters (100 ng elke) in afzonderlijke buizen zijn ingesteld voor het ondergaan van 3' adenylated barcoded oligonucleotide T4 afbinding 's nachts. De volgende dag, zijn de enzymatische reacties warmte-gedeactiveerd, gecombineerd en neergeslagen in een enkele buis. De RNA-pellet is geresuspendeerde en de ligaturen RNA-moleculen worden gescheiden op een 15% denaturering polyacrylamidegel (pagina), waar RNA oligonucleotide grootte markeringen die gemigreerd in aangrenzende putten van het gel van de pagina, worden gebruikt om te kiezen van de gepaste afmetingen 3' barcoded kleine RNAs (Figuur 2). Het verwijderde gel stuk is geïncubeerd in een NaCl oplossing 's nachts elueer de ligaturen RNA-moleculen. De volgende dag, de eluted RNA wordt neergeslagen, en een 5' adapter Afbinding wordt uitgevoerd. Vervolgens worden de 5' afgebonden adapter kleine molecules van RNA gemigreerd en gescheiden op een 12% acrylamide gel, waar opnieuw gemigreerde RNA grootte markering oligonucleotides toestaan excisie van de grootte van de kleine RNAs met zowel de barcoded oligonucleotides 3' en 5'-adapter ( Figuur 3). De verwijderde gel is's nachts geïncubeerd in een NaCl-oplossing voor het toestaan van de elutie van RNA. De volgende dag, de ligaturen kleine molecules van RNA zijn neergeslagen, en de pellet is geresuspendeerde in RNase-gratis water, gevolgd door omgekeerde-transcriptie; een aliquot deel van de moleculen van cDNA ondergaat een pilot PCR reactie (figuur 4A). Grootschalige PCR reacties met behulp van dezelfde input van cDNA bibliotheken worden ingesteld en beoordeeld op een 2,5% agarose gel om te verifiëren dat alle reacties voldoende PCR versterkt (figuur 4B), vóór de bundeling en nachtelijke ethanol neerslag waren. De volgende dag, de versterkte cDNA bibliotheek met alle 18 afzonderlijke bibliotheken voor de 18 unieke FFPE RNA specimens, wordt gemigreerd een 2,5% agarose gel, en de bovenste PCR band, met bij 100 nt is weggesneden en gezuiverd (figuur 4C). Vervolgens wordt de cDNA Bibliotheek zuivering geëvalueerd op een hoge gevoeligheid DNA-chip (Figuur 5) om te bepalen dat het gezuiverde PCR-product geen excess inleidingsdimeer of andere bijproducten van de PCR-reactie bevat. Het PCR-product wordt vervolgens geanalyseerd op een systeem met hoge gegevensdoorvoer sequencing. De adapter trimmen en generatie van 18 afzonderlijke bestanden voor elk van de 18 modellen zijn uitgevoerd met behulp van de RNAworld-pijpleiding (toegang werd verstrekt aan ons door Dr. Thomas Tuschl). Biostatistisch analyses worden vervolgens uitgevoerd om te evalueren van de miRNA inhoud van de FFPE RNA specimens.

Geoptimaliseerd voor het valideren van deze procedure, gematched vers bevroren en FFPE borst tumor exemplaren werden gebruikt voor de analyses (Figuur 6). Twee soortgelijke borst van invasief ductaal carcinoom (IDC) tumoren werden geselecteerd om de gevoeligheid van de procedure te evalueren en bepalen als miRNA expressie verschillen vastgesteld tussen de twee vers bevroren weefsels kunnen ook worden gedetecteerd de gecompenseerde gearchiveerd FFPE RNA exemplaren. Voor dit experiment, de kwaliteit van het totaal RNA verkregen uit de 2 vers bevroren en de overeenkomende twee FFPE RNA monsters werd geëvalueerd (figuur 6A). Zoals verwacht werd de RNA-grootte en de kwaliteit van de FFPE specimens in vergelijking met de gecompenseerde vers bevroren RNAs (vergelijk rijstroken 1 en 3, en rijstroken 2 en 4) ernstig verlaagd. Een van de FFPE-RNA had zijn gearchiveerd op RT voor 4 jaar (invasieve borst kanker 1, (IBC1)) en de andere had zijn gearchiveerd op RT voor 8 jaar (IBC2), terwijl de vers bevroren tegenposten was opgeslagen bij-80 ° C. De vier afzonderlijke RNA specimens werden geanalyseerd in één bibliotheek, met behulp van 4 individuele streepjescodes en de miRNA lezen distributie percelen worden weergegeven in figuur 6B. De twee bovenste panelen weergeven miRNA expressie correlatie tussen de twee-vers bevroren tumor RNAs en hun specifieke FFPE RNA specimen tegenhangers. De percelen tussen gematched vers bevroren en FFPE miRNAs geven aan dat de voorbereiding van cDNA Bibliotheek een goede reproduceerbaarheid biedt zoals een hoge correlatie tussen het miRNAs gedetecteerd in specimens anders verwerkt (bevroren vs. FFPE) kan worden waargenomen. De twee onderste panelen tonen het verband tussen miRNA expressie gegevens uit de twee verschillende bevroren tumoren en tussen de twee verschillende FFPE tumoren. Zoals aangegeven in Figuur 6 c, werden de miRNA expressie verschillen vastgesteld tussen de twee vers bevroren tumoren gecorreleerd met de verschillen tussen de twee overeenkomende FFPE tumor exemplaren aangetroffen. Betekenis miRNA expressie verschillen waarneembaar waren beide in vers bevroren en FFPE tumoren.

Voor verdere evaluatie van de gevoeligheid van deze aanpak, miRNA expressie gegevens uit 12 gearchiveerde FFPE specimens en 4 vers bevroren RNA exemplaren werden gebruikt (figuur 6D). De 16 verschillende RNA specimens werden individueel 3' barcoded en al gebruikt voor de bereiding van een enkele cDNA Bibliotheek. De monsters van de RNA gebruikt in deze bibliotheek opgenomen twee borst cellijnen, de MCF10A (normaal-achtige cellijn) en de MCF7 (borst kanker cellijn) met RNA van nieuwe cellen en van hun gearchiveerde FFPE tegenhangers23, gematched vers bevroren en FFPE RNA samples van de twee borstkanker monsters geanalyseerd onafhankelijk (IBC1 en IBC2 in figuur 6A en 6B) en gematched vers bevroren en FFPE RNA samples van normale cervicale monsters (Cx). Bovendien, waren gearchiveerde FFPE specimens van normaal (normale Br1, Br2 normale en normale Br3) en kanker borstweefsels (IBC 5, IBC 6 en IBC 7), zonder hun vers bevroren tegenhangers geanalyseerd. Zoals waargenomen op de heatmap, ongeacht vers bevroren of FFPE RNA oorsprong, miRNA expressieprofielen van dezelfde cellen (MCF10 of MCF7), of het dezelfde weefsels (IBC1, IBC2 of Cx) samen een cluster vormen. Bovendien, zoals vermeld op de ongecontroleerde cluster, van links naar rechts, normale borst cellen en weefsels die samen een cluster vormen terwijl borst tumoren en tumorcellen geclusterd aan de rechterkant. Het cervicale weefsel, die een verschillende miRNA expressie profiel weergegeven, gegroepeerd aan de rechterkant van de heatmap.

Gezien het feit dat de meeste van de klinisch gearchiveerde FFPE specimens geen vers bevroren tegenhangers, maar dat ze kunnen worden opgehaald na verschillende opslag duur, het werd gevraagd om te bepalen als het geoptimaliseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol van toepassing was en reproduceerbaar met steeds meer oudere FFPE exemplaren. Zoals weergegeven in Figuur 7, miRNA expressieprofielen uit FFPE weefsels gearchiveerd voor 18, 20, 22, 27, werden 30 en 35 jaar verkregen. Het RNA werd geëxtraheerd met behulp van de geoptimaliseerde gelijktijdige RNA/DNA procedure21en kwartet RNA aliquots van elke individuele FFPE specimen waren voorbereid op dezelfde dag en opgeslagen bij-80 ° C vóór bibliotheek preparaten. Een totaal van 9 verschillende FFPE specimens werden geanalyseerd in tweevoud, waar elk individuele RNA aliquot werd afgebonden met verschillende barcoded oligonucleotides (18 totaal barcodes), binnen dezelfde bibliotheek. Dit experiment werd herhaald gedurende twee opeenvolgende weken (week 1 en week 2). Hierdoor konden de evaluatie van de reproduceerbaarheid van cDNA Bibliotheek voorbereiding met de dezelfde RNA specimens, met twee verschillende barcodes binnen één bibliotheek, en tussen twee verschillende bibliotheken met een interval van één week. Zoals aangegeven op Figuur 7, bleef de correlatiecoëfficiënt boven 0.96 ongeacht de leeftijd van het model of de bibliotheek voorbereiding week; Daarom, geoptimaliseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding voorziet het protocol een robuust hulpmiddel reproduceerbare analyse van FFPE specimens ongeacht hun archivering tijd, bijvoorbeeld, de 35-jarige gearchiveerde FFPE RNA hoge reproduceerbare maatregelen (Zie borst #9) weergegeven gelijkwaardig zijn aan die opgemerkt met de 20-jarige FFPE RNA samples (Zie borst #3).

Figure 1
Figuur 1: Oligonucleotides. Alle oligonucleotide sequenties, hun overeenkomstige chemische wijzigingen, en in dit protocol gebruikte concentraties worden beschreven. De soorten chemische wijzigingen worden beschreven in het vak van de wijziging en de verkorte wijzigingen weergegeven in de oligonucleotide sequenties. De kalibrator cocktail toont de lijst van de 10 afzonderlijke RNA oligonucleotide kalibratoren, die waren geresuspendeerde in een oplossing met de vervoerder oligonucleotide (0,5 µM). De achttien 3' barcoded oligonucleotide adapters zijn gedetailleerd met grijze arcering van de streepjescode reeks. De opeenvolging van RNA van de 5'-adapter, en de opeenvolgingen van DNA van de 3' PCR en 5' PCR inleidingen zijn gedetailleerd. Het RNA-sequenties van de twee grootte markering oligonucleotides, namelijk waarnaar wordt verwezen in het protocol als 19 nt-3' adapter en 24 nt-3' adapter grootte markers, worden verstrekt. Alle DNA en RNA oligonucleotides werden commercieel aangekocht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: pagina zuivering van de 3' barcoded RNA monsters. Nadat bundelen en neerslaan van de 18 barcoded RNA monsters, de geresuspendeerde pellet RNA is gemigreerd en gescheiden door elektroforese over een 15% acrylamide gel (Zie ook 8). Het rode vierkantje benadrukt het gebied met de 3' barcoded microRNAs, die werd weggesneden met een scalpel mes en overgebracht in een nuclease-vrije gesiliconiseerd microcentrifuge buis. Een totaal van vier wells, met twee met de 19 nt-3' adapter en twee met de 24 nt-3' adapter aan elke kant van de bibliotheek een goed weg, was ingesteld (Zie wells 5, 6, 10 en 11, respectievelijk). Als een test voor de T4 RNA ligase 1 en voor de zuivering van de ligaturen grootte markeringen worden voltooid de volgende dag, afbinding reacties met de 19 nt-3' adapter grootte markering met het 5'-adapter en de 24 nt-3' adapter grootte markering met het 5'-adapter zijn uitgevoerd in putten 2 een d 3, respectievelijk. De gele pleinen weer de verwijderde banden voor de ligaturen grootte markering RNA oligonucleotides met de 5'-adapter. Deze banden zijn gezuiverd, neergeslagen en draaien tijdens op de 12% zuivering van de pagina (Zie afbeelding 3 hieronder). Wells 1 en 13 bevatten de 20 nt grootte ladder, waardoor de verwachte omvang van de ligaturen producten bevestigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: pagina zuivering van de gezuiverde bibliotheek na de afbinding van de 5' adapter. De gezuiverde RNA-bibliotheek werd afgebonden met de 5'-adapter en de grootte van de verwachte product was weggesneden uit de 12% pagina met behulp van de markeringen van de ligaturen grootte (Zie Rode plein). De producten van de T4 RNA-ligations tussen de 19 nt-3'-adapter en de 5' adapter (wells 4 en 9) en tussen de 24 nt-3' adapter en de 5' adapter (wells 5 en 10) waren uitgevoerd, parallel aan iedere kant van het putje met de RNA-bibliotheek. De hoogste bands (zie witte sterretjes) zijn de producten van de adapter afbinding 5' en gebruikt als de gids voor de gel band besnijdenis met de 5' adapter afgebonden RNA bibliotheek. De afbinding marker afbinding formaatproducten gezuiverd op de vorige pagina worden in goed 3 uitgevoerd. Zoals opgemerkt in de putjes 1 en 12, was ook de 20 nt grootte ladder uitvoeren voor het valideren van de verwachte omvang van de RNA-bibliotheek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Pilot PCR en grootschalige versterking van de cDNA Bibliotheek. De grootte en de verhouding van de PCR-producten werden geëvalueerd op een 2,5% agarose gel in aanwezigheid van ethidiumbromide. (A) na omgekeerde transcriptie van de barcoded RNA-bibliotheek, een aliquoot gedeelte van de cDNA bibliotheek werd versterkt met behulp van de 5' en 3' PCR inleidingen in een enkele pilot PCR reactie. Hoeveelheden van de pilot PCR reacties waren verkregen op 10, 12, 14, 16, 18 en 20 cycles en gemigreerd op een 2,5% agarose gel. Zoals waargenomen tussen putten 1 en 7, de aanwezigheid van de cDNA Bibliotheek en adapter Dimeren exponentieel waarneembare was (zie groene rechthoeken). Voor deze bibliotheek, wordt in de PCR cyclus geselecteerd voor versterking van de cDNA Bibliotheek 15 was. (B) dit schema toont de positie en lengte van de verschillende oligonucleotides en de resulterende RNA en DNA producten, die herkenbaar zijn op de pagina en agarose gels. (C) Aliquots van de 6 grootschalige PCR reacties (aangeduid in A) zijn afzonderlijk geanalyseerd op een 2,5% agarose gel (Zie wells 3 tot en met 8). De twee soorten PCR producten, namelijk de bibliotheek (bovenste band) en de inleidingen Dimeren (onderste band) zijn zichtbaar op deze gel (zie groene rechthoeken). De lege PCR reactie zonder cDNA wordt weergegeven geen PCR versterking (Zie goed 2). De 20 nt grootte ladder kan controle van de maten van het product (Zie goed 1). (D) Gel beeld op een blauwe lichte transilluminator van de 2,5% agarose gel met de gebundelde PCR reacties liep in twee aangrenzende putten. Zoals opgemerkt, de hoogste band in beide putten is binnen de verwachte bibliotheek-grootte en de adapter dimeer band ligt onder. De bovenste PCR bands waren weggesneden en gezuiverd met een gel extractie kit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: evaluatie van de gezuiverde PCR vergroot DNA library. Een kleine hoeveelheid (1 µL) van de PCR versterkte cDNA Bibliotheek wordt geanalyseerd met behulp van een hoge gevoeligheid DNA-chip op een microfluidics gebaseerde platform. (A) dit paneel toont de migratie van de grootte markers voor het kalibreren van het instrument. (B) dit paneel wordt de migratie van de gezuiverde PCR versterkte cDNA bibliotheek weergegeven. De hoogste piek wordt gemeten op een grootte van 100 bp (Zie sterretje) en vertegenwoordigt de cDNA Bibliotheek. De kleine piek geëvalueerd op 72 bp door het instrument vertegenwoordigt de adapter inleidingsdimeer. De 100 bp piek gedetecteerd door microfluidics gebaseerd platform blijkt de geschatte omvang voor de versterkte cDNA Bibliotheek, die 18 afzonderlijke barcoded RNA exemplaren voor latere NGS op een systeem met hoge gegevensdoorvoer sequencing bevat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: cDNA Bibliotheek voorbereiding en het gebruik van de volgende generatie sequencing gematched vers bevroren en formaline-vaste paraffine ingesloten specimens. (A) totaal RNA geëxtraheerd gewaagd vers bevroren en FFPE invasief ductaal carcinoma (IDC) tumoren werd geanalyseerd op een totale RNA-chip op een microfluidics gebaseerde platform. (B) totale RNA van gecompenseerde vers bevroren en FFPE exemplaren (IBC 1 en IBC2) onderging het cDNA protocol voor de voorbereiding van de bibliotheek en de miRNA sequencing gegevens werden uitgezet. (C) DifferentialmiRNA expressie tussen IBC1/IBC2 specimens en correlatie tussen bevroren en FFPE gepaarde monsters. miRNA expressie wordt weergegeven in het logboek tellen per miljoen (CPM), van hoog naar laag leest (rood blauw van kleur). De significantie van het verschil van de expressie tussen de twee weefsel paren, per miRNA, weergegeven door de grijze cirkels, met hoge en lage expressie miRNAs geïdentificeerd in vers en FFPE monsters. (D) totaal RNA onttrokken gecompenseerde vers en FFPE RNA specimens van borstkanker cel lijnen (MCF10A en MCF7), menselijke invasieve kanker (IBC 1 en IBC2), cervicale borstweefsel (Cx), gearchiveerd normale borstweefsels (normale Br1, Br2 normale en normale Br 3), en gearchiveerde invasieve borstkanker (IBC 5, IBC 6 en IBC7) onderging de cDNA Bibliotheek voorbereiding binnen het zelfde punt. De NGS-gegevens van de miRNAs gedetecteerd in de bibliotheken worden weergegeven in de configuratie van een warmte-kaart. Dit cijfer is gewijzigd van Loudig et al. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: cDNA Bibliotheek voorbereiding en miRNA expressie correlatie tussen wordt gerepliceerd met behulp van de oudere gearchiveerde FFPE specimens. Totaal RNA van 18, 20, 22, 27, 30 en 35-jaar-oude gearchiveerde FFPE borst weefsel monsters onderging ons geoptimaliseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol. RNA monsters uit 9 verschillende FFPE monsters werden afgebonden met verschillende 3' barcoded oligonucleotides en geanalyseerd binnen dezelfde bibliotheek op week 1 (w1). Hetzelfde experiment werd herhaald binnen een interval van één week (week 2 of w2). Reproduceerbaarheid maatregelen van gedupliceerde miRNA expressie gegevens tussen de dezelfde gearchiveerde exemplaren van RNA worden weergegeven in de heatmaps en met coëfficiënten van de correlatie tussen 0,93 en 0.99 geëvalueerd. Dit cijfer is gewijzigd van Loudig et al. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een zeer reproduceerbaar en robuuste cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE RNA specimens is gepresenteerd in dit protocol, dat een aangepaste en geoptimaliseerde versie van de procedure beschreven door Hafner et al. is 22

Alle stappen van dit protocol zijn geoptimaliseerd voor gebruik met oudere gearchiveerde en gecompromitteerde totaal RNA verhaald van FFPE exemplaren. De belangrijkste stap van dit protocol, voor de verwerking van kleine hoeveelheden FFPE RNA, woont in de bundeling van alle monsters van RNA (d.w.z., 18 afzonderlijke 100 ng FFPE RNA samples) na individuele ligations met de 18 unieke 3' barcoded adapters. Deze kritieke stap zorgt voor de 18 FFPE RNA monsters uniform ondergaan alle opeenvolgende biochemische en enzymatische stappen nodig zijn voor de voorbereiding van de kleine RNA-cDNA Bibliotheek. Bovendien, deze stap maximaliseert de hoeveelheid RNA ondergaat neerslag en gel zuivering door het verbeteren van het effect van de drager van de kleine molecules van RNA en doordat pellet observatie en gel selecties. Een andere belangrijke eigenschap van dit protocol, die verder zijn veelzijdigheid hoogtepunten bij het werken met kleine hoeveelheden FFPE RNA, is dat een piloot PCR reactie wordt gebruikt ter identificatie van de optimale versterking-cyclus van de cDNA Bibliotheek. Deze stap biedt ook inzicht in de dynamiek van de versterking van de bibliotheek versus primer dimeer amplificatie, wat cruciaal is bij de voorbereiding van de grootschalige PCR-reactie en zuiveren van de kleine RNA-bibliotheek op de agarose gel. De gegevens die zijn toegevoegd aan dit protocol tonen de reproduceerbaarheid van deze aanpak tussen gematched bevroren en FFPE exemplaren, en ook markeren de toepasbaarheid op oudere FFPE RNA samples van specimens gearchiveerd tot 35 jaar.

Dit protocol is bewerkt uit de originele versie, dus het is geoptimaliseerd voor bereiding van kleine RNA bibliotheken gemaakt van lagere kwaliteit en kwantiteit van chemisch gewijzigd en gecompromitteerde FFPE RNA. Één aspect van deze procedure die werd aangepast met succes afbinden en versterken van kleine RNAs van FFPE exemplaren heeft betrekking op het bedrag van de kalibrator cocktail spiked tijdens de eerste 3' barcoded adapter afbinding, waarvoor invoer werd teruggebracht tot 0.026 nM om te voorkomen dat concurrentie met de afbinding van lage abundaties kleine RNAs presenteren in FFPE RNA monsters. Een andere belangrijke wijziging van de oorspronkelijke procedure was de verwijdering van alle radioactief gelabelde grootte-markeringen gebruikt tijdens de selectie van de ligaturen kleine RNAs op de pagina gelen. Gebruik van deze radiolabeled grootte-merkers beperkt niet alleen de toepasbaarheid van deze aanpak tot laboratoria gecertificeerd voor het gebruik van radio-isotopen maar ook verhinderd observatie van de RNA-producten op de gels. In plaats daarvan dit geoptimaliseerd protocol, zijn grootte markeringen in putten grenzend aan de bibliotheek, op de pagina gel, uitgevoerd en gevisualiseerd rechtstreeks met een fluorescente kleurstof aan directe excisie van de ligaturen kleine RNAs. Nog belangrijker is, is de fluorescente kleurstof licht gespoten op de gel ter voorkoming van de verspreiding van de RNA-producten en vervolgens gevisualiseerd op een blauwe lichtbak. Vervolgens, als een maatregel van voorzorg en ter verbetering van de verspreiding van de ligaturen kleine RNAs vervat in de verwijderde pagina gel fragmenten, worden gel-breaker buizen gebruikt voor het gelijkmatig verpletteren de gel vóór incubatie in een oplossing van NaCl's nachts bij 4 ° C onder agitatie. Al deze stappen waren zorgvuldig geëvalueerd om te werken met kleinere hoeveelheden materiaal.

Dit protocol werd toegepast op FFPE RNA monsters uit verschillende bronnen (organen en instellingen) die zijn opgeslagen voor verschillende hoeveelheden van tijd. De analyses bleek de hoge reproduceerbaarheid van sequencing kleine RNAs van verse en diepgevroren specimens, wanneer using zulks geoptimaliseerd procedure. Aanvullende analyses met behulp van de oudere gearchiveerde FFPE exemplaren, opgeslagen tot 35 jaar, verder aangetoond de overgrote toepasselijkheid van het protocol op klinische monsters. De minimumeis FFPE RNA input zijn voor FFPE specimens bleek te worden 100 ng. Deze lage eis staat toepasbaarheid van dit protocol aan een verscheidenheid van laesies van verschillende maten en beschikbaarheid, maar het zou niet toestaan dat de analyse van eencellige FFPE RNA. Het is belangrijk op te merken, echter dat dit protocol geoptimaliseerd is ook gebruikt met totaal RNA onttrokken circulerende exosomes met ingangen voor minder dan 1 ng en getoond om zeer reproduceerbaar kleine RNA expressieprofielen (gegevens niet worden weergegeven). Deze lage input suggereert dat kleine RNAs in FFPE monsters, hoewel representatief zijn voor de oorspronkelijke verse weefsel, aanwezig in veel lagere verhoudingen dan in totaal RNA zijn van circulerende exosomes.

In recente werk, waar dit geoptimaliseerd protocol werd toegepast voor klinisch geclassificeerde DCIS FFPE specimens, bleek dat miRNA expressie verschillen geïdentificeerd door NGS van de cDNA Bibliotheek kon worden getraceerd door de kwantitatieve PCR. Dit werk toonde de haalbaarheid van het gebruik van DCIS laesies van gearchiveerde weefsels van verschillende instellingen voor grootschalige retrospectieve studies [20]. Deze studie benadrukt ook de robuustheid van deze cDNA Bibliotheek voorbereiding wanneer op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd (met tussenpozen van enkele weken), zonder afbreuk te doen aan de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de test.

Gezien de enorme hoeveelheid klinisch geclassificeerde gearchiveerde FFPE exemplaren biedt dit geoptimaliseerd protocol een robuust hulpmiddel voor bereiding van cDNA bibliotheken in grootschalige retrospectieve analyse en voor de mogelijke identificatie van biomarkers miRNA kanker ontwikkeling21is gekoppeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs wilt doorgeven dat een publicatie met enkele van de gegevens in dit manuscript werd gepubliceerd in de International Journal of Molecular Sciences door Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Thomas Tuschl, hoofd van het laboratorium voor moleculaire biologie van RNA, en ook familieleden van zijn laboratorium voor hun steun en voor het delen van de technologie, ontwikkeld in zijn laboratorium en toegang bieden tot de pijpleiding van de RNAworld. Wij danken ook Dr. Markus Hafner voor zijn protocol voor het delen en het verstrekken van gedetailleerde beschrijvingen over alle biochemische en enzymatische stappen in zijn eerste procedure gebruikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10, (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8, (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7, (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58, (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42, (12), 1911-1922 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics