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सरल और प्रभावी प्रशासन और छोटी मछलियों के संचार प्रणाली में Microparticles के दृश्य गुर्दे इंजेक्शन का उपयोग

Biology

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Summary

यह लेख छोटी मछलियों के संचार प्रणाली में और vivo दृश्य में मछली के खून में microparticles के एक त्वरित, मिनिमली इनवेसिव इंजेक्शन फ्लोरोसेंट microparticles के सिद्धांतों को दर्शाता है ।

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Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Karnaukhov, D., Sadovoy, A., Meglinski, I., Timofeyev, M. Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection. J. Vis. Exp. (136), e57491, doi:10.3791/57491 (2018).

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Abstract

एक जीवित जीव में सूक्ष्म आकार के कणों के प्रणालीगत प्रशासन vasculature दृश्य, दवा और वैक्सीन वितरण, ट्रांसजेनिक कोशिकाओं और छोटे ऑप्टिकल सेंसर के आरोपण के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, नसों में microinjections छोटे जानवरों, जो ज्यादातर जैविक और पशु चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है, बहुत मुश्किल है और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है । इस के साथ साथ, हम वयस्क zebrafish के संचार प्रणाली में microparticles की शुरूआत के लिए एक मजबूत और कुशल विधि का प्रदर्शन (ढाणियो rerio) मछली गुर्दे में इंजेक्शन द्वारा । vasculature में शुरू microparticles कल्पना करने के लिए, हम मछली गिल में एक सरल intravital इमेजिंग तकनीक का प्रस्ताव । zebrafish रक्त पीएच के vivo निगरानी में एक इंजेक्शन microencapsulated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर पूरा किया गया था, SNARF-1, वर्णित तकनीक के संभावित आवेदनों में से एक को प्रदर्शित करने के लिए. इस लेख पीएच के encapsulation के प्रति संवेदनशील डाई का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है और जल्दी इंजेक्शन और फ्लोरोसेंट संकेत की vivo रिकॉर्डिंग में के लिए प्राप्त microcapsules के दृश्य के सिद्धांतों को दर्शाता है । इंजेक्शन की प्रस्तावित विधि एक कम मृत्यु दर (0-20%) और उच्च दक्षता (70-90% सफलता) की विशेषता है, और यह आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर संस्थान के लिए आसान है । सभी वर्णित प्रक्रियाओं ऐसी guppies और medaka के रूप में अंय छोटी मछली प्रजातियों, पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Introduction

एक पशु जीव में सूक्ष्म आकार के कणों के प्रशासन दवा और वैक्सीन वितरण के रूप में ऐसे क्षेत्रों में एक महत्वपूर्ण कार्य है1, vasculature दृश्य2, ट्रांसजेनिक सेल आरोपण3, और छोटे ऑप्टिकल सेंसर आरोपण 4 , 5. हालांकि, छोटी प्रयोगशाला पशुओं के संवहनी प्रणाली में अतिसूक्ष्म कणों के लिए आरोपण प्रक्रिया मुश्किल है, नाजुक जलीय जीवों के लिए विशेष रूप से । zebrafish जैसे लोकप्रिय शोध नमूनों के लिए, यह सलाह दी जाती है कि वीडियो प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन प्रक्रियाओं को स्पष्ट किया जाए ।

Intracardiac और केशिका microinjections zebrafish रक्त में microobjects के वितरण के लिए प्रशिक्षित कर्मियों और अद्वितीय microsurgery सुविधाओं की आवश्यकता होती है । पहले, एक रेट्रो कक्षीय मैनुअल इंजेक्शन3 पूरी कोशिकाओं के प्रशासन के लिए एक आसान और प्रभावी तरीका के रूप में सुझाव दिया गया था । हालांकि, हमारे अनुभव में, क्योंकि नेत्र केशिका नेटवर्क के छोटे से क्षेत्र में, यह इस तकनीक से वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए बहुत अभ्यास लेता है ।

इस के साथ साथ, हम मैनुअल इंजेक्शन द्वारा संचार प्रणाली में मजबूत और कुशल microparticle आरोपण के लिए एक विधि का वर्णन सीधे वयस्क zebrafish, जो केशिकाओं और गुर्दे वाहिकाओं में समृद्ध है के गुर्दे के ऊतकों में । इस तकनीक zebrafish गुर्दे6में सेल ट्रांसप्लांटेशन के लिए वीडियो प्रोटोकॉल पर आधारित है, लेकिन दर्दनाक और समय लेने वाली microsurgical कदम खत्म कर दिया गया । प्रस्तावित विधि कम मृत्यु दर (0-20%) और उच्च दक्षता (70-90% सफलता) की विशेषता है, और यह आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर संस्थान के लिए आसान है ।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा प्रत्यारोपित microparticles के दृश्य है (यदि वे फ्लोरोसेंट या रंग) में गिल केशिकाओं, जो इंजेक्शन की गुणवत्ता के सत्यापन के लिए अनुमति देता है, की संख्या का एक मोटा रिश्तेदार आकलन इंजेक्शन कणों, और परिसंचारी रक्त से सीधे शारीरिक माप के लिए वर्णक्रमीय संकेत का पता लगाने. वर्णित तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों का एक उदाहरण के रूप में, हम vivo माप में के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित zebrafish रक्त पीएच एक microencapsulated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर, SNARF-1, मूलतः Borvinskaya एट अल में सुझाव दिया२०१७5.

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं के अनुसार यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ के साथ पशु प्रयोगों के लिए आयोजित की गई और इर्कुत्स्क राज्य विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान संस्थान के पशु विषयों अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. Microcapsules का निर्माण

नोट: Microcapsules ले जाने के एक फ्लोरोसेंट डाई एक परत का उपयोग कर तैयार कर रहे है परत द्वारा विपरीत आरोप के विधानसभा7polyelectrolytes,8। सभी प्रक्रियाओं कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया गया ।

  1. फ्लोरोसेंट डाई संलग्न करने के लिए छिद्रित कएको छैन3 microcores संश्लेषित करने के लिए, मिश्रण SNARF-1-dextran समाधान के 2 मिलीलीटर (सबसे बहुलक-ऐसे FITC के रूप में फ्लोरोसेंट डाई-BSA इस्तेमाल किया जा सकता है) के एक एकाग्रता पर ~ 2 मिलीग्राम/एमएल के साथ ०.६ मिलीलीटर की प्रत्येक 1 मॉल/CaCl 2 के समाधान और ना2सह3 तेजी से सरगर्मी के तहत ।
    नोट: photobleaching करने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक के विभिन्न संवेदनशीलता पर ध्यान देना; यदि एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच (SNARF-1) की तरह इस्तेमाल किया, हेरफेर और microparticles के भंडारण के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए संभव के रूप में कम प्रकाश के रूप में ।
  2. आंदोलन के 5-10 एस के बाद, 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के निलंबन और 15 के लिए केंद्रापसारक पर 10000-12000 g गोली कएको छैन3 microcores के लिए स्थानांतरण ।
  3. त्यागें supernatant, के साथ कोर धो पानी की ~ 2 मिलीलीटर, और झटकों से गोली स्थगित ।
  4. इस केंद्रापसारक-धुलाई प्रक्रिया कुल में तीन बार दोहराएं । पिछले केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें ।
  5. एक अल्ट्रासोनिक स्नान में अपने एकत्रीकरण को कम करने के लिए 1 मिनट के लिए microcores की मशीन ।
    चेतावनी: headphones के साथ कान की रक्षा करने के लिए मत भूलना ।
  6. टेंपलेट्स पर पहली बहुलक परत जमा करने के लिए, में कोर reसस्पेंड ~ एक 4 मिलीग्राम/एमएल का समाधान पाली (allylamine हाइडरोक्लॉराइड) (पः) में 1 मॉल/L NaCl ।
    1. लगातार मिलाते के साथ ~ 5 मिनट के लिए समाधान में microcores रखो ।
    2. केंद्रापसारक के 15 एस के बाद, असीम पः के साथ supernatant त्यागें । कई केंद्रापसारक और कपड़े धोने के चरणों के माध्यम से पानी के नीचे से कम 3 बार microcores के साथ कवर धोया । पिछले केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें ।
    3. एक अल्ट्रासोनिक स्नान में अपने एकत्रीकरण को कम करने के लिए 1 मिनट के लिए microcores की मशीन ।
      नोट: यदि एप्लाइड फ्लोरोसेंट डाई cationic है, पाली (सोडियम 4-styrenesulfonate) से शुरू (PSS) 1 मॉल में/L NaCl (१.७ कदम देखें) ।
  7. दोहराएँ चरण १.६ के साथ ~ 2 मिलीलीटर की एक 4 मिलीग्राम/एमएल समाधान के PSS (भी 1 मॉल/NaCl) पर दूसरी बहुलक परत जमा करने के लिए टेंपलेट्स ।
  8. 12 बहुलक परतों को जमा करने के लिए छह बार १.६ और १.७ चरणों को दोहराएँ ।
    नोट: यह अनुशंसित नहीं है एक लंबे ब्रेक लेने के लिए (~ 12 ज या अधिक) प्रक्रिया में जब तक ~ 3-5 परतों जमा किया गया है क्योंकि कवरेज के बिना कएको छैन3 microcores को फिर से क्रिस्टलीकरण कर सकते हैं । ध्यान दें कि PSS कवरेज microcores का एक उच्च एकत्रीकरण का कारण बनता है, और लंबे ठहराव उचित है जब पः या पाली-L-lysine पॉलीथीन के साथ भ्रष्टाचार ग्लाइकोल (पीएलएल-g-खूंटी) सबसे अधिक परत है ।
  9. 2 मिलीग्राम/एमएल पीएलएल-जी-खूंटी में कवर microcores की मशीन (~ 1 microtube प्रति मिलीलीटर) कम से 2 ज के लिए ।
    1. microcores पानी के साथ अनुक्रमिक केंद्रापसारक और resuspension चरणों के माध्यम से धो लो । पिछले केंद्रापसारक के बाद, supernatant त्यागें ।
  10. खोखले microcapsules प्राप्त करने के लिए, कएको छैन3 टेम्पलेट्स को भंग करके ०.१ मॉल के 2 मिलीलीटर/L ethylenediaminetetraacetic अम्ल (EDTA) समाधान (NaOH के साथ पीएच ७.१ के लिए समायोजित) कवर microcores को जोड़कर.
    1. मशीन के ~ 5 मिनट के बाद, ४५ एस के लिए microcapsules केंद्रापसारक और EDTA के साथ supernatant त्यागें ।
    2. दोहराएं चरण 1.10-1.10.1 दो बार ।
  11. धोने चरणों के बाद ४५ एस के भीतर कई केंद्रापसारक कदम के माध्यम से ०.९% NaCl तीन बार के साथ microcapsules धो लो । पिछले केंद्रापसारक कदम के बाद, supernatant त्यागें ।
    नोट: इंजेक्शन के लिए अंतिम microcapsule समाधान बाँझ रखा जाना चाहिए (उदाहरण के लिए एम्पीसिलीन जोड़कर, ०.१ मिलीग्राम/एमएल), और मीडिया जांच की वस्तु के साथ संगत होना चाहिए (तटस्थ पीएच के साथ isotonic मीडिया).
  12. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत एक hemocytometer में तैयार microcapsules की एकाग्रता का अनुमान लगाएं । microcapsules के चित्रों की एक श्रृंखला ले लो, ImageJ9 या समकक्ष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बारे में एक सौ microcapsules के व्यास को मापने, और आकार वितरण की जांच हिस्टोग्राम का उपयोग कर ।
  13. अंधेरे में प्राप्त encapsulated जांच की दुकान ।
    नोट: बाँझ ०.९% NaCl में कई धोने के बाद, microcapsules 4 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है. भंडारण के दौरान microcapsules की पूरी सुखाने की सिफारिश नहीं है ।

2. ऑप्टिकल सेटअप और Microencapsulated SNARF-1 के अंशांकन की तैयारी

नोट: microencapsulated SNARF-1 के साथ किसी न किसी पीएच माप एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप7के दो चैनलों में छवियों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में एक एक चैनल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक फाइबर स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़ा लागू किया गया था.

  1. एप्लाइड फ्लोरोसेंट डाई की विशेषताओं के अनुसार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए प्रतिदीप्ति फिल्टर का आवश्यक सेट प्लेस और फ्लोरोसेंट लैंप पर बारी ।
    1. eyepieces के लिए लीवर को बाहर खींचो ।
      चेतावनी: अतिरिक्त प्रकाश स्पेक्ट्रोमीटर मैट्रिक्स को नुकसान पहुंचा सकता है । इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि स्पेक्ट्रोमीटर उपयोग नहीं किया जाता है जब लीवर "ऐपिस" मोड में है ।
    2. स्पेक्ट्रोमीटर और एक संधानक के लिए दूसरे छोर को ऑप्टिकल फाइबर के एक छोर से कनेक्ट करें । एडेप्टर का उपयोग, कैमरा ट्यूब या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के अन्य उपलब्ध बंदरगाह के ध्यान में संधानक जगह है.
    3. स्पेक्ट्रोमीटर को चालू करें । स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण प्रोग्राम चलाएं और माप के लिए स्पेक्ट्रोमीटर तैयार करें ।
  2. microcapsule बैच के अंशांकन के लिए, जगह ~ 5 µ l के microcapsule निलंबन (~ १० ००० microcapsules प्रति µ l में पानी में) एक खुर्दबीन स्लाइड पर, और एक अंधेरी जगह में ड्रॉप सूखी (उदाहरण के लिए, एक थर्मोस्टेट में ३५ डिग्री सेल्सियस).
    1. microencapsulated SNARF-1 के वर्णक्रमीय विशेषताओं जांचना करने के लिए, सीमा में अलग पीएच मान के साथ बफ़र्स की एक श्रृंखला का उपयोग ~ 6-9 । ड्रॉप ~ 10 SNARF के साथ सूखे microcapsules पर एक बफर के µ एल-1-dextran और यह एक coverslip के साथ कवर ।
    2. कांच की स्लाइड को माइक्रोस्कोपी स्टेज पर रखें । एक × ४० उद्देश्य का उपयोग कर microcapsules का पता लगाएँ ।
    3. कैमरा बंदरगाह के लिए माइक्रोस्कोप लीवर की बारी है । स्पेक्ट्रोमीटर के साथ उनके प्रतिदीप्ति रजिस्टर करें । लीवर को वापस eyepieces पर घुमाएं ।
      नोट: वर्णक्रमीय संकेत अभी तक पृष्ठभूमि स्तर से परे है, और यह सुनिश्चित करें कि देखने के क्षेत्र में microcapsules एक बुलबुला में नहीं हैं (एक कम आवर्धन के लिए स्विचन द्वारा यदि आवश्यक हो तो). एक ही microcapsules के लंबे समय तक रोशनी से बचें । SNARF-1 photobleaching के प्रति संवेदनशील है ।
    4. दोहराएं चरण 2.2.3 भिंन microcapsules 10-15 बार के लिए ।
  3. सभी पंजीकृत स्पेक्ट्रा के लिए प्रतिदीप्ति पीक अनुपात (उदाहरण के लिए, R या Scilab का उपयोग करके) की गणना करें और माध्य अनुपात (प्रत्येक बफ़र के लिए) के बीच प्रतीपगमन रेखा निर्धारित करें और निम्न सूत्र का उपयोग करके मध्यम pH:
    Equation 1
    नोट: SNARF-1 protonated और deprotonated डाई के उत्सर्जन के लिए इसी दो चोटियों के साथ एक स्पेक्ट्रम है, और चोटियों के बीच अनुपात माध्यम के पीएच के लिए उत्तरदायी है. इस अध्ययन में, ६०५ और ६६० एनएम के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच अनुपात का उपयोग किया जाता है । इन तरंग दैर्ध्य फिल्टर इस्तेमाल किया सेट के आधार पर चुना जाता है । a और b गैर-रेखीय प्रतीपगमन (उदाहरण के लिए, R का उपयोग करके) निर्धारित करने के लिए गुणांक हैं । मान ०.१५ और १.१ हैं, क्रमशः, न्यूनतम और अधिकतम मान की मैं६०५/I६६० अंशांकन के दौरान स्वीकार्य है ।
  4. लगभग 5 वयस्क जानवरों से मछली के रक्त के बारे में 10 µ एल लीजिए । 1 µ एल के साथ एक पेट्री डिश में मछली प्लेस/पानी संज्ञाहरण के लिए लौंग के तेल के निलंबन और जब तक पशु अपनी तरफ मुड़ता है और इंतजार करना बंद हो जाता है फिन की चुटकी (आमतौर पर ~ 2-3 मिनट) । एक गिलास स्लाइड पर मछली स्थानांतरण । एक नुकीला के साथ मछली पूंछ कट और पूंछ नस से मछली के खून की लगभग 2 µ एल इकट्ठा ।
    नोट: रक्त के थक्के को रोकने के लिए, हेपरिन (५००० U/एमएल) के साथ चीरा का इलाज और रक्त इकट्ठा करने के लिए heparinized ग्लास केशिकाओं और microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें ।
    1. microelectrode की नोक पर एक पिपेट के साथ रक्त के बारे में 10 µ एल ड्रिप और पीएच एक पीएच का उपयोग कर मीटर निर्धारित करते हैं ।
    2. सूखे microcapsules के साथ एक स्लाइड पर रक्त ड्रॉप और अंशांकन बफ़र्स के लिए वर्णित के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात रजिस्टर (चरण २.२-२.३).
  5. वक्र बनाने के लिए अंशांकन वक्र के रैखिक गुणांक को समायोजित मछली रक्त में माप मैच (अधिक जानकारी के लिए देखें Borvinskaya एट अल. २०१७5) ।

3. इंजेक्शन के लिए तैयारी

  1. एक तेज नुकीला के साथ प्लास्टिक को हटाकर इंसुलिन पेन (या सिरिंज) की नोक से स्टील की सुई छोड़ें.
    नोट: किसी भी पतली सुई (ø ०.३३ मिमी या कम) या कांच केशिका (आमतौर पर Ø1 मिमी) microinjection10,11के लिए तैयार किया जा सकता है.
  2. गिलास microcapillary में आधे रास्ते सुई डालें; जल्दी और धीरे यह एक गैस मशाल का उपयोग कर मिलाप ।
  3. microinjector करने के लिए कांच microcapillary कनेक्ट और यह बाँझ पानी के साथ तीन बार फ्लश । सुनिश्चित करें कि तरल सुई के माध्यम से बहती है ।
  4. आसुत जल के साथ प्रणाली भरें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सिस्टम में कोई बुलबुले हैं ।

4. इंजेक्शन

  1. microcapsules के तैयार निलंबन reसस्पेंड (बाँझ ०.९% NaCl, या किसी भी अन्य मीडिया इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया, microliter प्रति ६,०००,००० microcapsules की एकाग्रता के साथ) 1 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग कर.
    नोट: के बाद से microcapsules के लिए करते हैं, निम्नलिखित इंजेक्शन के दौरान, microcapsules के साथ शीशी हिला (एक रोटर का उपयोग करके) या मैन्युअल रूप से हर कुछ मिनट उन्हें reसस्पेंड और उनके एकत्रीकरण को रोकने के लिए.
  2. संवेदनाहारी के साथ एक पेट्री डिश में मछली प्लेस (०.१ मिलीलीटर/पानी में निलंबित लौंग के तेल की) ~ 2-3 मिनट के लिए रुको जब तक मछली अपनी तरफ मुड़ता है और फिन के एक प्रकाश चुटकी का जवाब बंद हो जाता है ।
  3. एक चंमच का प्रयोग, संवेदनाहारी से बाहर मछली हस्तांतरण और धीरे बाएं की ओर सिर के साथ एक पार्श्व की स्थिति में एक नम स्पंज पर यह जगह (दाएं हाथ के व्यक्ति के लिए) या सही (बाएं हाथ व्यक्ति के लिए) की ओर ।
  4. बस इंजेक्शन से पहले, microinjector के साथ जुड़े कांच केशिका में हवा के 1-2 मिमी चूसना । फिर, इसे फैलाने वाले microcapsules के लगभग 2 µ l के साथ लोड करें ।
    नोट: इंजेक्शन से पहले, microcapsule समाधान तापमान जिस पर मछली रखा जाता है करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए ।
  5. धीरे गैर प्रमुख हाथ से स्पंज पर मछली के शरीर को स्थिर ।
    1. मछली की पार्श्व पंक्ति खोजें । मानसिक रूप से एक खंड है कि operculum से उदर गुहा के अंत तक फैली चुनें । इस सेगमेंट के बीच का पता लगाएं । सुई 1 मिमी ventral दिशा में कम रखो ।
    2. एक परिमार्जन आंदोलन के साथ, धीरे से मछली तराजू एक तरफ ले जाते हैं, और एक पंचर बनाते हैं । मेज की सतह के लिए ४५ ° के एक कोण पर शरीर में सुई डालें ।
    3. रीढ़ की ओर सुई पुश जब तक यह ध्यान से इसके खिलाफ टिकी हुई है ।
    4. गुर्दे में ' microcapsules निलंबन के लगभग 1 µ एल रिलीज, और धीरे सुई वापस ले लो ।
      नोट: अधिक आसानी से उचित पंचर साइट खोजने के लिए, यह एक नीचे प्रकाश का उपयोग कर मछलियों transilluminating द्वारा ट्रंक गुर्दे खोजने अभ्यास करने के लिए उपयोगी है, के रूप में चित्र 2a और बी bमें दिखाया गया है ।
  6. पानी की एक धारा के साथ पूंछ के लिए सिर से मछली कुल्ला इंजेक्शन साइट पर किसी भी गिरा microcapsules को दूर करने के लिए ।

5. Vivo दृश्य में

  1. मछली सिर से गिल कवर हटाने और मछली गिल को निर्वस्त्र करने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें । पानी के साथ गिल कुल्ला ।
  2. एक चंमच का प्रयोग, एक खुर्दबीन स्लाइड को मछली हस्तांतरण, और यह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के मंच पर जगह है ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मछली के गिल लगातार प्रक्रियाओं के दौरान बाहर सूखी नहीं है । इस से बचने के लिए, समय पर उंहें एक पाश्चर पिपेट (लगभग हर 1-2 मिनट) का उपयोग कर पानी के साथ गीला ।
  3. कमरे अंधा और कम इज़ाफ़ा (x10 उद्देश्य) का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंट microcapsules खोजने के लिए गिल का निरीक्षण किया ।
    नोट: जब प्रक्रिया मछली संचार प्रणाली में कुछ फ्लोरोसेंट कणों की शुरूआत के लिए प्रयोग किया जाता है, यह इंजेक्शन से पहले अप्रत्याशित फ्लोरोसेंट कणों के लिए कई व्यक्तियों के गिल का निरीक्षण करने के लिए सिफारिश की है । जंगली-प्रकार zebrafish के गिल autofluorescence नहीं है, लेकिन कुछ मामलों में छिटपुट फ्लोरोसेंट कणों (जैसे खाना टुकड़े या कोशिकीय symbionts) गिल पर उपस्थित हो सकता है । यदि आवश्यक हो, ऐसे कणों को उनके विशिष्ट आकार के आधार पर पहचाना जा सकता है (उदाहरण के लिए, भोजन के टुकड़ों में गोलाकार microcapsules के विपरीत अनियमित आकार होता है) या प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम (यानी, रंग) ।
    1. एक उच्च परिमाण के लिए लेंस स्विच (× ४० उद्देश्य), और एक microcapsule या देखने के क्षेत्र के केंद्र में microcapsules के एक समूह की स्थिति ।
    2. एक कनेक्टेड स्पेक्ट्रोमीटर के साथ बंदरगाह के लिए लीवर बारी । वर्णक्रमीय संकेत रिकॉर्ड.
    3. लीवर को वापस ऐपिस पर घुमाएं ।
    4. विभिंन microcapsules के लिए कई बार माप दोहराएं ।
  4. वसूली के लिए उचित वातन के साथ मछलीघर में मछली हस्तांतरण ।
    नोट: न्यूनतम अभ्यास के साथ, यह मछली प्रति 2-3 मिनट की अनुमानित दर पर इंजेक्शन और संकेत रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए संभव है. माप एक व्यक्ति कई बार दोहराया कम के उपयोग के साथ दोहराया जा सकता है, संज्ञाहरण के हानिरहित खुराक या निर्धारण की किसी अन्य विधि. लंबी अवधि के अवलोकन के लिए, लगातार संज्ञाहरण12के साथ एक प्रणाली का उपयोग करें ।

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Representative Results

प्राप्त परिणाम प्रस्तुत प्रोटोकॉल के तीन मुख्य श्रेणियों में से एक से आते हैं: एक फ्लोरोसेंट डाई के encapsulation द्वारा फ्लोरोसेंट microparticles के गठन (चित्रा 1), आगे दृश्य के साथ microcapsules के गुर्दे इंजेक्शन में गिल केशिकाओं (चित्रा 2 और 3) और, अंत में, में vivo वर्णक्रमीय रिकॉर्डिंग SNARF-1 प्रतिदीप्ति रक्त पीएच स्तर (चित्रा 4) की निगरानी करने के लिए.

परत दर परत दृष्टिकोण कएको छैन3 विपरीत चार्ज पॉलिमर के कई परतों से डाई संलग्न कोर (पः और PSS) और एक सबसे बाहरी परत के एक गैर-संगत बहुलक (पीएलएल-g-खूंटी) एक सरल और लागत प्रभावी तरीका है की कोटिंग का उपयोग कर विधि जैसे SNARF-1-dextran, FITC-BSA या दूसरों के रूप में अलग फ्लोरोसेंट जांच encapsulate करने के लिए अनुमति (आंकड़ा 1a) । नतीजतन, खोखले स्थिर अर्द्ध पारगंय लोचदार गोले के साथ micrometric आकार के microcapsules और फ्लोरोसेंट डाई के साथ भरी हुई (आंकड़ा 1b) प्राप्त कर रहे हैं । इस तकनीक द्वारा गढ़े microcapsules आम तौर पर गैर वर्दी, कण आकार और प्रत्येक बैच (चित्रा 1С) में विशिष्ट औसत आकार के एक सामांय वितरण के साथ कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : परत-दर-परत संश्लेषण और खोखले polyelectrolyte microcapsules के लक्षण वर्णन एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ भरी हुई । (a) एक microcapsules विधानसभा की योजना (Gurkov एट अल. २०१६4में प्रकाशित एक समान योजना से तैयार). (ख) खोखले microcapsules के चित्र फ्लोरोसेंट डाई FITC-BSA के साथ भरी हुई । (ग) आंकड़ा 1bसे microcapsules के बैच के आकार लक्षण वर्णन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

छोटे मछलियों के संचार प्रणाली में मजबूत और कुशल microparticle आरोपण मैनुअल इंजेक्शन द्वारा सीधे मछली गुर्दे में किया जा सकता है । मछली शरीर (ट्रंक गुर्दे) के उचित स्थल में पंचर मैनुअल इंजेक्शन द्वारा microparticles के तेजी से वितरण के लिए महत्वपूर्ण है । मछली गुर्दे एक टेम अंग है और pigmented melanophores शामिल है, और इस प्रकार, यह अच्छी तरह से रंग का है । क्योंकि यह तैरने मूत्राशय के पारदर्शी कक्षों के बीच बसे है, यह कमजोर रंजकता के साथ बरकरार पशु में अंग की पहचान करने के लिए या छोटी मछलियों के transillumination द्वारा एक नीचे प्रकाश स्रोत का उपयोग कर, जैसा कि चित्र 2a और बीमें दिखाया आसान है ।

Figure 2
चित्रा 2 : गुर्दा इंजेक्शन के लिए उचित स्थल का स्थानीयकरण । (क) zebrafish की ट्रांस रोशनी ट्रंक गुर्दा (तीर) के स्थानीयकरण दर्शाता है । (ख) योजना कैसे उचित पंचर साइट की पहचान करने के लिए दिखाता है । सफेद बिंदीदार रेखा मछली के उदर खंड की पार्श्व रेखा को इंगित करता है । तीर पंचर और रीढ़ की ओर इंजेक्शन की उचित दिशा के लिए साइट को इंगित करता है । तैरना मूत्राशय ग्रीन लाइन द्वारा नामित है । (ग) अंगों और शरीर की दीवार को हटाने के बाद zebrafish गुर्दे का दृश्य । एक तीर ट्रंक गुर्दे के केंद्रीय उभार को अंक । (घ) d. rerio के एक sagittal ऊतकवैज्ञानिक खंड वयस्क मछली के आंतरिक अंगों के सामांय शरीर रचना विज्ञान (एच एंड ई दाग) दिखाता है । (ङ) एक मछली गुर्दे की Micrograph (बिंदीदार) से छोटा (डी) एक पीछे कार्डिनल नस के लुमेन की ओर इशारा करते हुए तीर के साथ । तारक का संकेत है तैरना मूत्राशय । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इंजेक्शन प्रक्रिया की सफलता की जांच करने के लिए, कम बढ़ाई (x10-20 उद्देश्य) में गिल के एक तीव्र दृश्य निरीक्षण मछली गिल कवर (3 ए आंकड़ा) काटने के बाद किया जाना चाहिए । इंजेक्शन साइट पर शेष microcapsules के अधिकांश के बावजूद या शरीर गुहा (चित्र बी) में फैल रहा है, अगर इंजेक्शन सही ढंग से किया जाता है, यह फ्लोरोसेंट microcapsules के गिल केशिकाओं में मुक्त रूप से तैर निरीक्षण करने के लिए संभव है इंजेक्शन के तुरंत बाद नग्न मछली गिल (चित्रा 3सी) । यदि कोई फ्लोरोसेंट कणों गिल में पता चला रहे हैं, यह एक ही पंचर में इंजेक्शन दोहराने के लिए संभव है । खून के लिए सफल प्रसव के कुल इंजेक्शन मछली के लगभग 70-90% में प्राप्त किया जाना चाहिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : गिल केशिकाओं में आगे दृश्य के साथ microcapsules के गुर्दे इंजेक्शन । (क) zebrafish खून में microcapsule प्रसव की समग्र योजना. (ख) हरी FITC के साथ microcapsules के इंजेक्शन के बाद एक zebrafish की फ्लोरोसेंट छवि-BSA डाई (पंचर साइट एक तीर से संकेत दिया है) । (ग) मछली के गिल की यह तस्वीर, (बी) से स्केल, गुर्दे इंजेक्शन द्वारा microcapsules के सफल प्रसव को दर्शाता है (जंगली के गिल प्रकार zebrafish कोई autofluorescence है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

मछली ट्रंक गुर्दे में सीधे इंजेक्शन के दौरान, पंचर साइट के नीचे व्यापक चोट सामांय रूप से, पैरेन्काइमा केशिकाओं या गुर्दे वाहिकाओं को नुकसान का संकेत है । शरीर से बाहर खून का रिसाव नहीं होने के कारण पंचर जल्दी से कांट्रेक्ट पर दिखाई देता है । आंतरिक रक्तस्राव के बावजूद, व्यक्तियों को अभी भी लगभग 80-90% प्रक्रिया (तालिका 1) के माध्यम से जीवित के साथ ठीक हो सकता है । यह भी ज्ञात है कि मछली प्रजातियों13,14चोट के बाद बिगडते de नोवो पुनर्जीवित कर सकते हैं । यदि मछली के 20% से अधिक मर रहे हैं, एक सुनिश्चित करना चाहिए कि anesthetization ठीक से किया जाता है ।

समझाया फ्लोरोसेंट डाई एन एकाग्रता, microcapsules प्रति µ l इंजेक्शन की मात्रा, µ एल microcapsules का औसत व्यास, µm मछली के खून में सफल डिलिवरी,% इंजेक्शन के बाद मृत्यु दर,%
1 ज 1 दिन
ट्रंक गुर्दे में इंजेक्शन
FITC-BSA ३६ 4 x 106 १.६ २.७ ९४ 8 3
SNARF-1-dextran 29 3-6 x 105 1-2 ५.१ ७२ 7 12
RITC-dextran 20 6 x 106 2 २.० ७० 0 0
०.९% NaCl ४१ - 1-2 - - 5 0
रेट्रो-कक्षीय इंजेक्शन
FITC-BSA 9 1 x 105 2 ४.२ 11 22 0
RITC-dextran 11 6 x 106 1 २.० 9 18 0

तालिका 1. सुरक्षा और zebrafish खून में microcapsules के वितरण की क्षमता । प्रक्रिया की सफलता मछली गिल केशिकाओं में फ्लोरोसेंट सामग्री की उपस्थिति से निर्धारित होता है ।

यदि इंजेक्शन microparticles की एकाग्रता अपर्याप्त है, बहुत कुछ कणों को तेजी से मछली गिल में visualized किया जा करने के लिए उपलब्ध हो सकता है । एक ही समय में, एक बहुत उच्च एकाग्रता के साथ एक निलंबन सुई रोकना कर सकते हैं । परत द्वारा परत के मामले में माध्य व्यास ~ 2-5 µm, लगभग 4 * 105-6 * 106 microcapsules प्रति µ एल के साथ इकट्ठे microcapsules मछली गुर्दे में इंजेक्शन के बाद मछली गिल में सरल का पता लगाने के लिए इष्टतम है (तालिका 2).

एकाग्रता, microcapsules प्रति µ l विभिंन व्यक्तियों (n = 7 एकाग्रता के अनुसार) के गिल में देखने के एक माइक्रोस्कोप क्षेत्र में microcapsules की संख्या (× 20 उद्देश्य)
4 x 106 > १०० > १०० 0 > १०० ≈ ७० ≈ ५० > १००
4 x 105 ≈ 10 ≈ 20 0 0 ≈ 20 ≈ ४० ≈ 15
4 x 104 0 3 0 0 0 0 4
4 x 103 0 0 0 0 0 0 0

तालिका 2. rerio में FITC-BSA-युक्त microcapsules के दृश्य गिनती का रिकार्ड इंजेक्शन के बाद गिल (१.६ µ एल) ट्रंक गुर्दे में ।

मछली संचार प्रणाली में microparticles आरोपण के प्रस्तावित विधि vivo zebrafish रक्त पीएच के microencapsulated फ्लोरोसेंट जांच, SNARF-1 (चित्रा 4) द्वारा निगरानी में के लिए लागू किया जा सकता है । SNARF-1 protonated और deprotonated डाई (चित्रा 4a) के उत्सर्जन के लिए इसी दो चोटियों के साथ एक स्पेक्ट्रम है, इस प्रकार मीडिया के विभिन्न पीएच में चोटियों के बीच अनुपात के अंशांकन घटता साजिश रची जा सकता है (चित्रा 4B). रक्त के घटकों के readout encapsulated SNARF-1 (चित्रा 4B), जो microcapsules द्वारा रक्त पीएच के एक साथ माप द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और एक पीएच-एक ग्लास microelectrode के साथ मीटर के प्रभाव । zebrafish रक्त में microcapsules के लिए एक ख्यात अंशांकन वक्र द्वारा बफ़र्स वक्र स्थानांतरण द्वारा रची जानी चाहिए pH अंतर के बराबर गुणांक द्वारा प्रयोग मापा (देखें Borvinskaya एट अल. २०१७5 विवरण के लिए) ।

zebrafish गिल केशिकाओं में रक्त पीएच microcapsules (चित्रा 4c) के इंजेक्शन के बाद कम से कई घंटे के दौरान स्थिर रहता है । एक ही समय में, एक छोटी hypercapnic जोखिम रक्त पीएच, जो vivo अनुसंधान में छोटी मछलियों पर के लिए विधि की प्रयोज्यता दर्शाता है की एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है ।

Figure 4
चित्र 4 : zebrafish रक्त की निगरानी का प्रतिनिधि उदाहरण рН के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के रजिस्ट्रेशन द्वारा microencapsulated डाई SNARF-1. (क) स्पेक्ट्रा अलग पीएच में सोडियम फास्फेट बफ़र्स में SNARF-1 के साथ भरी हुई तैयार microcapsules का. (ख) सोडियम फॉस्फेट बफ़र्स में और निकाले zebrafish रक्त में तैयार पीएच-संवेदी microcapsules के अंशांकन curves । सभी माप के लिए, मतलब ± मानक विचलन दर्शाया गया है । (ग) के एक प्रतिनिधि उदाहरण में vivo निगरानी में zebrafish रक्त рН द्वारा समझाया फ्लोरोसेंट SNARF-1 डाई zebrafish गिल केशिकाओं में । नियंत्रण की स्थिति में, रक्त पीएच microcapsules के इंजेक्शन के बाद 4 घंटे के दौरान स्थिर रहता है, जबकि 5 मिनट के जोखिम के तहत गंभीर hypercapnia (900-1000 मिलीग्राम/एल भंग सह2) मछली रक्त के अंलीकरण का कारण बनता है । तारांकन p < ०.०१ (मान-Whitney U test) के साथ समानांतर नियंत्रण समूह से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

zebrafish गुर्दे में microparticles के इंजेक्शन का प्रदर्शन करने के लिए, हम अर्द्ध पारगंय microcapsules एक संकेतक डाई के साथ भरी हुई थी । इस प्रकार, प्रोटोकॉल microcapsules के निर्माण के लिए निर्देश शामिल है परत द्वारा विपरीत आरोप polyelectrolytes7,8,15,16,17 के विधानसभा परत का उपयोग ,18 (आंकड़ा 1a) । इस तकनीक का एक लाभ यह है कि यह उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों के साथ प्रदर्शन करने के लिए आसान है । शर्तों और यौगिकों का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है, गढ़े microcapsules ०.५ से १०० µm nanometers-मोटी polyelectrolyte खोल15के साथ रेंज कर सकते हैं । संश्लेषण पैरामीटर 12 परतों से मिलकर लोचदार microcapsules में इस पांडुलिपि परिणाम में वर्णित (अंतिम की संगत परत के अलावा) पॉलिमर के लगभग 2-6 µm आकार में (आंकड़ा 1b और 1C). सबसे महत्वपूर्ण microcapsules के आकार का निर्धारण कदम टेंपलेट microcores के गठन है । इस प्रक्रिया में कैल्शियम कार्बोनेट क्रिस्टल के सहज गठन शामिल है, और इसलिए, प्राप्त कणों गैर समान हैं । इसलिए, microcapsule आकार वितरण के लक्षण वर्णन हर बैच के लिए किया जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण चरण micromanipulation तकनीकों के उपयोग के बिना zebrafish संचार प्रणाली में microparticles के वितरण का अनुकूलन है । रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन द्वारा पूरे कोशिकाओं के प्रशासन पहले विस्तार से3में वर्णित किया गया है । हालांकि, हमारे अनुभव में, नौसिखिया उपयोगकर्ताओं इंजेक्शन दक्षता लेखकों द्वारा वर्णित हासिल करने के लिए आसान नहीं है, क्योंकि रेट्रो कक्षीय साइनस बहुत छोटा है और ग्रसनी और गिल मेहराब के करीब स्थित है, जो गलती से एक सुई के साथ घायल करने के लिए आसान कर रहे हैं. एक मिलीमीटर से कम सटीकता इंजेक्शन के लिए आवश्यक है के बाद से, इंजेक्शन ठीक से एक जगह मुश्किल काम है । एक समान रूप से जल्दी और अधिक कुशल विकल्प (तालिका 1) को मछली गुर्दे पैरेन्काइमा में सीधे सुई है । इंजेक्शन के दौरान, सुई यांत्रिक रूप से नुकसान गुर्दे केशिकाओं और रक्त वाहिकाओं (उदाहरण के लिए, सबसे बड़ा पीछे कार्डिनल नस), जो संचार प्रणाली में microparticles के प्रवेश की अनुमति देता है (चित्रा 2E). अंत में, वयस्क zebrafish में ट्रंक गुर्दे के केंद्रीय उभार काफी बड़ा है (अप करने के लिए 2 मिमी) microsurgical उपकरण के बिना एक मैनुअल इंजेक्शन के लिए.

इंजेक्शन सुई की उचित स्थिति एक सफल मैनुअल प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण है । आप एक नीचे प्रकाश का उपयोग कर transilluminating मछलियों द्वारा बरकरार पशुओं में ट्रंक गुर्दे खोजने का अभ्यास कर सकते हैं, के रूप में चित्र 2a और बी bमें दिखाया गया है । चित्रा बी में योजना को दर्शाता है कैसे ठीक से इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए । यदि प्रक्रिया को रक्त प्रवाह में microparticles प्रशासन विफल रहता है, पुनः इंजेक्शन एक ही पंचर पर व्यक्तियों के जीवित रहने की दर पर वस्तुतः कोई प्रभाव के साथ एक कम समय सीमा के भीतर किया जा सकता है ।

वयस्क zebrafish के ट्रंक गुर्दे में इंजेक्शन (भी सफलतापूर्वक वयस्क गप्पी Poecilia रेटिकुलाटापर परीक्षण) एक स्वीकार्य पशु मृत्यु दर के साथ मछली खून में microparticle प्रसव का एक प्रभावी तरीका है; हालांकि, यह दवा इंजेक्शन मात्रा में बदलाव के कारण प्रशासन के लिए पूरी तरह से उपयुक्त नहीं है । इस तकनीक का एक कमजोर बिंदु तेजी से प्रशासन की वजह से पेट में गुर्दे के बाहर समाधान का एक महत्वपूर्ण रिसाव है । फिर भी, खून में इंजेक्शन पदार्थ की एक रिश्तेदार राशि लगभग गिल केशिकाओं (तालिका 2) में दृश्य का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । इंजेक्शन की मात्रा की कोई सख्त सीमा नहीं है, लेकिन प्रशासन के निलंबन के 1 से अधिक µ एल के अप्रभावी प्रतीत होता है । बेहतरीन कांच केशिकाओं microinjection के लिए लागू किया जा सकता है; हालांकि, microcapsules की एक बड़ी संख्या एकत्रीकरण को उत्तेजित करने के लिए जाता है, क्योंकि, हम सुई लुमेन में रोकना से बचने के लिए 31-29G (Ø 0.33-0.25 मिमी) इस्पात सुई के उपयोग की सलाह देते हैं ।

रक्त में गुर्दे इंजेक्शन के माध्यम से microcapsule प्रसव की सफलता गिल में फ्लोरोसेंट कणों की उपस्थिति के लिए तेजी से निरीक्षण का उपयोग कर निगरानी की जानी चाहिए । गिल आसानी से पहुंच के लिए कर रहे है अंगों में vivo प्रेक्षणों । गिल रेशा श्वसन उपकला की एक पतली परत द्वारा कवर रक्त केशिकाओं का एक नेटवर्क है, जो गिल में रक्त के प्रवाह की intravital इमेजिंग बनाता है विशेष रूप से सुविधाजनक (एक तरह का प्राकृतिक ऑप्टिकल विंडो). अवलोकन करने के लिए, उपास्थि गिल कवर तंतु को बेनकाब करने के लिए काटा जा सकता है । यह प्रक्रिया मछली के लिए सुरक्षित है, जो जीवन प्रत्याशा में कमी के बिना अच्छी तरह से वातित पानी में नंगा गिल के साथ रह सकते हैं । इसके अलावा, बड़ी मछलियों के गिल एक माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जा सकती है बस operculum धक्का से बाहर के रास्ते19। एक सफल इंजेक्शन के मामले में, फ्लोरोसेंट microparticles तुरंत गिल (चित्रा 3) में दिखाई देते हैं । ध्यान दें कि प्रत्यारोपित microparticles काफी परिचालित रक्त की मात्रा में भंग कर रहे हैं, और कणों की एक कम संख्या गिल केशिकाओं तक पहुँचने, microparticles के इस प्रकार पर्याप्त एकाग्रता के बाद मछली गिल में पता लगाने के लिए चुना जाना चाहिए मछली गुर्दे (तालिका 2) में इंजेक्शन ।

आरोपण के लिए प्रस्तावित प्रक्रिया छोटी मछलियों की विभिन्न प्रजातियों को शामिल अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू किया जा सकता है. तकनीक के बावजूद विकसित किया गया है और संचार प्रणाली में फ्लोरोसेंट microparticles के इंजेक्शन के लिए अनुकूलित, यह भी गैर के आरोपण के लिए लागू किया जा सकता है-सूक्ष्म रंग का/नैनोकणों या भंग पदार्थ; हालांकि, इस मामले में इंजेक्शन की प्रभावशीलता कुछ अन्य तरीके से सत्यापित किया जाना चाहिए । वर्तमान में वर्णित चरणों शारीरिक निगरानी के रूप में इस तरह के प्रयोजनों के लिए इष्टतम है अलग ऑप्टिकल माइक्रो या nanosensors, vasculature के दृश्य, टीके या कुछ ऑप्टिकली दिखाई वाहक पर दवाओं के वितरण, और के आरोपण का उपयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

लेखक बहुत वीडियो प्रोटोकॉल की तैयारी में Bogdan Osadchiy और Evgenii Protasov (इर्कुत्स्क राज्य विश्वविद्यालय, रूस) की मदद स्वीकार करते हैं । इस शोध को रूसी विज्ञान फाउंडेशन (#15-14-10008) और रूसी फाउंडेशन फॉर बेसिक रिसर्च (#15-29-01003) ने समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW Thermo Fisher Scientific D3304 Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) SIGMA A9771 Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) SIGMA R9379 Fluorescent probe
Calcium chloride SIGMA C1016 CaCO3 templates formation
Sodium carbonate SIGMA S7795 CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) SIGMA 283215 Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) SIGMA 243051 Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride SIGMA S8776 To dissolve applied polymers
Water Purification System Millipore SIMSV0000 To prepare deionized water
Magnetic stirrer Stegler For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL Eppendorf Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL Eppendorf Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL F.L. Medical 28093 Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL Eppendorf Z640069 Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed BioSan For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf Z666513 Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L ELMY Ltd. To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner To reduce microcapsule aggregation
Head phones  To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid SIGMA EDS To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate SIGMA S9638 Preparation of pH buffers
Disodium phosphate SIGMA S9390 Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide SIGMA S8045 To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2 LOMO In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) Chroma 79010 Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro Ocean Optics Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m Ocean Optics To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A Thorlabs To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide Fisherbrand 12-550-A3 Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm Pearl MS-SLIDCV Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL Blaubrand BR708709 To collect fish blood
Clove oil SIGMA C8392 Fish anesthesia
Lancet No 11 Apexmed international B.V. P00588 To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL Calbiochem L6510-BC For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode Mettler Toledo To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm Becton, Dickinson and Company For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co 9201075 For injection procedure
Gas torch To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B NARISHIGE For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene SIGMA P5481 For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors Thermo Scientific 31212 To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL BRAND Z331767 To moisten fish gills

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References

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