Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Formalin-fast paraffin-indlejrede enheder udgør en værdifuld kilde til molekylære markører af sygdomme hos mennesker. Her præsenterer vi en laboratorium-baseret cDNA bibliotek forberedelse protokol, oprindeligt designet med frisk frosset RNA, og optimeret til analyse af arkiverede MicroRNA fra væv gemt op til 35 år.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

– Arkiveret, klinisk klassificeret formalin-fast kan paraffin-embedded (FFPE) væv give nukleinsyrer til retrospektiv molekylære studier af udviklingen af kræft. Ved hjælp af non-invasive eller præmaligne læsioner fra patienter, der senere udvikler invasiv sygdom, kan gen expression analyser hjælpe med at identificere tidlige molekylære ændringer, der prædisponerer til kræftrisiko. Det har været godt beskrevet, at nukleinsyrer inddrives fra FFPE væv har undergået alvorlige fysiske skader og kemiske ændringer, hvilket vanskeliggør deres analyse og generelt kræver tilpasset assays. MicroRNA (miRNAs), men som repræsenterer en lille klasse af RNA molekyler spanning kun op til ~ 18 – 24 nukleotider, har vist sig at modstå langtidsopbevaring og med held har analyseret i FFPE prøver. Her præsenterer vi en 3' barcoded supplerende DNA (cDNA) bibliotek forberedelse protokollen specielt optimeret til analyse af små RNA'er udvundet af arkiverede væv, der var for nylig vist sig for at være robust og stærkt reproducerbare når ved hjælp af arkiveret kliniske prøver opbevares i op til 35 år. Dette bibliotek forberedelse er godt tilpasset til de multiplex analyse af kompromitteret/nedbrudt materiale hvor RNA prøver (op til 18) er forbundet med individuelle 3' barcoded adaptere og derefter samles sammen for efterfølgende enzymatiske og biokemiske præparater forudgående analyse. Alle purifications udføres af polyacrylamid gelelektroforese (side), som tillader størrelse-specifikke valg og enrichments af barcoded små RNA arter. Denne cDNA bibliotek forberedelse er veltilpasset til minut RNA indgange, som en pilot Polymerasekædereaktionen (PCR) giver mulighed for bestemmelse af en specifik forstærkning cyklus til at producere optimale mængder af materiale til næste generation sequencing (NGS). Denne metode var optimeret til anvendelse af forringede FFPE RNA fra prøver arkiveret i op til 35 år og giver meget reproducerbare NGS data.

Introduction

miRNAs er bemærkelsesværdigt godt bevaret i formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) enheder1,2,3. Tidligere arbejde har vist, at udtryk for disse korte regulerende ikke-kodende enkelt strandede RNA molekyler med succes kan evalueres ved hjælp af total RNA fra FFPE prøver og give relevante genekspression data i forhold til den oprindelige friske væv4,5,6,7,8. Sammenlignet med store messenger RNA'er, som har vist sig at være alvorligt påvirket af FFPE væv forarbejdning (formaldehyd, varme, udtørring, etc.), endogene RNases og alder af prøverne, den lille størrelse af miRNAs (~ 18 – 24 nukleotider) ser ud til at gøre dem resistente over for nedbrydning og robust til langtidsopbevaring, også demonstreret gennem miRNA udtryk undersøgelser, der udkonkurrerer høj overførselshastighed mRNA undersøgelser i arkiverede prøver9. miRNA udtryk undersøgelser ved hjælp af arkiverede kliniske prøver, der er for det meste udført i små analyser, har påvist, at single eller multipleksede kvantitativ PCR assays, forskellige typer af microarray teknologi, og senest NGS kan bruges til at vurdere udtryk for konserverede miRNAs efter optimering af disse assays10,11,12,13,14.

Eftersom dysregulering af miRNA udtryk har været forbundet med udviklingen af en række menneskelige maligniteter og at der er potentielt et enormt udbud af klinisk kommenteret arkiverede eksemplarer, har det vist sig at disse små RNA molekyler udgør en lovende kilde til potentiel kræft biomarkører15,16,17,18. Brug af en høj overførselshastighed gen expression teknologi såsom NGS har fordelen at give en global evaluering af alle miRNA udskrifter i forhold til målrettede teknologier såsom PCR og/eller microarrays19. Derfor var en optimeret, overkommelig og let anvendelig protokol til cDNA bibliotek tilberedning af små RNA'er fra ældre arkiverede prøver til NGS optimeret for at aktivere store retrospektive undersøgelser20.

Vi har tidligere etableret en samtidige RNA/DNA udvinding protokol for særskilt genvinding af RNA og DNA fra ældre arkiverede prøver, som vi fandt for at excellere moderne kommercielle kits21. Bruger denne udvinding protokol, for at opnå total RNA fra FFPE væv arkiveret i længere periode af gange, optimeret vi fremstilling af cDNA-biblioteker til NGS af miRNAs bevaret i klinisk prøvemateriale til op til 35 år. Desuden, i en nyligt offentliggjort undersøgelse hvor vi forberedt cDNA-biblioteker fra klinisk klassificerede duktalt karcinom i situ (DCIS) enheder, vi identificeret varierende udtrykt miRNAs, som blev godkendt af kvantitativ PCR, som er angivet at specifikke miRNA udtryk ændringer må kunne påvises i DCIS-læsioner fra patienter, der udvikler brystkræft sammenlignet med DCIS-læsioner fra patienter, der ikke udvikler brystkræft.

I betragtning af omkostningerne ved kommercielle kits til tilberedning af små RNA cDNA biblioteker, potentialet for deres seponering, samt anvendelse af copyright/patent-beskyttet reagenser, der ikke kan optimeres, besluttede vi at tilpasse en tidligere offentliggjort laboratorium-baseret og kit-fri 3' barcoded cDNA bibliotek forberedelse protokol for NGS af små RNA'er arkiveret i FFPE prøver, tillader simultan analyse af 18 prøver22. Denne protokol indeholder en ideel og robust trinvis procedure med visuel og teknisk evaluering kontrolposter, som var afgørende for tilpasning til FFPE RNA prøver, og har et stort potentiale for anvendelse til andre kilder af kompromitteret eller vanskeligt at bruge RNA materiale. Den originale protokol anvendelighed blev forbedret ved at erstatte radioaktivt mærket størrelse markører med fluorescerende (fxSYBR guld) påviselige RNA størrelse markører, der anvendes under udvælgelsen af sammenskrevne biblioteker på store polyacrylamidgeler. Denne optimerede protokol bygger på ligatur af 3' barcoded adaptere til 18 enkelte FFPE RNA prøver, som er så samles sammen for at gennemgå 5' adapter ligatur, reverse-transskription og en pilot PCR-analyse for skræddersyet forstærkning af den endelige cDNA biblioteket før storstilet PCR-amplifikation, rensning og NGS på en høj overførselshastighed sequencer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af alle reagenser og primere

  1. Bestil alle primere og adaptere, som beskrevet i figur 1.
  2. Forberede kalibrator cocktail materiel, der vil være spidse i hver enkelt ligatur.
    1. Resuspend carrier oligonukleotid (figur 1) til 0,5 µM med RNase-fri vand. Resuspend 10 kalibrator oligonukleotider (figur 1) til 100 µM bruger 0,5 µM carrier oligonukleotid løsning.
    2. Kombiner 10 µL af hver af de 10 kalibratorer i en Silikoniseret microcentrifuge at opnå en 100 µM cocktail kalibrator bestand, og forberede en 0.026 nM løsning til opbevares ved-20 ° C.
  3. Fortynd de 20 unikke, frysetørret, adenylated 3' adaptere med RNase-fri vand til en slutkoncentration på 50 µM (figur 1).
    Bemærk: Det anbefales at forberede 2,5 µL delprøver fra hvert netværkskort i individuelle Silikoniseret rør og gemme dem på-80 ° C i op til 2 år.
  4. Resuspend den afsaltede 19 nt-3' adapter og 24 nt-3' adapter størrelse markør oligonukleotider til 250 ng/mL (figur 1).
  5. Resuspend HPLC renset 5' adapter til 100 µM med RNAse-fri vand. Resuspend 5' og 3' PCR primere til 100 µM ved hjælp af RNase-fri vand (figur 1).
    Bemærk: Alikvot alle oligonukleotider i mængder, der er nødvendige for 1 – 2 eksperimenter og opbevares ved-80 ° C.
  6. Forberede polyacrylamid denatureringen (PAA) gel ladning farvestof ved at kombinere 98,8% formamid, 1% (v/v) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0, og 0,2% bromophenol blå, og sæt 1 mL alikvoter ved-80 ° C.
    1. Forbered 0,5 M Na2H2 EDTA-oploesning ved at tilføje 18.6 g Na2H2 EDTA pulver til 50 mL nukleasen-gratis vand. Tilsæt NaOH træpiller for at nå frem til pH 8,0. Regulér lydstyrken til 100 mL for at opnå en 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 stamopløsning.
    2. Veje 15 mg af bromophenol blå i en separat 15 mL tube. Tilføje 600 µL nukleasen-gratis vand. Tilføje 14,25 mL afioniseret formamid. Tilsæt 150 µL af 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 løsning.
    3. Alikvot PAA endelige løsning af 15 mL i 1 mL alikvoter ved-80 ° C.
  7. Forberede 5 x agarosegel lastning farvestof ved at kombinere 0,2% bromophenol blå, 0,2% xylen cyanol FF, 50 mM Na2H2 EDTA, pH 8,0, og 20% Ficoll Type-400.
    1. Resuspend 1.86 g Na2H2-EDTA i 50 mL nukleasen-frit vand i et 400 mL bægerglas på en magnetomrører ved stuetemperatur (RT). Tilsæt NaOH pellets til at nå en pH 8.0. Tilføje nukleasen-gratis vand for at nå 100 mL for at opnå en 50 mM Na2H2 EDTA-oploesning.
    2. Vejer 20 mg af bromophenol blå pulver, 20 mg af xylen cyanol FF pulver og 2 g af Ficoll Type-400 pulver, og pelleten i 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA.
    3. Vortex rør indeholdende de tre farvestoffer og tilsættes 5 mL af 50 mM Na2H2 EDTA. Bland 5 x agarose gel ladning farvestof, forberede 1 mL alikvoter, og opbevares ved-80 ° C.

2. opsætning af 3' Barcoded Adapter Ligations med 18 individuelle RNA prøver

  1. Identificere 18 individuelle RNA prøver (pre-aliquoted ved 100 ng i 9,5 µL nukleasen-frit vand i 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge rør), og angive rør på is til optøning i 10 min.
  2. Forberede 10 x RNA Ligase Buffer (uden ATP) friske.
    1. I en 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge tube, kombinere 343 µL af RNase-fri vand, 500 µL af Tris 1 M pH 7,5, 100 µL 1 M MgCl2, 50 µL af 20 mg/mL bovint serumalbumin og 7 µL af 14 M 2-mercaptoethanol. Mix af svippede tube, centrifuge for 2 s på 2.000 x g og RT og sæt på is.
      Bemærk: Alle trin i denne protokol, angive "centrifugeres i 2 s" er udført i en benchtop microcentrifuge på RT og en top hastighed af 2.000 x g at indsamle løsninger til bunden af rørene.
  3. Forberede 50% vandig DMSO lager ved tilsætning af 1 mL af RNase-fri vand til 1 mL af DMSO i et 2 mL Silikoniseret microcentrifuge rør, wrap røret i alufolie og opbevar ved RT.
  4. Afrimning 0.026 nM kalibrator cocktail i isbad i 10 min. Forbered ligatur Master Mix ved at kombinere i følgende rækkefølge i en 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge tube: 40 µL af 10 x RNA Ligase Buffer og 120 µL af 50% vandig DMSO ved hjælp af en 200 mL pipette , og tilsæt 10 µL af 0.026 nM kalibrator cocktail ved hjælp af en 10 µL pipette. Svip til 1,5 mL røret til mix, centrifugeres i 2 s, og sæt det på køl.
  5. Tilføje 8,5 µL af ligatur Master Mix til hver af de 18 individuelt aliquoted FFPE RNA prøver, forsigtigt svirp rør, centrifuge for 2 s og opbevares på is.
  6. Afrimning 2,5 µL delprøver fra hver af de 18, 3' barcoded adaptere og placere dem på is til optøning i 20 min.
    1. Brug en 3-µL pipette til at overføre 1 µL af hver adapter til de tilsvarende FFPE RNA prøver indeholdende RNA og ligatur Master Mix (dvs., 9.5 µL + 8,5 µL).
    2. Ikke pipetteres op og ned, blot give afkald i væsken og trække spidsen. Sørg for at ændre tips mellem FFPE RNA prøver. Lukke hver tube, svirp for at blande, centrifuge 2 s, og sæt på is.
  7. Denaturere reaktioner ved at placere de 18 rør på en varme blok ved 90 ° C i 1 min og derefter straks sted på is.
  8. Forberede ligatur enzym løsning ved at fortynde 10 µL af trunkerede K227Q T4 RNA Ligase 2 med 10 µL af RNase-fri vand ind i en frisk 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge rør.
  9. Bruge 3 µL pipette til at overføre 1 µL af de fortyndede ligatur enzym i hver af de 18 RNA prøver (ikke pipetteres op og ned, og ændre tips mellem hver tube). Sæt de 18 ligations på is og placere i en 4 ° C koldt værelse for en natten inkubation af 18 h.

3. rensning af de sammenskrevne små RNA'er

  1. Deaktivere ligatur reaktioner ved at placere de 18 rør til 1 min på en varme blok ved 90 ° C, og derefter vende tilbage til is i mindst 2 min. at køle ned.
  2. Forbered nedbør Master Mix ved at tilføje 1 µL af blå farvestof kovalent knyttet til glykogen til 26 µL af 5 M RNase-fri NaCl ind i en frisk Silikoniseret microcentrifuge rør.
    1. Overføre 1,2 µL af nedbør Master Mix i hver af de 18 rør. Tilføje 63 µL af 100% ethanol til hver af de 18 rør. Lukke hver tube, svip til mix, centrifugeres i 2 s, og sted rør på is. Kombinere indholdet af alle 18 rør ind i en enkelt 1,5 mL Silikoniseret rør.
    2. Luk røret, invertere tre gange til mix, centrifuge for 2 s, og sted på isen for 60 min. til bundfald.
  3. Forberede et stort (16 x 20 cm2) 15% polyacrylamid gel til side.
    1. Støbt to Silikoniseret glasplader (behandlet med et sikkert alternativ til silan belægninger) med 0,1 cm afstandsstykker.
    2. Kombinere 9 mL system fortyndingsvæske, 18 mL system koncentrat, 3 mL system buffer, 240 µL af APS (9%) og 12 µL af TEMED i en 50 mL tube.
    3. Overføre side gelopløsning mellem glasplader ved hjælp af 30 mL pipette, indsætte en 14-godt kam (0,1 cm tykke), og lad gel størkne på RT for 30 min.
  4. Der centrifugeres 1,5 mL rør med en samlet ligations på 16.000 x g og 4 ° C i 60 min.
  5. Fjern kammen. Ren brøndene rigeligt med RNase-fri vand ved hjælp af en sprøjte flaske med 200 µL spids på sin afslutning at nå inde brøndene og tvinge un-polymeriserede acrylamid (en godt ad gangen) ud over en vask. Sæt 15% siden på en gel apparater, fylde reservoirerne med 0,5 x Tris-Borat EDTA (TBE) løsning, og pre-køre gel for 30 min på 450 V.
  6. Inddrive tube med samlet ligations fra centrifugen og forsigtigt tørre RNA pellet.
    1. Fjern supernatanten med 1 mL pipette spids men forlade nogle væske i bunden. Vippe røret og bruge en 20 mL pipette til at fjerne de resterende supernatanten uden at røre pelleten. Vakuum sug røret ved hjælp af Pasteurs pipette med en 10 µL tip på sine ende, uden at røre pelleten.
    2. Resuspenderes RNA i 20 µL af RNase-fri vand ved at bladre til røret. Tilføj 20 µL af PAA gel lastning løsning til resuspend RNA, svirp for at blande, centrifuge for 2 sad RT, og sæt røret på 90 ºC for 1 min og derefter straks sted på is.
  7. Erstat 0,5 x TBE gel apparatet med friske 0,5 x TBE og belastning af stigen, størrelse markører og sammenskrevne miRNAs i midten af gel, efterlader 2-tomme brønde på begge sider (figur 2).
  8. Kør gelen på 450 V (35 mA) til 60 min, pause løb for 10 min at køle ned, og Kør igen på 520 V (25 mA) for en anden 60 min. Uncast på 15% siden ved at fjerne en af glasplader.
  9. Let spray gel sidder på glaspladen med fluorescerende farvestof løsning (10 µL) i 25 mL 0,5 x TBE, og lad det sidde fladt i 5 min. i mørke.
  10. Lægge glasset med gel på en blå lys transilluminator, og Juster begge 19 nt og 24 nt størrelse markører med en lineal til direkte excision af de sammenskrevne små RNA'er (figur 2). Punktafgifter gel.
  11. Placer den skåret gel i en 0,5 mL tube, designet til at fragmentere gel skiver, sikkert placeret i et 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge rør. Der centrifugeres ved 16.000 x g i 3 min. på RT. Resuspend den fragmenterede gel med 300 µL af 400 mM NaCl løsning, lukke røret og forsegle det med paraffin film.
  12. Sæt røret på agitation på en thermomixer på 1.100 rpm i en 4 ° C koldt rum for en natten inkubation (16-17 h).

4. ligatur af 5'-Adapter

  1. Oploesningen og fragmenterede gel til en 5 µm filter tube sidder i en 1,5 mL Silikoniseret tube, forsegle med paraffin film, og der centrifugeres i 5 min på 2.300 x g og RT.
  2. Tilføje 950 µL af 100% ethanol til den filtrerede løsning, lukke røret, invertere til mix, centrifugeres i 2 s, forsegling røret med paraffin film, og sat på køl i 1 time.
  3. Forberede en 12% siden gel som beskrevet i trin 3.3, men kombinere 12,6 mL fortyndingsvæske, 14.4 mL koncentrat, 3 mL buffer, 240 µL APS og 12 µL af TEMED i en 50 mL tube. Pre-køre 12% siden gel for 30 min på 450 V (~ 35 mA) i 0,5 x TBE.
  4. Centrifugeres den rensede små RNA løsning på 16.000 x g for 60 min. ved 4 ° C.
  5. Omhyggeligt afpipetteres ud supernatanten ved hjælp af 1 mL pipette til at fjerne hovedparten af løsningen og bruge en 200 mL pipette til at fjerne de resterende løsning, uden at røre pelleten.
  6. Ved hjælp af Pasteurs pipette med 10 mL spids enden dens tilsluttet en sugekolbe, forsigtigt tørre pellet uden at røre den.
  7. Resuspenderes i 9 µL af RNase-fri vand uden pipettering op og ned, men af let svippede røret, centrifugeres i 2 s, og sæt rør på is.
  8. Forberede 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP) frisk ved at kombinere 500 µL 1 M Tris pH 7,5, 100 µL 1 M MgCl2, 50 µL af 20 mg/mL acetyleret BSA, 200 µL af 10 mM ATP, 7 µL af 2-mercaptoethanol 14 M , og 143 µL af RNase-fri vand.
  9. Bland 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP) ved at bladre til røret, og der centrifugeres i 2 s at indsamle løsning i bunden af røret.
  10. Oprettet 5' adapter ligation af tilføjer 2 µL af 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP), 1 µL af 100 µM 5' adapter, og 6 µL 50% vandig DMSO til de 9 µL, 3' barcoded små RNA løsning.
  11. Svirp rør let at blande, centrifugeres i 2 s at indsamle løsning, placere røret på en varme blok ved 90 ° C i 1 min og tilbage på isen for mindst 2 min.
  12. Tilføj 2 µL af T4 RNA Ligase 1 oploesningen (ikke pipetteres op og ned), svirp tube, centrifuge for 2 s, og sidde i røret i flydende rack i et 37 ° C vandbad til 60 min.
  13. Samtidig oprettet to ligations mellem den 19 nt-3' adapter og 5' adapter og to ligations mellem den 24 nt-3' adapter og 5' adapter.
    1. Kombiner 2 µL af 19nt-3' adapter (250 ng/µL) eller 24 nt-3' adapter (250 ng/µL) med: 2 µL af 5' adapter (100 µM), 2 µL af 10 x RNA Ligase Buffer (med ATP), 6 µL af 50% vandig DMSO, 6 µL af RNase-fri vand , og 2 µL af T4 RNA Ligase 1 i 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge rør.
    2. Svirp rør til at blande, centrifugeres i 2 s, og sæt rør ved 37 ° C i 60 min.
  14. Tilføj 20 µL af PAA denatureringen Buffer til alle ligations (renset små RNA'er, 2 ligations med 19nt-3' adapter, og 2 ligations med 24nt-3' adapter).
    1. Mix af svippede rør, centrifuge for 2 s, og Inkuber rør på en varme blok ved 90 ° C i 1 min. overførsel alle rør til is, og forberede en stige (3 mL af stige med 20 µL af PAA).
  15. Tømme den øverste reservoir af apparatet gel med pre-Run 12% gel, og tilføje frisk 0,5 x TBE løsning under niveau af brøndene (brønde tømmes med en lang, tynd spids pipette).
    1. Indlæse prøver med en tynd pipette spids, som beskrevet i figur 3.
    2. Brug frisk 0,5 x TBE udfylde individuelle brønde til toppen af gelen.
    3. Tilføj frisk 0,5 x TBE til reservoir ovenfor brønde og start elektroforese af 12% side for 60 min. ved 450 V (~ 35 mA).
    4. Pause flugt ved at slukke generator for 10 min at køle gel ned. Genstart generator og Kør gelen i 60 min på 520 V (~ 25 mA).
  16. Stoppe generatoren, tømme reservoirerne af invertere apparater over en vask og uncast 12% side ved at fjerne en af glasplader.
  17. Sidde glas med flad gel, spray gel med 10 µL af den fluorescerende farvestof i 25 mL 0,5 x TBE, og der inkuberes i mørke for 5 min. lå glasset med gel på en blå lys transilluminator, og justere både 19 nt og begge 24 nt størrelse markører med en lineal til direkte excision af de sammenskrevne små RNA'er (figur 3).
    1. Punktafgifter gel og overføre skåret gel stykke til en 0,5 mL gel breaker tube. Luk hætten af gel breaker tube, sæt ind i en 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge rør, og sikkert med paraffin film. Fjerne gel breaker rør, tilsæt 300 µL af 300 mM NaCl og 1 µL af 100 µM 3' PCR primer til knust gel stykker i en 1,5 mL tube.
    2. Forsegle tube med paraffin film på agitation på en thermomixer på 1.100 rpm ved 4 ° C natten over (17-18 h) i et koldt rum.

5. reverse transkription af de 5' forbundet og 3' Barcoded renset små RNA'er

  1. Hent tube fra thermomixer og filter rense løsning med en 5 µM filter tube.
    1. Brug 1 mL pipette til at overføre løsningen på et 5 µM filter rør indsat i en 1,5 mL Silikoniseret RNase-fri collection tube. Centrifugeres tube for 3 min på 2.300 x g og RT.
    2. Kassér filter tube og tilføje 950 µL af 100% ethanol til 1,5 mL microcentrifuge collection tube indeholdende den filtrerede løsning. Vend røret til mix, centrifuge for 2 s, og sted på isen for 60 min. bundfaldet RNA pellet ved centrifugering tube på 16.000 x g og 4 ° C i 1 time.
  2. Tørre RNA pellet.
    1. Åbn fælles landbrugspolitik og fjern forsigtigt supernatanten med 1 mL pipette, forlader nogle væske i bunden.
    2. Bruge en 20 µL pipette til at fjerne alle resterende supernatanten uden at røre pelleten. Tilt rør til at tillade enhver løsning til at sidde på den modsatte side af toerstoffet.
    3. Bruge en Pasteur pipette med 10 mL ufiltreret pipette spids Aspirér supernatanten og tørre pellet ved hjælp af et vakuum.
  3. RNA resuspenderes i 5.6 µL af RNase-fri vand.
    1. Afrimning reverse transkription reagenser på isen i 15 min. sæt op en reverse transkription reaktion ved at tilføje 3 µL af 5 x Buffer, 4,2 µL af 10 x deoxynucleotide trifosfat (dNTP'er) (hver 2 mM) og 1,5 µL af dithiothreitol (DTT) til de 5,6 µL af RNase-fri resuspenderet pellet.
    2. Forsigtigt svirp rør for at blande reaktionen, og der centrifugeres i 2 s til at indsamle løsningen. Nedsat reaktion på en varme blok ved 90 ° C for præcis 30 s og derefter overføre direkte på en thermomixer på 50 ° C.
    3. Lade røret på thermomixer for 2 min, så temperaturen udligner. Tilføje 0,75 µL af reverse transkription enzymet direkte i løsning, flick forsigtigt at blande og sæt røret tilbage på thermomixer ved 50 ° C i 30 min straks.
  4. Efter 30 min, overføre røret til en varme blok ved 95 ° C i 1 min. at stoppe reverse transkription. Tilføje 95 µL af RNase-fri vand direkte til reverse transkription, svip røret til mix, og sæt det direkte på is i 2 min.
  5. Label tube med cDNA lager og biblioteket ID.

6. pilot PCR og storstilet PCR-amplifikation

  1. Forberede friske 10 x PCR buffer ved at tilføje 304 µL af RNase-fri vand, 125 µL af 2 M KCl, 50 µL 1 M Tris pH 8,0, 10 µL 1 M MgCl2, 5 µL af 1% Triton X-100 og 6 µL 1 M 2-mercaptoethanol i en Silikoniseret microcentrifuge tube , og holde på RT.
  2. Samle Pilot PCR reaktion ved at kombinere 67 µL af RNase-fri vand, 10 µL af 10 x PCR Buffer, 10 µL af 10 x dNTPs, 0,5 µL af 100 µM 5' PCR primer, 0,5 µL af 100 µM 3' PCR primer, 10 µL cDNA Stock bibliotek og 2 µL af 50 x Taq Polymerase.
    1. Oprettet to PCR cykler på en thermocycler som følger: fil 1: 94 ° C til 45 s, 50 ° C til 85 s og 72 ° C i 60 s til 10 cykler, holde ved 4 ° C; Fil 2: 94 ° C til 45 s, 50 ° C til 85 s og 72 ° C i 60 s til 2 cykler, holde ved 4 ° C. Oprette Pilot PCR reaktionen i thermocycler og start fil 1.
    2. I slutningen af filen 1, åbne PCR rør, og ved hjælp af en 20 µL pipette, overførsel 12 µL fra Pilot PCR reaktion til en 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende 3 µL af 5 x gel ladning farvestof, mix af pipettering op og ned, lukke røret , og navngiv den "10 cykler".
    3. Luk Pilot PCR rør og start filen 2 på en thermocycler. I slutningen af filen 2, åbne PCR rør og bruge en 20 mL pipette til at overføre 12 µL af løsning til 1,5 mL microcentrifuge tube med 3 µL af 5 x gel ladning farvestof, og navngiv den "12 cykler".
    4. Gentag trinene beskrevet i trin 6.2.2 og 6.2.3 at indsamle 12 µL PCR produkter fra Pilot PCR reaktion på PCR cyklus 14, 16, 18 og 20. Tilføje 3 µL af 5 x gel ladning farvestof til hver af de 12 µL PCR delprøver, og at 20 nt stigen indeholdende 3 µL af stigen og 9 µL af RNase-fri vand.
  3. Forberede en 2,5%-agarosegel med 0,5 x TBE.
    1. 2,5 g af Agarosen i en ren bægerglas og tilsættes 100 mL 0,5 x TBE. Opvarme løsning i en mikroovn, indtil det koger. Fjerne løsningen fra mikrobølgeovnen, swirl flaske for at blande agarosegelelektroforese, tilføje 4 μL af ethidiumbromid (10 mg/mL), og opløsningen overføres til en 7 x 10 cm2 elektroforese bakke, lukket i begge ender med tape.
    2. Angive en 8-godt kam og lad agarosegel størkne på RT. overførsel af størknet Agarosen gel i en elektroforese apparatet fyldt med 0,5 x TBE.
  4. Indlæse stigen og PCR prøver på agarosegel, og køre det i 30 min. ved 120 V.
  5. Evaluere gel på en UV for at identificere de optimale PCR cyklus (figur 4A).
    Bemærk: Størrelsen af de forventede PCR bands er vist i figur 4B.
    1. Observere de to PCR bands i hver af de forskellige brønde (øvre band: DNA bibliotek, lavere band: primer dimerer).
    2. Identificere den passende PCR cyklus for cDNA forstærkning ved at vælge den cyklus, hvor biblioteket cDNA er synlige, men primer-dimerer er næppe kan iagttages.
      Bemærk: Generelt, den passende PCR cyklus vælges mellem 12 – 16 cyklusser. På figur 4Aer den passende PCR cyklus for dette bibliotek 14.
  6. Oprettet de storstilede PCR reaktioner (6 x 100 µL) til Agarosen gel bibliotek rensning.
    1. Forberede en frisk tube 10 x PCR Buffer følgende trin 6.1.
    2. Forberede den store PCR Master Mix i 1,5 mL rør ved at kombinere 435.5 µL af RNase-fri vand, 65 µL af 10 x PCR buffer, 65 µL af 10 x dNTPs, 3.25 µL af 5' PCR primer, 3.25 µL af 3' PCR primer og pipettering op og ned for at blande.
    3. Overføre 88 µL PCR Master Mix til seks 0,5 mL PCR rør. Overfør 10 µL cDNA Stock bibliotek (opbevares på is), tilføje 2 µL af 50 x Taq polymerase i hver af de 6 PCR rør og afpipetteres for at blande.
    4. Forberede et negativt PCR reaktion rør ved at kombinere 77 µL af RNase-fri vand, 10 µL af 10 x PCR buffer, 10 µL af 10 x dNTPs, 0,5 µL af 5' PCR primer, 0,5 µL af 3' PCR primer og 2 µL af 50 x Taq polymerase og pipette til at blande.
    5. Placer PCR-rør i thermocycler ved hjælp af PCR cyklus beskrevet taktfast 6.2.1 og indstille det optimale antal forstærkning cyklusser. Forberede en 2,5% agarosegel bruger 0,5 x TBE, som beskrevet i trin 6.3.
  7. Efter PCR-amplifikation, overføre 9 µL fra hver PCR rør til seks 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende 3 µL af 5 x gel ladning farvestof.
    1. Forberede 20 nt stigen ved at kombinere 3 mL af stigen i 9 µL af RNase-fri vand og tilføje 3 µL gel ilægning farvestof i en 1,5 mL tube.
    2. Indlæse stigen, negativt PCR-kontrol og 6 PCR produkter på agarosegel, og Kør gelen i 30 min på 120 V.
    3. Kontrollere ensartethed af PCR klarlægger mellem baner på en UV boks (tage et billede).
    4. Kombiner 3 PCR reaktioner i to 1,5 mL Silikoniseret microcentrifuge tube (3 x 91 µL), tilføje 27 µL af 5 M NaCl og 950 µL af 100% ethanol. Invertere rør for at blande og sæt dem på-20 ° C natten over at udfælde PCR-produkter.

7. cDNA bibliotek rensning og evaluering

  1. Centrifugeres begge rør med PCR-reaktionerne på 16.000 x g for 60 min. ved 4 ° C.
  2. Fjern supernatanten med 1 mL pipette, og derefter vippe tube med pellet på oversiden og væske på den nedre side og bruge Pasteur pipette tilsluttet en sugekolbe med en balje og Opsug væske med 10 mL spids for enden af Pasteur pipette.
  3. Oprette PmeI fordøje.
    1. Resuspend en af PCR pellets med 17,5 µL nukleasen-gratis vand, og overføre den resuspenderede pellet til den anden PCR pellet. Tilføj 2 µL af 10 x Buffer og 0,5 µL af PmeI enzym, og sæt digest'en i et vandbad i 2 timer ved 37 ° C.
    2. Forberede en 2,5% agarosegel bruger 0,5 x TBE (trin 6.3). Tilføje 6 µL af 5 x gel ladning farvestof til at fordøje. Overføre 13 µL af hver digest i to tilstødende brønd af agarosegel, indlæse 20 nt størrelse stigen på udgangen wells og køre gel i 90 min ved 150 V (figur 4D).
    3. Punktafgifter de øverste PCR bånd fra gel på boksen UV, overføre gel stykker i en frisk vejede 1,5 mL microcentrifuge rør, og vejer gel stykker på en skala.
  4. Rense skåret PCR forstærket cDNA biblioteket ved hjælp af en gel udvinding kit efter fabrikantens anvisninger. Kvantificere cDNA biblioteket ved hjælp af et instrument, efter fabrikantens anvisninger og DNA kvantificering assay.
  5. Evaluering af størrelse og renhed af cDNA bibliotek med en høj følsomhed DNA chip på en Bioanalyzer (figur 5). Sekvens cDNA biblioteket ved hjælp af en høj overførselshastighed. Overføre filen FASTQ data til RNAworld pipeline for adapter trimning og tilpasning til det menneskelige genom til at identificere miRNA sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrevet i metoden her, ialt 18 individuelle FFPE RNA prøver (100 ng hver) er oprettet i separate rør til at gennemgå 3' adenylated barcoded oligonukleotid T4 ligatur natten over. Den næste dag, de enzymatiske reaktioner er varme-deaktiveret, kombineret, og udfældet i et enkelt rør. RNA pellet er genopslemmes og de sammenskrevne RNA molekyler er adskilt på en 15% denatureringen polyacrylamid gel (side), hvor RNA oligonukleotid størrelse markører, der overføres i tilstødende wells side gel, der anvendes til at vælge den passende størrelse 3' barcoded små RNA'er (figur 2). Skåret gel stykke er inkuberes i en NaCl løsning natten at eluere de sammenskrevne RNA molekyler. Den næste dag, den eluted RNA er fældet, og en 5' adapter ligatur udføres. Derefter, de 5' adapter forbundet små RNA-molekyler er migreret og adskilt på en 12% acrylamid gel, hvor igen overflyttede RNA størrelse markør oligonukleotider tillade størrelse excision af små RNA'er indeholdende både 3' barcoded oligonukleotider og 5'-adapter ( Figur 3). Skåret gelen er inkuberes natten over i en NaCl løsning at tillade eluering af RNA. Den næste dag, de sammenskrevne små RNA molekyler er bundfældet, og pellet er genopslemmes i RNase-fri vand, efterfulgt af reverse-transskription; en alikvot af cDNA molekyler gennemgår en pilot PCR reaktion (figur 4A). Storstilet PCR reaktioner ved hjælp af den samme input af cDNA-biblioteker er sat op og evalueret på en 2,5%-agarosegel at kontrollere at alle reaktioner var tilstrækkeligt PCR forstærket (figur 4B), før sammenlægning og natten ethanol nedbør. Den næste dag, forstærket cDNA bibliotek indeholdende alle 18 enkelte biblioteker for 18 unikke FFPE RNA enheder, overføres på en 2,5%-agarosegel, og den øverste PCR band, kører ved 100 nt er skåret ud og renset (figur 4 c). CDNA bibliotek rensning er derefter evalueres på en høj følsomhed DNA chip (figur 5) til at bestemme, at det rensede PCR produktet ikke indeholder et overskud af primer dimerer eller andre biprodukter af PCR reaktionen. PCR produkt er derefter analyseret på en høj overførselshastighed sekventering system. Adapter trimning og generation af 18 individuelle filer for hver af de 18 prøver udføres ved hjælp af RNAworld-rørledningen (adgang blev givet til os af Dr. Thomas Tuschl). Biostatistisk analyser udføres derefter for at evaluere miRNA indholdet af FFPE RNA prøver.

Til at validere dette optimeret procedure, matchede frisk frosset og FFPE bryst tumor enheder blev brugt til analyser (figur 6). To lignende invasive duktalt brysttumorer med carcinom (IDC) blev udvalgt til at evaluere følsomheden af proceduren og afgøre hvis miRNA udtryk forskelle identificeret mellem de to friske frosne væv kan også påvises i den matchede arkiveret FFPE RNA prøver. Kvaliteten af den samlede RNA fremstillet af 2 frisk frosset og de matchede to FFPE RNA prøver var vurderet til dette eksperiment (figur 6A). Som forventet, var RNA størrelsen og kvaliteten af FFPE prøver alvorligt faldt i forhold til de matchede frisk frosset RNA'er (Sammenlign baner 1 og 3, og baner 2 og 4). En af FFPE RNA havde blevet arkiveret på RT for 4 år (Invasive Breast Cancer 1, (IBC1)) og den anden var blevet arkiveret på RT for 8 år (IBC2), mens de friske frosne modparter havde været opbevares ved-80 ° C. De fire individuelle RNA prøver blev analyseret i et enkelt bibliotek, ved hjælp af 4 individuelle stregkoder og miRNA læse distribution parceller vises i figur 6B. De to top paneler vises miRNA udtryk korrelation mellem to friske frosne tumor RNA'er og deres specifikke FFPE RNA modellen modstykker. Observationsområderne mellem matchede frisk frosset og FFPE miRNAs indikerer at cDNA bibliotek forberedelse giver en god reproducerbarhed som en høj korrelation kan iagttages mellem miRNAs påvises i prøver behandles forskelligt (frosne vs FFPE). De to nederste paneler viser sammenhængen mellem miRNA udtryk data fra to forskellige frosne tumorer og mellem de to forskellige FFPE tumorer. Som anført i figur 6 c, var miRNA udtryk forskelle identificeret mellem de to friske frosne tumorer korreleret med forskelle fundet mellem de to matchede FFPE tumor prøver. Betydning miRNA udtryk forskellene var påviselige både i frisk frosset og FFPE tumorer.

Yderligere evaluering følsomheden af denne tilgang, miRNA udtryk data fra 12 arkiverede FFPE prøver og 4 friske frosne RNA prøver blev brugt (figur 6D). De 16 forskellige RNA prøver var individuelt 3' barcoded og alle, der anvendes til fremstilling af en enkelt cDNA bibliotek. RNA prøver, der indgår i dette bibliotek inkluderet to bryst cellelinjer, MCF10A (normal-lignende cellelinje) og MCF7 (bryst cancer cellelinie) med RNA fra friske celler og deres arkiverede FFPE modparter23, matchede frisk frosset og FFPE RNA prøver fra to brystkræft prøver analyseres uafhængigt (IBC1 og IBC2 i figur 6A og 6B), og matchet frisk frosset og FFPE RNA prøver fra normale cervikal prøver (Cx). Derudover blev arkiverede FFPE prøver fra normal (normal Br1, normal Br2 og normal Br3) og kræft bryst væv (IBC 5, IBC 6 og IBC 7), uden at deres friske frosne modstykker analyseret. Som observeret på heatmap, uanset frisk frosset eller FFPE RNA oprindelse, miRNA udtrykket profiler af de samme celler (MCF10 eller MCF7), eller de samme væv (IBC1, IBC2 eller Cx) grupperet sammen. Derudover som nævnt på uovervåget klyngen, fra venstre mod højre, normal brystkræft celler og væv grupperet sammen mens brystkræft og tumorceller grupperet til højre. Den cervikale væv, som vises en anden miRNA udtryk profil, grupperet til højre for heatmap.

I betragtning af at de fleste af klinisk arkiverede FFPE enhederne ikke har frisk frosset modparter men, kan de hentes efter forskellige storage varighed, det var søgt at bestemme hvis optimeret cDNA bibliotek forberedelse protokol var gældende og reproducerbare med mere og mere ældre FFPE prøver. Som vist i figur 7, miRNA udtryk profiler fra FFPE væv arkiveret til 18, 20, 22, 27, blev 30 og 35 år indhentet. RNA blev udvundet ved hjælp af den optimerede samtidige RNA/DNA procedure21, og Firling RNA delprøver fra hver enkelte FFPE modellen var forberedt på den samme dag og opbevares ved-80 ° C før bibliotek præparater. Ialt 9 forskellige FFPE prøver blev analyseret i to eksemplarer, hvor hver enkelte RNA alikvot var forbundet med forskellige barcoded oligonukleotider (18 stregkoder samlede), i det samme bibliotek. Dette eksperiment blev gentaget i to på hinanden følgende uger (uge 1 og uge 2). Dette tillod evaluering af cDNA bibliotek forberedelse reproducerbarhed med de samme RNA prøver ved hjælp af to forskellige stregkoder i et enkelt bibliotek, og mellem to forskellige biblioteker med en uges interval. Som observeret på figur 7, forblev korrelationskoefficienten over 0,96 uanset alder af modellen eller bibliotek forberedelse uge; Derfor optimeret cDNA bibliotek forberedelse protokollen giver en robust værktøj for reproducerbare analyse af FFPE enheder uanset deres arkivers tid, for eksempel den 35-årige arkiverede FFPE RNA (Se bryst #9) vises høj reproducerbare foranstaltninger svarende til dem, bemærkede med de 20-årige FFPE RNA prøver (Se bryst #3).

Figure 1
Figur 1: oligonukleotider. Alle oligonukleotid sekvenser, deres tilsvarende kemiske ændringer, og koncentrationerne anvendes i denne protokol er beskrevet. Typer af kemiske ændringer er beskrevet i boksen modifikation og de forkortede ændringer vises i oligonukleotid sekvenser. Kalibrator cocktail viser listen over de 10 individuelle RNA oligonukleotid kalibratorer, som var genopslemmes i en opløsning indeholdende carrier oligonukleotid (0,5 µM). De atten 3' barcoded oligonukleotid adaptere er detaljeret med grå skygge over at stregkode sekvens. RNA-sekvens af 5'-adapter, og DNA-sekvenser i 3' PCR og 5' PCR primere er detaljerede. RNA sekvenser af to størrelse markør oligonukleotider, nemlig refereret i protokollen som 19 nt-3' adapter og 24 nt-3' adapter størrelse markører, der tilbydes. Alle DNA og RNA-oligonukleotider var kommercielt købt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: side rensning af 3' barcoded RNA prøver. Efter sammenlægning og fældningen 18 barcoded RNA prøver, den resuspenderet pellet beregnes RNA er migreret og adskilt af elektroforese på en 15% acrylamid gel (se godt 8). Den røde firkant fremhæver det område, der indeholder 3' barcoded MicroRNA, som var skåret ud med en skalpel klinge og overføres til en nukleasen-fri Silikoniseret microcentrifuge tube. Ialt fire brønde, med to indeholdende den 19 nt-3' adapter og to indeholdende den 24 nt-3' adapter blev sat et godt væk, på hver side af biblioteket (Se brønde 5, 6 og 10, 11, henholdsvis). Som en test for T4 RNA ligase 1 og til rensning af den sammenskrevne størrelse markører til at være afsluttet den næste dag, ligatur reaktioner indeholdende den 19 nt-3' adapter størrelse markør med 5'-adapter og den 24 nt-3' adapter størrelse markør med 5' adapter blev kørt i brønde 2 en d 3, henholdsvis. De gule felter viser skåret bands der repræsenterer sammenskrevne størrelse markør RNA-oligonukleotider med 5' adapter. Disse bands er renset, fældet, og løbet på 12% af side rensning (Se figur 3 nedenfor). Brønde 1 og 13 indeholder 20 nt størrelse stigen, som hjalp bekræfte de forventede størrelser af de sammenskrevne produkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: side rensning af renset biblioteket efter ligatur af 5' adapter. Den oprensede RNA bibliotek var forbundet med 5' adapter og den forventede produktstørrelse var skåret ud fra 12% side ved hjælp af de sammenskrevne størrelse markører (Se rød firkant). Produkter af T4 RNA ligations mellem den 19 nt-3' adapter og 5'-adapter (wells 4 og 9) og mellem de 24 nt-3' adapter og 5'-adapter (wells 5 og 10) blev kørt parallelt på hver side af den godt der indeholder biblioteket RNA. De højeste bands (Se hvide stjerner) er produkter af 5' adapter ligatur og bruges som guide til gel band excision indeholdende 5' adapter forbundet RNA bibliotek. Ligatur størrelse markør ligatur produkterne renset på den foregående side køres i godt 3. Som observeret i wells 1 og 12, blev 20 nt størrelse stigen også kørt hen til efterprøve den forventede størrelse af RNA bibliotek. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Pilot PCR og storstilet udbygning af biblioteket cDNA. Størrelse og forholdet af PCR produkter blev evalueret på en 2,5%-agarosegel i overværelse af ethidiumbromid. (A) efter reverse transkription af biblioteket barcoded RNA, en alikvot af cDNA bibliotek blev forstærket ved hjælp af 5' og 3' PCR primere i en enkelt pilot PCR reaktionen. Delprøver af pilot PCR reaktioner var opnået på 10, 12, 14, 16, 18 og 20 cykler og overføres på en 2,5% agarosegel. Som observeret mellem wells 1 og 7, tilstedeværelsen af cDNA bibliotek og adapter dimerer var eksponentielt observerbare (Se grøn rektangler). For dette bibliotek var PCR cyklus valgt til forstærkning af cDNA bibliotek 15. (B) denne skematiske viser placering og længde af de forskellige oligonukleotider og de resulterende RNA og DNA produkter, som kan identificeres på de side og Agarosen geler. (C) delprøver af de 6 store PCR reaktioner (identificeret i A) blev analyseret hver for sig på en 2,5% Agarosen gel (Se wells 3 til 8). De to typer af PCR produkter, nemlig bibliotek (øvre band) og primere dimerer (lavere band) er synlige på denne gel (Se grøn rektangler). Tom PCR reaktionen uden cDNA viser ingen PCR-amplifikation (se godt 2). 20 nt størrelse stigen giver mulighed for verifikation af produktstørrelser (se godt 1). (D) Gel billede på en blå lys transilluminator af 2,5% Agarosen gel, der indeholder de poolede PCR reaktioner løb i to tilstødende brønde. Som bemærket, den højeste band i både brønde er inden for den forventede bibliotek størrelse og adapter dimer band er placeret under. De øverste PCR-bands var skåret ud og renses med en gel udvinding kit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: vurdering af renset PCR forstærket DNA bibliotek. En lille alikvot (1 µL) af PCR forstærket cDNA bibliotek er analyseret ved hjælp af en høj følsomhed DNA chip på et mikrofluidik-baseret platform. (A) dette panel viser migration af størrelse markører for kalibrering af instrumentet. (B) dette panel viser migration af renset PCR forstærket cDNA bibliotek. Det højeste er målt på en størrelse på 100 bp (Se asterisk) og repræsenterer cDNA biblioteket. Den lille peak evalueres på 72 bp af instrumentet repræsenterer primer adapter dimerer. De 100 bp peak opdaget af mikrofluidik baseret platform afslører den skønnede størrelse for det forstærkede cDNA bibliotek, som indeholder 18 enkelt barcoded RNA prøver til efterfølgende NGS på en høj overførselshastighed sekventering system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: cDNA bibliotek forberedelse og næste generation sequencing bruger matchede frisk frosset og formalin-fast paraffin indlejrede enheder. (A) Total RNA ekstraheret fra matchede frisk frosset og FFPE invasive duktalt carcinom (IDC) tumorer blev analyseret på en total RNA chip på et mikrofluidik baseret platform. (B) samlede RNA fra matchede frisk frosset og FFPE prøver (IBC 1 og IBC2) gennemgik cDNA bibliotek forberedelse protokol og miRNA sequencing data var afbildet. (C) DifferentialmiRNA udtryk mellem enheder, IBC1/IBC2 og korrelation mellem frosne og FFPE parret prøver. miRNA udtryk vises i log count per million (CPM), fra høj til lav læser (rød til blå farve). Betydningen af udtryk forskellen mellem to væv par pr. miRNA, vises som grå cirkler, med høj og lav udtryk miRNAs identificeret i frisk og FFPE prøver. (D) Total RNA ekstraheret fra matchede frisk og FFPE RNA prøver af celle linier (MCF10A og MCF7), menneskelige invasive breast cancer (IBC 1 og IBC2), cervikal brystvæv (Cx), arkiveret normale bryst væv (normal Br1, normal Br2 og normal Br 3), og arkiverede invasiv brystkræft (IBC 5, IBC 6 og IBC7) gennemgik cDNA bibliotek forberedelse inden for samme flugt. NGS data af miRNAs opdaget i bibliotekerne vises i en zonekort konfiguration. Dette tal er blevet ændret fra Loudig et al. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: cDNA bibliotek forberedelse og miRNA udtryk korrelation mellem replikater bruger ældre arkiverede FFPE eksemplarer. Total RNA fra 18, 20, 22, 27, 30 og 35-årige arkiverede FFPE bryst væv prøver gennemgik vores optimeret cDNA bibliotek forberedelse protokol. Repliker RNA prøver fra 9 forskellige FFPE prøver var forbundet med forskellige 3' barcoded oligonukleotider og analyseres inden for det samme bibliotek på uge 1 (w1). Samme eksperimentet blev gentaget i en uges interval (uge 2 eller w2). Reproducerbarhed foranstaltninger af duplikerede miRNA udtryk data mellem de samme arkiverede RNA prøver vises i heatmaps og med korrelationskoefficienter evalueret mellem 0,93 og 0,99. Dette tal er blevet ændret fra Loudig et al. 20 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En meget reproducerbare og robust cDNA bibliotek forberedelse protokol til NGS af små RNA'er arkiveret i FFPE RNA prøver er præsenteret i denne protokol, som er en modificeret og optimeret version af proceduren beskrevet af Hafner et al. 22

Alle trin i denne protokol er blevet optimeret til brug med ældre arkiverede og kompromitteret total RNA inddrives fra FFPE prøver. Det vigtigste skridt i denne protokol, for behandling af små mængder af FFPE RNA, er bosat i en sammenlægning af alle RNA prøver (dvs., 18 individuelle 100 ng FFPE RNA prøver) efter individuelle ligations med 18 unikke 3' barcoded adaptere. Dette kritiske trin giver mulighed for de 18 FFPE RNA prøver underkastes ensartet alle efterfølgende biokemiske og enzymatiske nødvendige skridt til forberedelse af den lille RNA cDNA bibliotek. Derudover dette trin maksimerer mængden af RNA under nedbør og gel purifications ved at forbedre carrier effekt af de lille RNA molekyler og ved at lette pellet observation og gel valg. Et andet centralt element i denne protokol, som yderligere fremhæver sin alsidighed, når du arbejder med små mængder af FFPE RNA, er, at en pilot PCR reaktionen bruges til at identificere den optimale forstærkning cyklus af cDNA bibliotek. Dette trin giver også indsigt i dynamikken i biblioteket forstærkning versus primer dimer forstærkning, som er kritiske, når forbereder den storstilede PCR reaktion og rensende små RNA biblioteket på Agarosen gel. De data, der er føjet til denne protokol demonstrere reproducerbarhed af denne tilgang mellem matchede frosne og FFPE prøver, og også fremhæve dets anvendelighed til ældre FFPE RNA prøver fra prøver arkiveret i op til 35 år.

Denne protokol er blevet ændret fra den oprindelige version, så det er optimeret til forberedelse af små RNA biblioteker lavet af lavere kvalitet og kvantitet af kemisk modificerede og kompromitteret FFPE RNA. Et aspekt af denne procedure, der blev ændret for at med held ligate og forstærke små RNA'er fra FFPE enheder vedrører mængden af kalibrator cocktail spiked under den indledende 3' barcoded adapter ligatur, som input blev reduceret til 0.026 nM-forhindre konkurrence med ligatur af lav overflod små RNA'er præsentere i FFPE RNA prøver. En anden vigtig ændring til den oprindelige procedure var fjernelse af alle radioaktivt mærket størrelse-markører, der anvendes under udvælgelsen af de sammenskrevne små RNA'er på side geler. Brug af disse radiolabeled størrelse-markører ikke kun er begrænset anvendeligheden af denne tilgang til laboratorier, der er certificeret til brug af radioaktive isotoper, men også forhindret observation af RNA produkter på geler. I stedet i denne optimerede protokol, er størrelse markører indkøre wells støder op til biblioteket, på side gel, og visualiseret direkte med et fluorescerende farvestof til direkte excision af de sammenskrevne små RNA'er. Vigtigere, er den fluorescerende farvestof let sprayes på gel til at forhindre udbredelsen af RNA produkter og derefter visualiseres på en blå lys boks. Efterfølgende, som en foranstaltning af forsigtighed og at forbedre udbredelsen af de sammenskrevne små RNA'er indeholdt i skåret side gel fragmenter, anvendes gel-breaker rør ensartet knuse gel før inkubation i en NaCl løsning natten over ved 4 ° C under agitation. Alle disse trin blev omhyggeligt evalueret for at arbejde med mindre mængder af materiale.

Denne protokol blev anvendt til FFPE RNA prøver fra forskellige kilder (organer og institutioner), der havde været gemt for forskellige mængder af tid. Analyserne afslørede høj reproducerbarhed sekventering små RNA'er fra ferske og frosne prøver, når ved hjælp af dette optimeret procedure. Supplerende analyser ved hjælp af ældre arkiverede FFPE prøver, opbevares i op til 35 år, finpudset af protokollens store anvendelighed til kliniske prøver. FFPE RNA input minimumskravet til FFPE prøver viste sig at være 100 ng. Dette lave krav giver mulighed for anvendelse af denne protokol til en bred vifte af læsioner i forskellige størrelser og tilgængelighed, men det ville ikke give analyse af enkelt celle FFPE RNA. Det er vigtigt at bemærke, men at dette optimeret protokol har også været brugt med total RNA ekstraheret fra cirkulerende exosomes med input af mindre end 1 ng og vist sig for at give meget reproducerbare små RNA udtryk profiler (data ikke vist). Denne lave input tyder på, at små RNA'er i FFPE prøver, skønt repræsentativ for den oprindelige frisk væv, er til stede i meget mindre omfang end i total RNA fra cirkulerende exosomes.

I de seneste arbejde, hvor denne optimerede protokol blev anvendt klinisk klassificerede DCIS FFPE enheder, konstateredes det, at miRNA udtryk forskelle identificeres ved NGS af cDNA biblioteket kunne valideres af kvantitativ PCR. Dette arbejde demonstreret mulighederne for ved hjælp af DCIS-læsioner fra arkiverede væv fra forskellige institutioner for store retrospektive undersøgelser [20]. Denne undersøgelse også fremhævet robustheden af denne cDNA bibliotek forberedelse når udføres på forskellige tidspunkter (i intervaller på flere uger), uden at kompromittere reproducerbarhed og følsomhed af analysen.

I betragtning af den enorme mængde af klinisk klassificerede arkiverede FFPE enheder indeholder denne optimerede protokol en robust værktøj til forberedelse af cDNA-biblioteker i store retrospektive analyser og potentielle identifikation af miRNA biomarkører forbundet med kræft udvikling21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ønsker at oplyse, at en publikation, der indeholder nogle af de data, der præsenteres i dette manuskript blev offentliggjort i International Journal of Molecular Sciences af Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Thomas Tuschl, leder af laboratoriet for RNA molekylær biologi, samt medlemmer af hans laboratorium for deres støtte og for at dele teknologi udviklet i hans laboratorium og giver adgang til RNAworld-rørledningen. Vi takker også Dr. Markus Hafner til at dele hans protokol og giver detaljerede beskrivelser på alle biokemiske og enzymatiske trin bruges i hans indledende procedure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10, (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8, (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7, (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58, (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42, (12), 1911-1922 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics