Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hassas kontrol transgene ifade biyolojik ve klinik çalışmalarda tercih edilir. Ancak, şu anda istihdam gen anahtarları ikili özelliği iki tedavi edici ifade ünite transferi aynı anda tek bir hücreye gerektirdiğinden, gen tedavisi için sisteminin pratik uygulama sınırlıdır. Transgene ifade sistemi basitleştirmek için tek bir vektör transgene ifade modüllerde eksiksiz bir dizi kapsayan pEUI(+) olarak belirlenmiş bir gen anahtarı oluşturulur. GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanını oluşan ve değiştirilmiş EcR (GvEcR), en az bir VP16 harekete geçirmek etki GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı, hem de değiştirilmiş Drosophila ecdysone reseptör (EcR), ile erimiş yeni geliştirilen tekil gen anahtarı son derece olduğunu kimyasal bir uyarıcı bir saat ve doz bağımlı şekilde yönetimi için duyarlı. PEUI(+) vektör transgene ifade Biyolojik araştırma ve önceden klinik çalışmalar kontrolünü geliştirmek için potansiyel olarak güçlü bir araçtır. Burada, detaylı bir iletişim kuralı modülasyonu pEUI(+) vektör tebufenozide (Teb) tedavi ile kullanarak bir geçici ve istikrarlı transgene ifade için mevcut. Ayrıca, kimyasal bir uyarıcı olarak Teb kullanımı için önemli bir yönerge paylaşıyoruz.

Introduction

Tam olarak hücre kültürü ve hayvan modellerinde başarı1,2,3değişen derecelerde transgene ifade düzenlemek yeteneklerini için birkaç farklı gen anahtar incelemiş bulunuyoruz. Potansiyel gen anahtar sistemleri de dahil olmak üzere birkaç sıkı kriterleri karşılamak: hassas yönlü ifade transgene, dozaj ve zaman bağımlı kavramaları indükleyicileri, düzenleyicinin önemsiz leakiness, transgene reversibility etkinleştirme uyarıcı kaldırma ve uyarıcı toksisite düzeyleri hücre satırları ve laboratuvar hayvanları1,2,3için tolere edilebilir. Birkaç küçük molekül indükleyicileri, tetrasiklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10da dahil olmak üzere istismar, ve ecdysone11,12,13,14. Genel olarak, bu sistemler, iki ya da üç ayrı ifade birimleri içeren en az iki plazmid gerektirir, bir ya da iki tanesi transkripsiyon etkinlik kazanmak için bir küçük molekül uyarıcı bağlar bir düzenleyici öğesi (uyarıcı plazmid) oluşturmak; ve başka bir plazmid (efektör plazmid) uyarıcı bağlı yasal öğe erişim sağlar düzenleyici bir DNA bölge kontrol altında transgene içeren. En büyük dezavantajı ikili sistemdeki hedef hücre içine iki vektörlerin (uyarıcı ve efektör) giriş eşlik eden gerektirmesidir. Geçici transgene ifade denemelerinde iki plazmid aynı anda transfection kaçınılmaz bir nüfus tek başına uyarıcı ya da efektör ile transfected veya unequally co transfected hücre üretir. Ayrıca, ikili sistem istikrarlı hücre hatları, zaman alan ve zahmetli olan kurmak için antibiyotik seçimi en az iki tur gerektirir. Bu nedenle, tüm bileşenleri birleştirerek transgene ifade için gerekli ve yönetmelik tek bir vektör içine tek bir hücredeki tüm gerekli öğeleri eşlik eden ifade garanti ve transgene ifade Yönetmeliği için izin vermek ideal olacaktır Küçük molekül indükleyicileri ile tedavi yoluyla.

İkili gen anahtarları eksikliklerin üstesinden gelmek için biz son zamanlarda bir tekil gen anahtar, bir Drosophila melanogaster EcR tabanlı gen indüklenebilir sistem15kullanılarak geliştirilmiş. Sırayla DNA düzenleyici elemanlarının3,11EcR bağlama indükler EcR/ultraspiracle (USP) heterodimerdir için bağlandığında ecdysone gen ekspresyonu aracılık eder. Omurgalı retinoid X reseptör (RXR), böcek USP, bir ortholog bir etkin transkripsiyon aktivatör16oluşturmak için EcR acemi. Böylece, omurgalı hücreleri veya doku transgene hedeflenen ifadesi için EcR ve RXR aynı anda ecdysone veya onun agonistler tarafından daha önce uyarılmış ortak ifade olması gerekir. Heterodimeric özelliği EcR tabanlı gen anahtarının endojen RXR düzeyi, Padidam ve arktarafından etkilenmiş olabilir beri. EcR DNA'ya bağlanıcı ve harekete geçirmek etki alanları kapaklı GAL4 DNA'ya bağlanıcı ile herpes simpleks virüs protein vmw65 yerine (VP16) etkinleştirme etki alanları erimiş olan o zaman endojen RXR tepkisiz oldu ve bir homodimer oluşan EcR ligand bağlayıcı etki Transkripsiyon etkinliği17kazanmak için. EcR tabanlı gen anahtar en az VP16 harekete geçirmek etki alanı olan bir homodimer oluşmuş ve ecdysone agonist, Teb16yokluğunda sitozol lokalize GvEcR ile birlikte oluşan bir chimeric protein oluşturmak yoluyla daha da geliştirildi, 18. Teb için bağlama tarafından GvEcR onun hücre altı yerelleştirme sitozol en az organizatörü kombine ile on bir tandem Zebra balığı E1b oluşan bir karma organizatörü ters yönde harekete geçirmek dizileri (UASs) başlatmak için tekrar tanımak için çekirdek değişti Transkripsiyon hedef gene16.

Daha önce raporlanmış EcR tabanlı gen basitleştirmek için16,18geçer, uyarıcı transgene ifade için tüm gerekli öğeleri ile donatılmış ve daha sonra belirlenen bir tek vektör ikili sistemin özelliklerini kombine Yeni oluşturulan vektör pEUI(+) (GenBank üyelik numarası: KP123436, şekil 1A)15. GvEcR sürücü (bundan sonra sürücü) yanıt efektör on tandem birden çok klonlama sitesi (MCS) tarafından takip E1b en az organizatörü yanındaki UAS tekrarlar, EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII tanıma dizileri ile (şekil 1B) oluşur. Buna ek olarak, seçimi kolaylaştırmak için transfected hücreleri, bir SV40 organizatörü tahrik puromisindir N-asetil-transferaz (PAC) gen istikrarlı hücre satır (şekil 1) korumak için sürücü ve efektör bölgeler arasında yerleştirildi.

Biz transgene ifade pEUI(+) kullanarak geçici ve istikrarlı modülasyon için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir ecdysone agonist TEB'in başarılı kullanımı için ayrıntılı yönergeler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transgene Subcloning

  1. Bir uygun restriksiyon enzimi tanıma sitesi (veya site) pEUI(+) MCS içinde seçin ve istenilen yönde (şekil 1) faiz gene subclone.
    Not: EGFP veya bayrak epitope öğesini ankyrin tekrar etki alanı 13A (ANKRD13A) transgene T4 DNA polimeraz bir sıra ve ligasyonu yöntem19klonlama bağımsız olarak kullanarak pEUI(+) vektör EcoRI sitedeki subcloned.
  2. 37 ° C'de 1 h için EcoRI ile pEUI(+) linearize Mix 50 ng/µL olan pEUI(+) ile 40 ng/µL PCR güçlendirilmiş EGFP veya ANKRD13A, doğrusallaştırılmış ve T4 DNA polimeraz (1 U) önce 10 dakika süreyle buzda kuluçka (RT) oda sıcaklığında 1 dk ile reaksiyon karışıma doğrudan 100 µL eklemek 10 µL tepki DH10B yetkili hücreleri aşağıdaki dönüştürme için denemeler yapın.
    Not: her ne kadar birkaç restriksiyon enzimi tanıma sitesi pEUI(+) (şekil 1B) MCS eklenmiş, hedef gen EcoRI siteye subcloning tüp ligasyonu bağımsız klonlama teknolojisi19,20kullanmanızı öneririz.
  3. Sıralama tarafından INSERT doğrulayın ve sonra transfection için uygun olan bir DNA arıtma kit kullanarak DNA arındırmak.

2. geçici Transfection ve Teb tedavi

  1. % 5-10 fetal sığır serum (FBS) ve antibiyotik (100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin) ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 5 mL taze pasajlı HEK293 hücreleri içeren dört hücre kültür yemekleri (60 mm çapında) hazırlamak. Bundan sonra "hücre kültür orta" veya sadece "kültür orta" FBS ve antibiyotik ile DMEM temsil eder. 37 ° C'de HEK293 hücreleri korumak
  2. 1 µg saf DNA'ın % 50-60 yoğunluk transfection reaktif 3 µL kullanarak, HEK293 hücre içine transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 200 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin. Transfection için iki tabak kullanın ve diğer denetimleri tedavi edilmezse bırakayım.
  3. Transfection 12-24 saat sonra Teb (son konsantrasyonları, 0.2 - 10 µmol) birine transfected örnekleri ve sigara transfected denetimleri ekleyin. Diğer iki örnek deneysel kontrolleri tedavi edilmezse bırakın.
    Not: Teb hisse senedi çözüm (50 mM Dimetil sülfoksit içinde çözünmüş) hücre kültür orta, DMEM veya fosfat tamponlu tuz (PBS) deneysel parametrelere bağlı olarak kültürlü hücrelere eklemeden önce uygun bir konsantrasyon, seyreltilmiş. Ancak, sulu çözelti içinde Teb düşük çözünürlük nedeniyle, orta TEB'in yüksek bir konsantrasyon ile ana bir karışım hazırlama kaçının; Bunun yerine, taze orta Teb istenen konsantrasyon içeren tam hücre kültür orta yerine.
  4. Teb-tedavi ve tedavi edilmezse hücreler için 12-48 h 37 ° C'de yetiştirmek
  5. EGFP kullanarak eklerseniz, EGFP ifade floresan mikroskop ( Şekil 2) altında analiz. Aksi halde, bir immunoblotting tahlil için hücreleri hasat.
    1. İmmunoblotting tahlil için buz gibi PBS iki kez hücrelerle durulama ve sonra onları bir hücre kazıyıcı kullanılarak kazımak.
    2. Hücreleri kazık için spin hasat 21.000 x g (RT) 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde aşağı.
    3. PBS tamamen discarding sonra buz gibi memeli protein ayıklama reaktif 0.5 mL ekleyin (M-başı), proteaz inhibitörü (100 proteaz inhibitörü kokteyl x 5 µL), 60 mm tabak içinde hücreler kültürlü Eğer Pelet için ile birlikte.
    4. Pipetting birkaç tur hücrelerle yeniden askıya alma ve askıya alınan hücreler (RT) 18-25 ° C'de 15 dakika için kuluçkaya.
    5. Hücre lysate 21.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin
    6. Sulu süpernatant temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın.
    7. İmmunoblotting, aşağıdaki standart iletişim kuralları ile uygun antikorlar tarafından süpernatant analiz.

3. nesil istikrarlı HEK293 hücre hatları ile pEUI(+) Gene Switch genomik entegrasyonu

  1. 5-10 µg transgene ile saf pEUI(+), 15-30 µL transfection reaktif kullanarak % 50-60 birleşmesi bir 90 mm çapında hücre kültür çanak içinde olan HEK293 hücrelere transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 500 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin.
  2. Transfection sonra büyümeye ve puromisindir-direnç gen ürünleri için 24-48 h 37 ° C'de (puromisindir) olmadan seçici olmayan kültür orta altında hızlı transfectants izin ver
  3. Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür orta atarak sonra transfectants Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile durulayın, 1 mL % 0.25 tripsin/ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Tripsin/EDTA sonra Şoklama Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek, hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri
  4. Transfectants 50 ml Önceden ısıtılmış kültür orta (37 ° C) ve transfer 10 mL hücrelerin içine 90 mm taze hücre kültür yemekler yeniden askıya alma. % 50-60 confluency puromisindir tedavi öncesi kadar 37 ° C'de hücreler kültür (genel olarak, bu yaklaşık 24-48 h alır).
  5. Hücre kültür 3 µg/mL puromisindir ile 3-4 hafta boyunca takıma orta 37 ° C'de transfectants yetiştirmek. Seçim döneminde seçimi basınç korumak için 2-3 günde puromisindir (3 µg/mL) içeren hücre kültür orta değiştirin. Hücreleri tamamen Konfluent olduğunda, puromisindir içeren kültür orta ile 3.3-3.4, adımda prosedürleri aşağıdaki bölüp. Kalan hücreleri kültür ortamında gerekli değildir Eğer atmak.
    Not: Puromisindir seçimi koşullar deneysel olarak belirli hücre tipleri için oluşturulmuş olmalıdır. Hücre kültürü ortamında 3 µg/mL puromisindir kullanılan; Bu hücre ölümü içinde sigara transfected HEK293 ikna etmek için yeterliydi.
  6. Hücre klonlama bir silindir kullanarak bireysel kolonilerden hasat ve üreticinin yönergeleri izleyin.
    1. Hücre kültür orta atın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) yüzen hücreleri kaldırmak için PBS ile plaka durulayın.
    2. Steril forseps kullanarak, klonlama silindir üzerinde bireysel kolonileri ayarlayın.
    3. %0.35 tripsin/EDTA 0.2 mL her silindir için ekleyin.
    4. Kadar hücreleri müstakil ve silindir için Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının birkaç damla eklemek için 1 dk 37 ° C'de çanak kuluçkaya.
    5. Hücreleri her silindir 6-şey plaka bireysel wells kültür orta 2 mL ve 1 µg/mL puromisindir her iyi ile aktarın.
      Not: hücreleri Konfluent olduğunda, kültürünü büyütmek. Şimdi clone(s) gerçekleştirilebilir.
  7. Hücre kültürü 1 µg/mL ile puromisindir takıma orta bireysel klonlar korumak.
  8. Bireysel kolonileri transgene ile immunoblotting ifade düzeyini analiz ederek onların duyarlılık için Teb tedaviye (son konsantrasyonu, 10 µM) 24 h Test yanıt için Teb klonların sınayarak doğrulayın. İstenen bir klonu (veya klonları) seçin. Teb tedavi ve tedavi edilmezse bir örnek 12-48 h 37 ° C'de için kültür ortamında transgene indüksiyon düzeyini analiz daha önce yetiştirmek. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 yordamlarda takip yoluyla ölçülebilir.

4. Teb tükenmesi

  1. Teb uyaranlara Teb-Alerjik orta ile Teb içeren hücre kültür orta değiştirerek gidermek.
    Not: Bu ilk hücreleri yeni bir kültür tabak üzerine reseeding olmadan büyüme ortamı değiştirin önerilir. Artık Teb plastik yemek için tutunacak görünür ve transgene güçlü arka plan ifadesidir temin. Hücreleri yeni bir kültür plaka üzerinde reseeding daha önce birkaç kez ile Kültür orta veya PBS hasat hücreleri durulayın.
    1. Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür ortamı içeren Teb atarak sonra iki kez Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile Teb teşvik hücreleri durulama, 1 mL % 0.25 tripsin/EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Teb-Alerjik Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek tripsin/EDTA Şoklama sonra hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri
    2. Önceden ısıtılmış Teb-Alerjik kültür orta (37 ° C) ve transfer 5 mL hücrelerin içine üç 60 mm taze hücre kültür yemekler 50 mL hücrelerde yeniden askıya alma. Sırasıyla 24, 48 ve 72 s 37 ° C'de hücreler kültür.
    3. Hücreleri farklı zaman noktalarda hasat ve immunoblotting kullanarak transgene ifade düzeyini ölçmek.
      Not: Bu deneysel koşullarda belirlenemeyen yaklaşık 3 gün sonrası kültür Teb-Alerjik kültürel orta (şekil 3) hücrelerinin transgene ifade oldu. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 göre tarafından ölçülebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekil gen GvEcR tabanlı anahtar şekil 1Aile tasvir edilir. PEUI(+) vektör Teb ile tedavi tarafından düzenlenmiş transgene ifade için optimize edildi. PEUI(+) efektör bölgesinin bir 10xUAS ve EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII restriksiyon enzimi tanıma siteleri içeren bir MCS tarafından en az organizatörü takip bir E1b oluşmaktadır. Bir SV40 Poli(a) sinyal MCS (şekil 1B) eklendi. PAC gen puromisindir direnç tanımak pEUI(+) sürücü ve efektör bölgeler arasında eklenir.

Etkinlik ve pEUI(+) leakiness değerlendirmek için biz subcloned EGFP MCS EcoRI siteye (pEUI(+)-EGFP), geçici HEK293 hücrelere plazmid yapı transfected ve Teb 24 h () için farklı konsantrasyonlarda yönetilen Şekil 2). Sahte vektör transfectants floresan değil göstermek did Teb tedavi ne olursa olsun (şekil 2A, B), pEUI (+) sinyalleri iken-EGFP transfectants oldu giderek duyarlı Teb (şekil 2C-F artış miktarı ). Daha da önemlisi, (+) pEUI-EGFP transfectants tedavi TEB'in olmadan değil herhangi bir tespit EGFP sinyalleri floresan mikroskop (şekil 2C) altında temin.

Daha fazla pEUI(+) Teb için yanıt verdiğini doğrulamak için biz bir bayrak epitope öğesini ANKRD13A gen pEUI(+) EcoRI siteye subcloned, yapý HEK293 hücrelere transfer ve sonra onları kurmak 3 hafta boyunca puromisindir seçime tabi istenen hücre kültürünü ANKRD13A transgene ile. ANKRD13A transgene ifade Teb ile 24 h tedaviden sonra analiz ettik ve kurulan hücre kültürünü iyi yanıt (şekil 3). Daha fazla kültürel ortamdan Teb tüketen tarafından pEUI(+) gen anahtarı reversibility gösterdi. Teb-Ücretsiz medya hücrelerde kültürlü zaman şekil 3' te gösterildiği gibi ANKRD13A ifade artık algılanabilir.

Figure 1
Resim 1 . PEUI(+) şematik diyagramı. (A) pEUI(+) vektör harita inşa. CMV organizatörü GvEcR kurucu ifade ediyor. Teb-bağlı GvEcR çekirdeği translocate ve 10xUAS CISbağlama-MCS eklenen transgene ifade uyarmak için düzenleyici serilerini rol. (A) köşeli ayraçlar arasında (B) sıra bilgi pEUI(+) tüm efektör dizisi içerir. Oklar MCS dahil bireysel restriksiyon enzimi tanıma siteleri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Tekil gen GvEcR tabanlı anahtar Teb tedaviye yanıt. HEK293 hücreleri ile belirtilen DNA transfected oluşturur. Transfection, 24 saat sonra hücreleri belirtilen konsantrasyon Teb ile 24 h için teşvik. EGFP transgene etkinlik floresan mikroskop altında gözlendi. PEUI(+) ile alay etmek transfectants(a)herhangi bir tespit Floresans gösterme veya (B) Teb tedavi olmadan. (C-E) PEUI (+) floresan yoğunluğu-EGFP-transfected hücreleri bir Teb doz bağımlı şekilde artırır. Ölçek bar, 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . HEK293 hücreleri stabil barındıran pEUI (+) / bayrak-ANKRD13A cevap geri dönülebilir olarak Teb yönetim. BAYRAK epitope öğesini ANKRD13A ifade Teb (1,5 µM) tedavi tarafından tetiklendi. Teb ile tedavinin 24 saat sonra hücreleri belirtilen süreyi için Teb bırakma medyaya açık. ANKRD13A göreli miktarını Anti-bayrak antikor ile Western Blot tarafından ölçüldü. α-tübülin endojen ifade düzeyini anti-α-tübülin antikor ile bir denetim olarak ölçüldü. Beyaz Yıldız işareti kimliği belirsiz bir cross-reactive türü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir ikili gen ifade anahtarı kullanmanın en büyük dezavantajı aynı anda iki ayrı plazmid (sürücü ve efektör) hedef hücreye teslim etmek ihtiyacıdır. Bu eşitsiz dağılımı Plazmid ve tutarsız bir yanıt sonucu indükleyicileri1,2,3geçmek için yol açabilir. İki-vektör sisteminin başka bir eksiklik en az iki el antibiyotik seçimi taahhüdü hücre satırları tanımlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, tek bir birim oluşan bir gen-indüklenebilir kaset uzun biyolojik araştırmalarda kullanılmak aranan. PEUI(+) tekil transgene ifade anahtarı transgene uyarılması için gerekli tüm yasal birimler ile donatılmış bir tek vektör yer almaktadır. Böylece, pEUI(+), subcloned transgene indüksiyon düzeyini geçici transfection deney ve kimyasal uyarıcı dozu transfected DNA miktarı bağlıdır. Buna ek olarak, daha fazla pEUI(+) vektör kullanımı ANKRD13A transgene15tek bir kopyasını içeren bir istikrarlı hücre satır oluşturarak test ettik. Kurulan hücre Teb tedaviye (şekil 3) yüksek hassasiyet gösterdi. Topluca, yüksek hassasiyet, reversibility ve düşük leakiness15, ifade düzeyi sınırlı varyasyon ile birlikte pEUI(+) hedef gen ekspresyonu değiştirmek için değerli bir moleküler ve hücresel araç olun.

Çeşitli indüklenebilir gen sistemleri arasında biz GvEcR bağlı gen indüksiyon kaset seçildi. GvEcR diğer sistemleri üzerinde çeşitli avantajları vardır: Birincisi, kimyasal indükleyicileri (Teb dahil olmak üzere) kullanılan birkaç ecdysone analogları lipofilik doğası hücresel zarları21; verimli penetrasyon için avantajlıdır İkinci olarak, omurgalıların içinde hiçbir EcR orthologs vardır, ecdysteroid agonistler üzerinde etkisi var bu yüzden işlevini endogenously nükleer reseptörleri21,22ifade; Üçüncü olarak, ecdysteroids omurgalılarda zararsız ve dolaşım sistemi içinde vivo21,23hızla temizlenmiş. ve çok sayıda ecdysone agonistler şimdiye kadar en iyi şekilde ölçekli küçük moleküller seçerek geliştirilmiştir bu yana dördüncü olarak, araştırmacılar istenmeyen komplikasyonlar13,22,24önleyebilirsiniz. PEUI(+) yüksek hassasiyet için Teb gösterir, ancak yanıt için diğer ecdysteroid agonistler pEUI(+) hızını test değerli kanıtlayabilir. Methoxyfenozide gibi non-steroid EcR agonistler varlığını Teb24 pEUI(+) uygulamalarının kapsamını genişletmek daha fazla suda çözünür. PEUI(+) transgene ifade bu Tet-sistemi15dakika sonra daha nispeten zayıf olsa da, transgene indüksiyon düzeyini VP16 transactivation etki (veri gösterilmez) çok bir kopyasını ekleme tarafından artar. Son gen terapisi uygulamaları bir hedef gen güvenli teslimat hücreleri veya ilgili fonksiyonel gen ürünü sayesinde genetik hastalık25,26,27eksikliği dokular üzerinde odaklanmıştır. Ancak, Sigara düzenlenir transgene doku özgü ya da viral bünye rehberleri kontrol altında hiper-ifade yerel doku hasarı28,29olasılığını yükseltir hedef genin temin. Böylece, bir güvenilir gen anahtar gen tedavisi için uygulama istenmeyen komplikasyonları önlemek olabilir. PEUI(+) vektör biyolojik ve klinik çalışmalarda transgene ifade denetlemek için kullanışlı ve güçlü bir araç sağlar. Şu anda, bir tekil lentiviral vektör sistemimiz uygulama aralığı artırmak için GvEcR üzerinde dayalı gelişmekte olan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

Acknowledgments

Yazarlar S-İ Choi (Chonnam National University) değerli yorum ve bizim el yazması ayrıntılı okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Chungnam Ulusal Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9, (5), 451-456 (1998).
  2. Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7, (2), 120-125 (2000).
  3. Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, (12), 5547-5551 (1992).
  5. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  6. Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (24), 13796-13801 (2001).
  7. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127, (13), 4715-4721 (2005).
  8. Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1, (1), 29 (2012).
  9. Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
  10. Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68, (6), 409-420 (2003).
  11. Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366, (6454), 476-479 (1993).
  12. Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60, (2000), 1-73 (2000).
  13. Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97, (26), 14512-14517 (2000).
  14. Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39, (2), 191-200 (2005).
  15. Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5, (9), e367 (2016).
  16. Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3, (3), 154-155 (2007).
  17. Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12, (1), 101-109 (2003).
  18. Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (46), 19933-19938 (2010).
  19. Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78, (15), 5440-5443 (2012).
  20. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43, (3), 354-359 (2007).
  21. No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (8), 3346-3351 (1996).
  22. Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59, (1), 25-35 (2003).
  23. Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37, (6), 1174-1177 (1988).
  24. Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57, (2), 115-119 (2001).
  25. McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15, (11), 1022-1033 (2004).
  26. Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (4), a015149 (2014).
  27. Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
  28. Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110, (1), 228-234 (2003).
  29. Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19, (3), 470-478 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics