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Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

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Summary

Cet article illustre les principes d’une injection rapide et mini-invasive de microparticules fluorescentes dans le circulatory system de petits poissons et de la visualisation en vivo des microparticules dans le sang du poisson.

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Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Karnaukhov, D., Sadovoy, A., Meglinski, I., Timofeyev, M. Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection. J. Vis. Exp. (136), e57491, doi:10.3791/57491 (2018).

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Abstract

L’administration systémique de taille micro particules dans un organisme vivant peut être appliquée pour la visualisation du système vasculaire, drogue et administration de vaccins, implantation de cellules transgéniques et de minuscules capteurs optiques. Toutefois, des microinjections intraveineuse en petits animaux, qui sont principalement utilisés dans les laboratoires biologiques et vétérinaires, sont très difficiles et nécessitent un personnel formé. Ici, nous démontrons une méthode robuste et efficace pour l’introduction de microparticules dans le système circulatoire du adult poisson zèbre (Danio rerio) par injection dans le rein de poissons. Pour visualiser les microparticules introduites dans le système vasculaire, nous proposons une technique d’imagerie intravitale simple dans les branchies des poissons. Surveillance in vivo du poisson-zèbre pH sanguin a été accompli à l’aide d’une injection fluorescentes microencapsulés probe, SNARF-1, afin de démontrer une des applications possibles de la technique décrite. Cet article fournit une description détaillée de l’encapsulation de colorant sensibles au pH et illustre les principes de l’injection rapide et visualisation des microcapsules obtenues pour in vivo d’enregistrement du signal fluorescent. La méthode proposée d’injection se caractérise par un taux de mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible. Toutes les procédures décrites peuvent être exécutées sur d’autres espèces de petits poissons, comme les guppys et chez les sujets exposés.

Introduction

L’administration de taille micro particules dans l’organisme animal est une tâche importante dans des domaines tels que la drogue et vaccin livraison1, système vasculaire visualisation2, implantation de cellules transgéniques3et implantation de minuscules capteurs optiques 4 , 5. Toutefois, la procédure d’implantation pour les particules de micro-échelle dans le système vasculaire des petits animaux de laboratoire est difficile, surtout pour les organismes aquatiques sensibles. Pour les échantillons de recherche populaires comme le poisson-zèbre, il est conseillé que ces procédures de préciser à l’aide de protocoles vidéo.

Microinjections intracardiaques et capillaires nécessitent un personnel formé et des installations de microchirurgie unique pour la livraison de microobjects dans le sang du poisson-zèbre. Auparavant, un rétro-orbitaire injection manuelle3 a été proposé comme une méthode simple et efficace pour l’administration de cellules entières. Cependant, dans notre expérience, à cause de la petite surface du réseau capillaire oeil, il faut beaucoup de pratique pour atteindre les résultats escomptés de cette technique.

Ici, on décrit une méthode pour l’implantation de microparticules robustes et efficaces dans le système circulatoire par injection manuelle directement dans le tissu rénal du poisson-zèbre adulte, qui est riche en capillaires et de vaisseaux rénaux. Cette technique est basée sur le protocole vidéo greffe de cellules dans le poisson-zèbre rein6, mais les opérations microchirurgicales traumatiques et beaucoup de temps ont été éliminées. La méthode proposée se caractérise par une mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible.

Une partie importante du protocole proposé est la visualisation de l’implanté microparticules (s’ils sont fluorescents ou colorisée) dans les capillaires de gill, qui permet la vérification de la qualité de l’injection, une évaluation approximative relative du nombre de injection de particules et la détection du signal spectral pour mesures physiologiques directement à partir de la circulation sanguine. Par exemple des applications possibles de la technique décrite, nous démontrons le protocole pour des mesures in vivo du poisson-zèbre pH du sang à l’aide d’une sonde fluorescente microencapsulée, SNARF-1, initialement suggéré dans Borvinskaya et al. 20175.

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la Directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale et ont été approuvés par l’Animal sujets recherche Comité d’Institut de biologie à l’Université d’état d’Irkoutsk.

1. fabrication de Microcapsules

Remarque : Les Microcapsules transportant un colorant fluorescent sont préparés à l’aide d’une couche par couche de charge opposée polyélectrolytes7,8. Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante.

  1. Pour synthétiser poreux CaCO3 microcores enfermant le colorant fluorescent, mélanger 2 mL de la solution de SNARF-1-dextran (la plupart liés au polymère de colorant fluorescent comme FITC-BSA peut être utilisé) à une concentration de 2 mg/mL à 0,6 mL chacune des solutions de 1 mol/L de CaCl2 et Na2CO3 sous agitation rapide.
    Remarque : Faire attention aux sensibilités différentes de colorants fluorescents et photoblanchiment ; Si on utilise une sonde fluorescente sensible à la lumière (comme le SNARF-1), la manipulation et le stockage des microparticules doivent être effectuées avec comme peu de lumière que possible.
  2. Après 5-10 s d’agitation, transférer la suspension pour tubes de microcentrifuge de 2 mL et centrifuger pendant 15 s à 10 000-12 000 g pour granuler CaCO3 microcores.
  3. Jeter le surnageant, laver les carottes avec environ 2 mL d’eau désionisée et Resuspendre le culot en secouant.
  4. Répéter le procédé de centrifugation-laver trois fois au total. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant.
  5. Incuber le microcores pendant 1 min dans un bain ultrasonique pour réduire leur agrégation.
    ATTENTION : N’oubliez pas de protéger les oreilles avec un casque.
  6. Pour déposer la première couche de polymère sur les modèles, remettre en suspension les carottes dans environ 2 mL d’une solution de 4 mg/mL de poly(allylamine hydrochloride) (HAP) à 1 mol/L de NaCl.
    1. Gardez le microcores dans la solution pendant environ 5 min avec agitation constante.
    2. Après 15 s de centrifugation, jeter le surnageant avec le PAH indépendant. Laver le microcores couvert au moins 3 fois par centrifugation multiples et étapes de lavage l’eau désionisée. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant.
    3. Incuber le microcores pendant 1 min dans un bain ultrasonique pour réduire leur agrégation.
      Remarque : Si le colorant fluorescent appliqué est cationique, lancer de poly (4-styrenesulfonate de sodium) (PSS) à 1 mol/L de NaCl (voir étape 1.7).
  7. Répétez l’étape 1.6 avec environ 2 mL d’une solution de 4 mg/mL de PSS (également contenant 1 mol/L de NaCl) pour déposer la deuxième couche de polymère sur les modèles.
  8. Répétez les étapes 1.6 et 1.7 six fois à déposer 12 couches de polymères.
    NOTE : Il n’est pas recommandé de prendre une pause longue (~ 12 h ou plus) dans la procédure jusqu'à environ 3-5 couches ont été déposés parce que CaCO3 microcores sans couverture peut avoir tendance à recristalliser. Notez que la couverture PSS provoque une agrégation supérieure de la microcores, et la longue pause est recommandable qu'uniquement lorsque les HAP ou poly-L-lysine greffée avec du polyéthylène glycol (PEG-g-PLL) est la couche demi-taille.
  9. Incuber le microcores couvert en 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL pour microtube) pendant au moins 2 h.
    1. Laver le microcores avec de l’eau par centrifugation séquentielle et des mesures de remise en suspension. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant.
  10. Pour obtenir des microcapsules creuses, dissoudre les CaCO3 modèles en ajoutant 2 mL de 0,1 mol/L tétraacétique (EDTA) solution acide (ajusté à pH 7.1 avec NaOH) à la microcores couverte.
    1. Après environ 5 min d’incubation, centrifuger les microcapsules pour 45 s et jeter le surnageant avec l’EDTA.
    2. Répétez les étapes 1.10-1.10.1 deux fois.
  11. Laver les microcapsules avec 0,9 % NaCl trois fois par centrifugation plusieurs étapes dans les 45 s suivie d’étapes de lavage. Après la dernière étape de centrifugation, éliminer le surnageant.
    Remarque : La solution finale microcapsule injectable doit être stérile (par exemple en ajoutant l’ampicilline, 0,1 mg/mL), et les médias devraient être biocompatibles dans le but d’enquête (milieux isotoniques avec pH neutre).
  12. Estimation de la concentration des microcapsules préparés dans un hémocytomètre sous un microscope à fluorescence. Prendre une série de photos de microcapsules, mesurer le diamètre d’environ une centaine de microcapsules ImageJ9 ou équivalent logiciel et étudier la répartition de la taille à l’aide d’un histogramme.
  13. Magasin obtenu encapsulé sonde dans l’obscurité.
    NOTE : après plusieurs lavages en stérile 0,9 % NaCl, les microcapsules peuvent être stockées pendant des mois à 4 ° C. Il n’est pas recommandé de compléter le séchage des microcapsules pendant le stockage.

2. préparation d’optique montage et étalonnage des microcapsules SNARF-1

Remarque : Des mesures de pH rugueux avec microencapsulés SNARF-1 peuvent être faites en utilisant des images dans les deux canaux d’un microscope à fluorescence7, mais dans le présent protocole, un microscope à fluorescence une voie connecté à un spectromètre de fibre a été appliqué.

  1. Placez le jeu de filtres de fluorescence pour le microscope à fluorescence selon les caractéristiques du colorant fluorescent appliqué requis et allumez la lampe fluorescente.
    1. Tirez sur le levier pour les oculaires.
      ATTENTION : Léger excédent peut endommager la matrice du spectromètre. Ainsi, assurez-vous que le levier est en mode « oculaire » lorsque le spectromètre n’est pas utilisé.
    2. Connectez une extrémité de la fibre optique pour le spectromètre et l’autre extrémité à un collimateur. L’utilisation d’adaptateurs, placer le collimateur dans la mise au point du tube caméra ou autre port disponible du microscope à fluorescence.
    3. Allumez le spectromètre. Exécutez le programme de contrôle de spectromètre et préparer le spectromètre pour les mesures.
  2. Pour l’étalonnage du lot microcapsule, placer ~ 5 µL de la suspension de microcapsules (microcapsules ~ 10 000 par µL dans l’eau désionisée) sur une lame de microscope et sécher la goutte dans un endroit sombre (par exemple, dans un thermostat à 35 ° C).
    1. Pour calibrer les caractéristiques spectrales du SNARF-1 micro-encapsulée, utilisez une série de tampons avec différentes valeurs de pH dans la gamme ~ 6-9. Laisser tomber ~ 10 µL d’un tampon sur les microcapsules séchées avec SNARF-1-dextran et recouvrir d’un lamelle couvre-objet.
    2. Placer la lame sur la platine du microscope. Localiser les microcapsules à l’aide d’un objectif de 40 ×.
    3. Tournez le levier de microscope pour le port de la caméra. S’inscrire à leur fluorescence avec le spectromètre. Tournez le levier vers les oculaires.
      Remarque : Assurez-vous que le signal spectral est bien au-delà du niveau de fond et faire en sorte que les microcapsules dans le champ de vision ne sont pas dans une bulle (en optant pour un grossissement inférieur si nécessaire). Évitez d’illumination prolongée des microcapsules mêmes. SNARF-1 est sensible au photoblanchiment.
    4. Répétez l’étape 2.2.3 pour différents microcapsules 10 à 15 fois.
  3. Calculer les ratios de pic de fluorescence (par exemple, à l’aide de R ou Scilab) pour tous les spectres enregistrés et de déterminer la courbe de régression entre le ratio médian (pour chaque tampon) et le pH du milieu à l’aide de la formule suivante :
    Equation 1
    NOTE : SNARF-1 a un spectre avec deux pics correspondant à l’émission de la teinture protoné et déprotoné, et le rapport entre les pics est sensible au pH du milieu. Dans cette étude, le rapport entre l’intensité de fluorescence pour 605 et 660 nm est utilisé. Ces longueurs d’onde sont choisies selon le filtre utilisé. a et b sont des coefficients à déterminer par régression non linéaire (par exemple, à l’aide de R). Valeurs de 0,15 et 1.1 sont respectivement les valeurs minimales et maximales de j’ai605/i660 observée au cours de l’étalonnage.
  4. Recueillir environ 10 µL de sang poisson d’environ 5 animaux adultes. Poisson de la place dans une boîte de Pétri avec 1 µL/mL suspension d’huile de clou de girofle pour l’anesthésie de l’eau et attendre jusqu'à ce que l’animal se tourne sur le côté et ne répond plus aux pincées de la nageoire (habituellement environ 2-3 min). Transférer le poisson sur une lame de verre. Couper la queue de poisson avec une lancette et recueillir environ 2 µL de sang de poissons de la veine caudale.
    Remarque : Pour éviter la coagulation du sang, traiter l’incision avec de l’héparine (5000 U/mL) et utiliser des capillaires en verre hépariné et tubes de microcentrifuge de recueillir le sang.
    1. S’écouler environ 10 µL de sang avec une pipette sur l’extrémité de la microélectrode et déterminer le pH à l’aide d’un pH-mètre.
    2. Laisser tomber le sang sur une lame de microcapsules séchées et enregistrer le rapport entre l’intensité de fluorescence, comme pour les mémoires tampons d’étalonnage (étapes 2.2 à 2.3).
  5. Ajuster le coefficient linéaire de la courbe d’étalonnage à faire la courbe correspond à la mesure dans le sang de poissons (pour plus de détails, voir Borvinskaya et coll. 20175).

3. préparation pour Injection

  1. Libérer l’aiguille d’acier de la pointe du stylo à insuline (ou seringue) en enlevant le plastique avec une lancette pointu.
    Remarque : Une aiguille fine (Ø0.33 mm ou moins) ou capillaire de verre (habituellement Ø1 mm) peut être préparé pour la microinjection10,11.
  2. Insérer l’aiguille à mi-chemin dans le verre microcapillaire ; rapidement et en douceur, souder à l’aide d’un chalumeau à gaz.
  3. Connectez le microcapillaire de verre à le microinjector et rincez-la à l’eau stérile trois fois. Veiller à ce que le liquide s’écoule à travers l’aiguille.
  4. Remplir le système avec de l’eau distillée.
    Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le système.

4. injection

  1. Remettre en suspension la suspension préparée des microcapsules (en stérile 0,9 % NaCl, ou tout autre support utilisé pour les injections, avec une concentration de 0,5 à 6 millions de microcapsules par microlitre) en utilisant le bain à ultrasons pendant 1 min.
    Remarque : Étant donné que les microcapsules ont tendance à précipiter, au cours de l’injection suivante, agiter le flacon avec les microcapsules mécaniquement (à l’aide d’un rotor) ou manuellement toutes les quelques minutes pour remettre en suspension les et empêcher leur agrégation.
  2. Placer le poisson dans un plat de Pétri avec un anesthésique (0,1 mL/L d’huile de clou de girofle en suspension dans l’eau) pendant environ 2-3 min. Attendez que le poisson se tourne sur le côté et ne répond plus à un léger pincement de la nageoire.
  3. À l’aide d’une cuillère, transférer le poisson hors de l’anesthésique et placez-le délicatement sur une éponge humide dans une position latérale avec la tête vers la gauche (pour droitier) ou vers la droite (pour une personne gauchère).
  4. Juste avant l’injection, sucer 1 ou 2 mm d’air dans le verre capillaire lié à microinjector. Puis, chargez-le avec environ 2 µL de microcapsules dispersées.
    NOTE : Avant l’injection, la solution de la microcapsule doit être réglée à la température à laquelle les poissons sont maintenus.
  5. Doucement stabiliser le corps des poissons sur l’éponge avec la main non dominante.
    1. Trouver la ligne latérale des poissons. Mentalement, sélectionnez un segment qui s’étend de l’opercule jusqu'à la fin de la cavité abdominale. Trouver au milieu de ce segment. Mettre l’aiguille de 1 mm plus bas dans la direction ventrale.
    2. Avec un mouvement de grattage, déplacez doucement le poisson met à l’échelle côté et faire une piqûre. Introduire l’aiguille dans le corps à un angle de 45° à la surface de la table.
    3. Pousser l’aiguille vers la colonne vertébrale jusqu'à ce qu’il repose bien contre elle.
    4. Libèrent environ 1 µL de suspension des microcapsules dans le rein et retirer doucement l’aiguille.
      Remarque : Pour trouver le bon point de ponction plus facilement, il est utile de pratique trouver le rein de tronc de transilluminating les poissons à l’aide d’une lumière de fond, comme illustré dans la Figure 2 a et 2 b.
  6. Rincer le poisson de la tête à la queue avec un jet d’eau afin d’éliminer tout déversements microcapsules au site d’injection.

5. in Vivo de visualisation

  1. Utiliser des ciseaux de dissection pour enlever l’opercule de la tête de poisson et DDE les branchies des poissons. Rincer les branchies avec de l’eau.
  2. À l’aide d’une cuillère, transférer le poisson sur une lame de microscope et placez-le sur la scène du microscope à fluorescence.
    Remarque : Assurez-vous que les branchies des poissons ne sèchent pas durant les interventions successives. Pour éviter cela, périodiquement les humidifier avec de l’eau à l’aide d’une pipette Pasteur (environ toutes les 1-2 min).
  3. Assombrir la pièce et à l’aide de faible grossissement (x 10 objectif) inspecter les branchies pour trouver les microcapsules fluorescents.
    Remarque : Lorsque la procédure est utilisée pour l’introduction de certaines particules fluorescentes dans système circulatoire du poisson, il est recommandé d’inspecter les branchies de plusieurs personnes pour des particules fluorescentes inattendues avant les injections. Branchies de poissons zèbres sauvage n’ont pas d’autofluorescence, mais dans certains cas des particules fluorescentes sporadiques (comme des morceaux d’aliments ou symbiotes unicellulaires) peuvent être présents sur les branchies. Si nécessaire, ces particules peuvent être reconnus basée sur leur forme spécifique (par exemple, morceaux d’aliments ont une forme irrégulière, à la différence des microcapsules sphériques) ou spectre de fluorescence (c.-à-d., couleur).
    1. Basculez la lentille à une magnitude plus élevée (objectif x 40) et placer une microcapsule ou un groupe de microcapsules au centre du champ de vision.
    2. Tournez le levier sur le port avec un spectromètre connecté. Enregistrer le signal spectral.
    3. Tournez le levier vers l’oculaire.
    4. Répéter les mesures pour différents microcapsules plusieurs fois.
  4. Transférer les poissons dans l’aquarium avec une aération adéquate pour la récupération.
    Remarque : Avec un minimum de pratique, il est possible d’effectuer l’injection et le signal d’enregistrement au taux approximatif de 2-3 min par poisson. La mesure peut être répétée pour un individuelle plusieurs fois avec l’utilisation de doses répétées de faibles et inoffensifs de l’anesthésie ou une autre méthode de fixation. Pour l’observation à long terme, utiliser un système avec anesthésie continue12.

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Representative Results

Les résultats obtenus proviennent d’un des trois principales catégories du protocole présenté : la formation de microparticules fluorescentes par encapsulation d’un colorant fluorescent (Figure 1), l’injection de rein de microcapsules avec davantage de visualisation dans branchies capillaires (Figure 2 et 3) et, enfin, l’in vivo spectrale enregistrement de fluorescence SNARF-1 pour surveiller de sang niveaux de pH (Figure 4).

L’approche de couche par couche en utilisant le revêtement des carottes modèle CaCO3 enfermant le colorant par plusieurs couches de façon opposée facturés polymères (HAP et PSS) et une couche la plus externe d’un polymère biocompatible (PLL-g-PEG) est une méthode simple et rentable ce qui permet d’encapsuler des différentes sondes fluorescentes comme SNARF-1-dextran, BSA-FITC ou d’autres (Figure 1 a). En conséquence, des microcapsules creux de micrométrique taille avec coquilles élastiques semi-perméable stables et chargés avec le colorant fluorescent sont obtenues (Figure 1 b). Les microcapsules fabriquées par cette technique sont généralement non uniforme, avec une distribution normale de la taille des particules et caractéristique taille médiane dans chaque lot (Figure 1,С).

Figure 1
Figure 1 : Couche-par-couche synthèse et caractérisation de microcapsules de polyélectrolyte creux chargé avec un colorant fluorescent. (A) schéma d’un montage de microcapsules (tiré d’un arrangement semblable publié dans Gurkov al 20164). (B) photo de microcapsules creux truffé de colorant fluorescent BSA-FITC. (C) taille : caractérisation du lot de microcapsules de la Figure 1 b. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Implantation de robustes et efficaces au moyen de microparticules dans l’appareil circulatoire de petits poissons peut être effectuée par injection manuelle directement dans le rein de poissons. La ponction dans le bon site du corps du poisson (rein de tronc) est cruciale pour la livraison rapide de microparticules par injection manuelle. Le rein de poissons est un organe hématopoïétique et contient des mélanophores pigmentées, et ainsi, il est bien coloré. Parce qu’il est niché entre les chambres transparents de la vessie natatoire, il est facile d’identifier l’organe chez l’animal intact avec faible pigmentation ou par transillumination de petits poissons à l’aide d’une source de lumière de fond, comme illustré à la Figure 2 a et 2 b.

Figure 2
Figure 2 : Localisation du site appropriée pour l’injection de rein. (A) Trans-illumination du poisson-zèbre montre la localisation du rein tronc (flèche). (B) schéma illustre comment identifier le bon point de ponction. La ligne pointillée blanche indique la ligne latérale du segment abdominale du poisson. La flèche indique le site de ponction et le bon sens d’injection vers la colonne vertébrale. La vessie natatoire est désignée par la ligne verte. (C) la visualisation du poisson-zèbre rein après le prélèvement d’organes et la paroi du corps. Une flèche pointe vers le bulbe central du rein tronc. (D) une coupe sagittale histologique de d. rerio illustre l’anatomie générale des organes internes du poisson adult (coloration H & E). Micrographie (E) d’un rein de poissons (en pointillé) gravie depuis (D) avec une flèche pointant vers la lumière de la veine Cardinale postérieure. Les astérisques indiquent la vessie natatoire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour vérifier le succès de la procédure d’injection, il faudrait une rapide inspection visuelle des branchies à faible grossissement (objectif x10-20) après avoir coupé l’opercule de poissons (Figure 3 a). En dépit de la plupart des microcapsules restant au site d’injection ou de se jeter dans la cavité du corps (Figure 3 b), si l’injection est effectuée correctement, il est possible d’observer les microcapsules fluorescents flottant librement dans les capillaires de branchies de la les branchies de poissons dénudées immédiatement après l’injection (Figure 3). Si aucuns particules fluorescentes ne sont détectés dans les branchies, il est possible de renouveler l’injection dans le même trou. Mise en œuvre réussie de la circulation sanguine doit être obtenu dans environ 70 à 90 % des poissons totales injectés.

Figure 3
Figure 3 : Injection de rein de microcapsules avec une visualisation plus loin dans les capillaires de gill. (A) le régime global de la prestation de microcapsules dans le sang du poisson-zèbre. (B) image fluorescente d’un poisson-zèbre après l’injection de microcapsules avec colorant vert de BSA-FITC (le site de ponction est indiqué par une flèche). (C) cette photo des branchies des poissons, à bractées de (B), illustre la livraison réussie des microcapsules par injection de rein (branchies du poisson-zèbre sauvage n’ont aucun autofluorescence). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Pendant l’injection directement dans le rein de tronc de poisson, importantes meurtrissures normalement forme sous le site de ponction, indiquant des dommages pour les capillaires de parenchyme ou les vaisseaux rénaux. Il n’y a aucune fuite de sang hors du corps parce que la ponction semble se contracter rapidement. Malgré une hémorragie interne, les individus peuvent toujours récupérer avec environ 80-90 % de survie par le biais de la procédure (tableau 1). On sait aussi que les espèces de poissons peuvent se régénérer néphrons de novo après blessure13,14. Si plus de 20 % des poissons sont en train de mourir, il faut s’assurer que l’anesthetization est exécutée correctement.

Encapsulé colorant fluorescent n Concentration, microcapsules par µL Volume d’injection, µL Diamètre moyen de microcapsules, µm Mise en œuvre réussie dans le sang du poisson, % Mortalité après l’injection, %
1 h 1 jour
Injection dans le rein du tronc
BSA-FITC 36 4 x 106 1.6 2.7 94 8 3
SNARF-1-dextran 29 3-6 x 105 1-2 5.1 72 7 12
RMCT-dextran 20 6 x 106 2 2.0 70 0 0
0,9 % NaCl 41 - 1-2 - - 5 0
Injection de rétro-orbitaire
BSA-FITC 9 1 x 105 2 4.2 11 22 0
RMCT-dextran 11 6 x 106 1 2.0 9 18 0

Tableau 1. Sécurité et l’efficacité de la livraison de microcapsules dans la circulation sanguine zebrafish. Le succès de la procédure est déterminé par la présence des matériaux fluorescents dans les capillaires de branchies du poisson.

Si la concentration des microparticules injectées est insuffisante, trop peu de particules peuvent être disponibles à visualiser rapidement dans les branchies des poissons. Dans le même temps, une suspension avec une trop forte concentration peut boucher l’aiguille. Dans le cas de couche par couche les microcapsules assemblés avec diamètre médian ~ 2 à 5 µm, une concentration d’environ 4 * 10,5-6 * 106 microcapsules par µL est optimale pour la détection sans effort dans les branchies des poissons après injection dans les reins des poissons (Table 2).

Concentration, microcapsules par µL Nombre de microcapsules dans un microscope champ de vision (objectif × 20) dans les branchies d’individus différents (n = 7 par concentration)
4 x 106 > 100 > 100 0 > 100 ≈ 70 ≈ 50 > 100
4 x 10,5 ≈ 10 ≈ 20 0 0 ≈ 20 ≈ 40 ≈ 15
4 x 104 0 3 0 0 0 0 4
4 x 103 0 0 0 0 0 0 0

Le tableau 2. Record de la comptage visuel des microcapsules contenant de la BSA-FITC dans d. rerio branchies après injection (1.6 µL) dans le rein tronc.

La méthode proposée de l’implantation des microparticules en système circulatoire du poisson peut être appliquée pour la surveillance in vivo du poisson-zèbre pH du sang par sonde fluorescente microencapsulé, SNARF-1 (Figure 4). SNARF-1 a un spectre avec deux pics correspondant à l’émission de la teinture protoné et déprotoné (Figure 4 a), donc l’étalonnage courbes du rapport entre les sommets à différents pH des médias peuvent être tracées (Figure 4 b). Les composants du sang influencent la lecture de l’encapsulé SNARF-1 (Figure 4 b), qui peut être évaluée expérimentalement par mesure simultanée du pH du sang par les microcapsules et un pH-mètre avec une microélectrode de verre. Une courbe d’étalonnage putatif de microcapsules dans le sang du poisson-zèbre devrait être tracée en décalant la courbe des tampons par le coefficient correspondant à la différence de pH mesurée expérimentalement (voir Borvinskaya et coll. 20175 pour plus de détails).

PH du sang dans les capillaires de branchies de poisson-zèbre reste stable pendant au moins plusieurs heures après l’injection de microcapsules (Figure 4). Dans le même temps, une courte exposition hypercapnique conduit à une réduction statistiquement significative du pH sanguin, ce qui démontre l’applicabilité de la méthode pour la recherche en vivo sur petits poissons.

Figure 4
Figure 4 : Un exemple représentatif de surveillance du poisson-zèbre sang РН par l’enregistrement de spectres de fluorescence du colorant microencapsulé SNARF-1. (A) les spectres des microcapsules préparés truffé de SNARF-1 dans des tampons de phosphate de sodium à différents pH. (B) les courbes de Calibration des microcapsules sensibles au pH préparés dans des tampons de phosphate de sodium et dans le sang de l’extrait de poisson-zèbre. Pour toutes les mesures, la moyenne ± écart-type est représenté. (C) un exemple représentatif du in vivo suivi des рН de sang de poisson-zèbre de colorant fluorescent encapsulé de SNARF-1 dans les capillaires de branchies de poisson-zèbre. Dans des conditions de contrôle, le pH sanguin reste stable pendant 4 heures après l’injection de microcapsules, tandis que les 5 minutes une exposition sous hypercapnie sévère (900-1000 mg/L de CO2dissous) provoque l’acidification du sang poisson. Astérisque indique une différence statistiquement significative dans le groupe contrôle parallèle avec p < 0,01 (test U de Mann-Whitney). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour illustrer l’injection de microparticules dans les reins de poisson-zèbre, nous avons utilisé semi-perméable microcapsules chargées avec un colorant indicateur. Ainsi, le protocole contient des instructions pour la fabrication de microcapsules à l’aide de l’Assemblée de couche par couche de charge opposée polyélectrolytes7,8,15,16,17 ,18 (figure 1 a). Un avantage de cette technologie est qu’il est facile à réaliser avec des équipements de laboratoire disponibles. Selon les conditions et les composés utilisés, les microcapsules fabriqués peuvent varier de 0,5 à 100 µm avec coquille de polyélectrolyte nanomètres d’épaisseur15. Les paramètres de synthèse décrits dans ce résultat de manuscrit dans des microcapsules élastiques constitué de 12 couches (en plus de la dernière couche biocompatible) de polymères environ 2 à 6 µm de longueur (Figure 1 b et 1c). Déterminer la taille des microcapsules l’étape la plus importante est la formation de la microcores de modèle. Ce processus implique la formation spontanée de cristaux de carbonate de calcium, et par conséquent, les particules obtenues sont non uniforme. Par conséquent, une caractérisation de la distribution de taille des microcapsules devrait être effectuée pour chaque lot.

L’étape importante de ce protocole est l’optimisation de la prestation de microparticules dans l’appareil circulatoire zebrafish sans l’utilisation de techniques de micromanipulation. L’administration des cellules entières par injection rétro-orbitaire a été précédemment décrit dans le détail3. Cependant, dans notre expérience, il n’est pas facile pour les utilisateurs novices d’obtenir l’efficacité d’injection décrite par les auteurs car le sinus rétro-orbitaire est très petit et situé à proximité du pharynx et des arcs branchiaux, qui sont faciles à blesser accidentellement avec une aiguille. Depuis moins d’un millimètre de précision est requise pour les injections, l’injection correctement est une tâche assez difficile. Une alternative tout aussi rapide et plus efficace (tableau 1) consiste à injecter directement dans le parenchyme rénal de poissons. Pendant l’injection, l’aiguille mécaniquement les dommages rénaux capillaires et des vaisseaux sanguins (p. ex., la plus grande veine Cardinale postérieure), qui permet l’entrée de microparticules dans l’appareil circulatoire (Figure 2E). Enfin, le bulbe central du rein chez le poisson zèbre adulte tronc est grand assez (jusqu'à 2 mm) pour une injection manuelle sans équipement MICROCHIRURGICAL.

Le bon positionnement de l’aiguille d’injection est essentiel pour une administration manuelle réussie. Vous pouvez pratiquer à trouver le rein du tronc chez les animaux intacts par les poissons transilluminating à l’aide d’une lumière de fond, comme illustré dans la Figure 2 a et 2 b. Le schéma Figure 2 b montre comment effectuer correctement l’injection. Si la procédure ne permet pas d’administrer des microparticules dans la circulation sanguine, ré-injection peut être faite à la piqûre même dans un court laps de temps avec pratiquement aucun effet sur le taux de survie des individus.

Injection dans le rein de tronc de poisson-zèbre adulte (testé également avec succès sur adult guppy Poecilia reticulata) est une méthode efficace de livraison au moyen de microparticules dans le sang de poissons avec une mortalité animale admissible ; Cependant, il n’est pas parfaitement adapté pour l’administration de médicaments en raison des variations dans le volume injecté. Un point faible de cette technique est une fuite importante de la solution par le rein dans l’abdomen à cause de l’administration rapide. Néanmoins, une quantité relative de la substance injectée dans la circulation sanguine peut être grossièrement estimée en utilisant la visualisation dans les capillaires de gill (tableau 2). Il n’y a aucune limitation stricte du volume d’injection, mais l’administration de plus de 1 µL de la suspension semble être inefficace. Les plus beaux capillaires de verre peuvent être appliqués pour la microinjection ; Cependant, parce qu’un grand nombre de microcapsules tend à inciter à l’agrégation, nous recommandons l’utilisation de 31-29G (Ø 0,33-0,25 mm) acier aiguilles pour éviter les obstructions dans le lumen de l’aiguille.

Le succès de la livraison de la microcapsule par injection de rein dans la circulation sanguine doit être surveillé à l’aide de l’inspection rapide de la présence des particules fluorescentes dans les branchies. Branchies sont des organes facilement accessibles pour les observations in vivo . Les filaments branchiaux sont un réseau de capillaires sanguins couverts d’une mince couche d’épithélium respiratoire, ce qui rend intravitale imagerie du sang couler dans les branchies particulièrement pratiques (une sorte de fenêtre optique naturelle). Pour effectuer l’observation, l’opercule de cartilage peut être coupée pour exposer les filaments. Cette procédure est sans danger pour les poissons, qui peuvent vivre avec des branchies dénudées dans de l’eau aérée sans une diminution de l’espérance de vie. En outre, les branchies des gros poissons peuvent être examinés sous un microscope en poussant sur l’opercule sur la façon dont19. Dans le cas d’une injection réussie, les microparticules fluorescentes apparaissent immédiatement dans les branchies (Figure 3). Notez que microparticules implantés sont considérablement dissoute dans le volume de sang circulant et un réduction du nombre de particules atteindre les capillaires gill, donc une concentration suffisante de microparticules doit être sélectionnée pour la détection dans les branchies des poissons après injection dans les reins des poissons (tableau 2).

La procédure proposée pour l’implantation peut être appliquée dans un large éventail d’études portant sur les différentes espèces de petits poissons. Malgré la technique ayant été développé et optimisé pour injection de microparticules fluorescentes dans le système circulatoire, il peut également être appliquée pour l’implantation de couleur non micro/nanoparticules ou dissout les substances ; Toutefois, dans ce cas l’efficacité d’injection doit être vérifiée d’une autre manière. Les mesures actuellement décrits sont optimales à de telles fins surveillance aussi physiologique à l’aide de différentes optiques micro ou nano-capteurs, visualisation du système vasculaire, la livraison de vaccins ou de médicaments sur certains supports optiquement visibles et l’implantation de cellules génétiquement modifiées.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Auteurs reconnaissent grandement l’aide de Bogdan Osadchiy et Evgenii Protasov (Université d’état d’Irkoutsk, Russie) dans l’élaboration du protocole vidéo. Cette recherche a été financée par la Fondation russe de la Science (#15-14-10008) et la Fondation russe pour la recherche fondamentale (#15-29-01003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW Thermo Fisher Scientific D3304 Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) SIGMA A9771 Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) SIGMA R9379 Fluorescent probe
Calcium chloride SIGMA C1016 CaCO3 templates formation
Sodium carbonate SIGMA S7795 CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) SIGMA 283215 Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) SIGMA 243051 Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride SIGMA S8776 To dissolve applied polymers
Water Purification System Millipore SIMSV0000 To prepare deionized water
Magnetic stirrer Stegler For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL Eppendorf Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL Eppendorf Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL F.L. Medical 28093 Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL Eppendorf Z640069 Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed BioSan For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf Z666513 Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L ELMY Ltd. To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner To reduce microcapsule aggregation
Head phones  To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid SIGMA EDS To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate SIGMA S9638 Preparation of pH buffers
Disodium phosphate SIGMA S9390 Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide SIGMA S8045 To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2 LOMO In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) Chroma 79010 Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro Ocean Optics Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m Ocean Optics To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A Thorlabs To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide Fisherbrand 12-550-A3 Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm Pearl MS-SLIDCV Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL Blaubrand BR708709 To collect fish blood
Clove oil SIGMA C8392 Fish anesthesia
Lancet No 11 Apexmed international B.V. P00588 To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL Calbiochem L6510-BC For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode Mettler Toledo To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm Becton, Dickinson and Company For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co 9201075 For injection procedure
Gas torch To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B NARISHIGE For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene SIGMA P5481 For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors Thermo Scientific 31212 To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL BRAND Z331767 To moisten fish gills

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References

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