一种基于昆虫蜕皮激素受体的奇异基因开关, 用于对转基因进行有鲁棒性、可逆性和可忽略的泄漏的刻意表达

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Genetics

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Summary

在这里, 我们提出了一种调制的转基因表达使用 pEUI (+) 奇异基因开关的米满治疗。

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Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

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Abstract

在生物学和临床研究中, 对转基因表达的精确控制是可取的。然而, 由于目前使用的基因开关的二进制特征要求将两个治疗表达单元同时移植到单个细胞中, 基因治疗系统的实际应用受到限制。为了简化转基因表达系统, 我们生成了一个基因开关, 它被指定为 pEUI (+), 它包含了一个单一向量中的一整套转基因表达模块。由 GAL4 dna 结合领域和修改的 EcR (GvEcR) 组成, 一个最小的 VP16 活化域与 GAL4 DNA 结合领域, 以及修改后的果蝇昆虫蜕皮激素受体 (EcR), 新开发的奇异基因开关是高度以时间和剂量依赖性的方式对化学诱导剂的管理作出反应。pEUI (+) 载体是一种潜在的强有力的工具, 以改善基因表达的控制, 在生物研究和临床前研究。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以调制的瞬态和稳定的转基因表达使用 pEUI (+) 的治疗米满 (Teb)。此外, 我们还分享了使用 Teb 作为化学诱导剂的重要指导方针。

Introduction

研究了几种不同的基因开关, 以精确调节细胞培养和动物模型中转基因表达的能力, 不同程度的成功1,2,3。潜在的基因交换系统应符合几个严格的标准, 包括: 转基因的精确定向表达, 剂量和时间依赖性的诱导反应, 可忽略的启动子泄漏, 转基因的可逆性激活通过诱导剂去除, 诱导剂毒性水平耐受细胞系和实验动物1,2,3。已开发了几个小分子诱导剂, 包括四环素45、雷帕霉素678、米非司酮910、和昆虫蜕皮激素11, 12, 13, 14.一般而言, 这些系统至少需要两个或三个离散表达单元的二质粒, 其中一个或两个组成一个调节元素 (诱导质粒), 使小分子诱导剂能够获得转录活性;和另一种质粒 (效应质粒), 包含在调控 DNA 区域控制下的转基因, 允许诱导剂约束的调控元素进入。二进制系统的主要缺点是, 它需要同时引入两个向量 (诱导器和效应) 到目标单元中。在瞬态转基因表达实验中, 两种质粒的同时转染, 不可避免地会产生一个细胞的数量, 它们是由诱导器或效应器单独转移的, 或者是不相等的。此外, 二进制系统需要至少两轮抗生素选择, 以建立稳定的细胞系, 这是费时费力的。因此, 将转基因表达和调节所需的所有成分组合成一个单一的载体, 将是保证单个细胞中所有必需元素同时表达并允许对转基因表达进行调节的理想方法。通过小分子诱导剂治疗。

为了克服二进制基因开关的缺点, 我们最近开发了一个奇异基因开关, 使用了一个果蝇基于 EcR 的基因诱导系统15。昆虫蜕皮激素介导基因表达, 当它绑定到 ecr/ultraspiracle (USP) heterodimer, 这反过来又诱导了 ecr 对 DNA 调控元素的绑定3, 11.脊椎动物甲酸 X 受体 (RXR), 直系同源的昆虫 USP, 新兵 EcR 形成一个活跃转录激活剂 16.因此, 对于基因在脊椎动物细胞或组织中的靶向表达, EcR 和 RXR 必须同时表达, 然后才被昆虫蜕皮激素或其激动剂刺激。由于基于 EcR 的基因开关的 heterodimeric 特征可能受内源 RXR 水平的影响, Padidam et。用异源 GAL4 dna 结合、单纯疱疹病毒蛋白 vmw65 (VP16) 活化域取代 ecr dna 结合和活化域, 融合到 ecr 配体结合域, 从而对内源性 RXR 无反应, 形成 homodimer获取转录活动17。通过构建由最小 VP16 活化域和 GvEcR 组合组成的嵌合体蛋白, 在昆虫蜕皮激素激动剂缺席的情况下, 在细胞质中形成 homodimer 和局部化, 从而进一步改善了 EcR 基因开关,Teb16, 18。通过绑定到 Teb, GvEcR 改变了其亚细胞定位从细胞质到核, 以识别一个混合启动子由斑马鱼 E1b 最小启动子结合十串联重复上游活化序列 (UASs), 以启动目标基因的转录16

为了简化以前报告的基于 EcR 的基因开关16,18, 我们将系统的二进制特征组合成一个单一的向量, 并配备所有必需的元素来刺激转基因表达, 然后指定新生成的矢量, pEUI (+) (基因库加入号: KP123436,图 1A)15。响应 GvEcR 驱动程序 (以下驱动程序) 的效应器由一个 E1b 最小启动子旁边的十个串联的无人驾驶系统重复, 后跟一个具有 EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI 和 AflII 识别序列 (图 1B) 的多个克隆站点 (MCS)。此外, 为了便于选择转染细胞, SV40 启动子驱动嘌呤霉N-乙酰转移酶 (PAC) 基因放置在驱动程序和效应区之间, 以维持稳定的细胞线(图 1)。

本文描述了一种利用 pEUI (+) 对转基因表达进行瞬态和稳定调制的详细协议。此外, 我们还提供了有关成功使用 Teb 作为昆虫蜕皮激素激动剂的详细说明。

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Protocol

1. 转基因亚克隆

  1. 在 pEUI (+) 的 MCS 中选择适当的限制酶识别站点 (或站点), 并亚克隆所需方向的感兴趣基因 (1)。
    注意: EGFP或标志位标记的锚蛋白重复域 13A (ANKRD13A) 转基因在 EcoRI (+) 向量 pEUI 站点 subcloned, 使用 T4 DNA 聚合酶在序列和结扎无关的克隆方法 19.
  2. 进行线性化 pEUI (+), EcoRI 1 小时, 37 摄氏度。将50µL 线性化 pEUI (+) 与 PCR 扩增的EGFP或 ANKRD13A 的 40 ng/µL 混合在一起,并与 T4 DNA 聚合酶 (1 U) 在室温下孵化前1分钟 (RT) 反应10分钟. 将反应混合物的10µL 直接添加到100µLDH10B 胜任细胞进行以下改造实验。
    注意: 虽然在 pEUI (+) 的 MCS 中添加了几个限制酶识别站点 (图 1B), 但我们建议将目标基因亚克隆到 EcoRI 站点, 使用结扎无关的克隆技术 19, 20.
  3. 通过测序验证插入, 然后使用适合转染的 dna 纯化试剂盒纯化 dna。

2. 瞬变转染和 Teb 处理

  1. 准备四细胞培养皿 (60 毫米直径), 含有新鲜的传代 HEK293 细胞在5毫升 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充 5-10% 胎牛血清 (血清) 和抗生素 (100 U/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素)。此后, "细胞培养培养基" 或简单的 "培养基" 代表 DMEM 辅以血清和抗生素。保持 HEK293 细胞在37摄氏度。
  2. 用3µL 转染试剂将纯化 DNA 的1µg 染 50-60% 密度的 HEK293 细胞中。添加转染试剂到200µL 稀释剂 (DMEM 没有血清和抗生素) 含有 DNA。在30分钟的反应混合物孵化后, 在培养皿中加入 HEK-293 细胞的混合物。使用两个盘子进行转染, 并让其他两个不治疗作为控制。
  3. 在转染 12-24 小时后, 将 Teb (最终浓度, 0.2-10 µmol) 添加到已染成的样本之一中, 并将其加入到一条未染的控制中。将其他两个样本保留为实验性控制。
    注: Teb 库存溶液 (50 毫米溶解在二甲基亚砜) 可以稀释在细胞培养基, DMEM, 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 在适当的浓度, 然后添加到培养细胞根据实验参数。但是, 由于 Teb 在水溶液中溶解度低, 避免了在培养基中制备高浓度 Teb 的主混合;取而代之的是, 用含有 Teb 的新鲜培养基取代完整的细胞培养培养基, 以达到预期的浓度。
  4. 培养 Teb 治疗和未经治疗的细胞为 12-48 小时在37摄氏度。
  5. 如果使用EGFP插入, 请在荧光显微镜下分析 EGFP 表达式 (图 2)。否则, 收获细胞的免疫印迹法化验。
    1. 对于免疫印迹法化验, 用冷的 PBS 冲洗两次细胞, 然后用一个细胞刮刀将它们刮出来。
    2. 对于堆积细胞, 在 2.1万 x g (RT) 的2分钟内, 在15毫升圆锥管中的收成下旋转。
    3. 完全丢弃 PBS 后, 添加0.5 毫升的冰-冷哺乳动物蛋白萃取试剂 (M 每), 连同蛋白酶抑制剂 (5 µL 的100x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒), 如果细胞培养在60毫米菜。
    4. 用几轮吹打重新悬浮细胞, 然后在 18-25 摄氏度 (RT) 上孵化悬浮细胞15分钟。
    5. 旋转细胞裂解液在 2.1万 x g 10 分钟在4摄氏度。
    6. 将水中清液转化为新鲜的1.5 毫升离心管。
    7. 用适当的抗体免疫印迹法的标准协议, 分析上清液。

3. pEUI (+) 基因开关的基因组积分生成稳定的 HEK293 细胞系

  1. 染 5-10 µg 的纯化 pEUI (+) 与转基因成 HEK293 细胞, 50-60% 汇合在90毫米直径细胞培养皿, 使用 15-30 µL 的转染试剂。添加转染试剂到500µL 稀释剂 (DMEM 没有血清和抗生素) 含有 DNA。在30分钟的反应混合物孵化后, 在培养皿中加入 HEK-293 细胞的混合物。
  2. 转染后, 允许 transfectants 在非选择性培养基 (不嘌呤霉素) 下生长和表达嘌呤霉素抗性基因产物, 24-48 小时37摄氏度。
  3. 用 trypsinization 将细胞从培养皿中分离出来。丢弃培养基后, 用预热后的 PBS (37 °c) 冲洗 transfectants, 加入1毫升0.25% 胰蛋白酶/乙二胺 (EDTA), 并在37摄氏度孵育1分钟。在通过加入预热培养基 (10 毫升, 37 °c) 淬火胰蛋白酶/EDTA 后, 使用细胞刮刀收割细胞, 然后在15毫升圆锥管中离心, 在18-25°C 的 2.1万 x g 处为2分钟。
  4. 在50毫升预热培养基 (37 °c) 中重新悬浮 transfectants, 将10毫升的细胞转移到90毫米新鲜细胞培养皿中。培养细胞在37°c 直到 50-60% 融合在嘌呤霉素治疗之前 (一般来说, 这需要大约 24-48 h)。
  5. 培养 transfectants 在37°c 在细胞培养培养基补充3µg/毫升嘌呤霉素 3-4 周。在选择期间, 每 2-3 天, 改变含有嘌呤霉素 (3 µg/毫升) 的细胞培养基, 以保持选择压力。当细胞完全汇合时, 按照步骤 3.3-3.4 中的过程划分它们, 其中含有嘌呤霉素的培养基。如果不需要, 请丢弃区域性介质中的其余单元格。
    注意: 必须为特定的细胞类型建立实验性的嘌呤霉素选择条件。我们在细胞培养培养基中使用了3µg/毫升嘌呤霉素;这足以诱发非转染 HEK293 细胞死亡。
  6. 使用克隆圆柱体从单个菌落中收获细胞, 并按照制造商的说明进行操作。
    1. 丢弃细胞培养基。用预热后的 (37 °c) PBS 冲洗两次盘子, 以去除漂浮的细胞。
    2. 使用无菌钳, 将克隆筒放在各个菌落上。
    3. 添加0.2 毫升0.35% 胰蛋白酶/EDTA 到每个气缸。
    4. 孵化的菜在37°c 1 分钟, 直到细胞分离, 然后添加几滴预预热 (37 °c) 培养基到气缸。
    5. 将每个气缸的细胞转移到一个6井板的单个井中, 每个井中有2毫升培养基和1µg/毫升嘌呤霉素。
      注意: 当细胞汇合时, 放大文化。现在可以建立克隆。
  7. 维持细胞培养培养基中的单个无性系, 辅以1µg/毫升嘌呤霉素。
  8. 通过测试其对 Teb 治疗 (最终浓度, 10 µM) 的敏感性, 验证各自的菌落数 24 h. 通过分析转基因与免疫印迹法的表达水平, 测试克隆对 Teb 的响应性。选择所需的克隆 (或克隆)。在对转基因的诱导水平进行分析之前, 在 12-48 小时的培养基上培养 Teb 处理的和未经治疗的样品。转基因的表达水平可以通过免疫印迹法测量, 遵循步骤 2.5.1 2.5.7。

4. Teb 的损耗

  1. 用 Teb 游离培养基取代含有细胞培养培养基的 Teb, Teb 刺激。
    注意: 建议在不首先补种细胞进入新的培养皿的情况下更换培养基。残留的 Teb 似乎附着在塑料盘子上, 并会引起转基因的强烈背景表达。在将细胞补种到新的培养板上之前, 用培养基或 PBS 多次冲洗收获细胞。
    1. 用 trypsinization 将细胞从培养皿中分离出来。在丢弃含有培养基的 Teb 后, 用预热后的 PBS (37 °c) 冲洗两次 Teb 刺激细胞, 加入1毫升0.25% 胰蛋白酶/EDTA, 在37摄氏度时孵育1分钟。在通过加入预热的 Teb 培养基 (10 毫升, 37 °c) 淬火胰蛋白酶/EDTA 后, 用一个细胞刮刀收割细胞, 然后在15毫升圆锥管中离心, 在2摄氏度处为18-25 分钟。
    2. 重新悬浮细胞在50毫升预热的 Teb 培养基 (37 °c), 并将5毫升的细胞转化为三60毫米新鲜细胞培养皿。培养细胞在37°c 分别为 24, 48 和 72 h。
    3. 利用免疫印迹法, 在不同时间点收获细胞, 测量转基因的表达水平。
      注: 在这些实验条件下, 转基因表达在无 Teb 文化培养基中的细胞后培养的大约3天内无法检测到 (图 3)。转基因的表达水平可以通过免疫印迹法测量, 每步 2.5.1 2.5.7。

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Representative Results

图 1A中描述了基于 GvEcR 的奇异基因开关。pEUI (+) 载体通过 Teb 治疗对转基因表达进行优化。pEUI (+) 的效应区包括10xUAS 和 E1b 最小启动子, 后跟一个包含 EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI 和 AflII 限制酶识别点的 MCS。在 MCS (图 1B) 后面添加了一个 SV40 的聚 (A) 信号。在 pEUI (+) 的驱动程序和效应区域之间插入了一个PAC基因, 以赋予对嘌呤霉素的抵抗力。

为了评估 pEUI (+) 的活动和泄漏, 我们 subcloned EGFP到 MCS (EcoRI (+) pEUI) 的 EGFP 站点, 瞬时将质粒结构转染为 HEK293 细胞, 并在不同浓度下对 24 h ( ) 执行 Teb。图 2)。尽管模拟矢量 transfectants 没有显示荧光信号 (图 2AB), 但 pEUI (+) EGFP transfectants 逐渐敏感到 Teb 的增加量 (图 2C-F).更重要的是, pEUI (+)-EGFP transfectants 没有治疗 Teb 没有引起任何可检测的 EGFP 信号下荧光显微镜 (图 2C)。

为了进一步验证 pEUI (+) 对 Teb 的响应性, 我们 subcloned 了一个标志位标记的ANKRD13A基因到 EcoRI (+) 的 pEUI 站点, 将构造转移到 HEK293 单元, 然后将其按嘌呤霉素选择3周, 以建立具有ANKRD13A转基因的所需的单元格线。我们分析了ANKRD13A转基因的表达后, 24 小时的治疗与 Teb 和建立的细胞线反应良好 (图 3)。我们进一步证明了 pEUI (+) 基因开关的可逆性通过消耗 Teb 从文化媒介。如图 3所示, 当我们在无 Teb 介质中培养细胞时, ANKRD13A 表达式不再能被检测到。

Figure 1
图 1.pEUI (+) 的原理图.(A) 构造了 pEUI (+) 的矢量图。一种巨细胞病毒启动子驱动 GvEcR 的本构表达。Teb 绑定的 GvEcR 将植物常常将到原子核中 , 并绑定10xUAScis - 代理规则序列 , 以刺入到 MCS 中的转基因的表达。(B) (A) 中方括号之间的序列信息包含 pEUI (+) 的整个效应器序列。箭头表示 MCS 中包含的单个限制酶识别站点。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.基于 GvEcR 的奇异基因开关对 Teb 的治疗有反应.HEK293 细胞用指定的 DNA 结构进行转染。经过24小时的转染, 细胞被刺激为 24 h 与 Teb 在指定的浓度。在荧光显微镜下观察到了EGFP转基因活性。模拟 transfectants 与 pEUI (+) 没有显示任何可检测的荧光与 (A) 或没有 (B) Teb 治疗。(C-E)pEUI (+)-EGFP 转染细胞的荧光强度以 Teb 剂量依赖性的方式增加。缩放条, 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.HEK293 细胞稳定地窝藏 pEUI (+)/旗 ANKRD13A 反应可逆地对 Teb 的管理.标记表位标记的 ANKRD13A 表达是由 Teb (1.5 µM) 的治疗触发的。经过24小时的治疗与 Teb, 细胞被切换到 Teb 下降的媒体, 在指定的时间量。用反旗抗体测定了 ANKRD13A 的相对含量。以抗α蛋白抗体为对照, 测定了α蛋白的内源表达水平。白色星号表示未知的交叉反应物种。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

使用二进制基因表达式开关的主要缺点是需要同时提供两个单独的质粒 (驱动程序和效应器) 到目标细胞。这可能导致质粒的分布不均匀, 并导致切换到诱导器123的不一致响应。两个向量系统的另一个缺点是需要至少两轮的抗生素选择, 以确定有希望的细胞系。因此, 在生物研究中, 长期以来一直在寻找一种由一个单元组成的基因诱导盒。pEUI (+) 奇异基因表达开关包含在一个单一的载体, 配备所有调控单位所需的转基因刺激。因此, subcloned 在 pEUI (+) 中的诱导水平依赖于瞬变转染实验中的 DNA 量和化学诱导剂的用量。此外, 我们进一步测试了 pEUI (+) 向量的用法, 方法是生成一个稳定的单元格线, 其中包含ANKRD13A转基因15的单个副本。已建立的细胞线对 Teb 治疗有很高的敏感性 (图 3)。总的来说, 它的高灵敏度、可逆性和低泄漏15以及表达式水平的有限变化, 使得 pEUI (+) 成为处理目标基因表达的宝贵的分子和细胞工具。

在各种诱导基因系统中, 我们选择了 GvEcR 依赖的基因诱导盒。GvEcR 比其他系统有几个优点: 首先, 作为化学诱导剂 (包括 Teb) 的几种昆虫蜕皮激素类似物的亲脂性质有利于细胞膜的有效穿透21;其次, 脊椎动物中没有 EcR orthologs, 所以 ecdysteroid 激动剂不影响内在表达核受体的功能21,22;第三, ecdysteroids 在脊椎动物中是无害的, 并且从循环系统中快速清除体内21,23;第四, 由于许多昆虫蜕皮激素激动剂已经发展到目前为止, 通过选择最佳大小的小分子, 研究人员可以避免不良的并发症13, 22, 24.尽管 pEUI (+) 对 Teb 有很高的灵敏度, 但测试 pEUI (+) 对其他 ecdysteroid 激动剂的响应性可能证明是有价值的。非甾体 EcR 激动剂的存在, 如 methoxyfenozide, 比 Teb24更能溶于水, 可扩大 pEUI (+) 的应用范围。虽然 pEUI (+) 中的转基因表达相对较弱, 但在系统15中, 可通过增加 VP16 转录激活域 (未显示的数据) 的多拷贝来增强转基因的诱导水平。最近的基因治疗应用重点是将目标基因安全交付到缺乏各自功能基因产品的细胞或组织中, 因为遗传疾病25,26,27。然而, 在组织特异或病毒本构促进剂的控制下, 非调控转基因可以诱导靶基因的超表达, 从而提升局部组织损伤的可能性28,29。因此, 应用可靠的基因开关进行基因治疗可以避免不必要的并发症。pEUI (+) 载体为控制转基因在生物和临床研究中的表达提供了方便和有力的工具。目前, 我们正在开发一个基于 GvEcR 的奇异慢病毒载体向量, 以增加系统的应用范围。

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Disclosures

我们没有与本报告有关的利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢全南 (美国国立大学) 的宝贵意见和对我们手稿的透彻阅读。这项工作得到了于忠清国立大学研究基金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

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