Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

Genetics

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Summary

Esemplari di paraffina-incastonati formalina-fisse rappresentano una preziosa fonte di biomarcatori molecolari delle malattie umane. Qui presentiamo un protocollo di preparazione libreria cDNA laboratorio-basato, inizialmente progettato con RNA congelato fresco e ottimizzato per l'analisi dei microRNA archiviati dai tessuti stored fino ai 35 anni.

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Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

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Abstract

– Archiviata, clinicamente classificati formalina tessuti paraffina-incastonati (FFPE) è in grado di fornire acidi nucleici per studi retrospettivi molecolari dello sviluppo del cancro. Utilizzando lesioni non invasive o pre-maligne da pazienti che successivamente sviluppano la malattia invasiva, analisi di espressione genica possono contribuire ad identificare le alterazioni molecolari iniziali che predispongono al rischio di cancro. È stata descritta bene che gli acidi nucleici recuperati dai tessuti FFPE hanno subito gravi danni fisici e modificazioni chimiche, che rendono difficile la loro analisi e generalmente richiede dosaggi adattati. I microRNA (Mirna), tuttavia, che rappresentano una piccola classe di molecole di RNA che coprono solo fino a ~ 18 – 24 nucleotidi, hanno dimostrato di resistere a deposito a lungo termine e sono state analizzate con successo in campioni FFPE. Qui presentiamo un 3' con codice a barre del DNA (cDNA) Biblioteca preparazione protocollo complementare specificamente ottimizzato per l'analisi di piccole molecole di RNA estratto dai tessuti archiviati, che recentemente è stata dimostrata per essere robusto e altamente riproducibile quando utilizzando archiviati campioni clinici memorizzati fino a 35 anni. Questa preparazione di libreria è ben adattata per l'analisi multiplex del materiale compromessa/degradato dove campioni di RNA (fino a 18) sono legati con singoli 3' adattatori con codice a barre e poi sommati insieme per le successive preparazioni enzimatiche e biochimiche prima dell'analisi. Tutte le purificazioni vengono eseguite mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (pagina), che consente dimensioni specifiche selezioni e arricchimenti di piccole specie di RNA con codice a barre. Questa preparazione di libreria di cDNA è ben adattata al minuto ingressi di RNA, come un pilota catena della polimerasi (PCR) consente la determinazione di un ciclo di amplificazione specifica di produrre quantità ottimale di materiale per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questo approccio è stato ottimizzato per l'uso di RNA FFPE degradato dagli esemplari conservati per fino a 35 anni e fornisce dati NGS altamente riproducibili.

Introduction

Mirna sono straordinariamente ben conservati in formalina-fisso paraffina (FFPE) esemplari1,2,3. Lavoro precedente ha dimostrato che l'espressione di queste breve non codificanti singolo incagliato RNA molecole regolatorie possono essere correttamente valutate utilizzando RNA totale da campioni FFPE e fornire dati di espressione genica rilevanti rispetto ai freschi originale tessuti4,5,6,7,8. Rispetto al RNA messaggeri di grandi dimensioni, che hanno dimostrato di essere interessati in modo critico da FFPE processazione dei tessuti (formaldeide, calore, essiccazione, ecc.), RNasi endogene e l'età dei campioni, le piccole dimensioni dei miRNA (~ 18 – 24 nucleotidi) appare per renderli resistenti alla degradazione e resiliente per immagazzinaggio a lungo termine, hanno dimostrato attraverso studi di espressione di miRNA che superano le prestazioni studi di mRNA di alto-rendimento archiviati esemplari9. studi di espressione di miRNA utilizzando campioni clinici archiviati, che sono stati effettuati principalmente nelle analisi su piccola scala, hanno dimostrato quel singolo o multiplex analisi quantitative di PCR, diversi tipi di tecnologie di microarray e, più recentemente, NGS può essere usato per valutare l'espressione dei miRNA conservati dopo l'ottimizzazione di questi saggi10,11,12,13,14.

Dato che la disregolazione dell'espressione dei miRNA è stata associata con lo sviluppo di una varietà di malignità umane e che c'è potenzialmente un enorme apporto di clinicamente annotato archiviati esemplari, è diventato evidente che questi piccoli RNA molecole rappresentano una promettente fonte di potenziale cancro biomarkers15,16,17,18. L'uso di una tecnologia di espressione genica di alto-rendimento come NGS ha il vantaggio di fornire una valutazione globale di tutte le trascrizioni di miRNA rispetto a tecnologie mirate come PCR e/o microarrays19. Per questo motivo, un protocollo ottimizzato, accessibile e facilmente applicabile per la preparazione di libreria di cDNA di piccoli RNA da esemplari più vecchi archiviati per NGS è stato ottimizzato per consentire studi retrospettivi su larga scala20.

Precedentemente abbiamo stabilito un protocollo di estrazione di RNA/DNA simultaneo per recupero separato del RNA e DNA da esemplari più vecchi archiviati, che abbiamo trovato a sovraperformare contemporanea kit commerciali21. Usando questo protocollo di estrazione, per ottenere il RNA totale da tessuti FFPE archiviati per un periodo prolungato di volte, abbiamo ottimizzato la preparazione di librerie di cDNA per NGS di Mirna conservati nei campioni clinici per fino a 35 anni. Inoltre, in uno studio recentemente pubblicato, dove, abbiamo preparato le librerie di cDNA da classificate clinicamente il carcinoma duttale in situ esemplari (DCIS), abbiamo identificato Mirna differenzialmente espressi sono stati convalidati mediante PCR quantitativa, che indicava che cambiamenti di espressione di miRNA specifici possono essere rilevabili nelle lesioni DCIS da pazienti che sviluppano il cancro al seno rispetto alle lesioni DCIS da pazienti che non sviluppano il cancro al seno.

Considerando il costo del kit commerciali per la preparazione di piccole librerie di cDNA di RNA, il potenziale per la loro sospensione, così come l'uso di reagenti protetta da copyright/brevetto che non può essere ottimizzata, abbiamo deciso di adattare un precedentemente pubblicati laboratorio-basato e kit-gratuita 3' protocollo di preparazione libreria cDNA da codice a barre per NGS di piccoli RNA archiviata negli esemplari di FFPE, che permette l'analisi simultanea di 18 campioni22. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata ideale e robusta con i checkpoint di valutazione visiva e tecnica, che erano critici per l'adattamento ai campioni FFPE RNA, e ha un forte potenziale per applicazione ad altre fonti di difficile o compromessa utilizzare materiale di RNA. Applicabilità del protocollo originale è stato migliorato sostituendo marcatore radioattivo etichettato con fluorescenti (ad es., SYBR Gold) indicatori di dimensione RNA rilevabili utilizzati durante la selezione delle librerie legate sul grande gel di poliacrilammide. Questo protocollo ottimizzato si basa sulla legatura della 3' adattatori con codice a barre a 18 singoli campioni FFPE RNA, che sono poi riuniti insieme per subire la legatura 5' adattatore, d'inversione-trascrizione e un'analisi PCR pilota per amplificazione del cDNA finale su misura Biblioteca prima dell'amplificazione PCR su larga scala, purificazione e NGS su un sequencer a resa elevata.

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Protocol

1. preparazione di tutti i reagenti e primer

  1. Ordinare tutti i primer e adattatori come descritto nella Figura 1.
  2. Preparare il calibratore cocktail stock, che potranno essere a spillo in ogni legatura individuo.
    1. Risospendere il oligonucleotide di vettore (Figura 1) a 0,5 µM con acqua RNAsi-libera. Risospendere i oligonucleotides di calibratore 10 (Figura 1) a 100 µM utilizzando la soluzione di oligonucleotide di 0,5 µM vettore.
    2. Unire 10 µ l di ciascuno dei 10 calibratori in una microcentrifuga siliconato per ottenere uno stock di cocktail calibratore 100 µM e preparare una soluzione di nM 0,026 per conservare a-20 ° C.
  3. Diluire il adenylated unico, liofilizzata, 20 3' schede con RNAsi-libera di acqua ad una concentrazione finale di 50 µM (Figura 1).
    Nota: Si consiglia di preparare aliquote di 2,5 µ l da ogni scheda in singole provette siliconati e conservarli a-80 ° C fino a 2 anni.
  4. Risospendere il dissalate nt-19 3' adattatore e nt-24 3' oligonucleotidi di marcatore Dimensioni adattatore a 250 ng/mL (Figura 1).
  5. Risospendere la scheda di HPLC purificato da 5' a 100 µM con acqua RNAsi-libera. Risospendere i primer PCR 5' e 3' a 100 µM utilizzando acqua RNAsi-libera (Figura 1).
    Nota: Aliquota tutti i oligonucleotides nelle quantità necessarie per 1 – 2 esperimenti e conservare a-80 ° C.
  6. Preparare il poliacrilammide denaturante gel (PAA) tintura di caricamento combinando 98,8% formammide, 1% (v/v) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 e 0,2% blu di bromofenolo e impostare aliquote di 1 mL a-80 ° C.
    1. Preparare la soluzione di EDTA 0.5 M Na2H2 aggiungendo 18,6 g di Na2H2 EDTA in polvere a 50 mL di acqua priva di nucleasi. Aggiungere pellet di NaOH per raggiungere pH 8.0. Regolare il volume a 100 mL per ottenere un 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 soluzione stock.
    2. Pesare 15 mg di bromofenolo in un tubo separato da 15 mL. Aggiungere 600 µ l di acqua priva di nucleasi. Aggiungere mL 14,25 di formammide deionizzata. Aggiungere 150 µ l di 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 soluzione.
    3. Aliquotare la soluzione finale di PAA da 15 mL in aliquote di 1 mL a-80 ° C.
  7. Preparare il 5 x gel dell'agarosi della tintura di caricamento combinando blu di bromofenolo 0,2%, 0,2% xilene cianolo FF, Na2H2 EDTA, pH 8.0 e 20% tipo di Ficoll-400.
    1. Risospendere 1,86 g di Na2H2-EDTA in 50 mL di acqua priva di nucleasi in un becher da 400 mL su un agitatore magnetico a temperatura ambiente (TA). Aggiungere pellet di NaOH per raggiungere un pH 8.0. Aggiungere acqua priva di nucleasi per raggiungere 100 mL per ottenere un 50 mM Na2H2 EDTA soluzione.
    2. Pesare 20 mg di polvere di blu di bromofenolo, 20 mg di polvere di xilene cianolo FF e 2 g di polvere di tipo Ficoll-400 e risospendere in 5 mL di Na2H2 EDTA.
    3. Vortex la provetta contenente i tre coloranti e aggiungere 5 mL di 50mm Na2H2 EDTA. Mescolare la tintura 5 x agarose gel di caricamento, preparare aliquote di 1ml e conservare a-80 ° C.

2. impostare i 3' codice a barre adattatore legature con 18 campioni di RNA individuali

  1. Identificare 18 singoli campioni di RNA (pre-aliquotato a 100 ng in 9,5 µ l di acqua priva di nucleasi in provette per microcentrifuga da 1,5 mL siliconata) e impostare i tubi sul ghiaccio per scongelare per 10 min.
  2. Preparare i 10 x fresco RNA ligasi Buffer (senza ATP).
    1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL siliconato, combinare 343 µ l di acqua RNAsi-libera, 500 µ l di Tris 1 M pH 7.5, 100 µ l di 1 M MgCl2, 50 µ l di albumina di siero bovino di 20 mg/mL e 7 µ l di 14 M 2-mercaptoetanolo. Mix, spostando il tubo, centrifuga per 2 s a 2.000 x g e RT e su ghiaccio.
      Nota: Tutti i punti in questo protocollo che indicano "centrifuga per 2 s" vengono eseguiti in una microcentrifuga da banco a RT e una velocità massima di 2.000 x g per raccogliere soluzioni alla parte inferiore dei tubi.
  3. Preparare 50% acquosa DMSO brodo aggiungendo 1 mL di RNAsi-libera dell'acqua a 1 mL di DMSO in un tubo del microcentrifuge 2ml siliconato, avvolgere il tubo in alluminio e archiviare a TA.
  4. Sbrinare il cocktail di calibratore nM 0,026 in ghiaccio per 10 min. Prepare la legatura Master Mix combinando nel seguente ordine in una microcentrifuga da 1,5 mL siliconata: 40 µ l di 10 x RNA ligasi Buffer e 120 µ l di 50% DMSO acquosa utilizzando una pipetta 200 mL , e aggiungere 10 µ l di calibratore di nM 0.026 cocktail usando una pipetta di 10 µ l. Scorri la provetta da 1,5 mL per mescolare, centrifugare per 2 s e insieme sul ghiaccio.
  5. Aggiungere 8,5 µ l di legatura Master Mix per ciascuno dei 18 campioni FFPE RNA individualmente aliquotati, spostare delicatamente a scatti i tubi, centrifugare per 2 s e archivio sul ghiaccio.
  6. Le aliquote da ciascuna delle 18, schede con codice a barre 3' 2,5-µ l di sbrinamento e metterli sul ghiaccio per scongelare per 20 min.
    1. Utilizzare una pipetta 3-µ l per trasferire 1 µ l di ogni scheda ai campioni FFPE RNA corrispondenti contenente RNA e legatura Master Mix (cioè, µ l 9,5 + 8,5 µ l).
    2. Non pipettare su e giù, semplicemente dispensare nel liquido ed estrarre la punta. Assicurarsi di modificare suggerimenti tra i campioni di RNA FFPE. Chiudere ogni tubo, scorri per miscelare, centrifugare per 2 s e su ghiaccio.
  7. Denaturare le reazioni inserendo i 18 tubi su un blocco di calore a 90 ° C per 1 min e poi collocare immediatamente sul ghiaccio.
  8. Preparare la soluzione di enzima legatura da diluire 10 µ l di troncato K227Q T4 RNA ligasi 2 con 10 µ l di RNAsi-libera dell'acqua in un tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL siliconato.
  9. Utilizzare una pipetta di 3 µ l per trasferire 1 µ l di enzima legatura diluito in ciascuno dei 18 campioni di RNA (non pipettare su e giù e cambiare suggerimenti tra ciascuna provetta). Impostare i 18 legature sul ghiaccio e posto in una camera fredda a 4 ° C per un'incubazione overnight di 18 h.

3. la purificazione della dei piccoli RNA

  1. Disattivare le reazioni di legatura inserendo i 18 tubi per 1 minuto su un blocco di calore a 90 ° C e poi tornare a ghiaccio per almeno 2 minuti raffreddare.
  2. Preparare la miscela di precipitazione Master aggiungendo 1 µ l di colorante blu legata covalentemente ad glicogeno a 26 µ l di NaCl 5 M RNAsi-libera in una microcentrifuga siliconato fresco.
    1. Trasferire 1,2 µ l di precipitazione Master Mix in ciascuna delle 18 provette. Aggiungere 63 µ l di etanolo al 100% a ciascuno dei 18 tubi. Chiudere ogni tubo, scorri fino a mescolare, centrifugare per 2 s e posto i tubi sul ghiaccio. Combinare il contenuto di tutti i 18 tubi in una provetta singola 1,5 mL siliconato.
    2. Tappare la provetta, invertire tre volte per mix, centrifuga per 2 s e posto in ghiaccio per 60 min a precipitare.
  3. Preparare un gel di poliacrilammide di 15% (16 x 20 cm2) grande per pagina.
    1. Due cast siliconate tra lastre di vetro (trattati con una sicura alternativa ai rivestimenti di silano) con distanziali di 0,1 cm.
    2. Combinare 9 mL di diluente sistema, 18 mL di concentrato di sistema, 3 mL di buffer di sistema, 240 µ l di APS (9%) e 12 µ l di TEMED in una provetta da 50 mL.
    3. Trasferire la soluzione di gel di pagina tra lastre di vetro utilizzando una pipetta 30 mL, inserire un pettine 14-pozzo (0,1 cm di spessore) e lasciare che il gel si solidificano alla RT per 30 min.
  4. Centrifugare la provetta da 1,5 mL con le legature in pool a 16.000 x g e a 4 ° C per 60 min.
  5. Rimuovere il pettine. Pulire i pozzetti abbondantemente con acqua RNAsi-libera utilizzando una spruzzetta con una mancia di 200 µ l alla sua fine per raggiungere l'interno dei pozzetti e forzare acrilammide non polimerizzato (bene uno alla volta) sopra un lavandino. Impostare il 15% di pagina su un apparato di gel, riempire i serbatoi con 0,5 x soluzione Tris-Borato EDTA (TBE) e pre-corsa il gel per 30 min a 450 V.
  6. Recuperare il tubo con legature in pool dalla centrifuga e asciugare accuratamente la pallina del RNA.
    1. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1 mL, ma lasciare un po' di liquido sul fondo. Inclinare il tubo e utilizzare una pipetta 20 mL per rimuovere il surnatante rimanente senza toccare il pellet. Vuoto di aspirazione tubo usando una pipetta Pasteur con una mancia di 10-µ l sulla sua estremità, senza toccare il pellet.
    2. Risospendere il pellet di RNA in 20 µ l di acqua RNAsi-libera, spostando il tubo. Aggiungere 20 µ l di soluzione per risospendere il RNA, scorri per mescolare di caricamento del gel PAA, centrifuga per 2 seduti RT e impostata il tubo a 90 ° c per 1 min e poi collocare immediatamente sul ghiaccio.
  7. Sostituisci il 0,5 x TBE dell'apparato gel fresco 0,5 x TBE e carico la scala, gli indicatori di dimensione e dei miRNA nel centro del gel, lasciando vuota 2 pozzi su entrambi i lati (Figura 2).
  8. Esegua il gel a 450 V (35 mA) per 60 min, mettere in pausa l'esecuzione per 10 min raffreddare ed eseguire nuovamente a 520 V (25 mA) per un altro 60 min Uncast 15% pagina rimuovendo una delle lastre di vetro.
  9. Leggermente spruzzare il gel che si siede sulla lastra di vetro con soluzione colorante fluorescente (10 µ l) in 25 mL di 0.5 x TBE e lasciare che siedono Appartamento per 5 min al buio.
  10. Posare il vetro con il gel su un transilluminatore luce blu e allineare entrambi 19 nt e 24 indicatori di dimensione di nt con un righello per dirigere l'asportazione del dei piccoli RNA (Figura 2). Asportare il gel.
  11. Collocare il gel asportato in una provetta 0,5 mL, progettata per frammentare fette del gel, posizionate in modo sicuro in una provetta da 1,5 mL microcentrifuga siliconato. Centrifugare a 16.000 x g per 3 min a RT. Risospendere il gel frammentato con 300 µ l di 400 mM NaCl soluzione, tappare la provetta e sigillare con la pellicola di paraffina.
  12. Impostare il tubo su agitazione su un thermomixer a 1.100 giri/min in una camera fredda a 4 ° C per un'incubazione overnight (h 16-17).

4. legatura dell'adattatore 5'

  1. Trasferire la soluzione e frammentato gel per un filtro da 5 µm tubo seduto in una provetta da 1,5 mL siliconato, sigillare con la pellicola di paraffina e centrifugare per 5 min a 2.300 x g e RT.
  2. Aggiungere 950 µ l di etanolo al 100% per la soluzione filtrata, tappare la provetta, capovolgere per mescolare, centrifugare per 2 s, sigillare il tubo con la pellicola di paraffina e impostare sul ghiaccio per 1h.
  3. Preparare un 12% gel della pagina come descritto al punto 3.3, ma combinano 12,6 mL di diluente, 14,4 mL di concentrato, 3 mL di tampone, 240 µ l APS e 12 µ l di TEMED in una provetta da 50 mL. Pre-corsa il 12% gel pagina per 30 min a 450 V (~ 35 mA) in 0,5 x TBE.
  4. Centrifugare la soluzione di RNA purificata piccola a 16.000 x g per 60 min a 4 ° C.
  5. Pipettare attentamente fuori il surnatante con una pipetta da 1 mL per rimuovere la maggior parte della soluzione e utilizzare una pipetta 200 mL per rimuovere la soluzione rimanente, senza toccare il pellet.
  6. Utilizzando una pipetta Pasteur con una mancia di 10 mL al suo termine collegato ad un termos, asciugare accuratamente il pellet senza toccarlo.
  7. Risospendere il pellet in 9 µ l di acqua RNAsi-libera senza pipettaggio su e giù, ma scorrendo leggermente il tubo, centrifugare per 2 s e insieme il tubo sul ghiaccio.
  8. Preparare i 10 x fresco di RNA ligasi Buffer (con ATP) combinando 500 µ l di 1 M Tris-HCl pH 7.5, acetilato 100 µ l di 1 M MgCl2, 50 µ l di 20 mg/mL BSA, 200 µ l di 10 mM ATP, 7 µ l di 2-mercaptoetanolo 14 M e 143 µ l di acqua RNAsi-libera.
  9. Mescolare le 10 x RNA ligasi Buffer (con ATP), spostando il tubo e centrifugare per 2 s per raccogliere la soluzione nella parte inferiore del tubo.
  10. Impostare la legatura adattatore 5' aggiungendo 2 µ l di tampone di RNA ligasi (con ATP), 10x 1 µ l di 100 µM 5' adattatore e 6 µ l 50% DMSO acquosa ai 9 µ l, 3' codice a barre piccola soluzione RNA.
  11. Scorri il tubo leggermente per mescolare, centrifugare per 2 s per raccogliere la soluzione, posizionare il tubo su un blocco di calore a 90 ° C per 1 min e torna sul ghiaccio per almeno 2 min.
  12. Aggiungere 2 µ l di T4 RNA ligasi 1 nella soluzione (non pipettare su e giù), scorrere il tubo, centrifuga per 2 s e sedersi il tubo galleggiante cremagliera in bagnomaria a 37 ° C per 60 min.
  13. Contemporaneamente, impostare due legature tra il nt-19 3' adattatore e l'adattatore 5' e due legature tra il nt-24 3' adattatore e l'adattatore 5'.
    1. Combinare 2 µ l di 19nt-3' adattatore (250 ng / µ l) o 24 nt-3' adattatore (250 ng / µ l) con: 2 µ l dell'adattatore 5' (100 µM), 2 µ l di tampone di RNA ligasi (con ATP), 10x 6 µ l di DMSO acquosa di 50%, 6 µ l di acqua RNAsi-libera e 2 µ l di T4 RNA ligasi 1 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL siliconato.
    2. Scorri i tubi per mescolare, centrifugare per 2 s e insieme le provette a 37 ° C per 60 min.
  14. Aggiungere 20 µ l di tampone di denaturazione di PAA a tutte le legature (purificato piccoli RNA, 2 legature con 19nt-3' adattatore e 2 legature con 24nt-3' adattatore).
    1. Mix, spostando i tubi, centrifuga per 2 s, incubare le provette su un blocco di calore a 90 ° C per 1 min. trasferimento tutti i tubi per il ghiaccio e preparare una scaletta (3 mL di scaletta con 20 µ l di PAA).
  15. Svuotare il serbatoio superiore dell'apparato di gel con il pre-run 12% pagina gel e aggiungere la soluzione di x TBE 0,5 fresca sotto il livello dei pozzi (pozzi sono svuotati con una pipetta di punta lunga e sottile).
    1. Caricare i campioni con una punta sottile, come descritto nella Figura 3.
    2. Uso fresco 0,5 x TBE per riempire singoli pozzetti alla parte superiore del gel.
    3. Aggiungere 0,5 fresco x TBE al serbatoio sopra i pozzi e inizio l'elettroforesi di 12% pagina per 60 min a 450 V (~ 35 mA).
    4. Mettere in pausa l'esecuzione tramite lo spegnimento del generatore per 10 min raffreddare il gel. Riavviare il generatore ed eseguire il gel per 60 min a 520 V (~ 25 mA).
  16. Arrestare il generatore, svuotare i serbatoi capovolgendo l'apparecchio sopra un lavandino e il 12% di uncast pagina rimuovendo una delle lastre di vetro.
  17. Sedere il vetro con il gel piatto, spruzzare il gel con 10 µ l di colorante fluorescente in 25 mL 0,5 x TBE, incubare al buio per 5 min. Lay il vetro con il gel su un transilluminatore luce blu e allineare entrambi i 19 nt ed entrambi i 24 nt dimensione marcatori con un righello per dirigere l'asportazione del dei piccoli RNA (Figura 3).
    1. Asportare il gel e trasferire la parte asportata gel in una provetta di interruttore gel 0,5 mL. Chiudere il tappo del tubo gel breaker, set in una microcentrifuga da 1,5 mL siliconata e sicuro con la pellicola di paraffina. Rimuovere il tubo dell'interruttore del gel, aggiungere 300 µ l di 300 mM NaCl e 1 µ l di 100 µM 3' PCR primer per i pezzi di gel schiacciato in una provetta da 1,5 mL.
    2. Sigillare il tubo con la pellicola di paraffina su agitazione su un thermomixer a 1.100 giri/min a 4 ° C, durante la notte (17 – 18 h) in una stanza fredda.

5. retrotrascrizione del 5' legato e 3' codice a barre purificato piccoli RNA

  1. Recuperare il tubo dal filtro e thermomixer purificare la soluzione con un tubo del filtro di 5 µM.
    1. Utilizzare una pipetta da 1 mL per trasferire la soluzione in un 5 µM filtro tubo inserito in un 1,5 mL siliconato RNAsi-libera del tubo di raccolta. Centrifugare la provetta per 3 min a 2.300 x g e RT.
    2. Gettare la provetta di filtro e aggiungere 950 µ l di etanolo al 100% per il tubo di raccolta microcentrifuga da 1,5 mL contenente la soluzione filtrata. Capovolgere la provetta al mix, centrifugare per 2 s e posto in ghiaccio per 60 min. precipitato il RNA a pellet mediante centrifugazione la provetta a 16.000 x g e a 4 ° C per 1 h.
  2. Asciugare il pellet di RNA.
    1. Aprire il tappo e rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta 1 mL, lasciando un po' di liquido sul fondo.
    2. Utilizzare una pipetta 20 µ l per rimuovere tutti i resto surnatante senza toccare il pellet. Inclinare il tubo per consentire qualsiasi soluzione per sedersi sul lato opposto del pellet.
    3. Utilizzare una pipetta Pasteur con un puntale non filtrato di 10 mL per aspirare il supernatante e asciugare il pellet con un aspirapolvere.
  3. Risospendere il pellet di RNA in 5,6 µ l di acqua RNAsi-libera.
    1. Scongelare i reagenti di trascrizione inversa sul ghiaccio per 15 minuti insieme a una reazione di retrotrascrizione aggiungendo 3 µ l di tampone, 4,2 µ l di 10 x deoxynucleotide trifosfato (dNTP) (ogni 2 mM) e 1,5 µ l di ditiotreitolo (DTT): 5x per il 5,6 µ l di RNAsi-libera sedimento risospeso.
    2. Spostare delicatamente a scatti la provetta per mescolare la reazione e centrifugare per 2 s per raccogliere la soluzione. Impostare la reazione su un blocco di calore a 90 ° C per esattamente 30 s e poi il trasferimento direttamente su un thermomixer a 50 ° C.
    3. Lasciare il tubo su thermomixer per 2 min in modo che la temperatura Equalizza. Aggiungere 0,75 µ l di enzima trascrizione inversa direttamente nella soluzione, flick delicatamente per mescolare e impostare il tubo indietro immediatamente su thermomixer a 50 ° C per 30 min.
  4. Dopo 30 min, il tubo di trasferimento di un blocco di calore a 95 ° C per 1 min interrompere la trascrizione inversa. Aggiungere 95 µ l di acqua RNAsi-libera direttamente la trascrizione d'inversione, scorri il tubo per mescolare e impostarlo direttamente sul ghiaccio per 2 min.
  5. Etichettare la provetta con l'ID di Stock in biblioteca e libreria di cDNA

6. pilota PCR e l'amplificazione di PCR su larga scala

  1. Preparare fresco 10 x PCR buffer aggiungendo 304 µ l di acqua RNAsi-libera, 125 µ l di 2 M KCl, 50 µ l di 1 M Tris-HCl pH 8.0, 10 µ l di 1 M MgCl2, 5 µ l di 1% Triton X-100 e 6 µ l di 1 M 2-mercaptoetanolo in un tubo del microcentrifuge siliconato e tenere a TA.
  2. Assemblare la reazione di PCR pilota combinando 67 µ l di acqua RNAsi-libera, 10 µ l di 10X PCR Buffer, 10 µ l di 10 x dNTPs, 0,5 µ l di 100 µM 5' PCR primer, 0,5 µ l di 100 µM 3' PCR primer, 10 µ l di cDNA Library Stock e 2 µ l di 50 x Taq della polimerasi.
    1. Impostare due cicli PCR su un termociclatore come segue: il File 1: 94 ° C per 45 s, 50 ° C per 85 s e 72 ° C per 60 s per 10 cicli, mantenere a 4 ° C; File 2: 94 ° C per 45 s, 50 ° C per 85 s e 72 ° C per 60 s per 2 cicli, tenere a 4 ° C. Impostare la reazione di PCR pilota nel termociclatore e avviare il File 1.
    2. Alla fine del File 1, aprire il tubetto PCR, e utilizzando una pipetta di 20 µ l, trasferire 12 µ l dalla reazione PCR pilota in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 3 µ l di 5 x tintura di caricamento del gel, Miscelare pipettando su e giù, chiudere il tubo e l'etichetta "10 cicli".
    3. Chiudere il tubo pilota PCR e avviare File 2 su un termociclatore. Alla fine del File 2, aprire la provetta PCR e utilizzare una pipetta 20 mL per trasferire 12 µ l di soluzione in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL con 3 µ l di 5 x gel colorante di caricamento ed etichettarlo "12 cicli".
    4. Ripetere le operazioni descritte nei passaggi 6.2.2 e 6.2.3 per raccogliere i prodotti di PCR di 12 µ l dalla reazione PCR pilota a cicli PCR 14, 16, 18 e 20. Aggiungere 3 µ l di 5 x tintura di caricamento del gel per ognuna delle 12 aliquote PCR µ l e alla scala di nt 20 contenente 3 µ l di ladder e 9 µ l di acqua RNAsi-libera.
  3. Preparare un gel di agarosio 2,5% con 0,5 x TBE.
    1. Pesare 2,5 g di agarosio in un bicchiere pulito e aggiungere 100 mL di 0.5 x TBE. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde fino a ebollizione. Rimuovere la soluzione dal microonde, agitare il flacone per mescolare l'agarosio, aggiungere 4 μL di bromuro di etidio (10 mg/mL) e trasferire la soluzione in un vassoio di elettroforesi2 7 x 10 cm, chiuso su entrambe le estremità con del nastro adesivo.
    2. Un pettine di 8 pozzetti e lasciate che il gel di agarosio si solidificano al trasferimento della RT. gel di agarosio solidificato in un apparecchio di elettroforesi riempito con 0,5 x TBE.
  4. Caricare la scaletta e gli esempi PCR su gel di agarosio ed eseguirlo per 30 min a 120 V.
  5. Valutare il gel su una casella UV per identificare il ciclo PCR ottimo (Figura 4A).
    Nota: La dimensione delle bande PCR attese è mostrata in Figura 4B.
    1. Osservare le due bande PCR in ciascuno dei diversi pozzetti (banda superiore: Biblioteca del DNA, banda inferiore: dimeri dell'iniettore).
    2. Identificare il ciclo adeguato di PCR per l'amplificazione del cDNA selezionando il ciclo dove la libreria cDNA è visibile, ma i dimeri di primer sono a malapena osservabile.
      Nota: Generalmente, il ciclo PCR adeguato è selezionato tra i cicli di 12 – 16. Figura 4A, il ciclo PCR adeguato per questa libreria è 14.
  6. Impostare le reazioni di PCR su larga scala (6 x 100 µ l) per la purificazione di biblioteca del gel dell'agarosi.
    1. Preparare una nuova provetta di 10X PCR Buffer seguendo passo 6.1.
    2. Preparare la miscela di PCR Master su larga scala in una provetta da 1,5 mL combinando 435,5 µ l di acqua RNAsi-libera, 65 µ l di buffer di x PCR 10, 65 µ l di 10 x dNTPs, 3,25 µ l di 5' primer PCR, 3,25 µ l di 3' PCR primer e pipettaggio su e giù per mescolare.
    3. Trasferire 88 µ l di PCR Master Mix in sei provette per PCR da 0,5 mL. Trasferire 10 µ l di cDNA Stock Library (conservati nel ghiaccio), aggiungere 2 µ l di 50 x Taq polimerasi in ciascuna delle 6 provette PCR e pipettare per mescolare.
    4. Preparare una provetta di reazione di PCR negativa combinando 77 µ l di RNAsi-libera acqua, 10 µ l di tampone di x PCR 10, 10 µ l di 10 x dNTPs, 0,5 µ l di 5' primer PCR, 0,5 µ l di primer PCR 3' e 2 µ l di 50 x Taq della polimerasi e pipetta per mescolare.
    5. Disporre le provette PCR nel termociclatore usando il ciclo PCR descritto al punto 6.2.1 e impostare il numero ottimale di cicli di amplificazione. Preparare un gel di agarosio al 2,5% utilizzando 0,5 x TBE, come descritto al punto 6.3.
  7. Dopo l'amplificazione di PCR, trasferire 9 µ l da ciascuna provetta PCR in sei per microcentrifuga da 1,5 mL contenente 3 µ l di 5 x gel colorante di caricamento.
    1. Preparare 20 scala nt combinando 3 mL di scaletta in 9 µ l di acqua RNAsi-libera e tintura di caricamento in una provetta da 1,5 mL aggiungendo del gel di 3 µ l.
    2. Caricare la scaletta, controllo negativo di PCR e 6 prodotti di PCR su gel di agarosio ed eseguire il gel per 30 min a 120 V.
    3. Verificare l'uniformità di amplificazioni di PCR tra vicoli su una casella UV (prendere un'immagine).
    4. Unire 3 reazioni di PCR in due microcentrifuga da 1,5 mL siliconato (3 x 91 µ l), aggiungere 27 µ l di 5 M di NaCl e 950 µ l di etanolo al 100%. Invertire i tubi per mescolare e impostarle a-20 ° C durante la notte per far precipitare i prodotti PCR.

7. cDNA Library purificazione e valutazione

  1. Centrifugare entrambi i tubi con le reazioni di PCR a 16.000 x g per 60 min a 4 ° C.
  2. Rimuovere il surnatante con una pipetta da 1 mL, quindi inclinare il tubo con la pallina sul lato superiore e liquido sul lato inferiore e utilizzare una pipetta Pasteur collegata ad un termos con una vasca e aspirare il liquido con una mancia di 10 mL all'estremità della pipetta Pasteur.
  3. Impostare il digest PmeI.
    1. Risospendere uno dei pellet PCR con 17,5 µ l di acqua priva di nucleasi e trasferire il sedimento risospeso la seconda pallina PCR. Aggiungere 2 µ l di tampone 10x e 0,5 µ l di enzima PmeI e impostare il digest in un bagno d'acqua per 2 ore a 37 ° C.
    2. Preparare un gel di agarosio al 2,5% utilizzando 0,5 x TBE (punto 6.3). Aggiungere 6 µ l di 5 x caricamento gel colorante per il digest. Trasferire 13 µ l di ogni digest in due pozzetti adiacenti del gel dell'agarosi, caricare la scaletta di formato nt 20 presso i pozzi di fine ed eseguire il gel per 90 min a 150 V (Figura 4).
    3. Asportare le bande PCR superiore dal gel nella finestra UV, trasferire i pezzi di gel in un tubo del microcentrifuge appena pesato 1,5 mL e pesare i pezzi di gel su una scala.
  4. Purificare la libreria di cDNA amplificato PCR asportata utilizzando un kit di estrazione del gel seguendo le istruzioni del produttore. Quantificare la libreria di cDNA utilizzando uno strumento, seguendo le istruzioni del produttore e l'analisi di quantificazione del DNA.
  5. Valutare la dimensione e la purezza della libreria cDNA con un chip di DNA di alto-sensibilità su un Bioanalyzer (Figura 5). Sequenza la libreria di cDNA utilizzando un sistema di alto-rendimento. Trasferire il file di dati FASTQ alla pipeline RNAworld per rimozione di adattatore e l'allineamento al genoma umano per identificare le sequenze miRNA.

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Representative Results

Come descritto nel metodo qui, un totale di 18 campioni di RNA FFPE individuali (100 ng ogni) sono impostati in provette separate per sottoporsi a 3' adenylated con codice a barre del oligonucleotide T4 la legatura durante la notte. Il giorno successivo, le reazioni enzimatiche sono calore-disattivato, combinate e precipitate in un singolo tubo. La pallina del RNA è risospeso e le molecole di RNA legate sono separate su un 15% di denaturare i gel di poliacrilamide (pagina), dove gli indicatori di dimensione del oligonucleotide RNA migrati in pozzetti adiacenti del gel pagina, vengono utilizzati per selezionare dimensioni appropriate 3' con codice a barre piccole molecole di RNA (Figura 2). Il pezzo asportato gel viene incubato in una soluzione di NaCl durante la notte per eluire le molecole di RNA legate. Il giorno successivo, il RNA eluito è precipitato, e viene eseguita una legatura di adattatore 5'. Quindi, il 5' adattatore legato piccole molecole di RNA sono migrate e separate su un gel di acrilammide 12%, dove ancora migrato dimensioni marcatore oligonucleotidi da RNA permettono l'asportazione di dimensioni di piccoli RNA contenente sia i oligonucleotides di codice a barre 3' e 5' adattatore ( Figura 3). Il gel asportato viene incubato durante la notte in una soluzione di NaCl per consentire eluizione del RNA. Il giorno successivo, le piccole molecole di RNA legate sono precipitate, e il pellet è risospeso in acqua RNAsi-libera, seguita da d'inversione-trascrizione; un'aliquota delle molecole di cDNA subisce una reazione di PCR pilota (Figura 4A). Reazioni di PCR su larga scala utilizzando lo stesso input di librerie di cDNA vengono impostate e valutate su un gel di agarosio 2,5% per verificare che tutte le reazioni sono state adeguatamente amplificati di PCR (Figura 4B), prima della messa in comune e pernottamento precipitazione dell'etanolo. Il giorno successivo, la libreria di cDNA amplificato contenente tutti i 18 singole librerie per i 18 esemplari unici di FFPE RNA, viene eseguita la migrazione su un gel di agarosio al 2,5% e la banda PCR superiore, in esecuzione a 100 nt viene asportato e purificata (Figura 4). La purificazione di libreria di cDNA viene quindi valutata su un chip di DNA ad alta sensibilità (Figura 5) per determinare che il prodotto PCR purificato non contiene un eccesso di dimeri dell'iniettore o altri sottoprodotti della reazione PCR. Il prodotto PCR viene poi analizzato su un sistema di sequenziamento ad alte prestazioni. La rifinitura di adattatore e la generazione dei 18 singoli file per ciascuno dei 18 esemplari vengono eseguite tramite la pipeline di RNAworld (accesso ci è stata fornita dal Dr. Thomas Tuschl). Quindi vengono condotte analisi biostatistica per valutare il contenuto di miRNA dei campioni FFPE RNA.

Per convalidare questo ottimizzato procedura, abbinato fresco congelato ed esemplari del tumore al seno FFPE sono stati utilizzati per le analisi (Figura 6). Due simili tumori (IDC) il carcinoma mammario duttale invasivo sono stati selezionati per valutare la sensibilità della procedura e determinare se le differenze di espressione di miRNA identificate tra i due tessuti congelati freschi anche potrebbero essere rilevate compensata archiviata FFPE Campioni di RNA. Per questo esperimento, la qualità del totale RNA ottenuta il 2 freschi congelati e abbinati due campioni FFPE RNA è stata valutata (Figura 6A). Come anticipato, la dimensione di RNA e la qualità dei campioni FFPE severamente è stata diminuita rispetto al RNAs congelato fresco abbinato (confronta le corsie 1 e 3 e corsie 2 e 4). Uno del RNA FFPE era stato archiviato presso RT per 4 anni (invasivo al seno cancro 1, (IBC1)) e l'altro era stato archiviato presso RT per 8 anni (IBC2), mentre le controparti congelate fresche erano state immagazzinate a-80 ° C. I quattro singoli campioni di RNA sono stati analizzati in un'unica libreria, usando 4 singoli codici a barre e quieto leggere distribuzione trame vengono visualizzati in Figura 6B. I due pannelli superiori Visualizza sulla correlazione di espressione di miRNA tra due freschi congelato tumore RNAs e le loro controparti di esemplare FFPE RNA specifici. Le trame abbinati tra freschi congelati e Mirna FFPE indicano che la preparazione di cDNA library fornisce una buona riproducibilità, come si può osservare un'elevata correlazione tra i miRNA rilevati in campioni trattati in modo diverso (Frozen vs FFPE). I due pannelli inferiori visualizzano la correlazione tra dati di espressione di miRNA dai due diversi tumori congelati e tra i due diversi tumori FFPE. Come indicato in Figura 6, le differenze di espressione di miRNA identificate tra i due tumori congelati freschi sono state correlate con le differenze rilevate tra i due campioni di tumore FFPE abbinati. Le differenze di espressione di miRNA significato erano rilevabili sia in fresco congelato ed i tumori FFPE.

Per valutare ulteriormente la sensibilità di questo approccio, sono stati utilizzati dati di espressione di miRNA da 12 archiviati FFPE e 4 provini congelati freschi di RNA (Figura 6). I 16 esemplari differenti di RNA erano individualmente tutti utilizzati per la preparazione di una libreria di cDNA singolo e 3' codice a barre. I campioni di RNA utilizzati in questa varietà di cellula seno due libreria inclusa, il MCF10A (linea cellulare normale-come) e la MCF7 (linea cellulare del cancro del seno) con il RNA da cellule fresche e da loro archiviati FFPE controparti23, abbinato fresco congelato e campioni di RNA FFPE da cancro al due seno campioni analizzato in modo indipendente (IBC1 e IBC2 in Figura 6A e 6B) e abbinato fresco congelato e campioni di RNA FFPE da campioni cervicali normali (Cx). Inoltre, archiviati FFPE esemplari dal normale (normale Br1, Br2 normale e normale Br3) e cancro al seno dai tessuti (IBC 5, IBC 6 e 7 di IBC), senza controparti congelati freschi sono stati analizzati. Come osservato sull'heatmap, indipendentemente dal fresco congelato o origine FFPE RNA, profili di espressione di miRNA delle stesse cellule (MCF10 o MCF7), o gli stessi tessuti (IBC1, IBC2 o Cx) raggruppati insieme. Inoltre, come segnalato sul cluster senza supervisione, da sinistra a destra, le cellule normali e tessuti raggruppati insieme mentre i tumori del seno e le cellule del tumore in cluster sulla destra. Il tessuto cervicale, che visualizzato un profilo di espressione di miRNA diversi, raggruppati sulla destra dell'heatmap.

Considerando che la maggior parte degli esemplari FFPE clinicamente archiviati non abbia controparti congelati freschi, ma che possono essere recuperati dopo la durata di archiviazione differenti, si cercava di determinare se il protocollo di preparazione ottimizzata cDNA biblioteca era applicabile e riproducibile con esemplari FFPE sempre più più vecchi. Come visualizzato in Figura 7, profili di espressione di miRNA dai tessuti FFPE archiviati per 18, 20, 22, 27, 30 e 35 anni sono stati ottenuti. il RNA è stato estratto utilizzando l'ottimizzato simultanea RNA/DNA procedura21e aliquote di RNA quaterna da ogni singolo esemplare FFPE sono state preparate il giorno stesso e conservate a-80 ° C prima di preparazioni di biblioteca. Un totale di 9 esemplari FFPE differenti sono stati analizzati in duplicato, dove ogni singola aliquota di RNA è stata legata con codice a barre differenti oligonucleotidi (18 codici a barre totale), all'interno della libreria stessa. Questo esperimento è stato ripetuto durante due settimane consecutive (settimana 1 e 2). Questo ha permesso la valutazione della riproducibilità di preparazione di cDNA biblioteca con gli stessi campioni di RNA utilizzando due diversi codici a barre all'interno di una singola libreria e tra due diverse librerie con un intervallo di una settimana. Come osservato in Figura 7, il coefficiente di correlazione è rimasto sopra 0,96 indipendentemente dall'età del campione o la settimana di preparazione della biblioteca; di conseguenza, il protocollo di preparazione libreria cDNA ottimizzata fornisce uno strumento robusto per riproducibile analisi degli esemplari FFPE indipendentemente dal loro tempo di archiviazione, ad esempio, il 35-year-old archiviati FFPE RNA (Vedi seno n. 9) visualizzato alte misure riproducibili equivalente a quelle celebri con i campioni di RNA FFPE 20-year-old (Vedi seno n. 3).

Figure 1
Figura 1: oligonucleotidi. Tutte le sequenze di oligonucleotidi, loro corrispondenti modifiche chimiche e concentrazioni utilizzate in questo protocollo sono descritti. I tipi di modificazioni chimiche sono descritti nella casella di modifica e le modifiche abbreviate visualizzate nelle sequenze di oligonucleotidi. Il calibratore cocktail viene visualizzato l'elenco dei 10 singoli RNA oligonucleotidi calibratori, che sono state risospese in una soluzione contenente il oligonucleotide di vettore (0,5 µM). Gli adattatori del oligonucleotide di diciotto 3' codice a barre sono dettagliati con ombreggiatura grigia su sequenza di codice a barre. La sequenza di RNA dell'adattatore 5' e le sequenze di DNA i 3' 5' e PCR degli iniettori di PCR sono dettagliati. Le sequenze di RNA dei oligonucleotides di marcatore di due dimensioni, vale a dire a cui fa riferimento il protocollo come nt-19 3' adattatore e nt-24 3' indicatori di dimensione adattatore, sono forniti. Tutti gli oligonucleotidi di DNA e RNA sono stati acquistati in commercio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: purificazione pagina degli esempi di codice a barre RNA 3'. Dopo pooling e precipitando i 18 campioni di RNA con codice a barre, il sedimento risospeso di RNA è migrato e separati mediante elettroforesi su un 15% di acrilammide gel (vedere ben 8). La Piazza rossa evidenzia l'area contenente i 3' microRNA con codice a barre, che è stati asportati con un bisturi e trasferiti in una provetta da microcentrifuga siliconato nucleasi-free. Un totale di quattro pozzi, con due contenenti il nt-19 3' adattatore e due contenenti il nt-24 3' adattatore è stato impostato un ben lontano, su ciascun lato della libreria (Vedi pozzetti 5, 6 e 10, 11, rispettivamente). Come un test per la ligasi T4 RNA 1 e per la purificazione delle dimensioni dei marcatori per essere completato il giorno successivo, le reazioni di legatura contenenti il nt-19 3' marcatore per l'adattatore, con l'adattatore 5' e il nt-24 3' marcatore per l'adattatore, con l'adattatore 5' sono stati eseguiti in pozzi 2 un quinquies 3, rispettivamente. I quadrati gialli visualizzano le bande asportate che rappresenta i oligonucleotides di RNA marcatore dimensione legato con l'adattatore 5'. Queste bande sono purificate, precipitate ed eseguire durante il 12% purificazione pagina (Vedi Figura 3 qui sotto). Pozzetti 1 e 13 contengono la scaletta di formato nt 20, che ha contribuito a confermare le dimensioni attese dei prodotti legati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: purificazione pagina della libreria purificata dopo la legatura dell'adattatore 5'. La biblioteca di RNA purificata è stata legata con l'adattatore 5' e le dimensioni del prodotto previsto è stata asportata dal 12% pagina utilizzando i marcatori di dimensione legato (Vedi quadrato rosso). I prodotti delle legature di T4 RNA tra il nt-19 3' adattatore e l'adattatore 5' (pozzi 4 e 9) e tra il nt-24 3' adattatore e l'adattatore 5' (pozzi 5 e 10) sono state eseguite in parallelo, su ciascun lato del bene che contiene la libreria di RNA. Le bande più alte (Vedi asterischi bianchi) sono i prodotti della legatura adattatore 5' e utilizzato come la guida per l'asportazione di banda gel contenente 5' adattatore legato biblioteca di RNA. I prodotti di legatura legatura dimensioni marcatore purificati nella pagina precedente vengono eseguiti in ben 3. Come osservato in pozzetti 1 e 12, la scaletta di formato nt 20 è stato eseguito anche per convalidare la dimensione prevista della libreria di RNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: pilota PCR e amplificazione su larga scala della libreria cDNA. La dimensione e il rapporto dei prodotti di PCR sono stati valutati su un gel di agarosio al 2,5% in presenza di bromuro di etidio. (A) dopo trascrizione inversa della libreria con codice a barre RNA, un'aliquota della libreria cDNA è stato amplificato utilizzando i primer PCR 5' e 3' in una singola reazione di PCR pilota. Aliquote delle reazioni PCR pilota sono sono ottenute a cicli di 10, 12, 14, 16, 18 e 20 e migrate su un gel di agarosio al 2,5%. Come osservato tra pozzetti 1 e 7, la presenza dei dimeri cDNA library e adattatore era osservabile in modo esponenziale (Vedi rettangoli verdi). Per questa libreria, il ciclo PCR selezionato per l'amplificazione del cDNA biblioteca era 15. (B), questo schema consente di visualizzare la posizione e la lunghezza dei oligonucleotides differenti e i prodotti risultanti di RNA e DNA, che sono identificabili sui gel di pagina e dell'agarosi. (C) le aliquote delle 6 reazioni PCR su larga scala (identificate in A) sono state analizzate separatamente su un 2,5% di agarosio gel (Vedi pozzi 3 a 8). I due tipi di prodotti di PCR, vale a dire la biblioteca (fascia superiore) e i dimeri di primer (banda inferiore) sono visibili su questo gel (Vedi verde rettangoli). La reazione di PCR in bianco senza cDNA non visualizza nessuna amplificazione di PCR (Vedi bene 2). La scaletta di formato 20 nt consente la verifica delle dimensioni prodotto (Vedi pozzetto 1). (D) Gel immagine su un transilluminatore luce blu di agarosio 2,5% gel contenente le reazioni di PCR in pool ha funzionato in due pozzetti adiacenti. Come osservato, la band più alta in entrambi i pozzetti è all'interno della dimensione di biblioteca previsto e la band di dimero di adattatore si trova sotto. Le bande PCR superiore erano asportate e purificate con un kit di estrazione del gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: valutazione della PCR purificato amplificato libreria del DNA. Una piccola aliquota (1 µ l) della libreria di cDNA amplificato PCR viene analizzata utilizzando un chip di DNA ad alta sensibilità su una piattaforma basata su microfluidica. (A), questo pannello Visualizza la migrazione degli indicatori di dimensione per la calibrazione dello strumento. (B), questo pannello Visualizza la migrazione della libreria di cDNA amplificato PCR purificata. La vetta più alta è misurata ad una dimensione di 100 bp (Vedi asterisco) e rappresenta la libreria di cDNA. Il piccolo picco valutato a 72 bp dallo strumento rappresenta i dimeri di adattatore. Il picco di bp 100 rilevato da microfluidica basato su piattaforma rivela le dimensioni stimate per la libreria di cDNA amplificato, che contiene 18 campioni di RNA individuali con codice a barre per successive NGS su un sistema di sequenziamento ad alte prestazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: preparazione libreria cDNA e sequenziamento di nuova generazione utilizzando abbinati esemplari incastonato paraffina fresco congelato e formalina. (A) RNA totale Estratto da pari fresco congelato e i tumori FFPE carcinoma duttale invasivo (IDC) è stata analizzata su un chip di RNA totale su una piattaforma microfluidica basato. (B) RNA totale da abbinati fresco congelato e campioni FFPE (IBC 1 e IBC2) hanno subito il protocollo di preparazione di cDNA biblioteca e sono stati tracciati i dati di sequenziamento di miRNA. (C) DifferentialmiRNA espressione tra esemplari di IBC1/IBC2 e correlazione tra congelati e FFPE accoppiato campioni. espressione dei miRNA viene visualizzato nel registro di conteggio per milione (CPM), dall'alto verso il basse letture (rosso di colore blu). Il significato della differenza fra le coppie di due tessuti, a miRNA, espressione per visualizzare i cerchi grigi, con alta e bassa espressione miRNA identificati in fresca e campioni FFPE. (D) RNA totale Estratto da fresco abbinato e FFPE RNA dagli esemplari del tessuto del seno delle cellule linee (MCF10A e MCF7), umano della mammella dilagante del cancro (IBC 1 e IBC2), cervicale (Cx), archiviata tessuti del seno normale (normale Br1, Br2 normale e normale Br 3), e cancro al seno dilagante archiviati (IBC 5, IBC 6 e IBC7) hanno subito la preparazione di cDNA biblioteca all'interno della stessa serie. I dati NGS dei miRNA rilevati nelle librerie vengono visualizzati in una configurazione della mappa di calore. Questa figura è stata modificata da Loudig et al. 20 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: correlazione di espressione del cDNA biblioteca preparazione e miRNA tra repliche utilizzando vecchi archiviati i campioni FFPE. RNA totale da 18, 20, 22, 27, 30 e campioni di tessuto per 35-year-old archiviati FFPE seno ha subito il nostro protocollo di preparazione libreria cDNA ottimizzata. Campioni di RNA replicati da 9 diversi esemplari FFPE erano legati con diversi 3' oligonucleotidi con codice a barre ed analizzati all'interno della libreria stessa settimana 1 (w1). Lo stesso esperimento è stato ripetuto entro un intervallo di una settimana (settimana 2 o w2). Misure di riproducibilità dei dati di espressione di miRNA duplicati tra gli stessi campioni di RNA archiviati vengono visualizzati nel heatmaps e con coefficienti di correlazione valutati tra 0,93 e 0,99. Questa figura è stata modificata da Loudig et al. 20 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un protocollo di preparazione altamente riproducibile e robusto cDNA biblioteca per NGS di piccoli RNA archiviata negli esemplari di FFPE RNA è presentato in questo protocollo, che è una versione modificata e ottimizzata della procedura descritta da Hafner et al. 22

Tutti i passaggi del presente protocollo sono stati ottimizzati per l'uso con vecchio archiviato e compromesso RNA totale recuperato da campioni FFPE. Il passaggio chiave del presente protocollo, per la lavorazione di piccole quantità di RNA FFPE, risiede nella messa in comune di tutti i campioni di RNA (cioè, 18 100 campioni ng di RNA FFPE individuali) dopo legature singole con le schede di codice a barre unico 3' 18. Questo passaggio critico permette i 18 campioni di RNA FFPE uniformemente subire tutti i biochimici ed enzimatici passaggi successivi necessari per la preparazione della piccola biblioteca del cDNA RNA. Inoltre, questo passaggio massimizza la quantità di RNA in fase di precipitazioni e purificazioni gel migliorando l'effetto di vettore di piccole molecole di RNA e facilitando a pellet osservazione e selezioni del gel. Un'altra caratteristica fondamentale di questo protocollo, che ulteriormente sottolinea la propria versatilità quando si lavora con piccole quantità di RNA FFPE, una reazione di PCR pilota viene utilizzato per identificare il ciclo di amplificazione ottimale della libreria del cDNA. Questo passaggio fornisce anche approfondimenti le dinamiche dell'amplificazione biblioteca contro amplificazione di dimero di primer, che è fondamentale quando si prepara la reazione di PCR su larga scala e purificante la piccola biblioteca di RNA su agarosio gel. I dati aggiunti al presente protocollo dimostrano la riproducibilità di questo approccio tra abbinati congelati e campioni FFPE e anche evidenziare l'applicabilità all'età superiore FFPE RNA campioni da esemplari in archivio fino a 35 anni.

Questo protocollo è stato modificato dalla sua versione originale, in modo è ottimizzato per la preparazione di piccole librerie di RNA effettuata in minore qualità e quantità di RNA FFPE chimicamente modificate e compromesse. Uno degli aspetti di questa procedura che è stata modificata per legare e amplificare piccoli RNA da campioni FFPE correttamente si riferisce alla quantità di calibratore cocktail a spillo durante l'iniziale 3' legatura di adattatore con codice a barre, per il quale ingresso è stato ridotto a 0,026 nM per prevenire concorrenza con legatura della bassa abbondanza piccoli RNA presenti nei campioni di RNA FFPE. Un'altra importante modifica alla procedura originale è stata la rimozione di tutte le dimensioni-marcatori radioattivo con etichettati utilizzato durante la selezione del dei piccoli RNA su gel la pagina. Uso di questi dimensioni-marcatori radioattivi non limitato l'applicabilità di questo approccio al laboratori certificati per l'uso di radioisotopi ma anche impedito osservazione dei prodotti RNA su gel. Invece, in questo protocollo ottimizzato, dimensione marcatori sono eseguiti in pozzi adiacenti alla biblioteca, il gel di pagina e visualizzati direttamente con un colorante fluorescente per dirigere l'asportazione dei piccoli RNA. D'importanza, il colorante fluorescente è leggermente spruzzato sul gel per prevenire la diffusione dei prodotti RNA e quindi visualizzato su una scatola di luce blu. Successivamente, come misura di precauzione e per migliorare la diffusione degli RNA piccoli dei contenuti nella pagina gel frammenti asportati, gel-breaker tubi sono utilizzati per schiacciare uniformemente il gel prima dell'incubazione in una soluzione di NaCl durante la notte a 4 ° C sotto agitazione. Tutti questi passaggi sono stati attentamente valutati per lavorare con piccole quantità di materiale.

Questo protocollo è stato applicato ai campioni FFPE RNA da fonti diverse (organi e istituzioni) che erano stati immagazzinati per diverse quantità di tempo. Le analisi hanno rivelato l'alta riproducibilità del sequenziamento piccoli RNA da campioni freschi e congelati, quando usando questo ottimizzato la procedura. Ulteriori analisi utilizzando vecchi campioni FFPE archiviati, memorizzati fino a 35 anni, ulteriormente dimostrato vasta applicabilità del protocollo campioni clinici. Il requisito minimo di FFPE RNA input per campioni FFPE è stato indicato per essere 100 ng. Questo requisito basso permette applicabilità del presente protocollo ad una varietà di lesioni di diverse dimensioni e disponibilità, ma non consentirebbe l'analisi della singola cella FFPE RNA. È importante notare, tuttavia, che questo ottimizzata protocollo è anche stata utilizzata con RNA totale Estratto da circolanti esosomi con ingressi inferiore a 1 ng e indicato per fornire altamente riproducibili piccoli profili di espressione di RNA (dati non mostrati). Questo ingresso basso suggerisce che piccole molecole di RNA in campioni FFPE, sebbene rappresentativo del tessuto fresco originale, sono presenti in percentuali molto inferiori rispetto a RNA totale da circolanti esosomi.

In recenti lavori, dove era stato applicato questo protocollo ottimizzato clinicamente classificate DCIS FFPE esemplari, è stato trovato che le differenze di espressione di miRNA identificate da NGS della libreria cDNA potrebbero essere convalidate mediante PCR quantitativa. Questo lavoro ha dimostrato la fattibilità dell'utilizzo di lesioni DCIS dai tessuti archiviati da diverse istituzioni per studi retrospettivi su larga scala [20]. Questo studio ha anche evidenziato la robustezza di questa preparazione di cDNA biblioteca quando eseguita in momenti diversi (a intervalli di diverse settimane), senza compromettere la sensibilità del dosaggio e riproducibilità.

Considerando la grande quantità di esemplari FFPE archiviati clinicamente classificate, questo protocollo ottimizzato fornisce uno strumento robusto per la preparazione di librerie di cDNA in analisi retrospettive su larga scala e per identificare potenziali biomarcatori miRNA è associato con cancro sviluppo21.

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Disclosures

Gli autori desiderano rivelare che una pubblicazione contenente alcuni dei dati presentati in questo manoscritto è stata pubblicata nel giornale internazionale delle scienze molecolari di Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Si ringrazia il Dr. Thomas Tuschl, capo del laboratorio di biologia molecolare del RNA, come pure i membri del suo laboratorio per il loro sostegno e per condividere la tecnologia sviluppata nel suo laboratorio e fornire l'accesso alla pipeline di RNAworld. Ringraziamo anche il Dr. Markus Hafner per suo protocollo di condivisione e di fornire descrizioni dettagliate su tutti i passaggi biochimici ed enzimatici utilizzati nella sua procedura iniziale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

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References

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