En Ecdysone Receptor-baserede ental gen Switch til bevidst udtryk for transgen med robusthed, reversibilitet og ubetydelig Leakiness

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer her, en protokol om en graduering af transgenet udtryk ved hjælp af pEUI(+) ental gen switch ved tebufenozide behandling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Won, M., Hwang, R. H., Hur, G. M., Ro, H. An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness. J. Vis. Exp. (135), e57494, doi:10.3791/57494 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Præcis styring af transgenet udtryk er ønskeligt i biologiske og kliniske undersøgelser. Men fordi den binære funktion i øjeblikket ansat gen skifter kræver overførsel af to terapeutiske udtryk enheder samtidigt til en enkelt celle, den praktiske anvendelse af ordningen for genterapi er begrænset. For at forenkle ordningen transgen udtryk, skabt vi et gen switch udpeget som pEUI(+) omfatter et komplet sæt af transgenet udtryk moduler i en enkelt vektor. Bestående af GAL4 DNA-bindende domæne og modificerede Sml (GvEcR), en minimal VP16 aktivering domæne sammensmeltet med en GAL4 DNA-bindende domæne, samt en modificeret Drosophila ecdysone receptor (EcR), den nyudviklede ental gen switch er meget lydhør administration af en kemisk inducer på en måde, afhængig af tid og dosering. PEUI(+) vektor er et potentielt kraftfuldt værktøj til at forbedre kontrol af transgenet udtryk i både biologisk forskning og prækliniske undersøgelser. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for graduering af en forbigående og stabil transgen udtryk ved hjælp af pEUI(+) vektor ved behandling af tebufenozide (Teb). Derudover deler vi vigtige retningslinjer for brug af Teb som en kemisk inducer.

Introduction

Flere forskellige gen afbrydere har været undersøgt for deres evne til at regulere netop transgen udtryk i cellekultur og dyremodeller, med varierende grader af succes1,2,3. Potentielle gen switch systemer skal opfylde flere strenge kriterier, herunder: præcise retningsbestemt udtryk for transgen, afhængig af dosis og tidspunkt lydhørhed over for induktorer, ubetydelig leakiness af initiativtageren, reversibilitet af transgenet aktivering via inducer fjernelse og inducer toksicitet niveauer tolerabel at cellelinjer og laboratorium dyr1,2,3. Flere små molekyle induktorer er blevet udnyttet, herunder tetracyklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepriston9,10, og ecdysone11,12,13,14. Generelt er disse systemer kræver mindst to plasmider, der indeholder to eller tre enheder, diskret udtryk, en eller to som komponere en regulerende element (inducer plasmid), der binder en lille molekyle inducer at få transcriptional aktivitet; og en anden plasmid (effektor plasmid) indeholdende transgen under kontrol af en regulerende DNA-regionen, der giver mulighed for adgang af den inducer-bundet regulerende element. Den største ulempe ved det binære system er, at det kræver den samtidige indførelse af to vektorer (inducer og effektor) i målcellen. I forbigående transgen udtryk eksperimenter producerer den samtidige Transfektion af to plasmider uundgåeligt en befolkning af celler, der enkeltvis er transfekteret med enten Induceren eller effektor eller co transfekteret ulige. Derudover kræver det binære system mindst to runder af antibiotika valg at etablere stabile cellelinjer, som er tidskrævende og besværlige. Således, ved at kombinere alle komponenterne, der kræves for transgen udtryk og forordning i en enkelt vektor ville være ideel til at garantere de samtidig udtryk for alle de obligatoriske elementer i en enkelt celle og mulighed for regulering af transgenet udtryk gennem behandling med lille molekyle induktorer.

For at overvinde manglerne i binære gen switche, udviklet vi for nylig en enestående gen switch, ved hjælp af en Drosophila melanogaster Sml-baserede gen inducerbar system15. Ecdysone medierer genekspression, når det binder sig til Sml. / ultraspiracle (USP) heterodimer, som igen inducerer binding af EcR DNA regulerende elementer3,11. Hvirveldyr retinoid X receptor (RXR), en ortholog af insekt USP, rekrutter Sml for at danne en aktiv transcriptional aktivator16. Således, for den målrettede udtryk for en transgen i hvirveldyr celler eller væv, EcR og RXR skal være co udtrykte samtidig før bliver stimuleret af ecdysone eller dens agonister. Da funktionen heterodimerisk af parameteren Sml-baserede gen kan være påvirket af den endogene RXR niveau, Padidam mfl. erstattet de Sml. DNA-bindende og aktivering domæner med heterolog GAL4 DNA-bindende, herpes simplex virus protein vmw65 (VP16) aktivering domæner smeltet til Sml ligand-bindende domæne, som derefter blev ikke reagerer på endogene RXR og dannede en homodimer at få transcriptional aktivitet17. Parameteren Sml-baserede gen blev yderligere forbedret ved at konstruere en kimære protein består af minimal VP16 aktivering domæne kombineret med GvEcR, som dannede en homodimer og lokaliseret i cytosol i mangel af ecdysone agonist, Teb16, 18. Ved binding til Teb, GvEcR ændret sin subcellulært lokalisering fra cytosol til kernen til at genkende en hybrid promotor består af zebrafisk E1b minimal promotor kombineret med en ti tandem gentages opstrøms aktivering sekvenser (UASs) at indlede den transskription af target gen16.

For at forenkle den tidligere rapporteret Sml-baserede gen skifter16,18, vi kombineret de binære funktioner i systemet til en enkelt vektor udstyret med alle de obligatoriske elementer til stimulerende transgen udtryk, og derefter udpeget den nyligt oprettede vector, pEUI(+) (GenBank stammesamlingsnummer: KP123436, figur 1A)15. Effektor svarer til GvEcR-driveren (herefter driver) består af ti tandem UAS gentager ved siden af en E1b minimal promotor efterfulgt af en flere kloning websted (MCS) med EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI og AflII anerkendelse sekvenser (figur 1B). Desuden at lette udvælgelsen af transfekteret celler, en SV40 promotor-drevet puromycin N-acetyl-transferase (PAC)-genet blev placeret mellem regionerne driver og effektor at opretholde stabile cellelinjer (figur 1).

Vi beskriver en detaljeret protokol for den forbigående og stabil graduering af transgenet udtryk ved hjælp af pEUI(+). Derudover giver vi detaljeret vejledning til vellykket brug af Teb som en ecdysone agonist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. transgen Subcloning

  1. Vælg en passende begrænsning enzym anerkendelse websted (eller websteder) i MCS af pEUI(+), og subclone gen af interesse i den ønskede retning (figur 1).
    Bemærk: Den EGFP eller FLAG epitop-tagged ankyrin gentage domæne 13A (ANKRD13A) transgen var subcloned i EcoRI site af pEUI(+) vektor ved hjælp af T4 DNA polymerase i en sekvens - og ligatur-uafhængig kloning metode19.
  2. Linearize pEUI(+) med EcoRI i 1 timer ved 37 ° C. Mix 50 ng/µL af lineariseret pEUI(+) med 40 ng/µL PCR-forstærket EGFP eller ANKRD13A, og reagere med T4 DNA polymerase (1 U) i 1 minut ved stuetemperatur (RT) før inkubation i isbad i 10 min. tilføje 10 µL af reaktionsblandingen direkte til 100 µL af DH10B kompetente celler for den følgende transformation eksperimentere.
    Bemærk: Selvom flere begrænsning enzym genkendelsessekvenser blev føjet til MCS af pEUI(+) (figur 1B), anbefaler vi subcloning target gen ind EcoRI webstedet, ved hjælp af ligatur-uafhængig kloning teknologi19,20.
  3. Kontrollere skæret af sekventering og derefter rense DNA ved hjælp af en DNA rensning kit, der er egnet til Transfektion.

2. forbigående Transfektion og Teb behandling

  1. Forberede fire celle kultur retter (60 mm i diameter) med frisk passaged HEK293 celler i 5 mL af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 5-10% føtal bovint serum (FBS) og antibiotika (100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin). Herefter, repræsenterer "cellekulturmedium" eller blot "næringssubstratet" DMEM suppleret med FBS og antibiotika. Opretholde HEK293 celler ved 37 ° C.
  2. Transfect 1 µg oprenset DNA i HEK293 celler på 50-60% massefylde ved hjælp af 3 µL Transfektion reagens. Tilføje Transfektion reagens til 200 µL fortyndingsvæske (DMEM uden FBS og antibiotika) som indeholder DNA. Efter inkubation af reaktionsblandingen for 30 min på RT, tilsæt blandingen til HEK-293 celler på kultur parabol. Bruge to retter for Transfektion, og lade de andre to ubehandlet som kontrol.
  3. Efter 12-24 h af Transfektion, tilføje Teb (endelige koncentrationer, 0,2 - 10 µmol) til en af transfected prøver og til en af de ikke-transfekteret kontrol. Forlade de andre to prøver ubehandlet som eksperimentelle kontrolelementer.
    Bemærk: Teb stamopløsningen (50 mM opløst i dimethylsulfoxid) kan fortyndes i cellekulturmedium, DMEM eller fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved en passende koncentration før du tilføjer til de dyrkede celler afhængigt af de eksperimentelle parametre. Men på grund af den lave Opløselighed af Teb i vandig opløsning, undgå forbereder en master mix med en høj koncentration af Teb i medium; i stedet erstatte den komplette cellekulturmedium med friske medium indeholdende Teb i den ønskede koncentration.
  4. Dyrke de Teb-behandlede og ubehandlede celler i 12-48 timer ved 37 ° C.
  5. Hvis du bruger EGFP indsætter, analysere EGFP udtryk i et fluorescerende mikroskop ( figur 2). Ellers, høste celler for en immunoblotting analyse.
    1. For immunoblotting analysen, skyl celler to gange med iskold PBS og derefter skrabe dem ud ved hjælp af en celle skraber.
    2. For hober sig cellerne, spin ned høsten i en 15 mL konisk slange på 21.000 x g i 2 min på 18-25 ° C (RT).
    3. Efter kassering PBS helt, tilføje 0,5 mL iskold pattedyrsproteiner udvinding reagens (M-PER), sammen med protease inhibitor (5 µL af 100 x protease hæmmer cocktail), at pellet hvis celler dyrkes i en 60 mm parabol.
    4. Genopslæmmes celler med flere runder af pipettering, og derefter inkuberes suspenderede cellerne for 15 min på 18-25 ° C (RT).
    5. Spin den celle lysate på 21.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    6. Overføre den vandige supernatanten ind i en frisk 1,5 mL microcentrifuge rør.
    7. Analysere supernatanten ved immunoblotting, følgende standardprotokoller med passende antistoffer.

3. generation af stabile HEK293 cellelinjer med genomisk Integration af pEUI(+)-genet Switch

  1. Transfect 5-10 µg af den renset pEUI(+) med transgenet til HEK293 celler, der er 50-60% sammenflydende i 90 mm diameter celle kultur fad med 15-30 µL Transfektion reagens. Tilføje Transfektion reagens til 500 µL af fortyndingsmiddel (DMEM uden FBS og antibiotika) som indeholder DNA. Efter inkubation af reaktionsblandingen for 30 min på RT, tilsæt blandingen til HEK-293 celler på kultur parabol.
  2. Efter Transfektion, tillade transfectants at vokse og udtrykke puromycin-resistens genprodukter under ikke-selektiv næringssubstratet (uden puromycin) i 24-48 timer ved 37 ° C.
  3. Adskille celler fra kultur retter af trypsinization. Efter kassering næringssubstratet, skyl transfectants med pre varmede PBS (37 ° C), der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin/ethylendiamintetra syre (EDTA) og inkuberes i 1 minut ved 37 ° C. Efter quenching trypsin/EDTA ved at tilføje pre varmede næringssubstratet (10 mL, 37 ° C), høste celler ved hjælp af en celle skraber, efterfulgt af centrifugering i en 15 mL konisk slange på 21.000 x g i 2 min på 18-25 ° C.
  4. Genopslæmmes i transfectants i 50 mL pre varmede næringssubstratet (37 ° C), og overføres 10 mL af celler til 90 mm frisk celle kultur retter. Kultur celler ved 37 ° C indtil 50-60% confluency før puromycin behandling (i almindelighed, det tager ca 24-48 h).
  5. Dyrke transfectants ved 37 ° C i cellekulturmedium suppleret med 3 µg/mL puromycin til 3-4 uger. Perioden udvalg ændre cellekulturmedium indeholdende puromycin (3 µg/mL) hver 2-3 dage for at opretholde udvælgelse pres. Når cellerne bliver fuldt sammenflydende, opdele dem efter procedurerne i trin 3.3-3.4, med puromycin-holdige næringssubstratet. Smid de resterende celler i substratet, hvis ikke nødvendig.
    Bemærk: Puromycin udvalg betingelser bør fastsættes eksperimentelt for specifikke celletyper. Vi brugte 3 µg/mL af puromycin i cellekulturmedium; Dette var nok til at fremkalde celledød i ikke-transfekteret HEK293.
  6. Høste celler fra enkelte kolonier, ved hjælp af en kloning cylinder, og følg producentens anvisninger.
    1. Kassér cellekulturmedium. Skyl plade to gange med pre varmede (37 ° C) PBS fjerne flydende celler.
    2. Ved hjælp af steril pincet, indstille kloning cylinderen over de enkelte kolonier.
    3. Der tilsættes 0,2 mL 0,35% trypsin/EDTA til hver cylinder.
    4. Inkuber parabol ved 37 ° C i 1 min., indtil cellerne er løsrevet, og derefter tilføje et par dråber af pre varmede (37 ° C) næringssubstrat til cylinderne.
    5. Overføre cellerne fra hver cylinder til individuelle brønde på en 6-godt plade, med 2 mL af næringssubstratet og 1 µg/mL af puromycin i hver brønd.
      Bemærk: Når cellerne bliver sammenflydende, skala oppe kulturen. Nu kan clone(s) etableres.
  7. Vedligeholde enkelte kloner i cellekulturmedium suppleret med 1 µg/mL af puromycin.
  8. Valider individuelle kolonier ved at teste deres følsomhed over for Teb behandling (endelig koncentration, 10 µM) for 24 h. Test lydhørhed af kloner til at Teb ved at analysere udtryk niveau af transgenet med immunoblotting. Vælg en ønsket klon (eller kloner). Dyrke en Teb-behandlet og en ubehandlet prøve dyrkningsmedium i 12-48 timer ved 37 ° C før analysere niveauet induktion af transgenet. Udtryk niveauet af transgenet kan måles gennem immunoblotting, efter procedurerne i trin 2.5.1 - 2.5.7.

4. nedbrydning af Teb

  1. Dæmpning Teb stimuli ved at erstatte Teb indeholdende cellekulturmedium med Teb-frit medium.
    Bemærk: Det anbefales at erstatte vækst medier uden første sædekorn celler på en ny kultur parabol. Resterende Teb synes at klamre sig til fadet, plast og vil fremkalde en stærk baggrund udtryk af transgenet. Før sædekorn celler på en ny kultur plade, skyl de høstede celler flere gange med enten næringssubstratet eller PBS.
    1. Adskille celler fra kultur retter af trypsinization. Efter kassering Teb indeholdende næringssubstrat, skyl Teb-stimuleres cellerne to gange med pre varmede PBS (37 ° C), der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin/EDTA og inkuberes i 1 minut ved 37 ° C. Efter quenching trypsin/EDTA ved at tilføje pre varmede Teb-fri næringssubstratet (10 mL, 37 ° C), høste celler ved hjælp af en celle skraber, efterfulgt af centrifugering i en 15 mL konisk slange på 21.000 x g i 2 min på 18-25 ° C.
    2. Cellerne i 50 mL pre varmede Teb-fri næringssubstratet (37 ° C), og tre 60 mm frisk celle kultur retter overføre 5 mL af cellerne genopslæmmes. Kultur celler ved 37 ° C i 24, 48 og 72 h henholdsvis.
    3. Høste celler på forskellige tidspunkter og måle udtryk niveau af transgenet ved hjælp af immunoblotting.
      Bemærk: Disse eksperimentelle betingelser transgen udtryk blev målbart ca 3 dage efter kultur af cellerne i den Teb-fri kulturelle medium (figur 3). Udtryk niveauet af transgenet kan måles ved immunoblotting, som trin 2.5.1 - 2.5.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Parameteren GvEcR-baserede ental genet er afbildet i figur 1A. PEUI(+) vektor var optimeret til regulerede transgen udtryk ved behandling med Teb. Regionen effektor af pEUI(+) består af en 10xUAS og en E1b minimal promotor efterfulgt af en MCS, der indeholder EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI og AflII begrænsning enzym genkendelsessekvenser. En SV40 poly(A) signal blev tilføjet bag MCS (figur 1B). En PAC gen var indsat mellem regionerne driver og effektor i pEUI(+) at give modstand til puromycin.

For at evaluere den aktivitet og leakiness af pEUI(+), vi subcloned EGFP i EcoRI stedet for MCS (pEUI(+)-EGFP), forbigående transfekteret plasmid konstruktion i HEK293 celler, og administreres Teb i forskellige koncentrationer til 24 h () Figur 2). Mens mock vektor transfectants ikke viste fluorescerende signalerer uanset Teb behandling (figur 2A, B), pEUI (+)-EGFP transfectants blev gradvis overfølsom over for den øgede mængde af Teb (figur 2 c-F ). Endnu vigtigere, pEUI (+)-EGFP transfectants uden behandling af Teb ikke fremkalde nogen påviselig EGFP signaler under en fluorescerende mikroskop (figur 2 c).

For at yderligere validere lydhørhed af pEUI(+) til Teb, vi subcloned et FLAG epitop-markeret ANKRD13A gen i EcoRI stedet for pEUI(+), overføres konstruktionen i HEK293 celler, og derefter udsat dem for puromycin udvalg i 3 uger til at etablere en ønskede cellelinie med ANKRD13A transgenet. Vi analyserede udtryk af ANKRD13A transgenet efter 24 timer behandling med Teb og den etablerede cellelinie reagerede godt (figur 3). Vi finpudset reversibilitet af parameteren pEUI(+) gen af nedbryder Teb fra den kulturelle medier. Som vist i figur 3, var ANKRD13A udtryk ikke længere kan påvises, når vi kulturperler celler i Teb-frie medier.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk diagram over pEUI(+). (A) vektor kort af pEUI(+) blev bygget. En CMV promotor drev konstitutiv udtryk for GvEcR. Teb-bundet GvEcR bliver translocate ind i kernen og binde 10xUAS cis-handler regulerende sekvenser for at stimulere udtryk af transgenet indsat i MCS. (B) sekvensen oplysninger mellem de kantede parenteser i (A) indeholder hele effektor sekvenser af pEUI(+). Pile repræsenterer de individuelle begrænsning enzym anerkendelse sites inkluderet i MCS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . GvEcR-baserede ental gen switch reagerer på behandling af Teb. HEK293 celler blev transfekteret med den angivne DNA konstruktioner. Efter 24 timer af Transfektion, blev cellerne stimuleret i 24 timer med Teb ved den maalte koncentration. EGFP transgen aktivitet blev observeret under et mikroskop for fluorescerende. Mock transfectants med pEUI(+) viste ikke nogen påviselig fluorescens med (A) eller uden (B) Teb behandling. (C-E) Fluorescerende intensiteten i pEUI (+)-EGFP-transfekteret celler øger i Teb dosis-afhængige måde. Skala bar, 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . HEK293 celler stabilt husly pEUI (+) / FLAG-ANKRD13A reagere reversibelt til administration af Teb. FLAG epitop-markeret ANKRD13A udtryk var udløst af Teb (1,5 µM) behandling. Efter 24 timer behandling med Teb, blev cellerne skiftede til Teb drop-out media for den angivne tid. Den relative mængde af ANKRD13A blev målt ved Western blotting med anti-FLAG antistof. Den endogene udtryk niveau af α-tubulin blev målt med anti-α-tubulin antistof som kontrol. Den hvide stjerne angiver en uidentificeret cross-reactive arter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største ulempe ved at bruge en binær gen udtrykket switch må samtidig levere to separate plasmider (driver og effektor) i målcellen. Dette kan føre til en ulige fordeling af plasmider og resultere i en inkonsekvent svar af overgangen til induktorer1,2,3. En anden mangel ved to-vektor-system er, at mindst to runder af antibiotika valg forpligtes til at identificere lovende cellelinjer. En gen-inducerbar kassette bestående af én enhed har derfor længe søgt til brug i biologisk forskning. Parameteren pEUI(+) ental transgen udtryk er indeholdt i en enkelt vektor udstyret med alle regulerede enheder kræves for transgen stimulation. Induktion niveau af transgenet, subcloned i pEUI(+), er således afhængig af mængden af DNA transfekteret i forbigående Transfektion eksperiment og dosering af den kemiske inducer. Derudover testet vi yderligere brugen af pEUI(+) vektor ved at generere en stabil cellelinje, der indeholder en enkelt kopi af ANKRD13A transgen15. Den etablerede cellelinie viste høj følsomhed over for Teb behandling (figur 3). Kollektivt gøre sin høj følsomhed, reversibilitet og lav leakiness15, sammen med begrænset variation i udtrykket niveau pEUI(+) en værdifuld molekylære og cellulære redskab til at manipulere target genekspression.

Blandt forskellige inducerbar gen systemer, har vi valgt GvEcR-afhængige gen induktion kassette. GvEcR har flere fordele sammenlignet med andre systemer: først, den lipofile karakter af flere ecdysone analoger anvendes som kemiske induktorer (herunder Teb) er fordelagtig for effektiv penetration af cellulære membraner21; for det andet er der ingen Sml. orthologs i hvirveldyr, så ecdysteroid agonister ikke påvirker funktionen af udtrykt endogent nukleare receptorer21,22; for det tredje er ecdysteroid uskadelige i hvirveldyr og hurtigt ryddet fra cirkulation system i vivo21,23; og for det fjerde, da talrige ecdysone agonister har udviklet indtil nu, ved at vælge optimalt mellemstore små molekyler, forskere kan undgå uønskede komplikationer13,22,24. Selv om pEUI(+) viser høj følsomhed til Teb, test lydhørhed af pEUI(+) til andre ecdysteroid agonister kan vise sig værdifulde. Eksistensen af non-steroide Sml agonister, såsom methoxyfenozid, der er mere opløselige i vand end Teb24 kan udvide anvendelsesområdet for anvendelser af pEUI(+). Selvom udtrykket af transgenet i pEUI(+) er relativt svagere end i en Tet-On system15, kunne niveau af transgenet induktion blive udvidet ved tilsætning af en multi kopi af VP16 transactivation domæne (data ikke vist). Seneste gene therapy programmer har fokuseret på de sikre leverancer af et target gen til celler eller væv, der mangler de respektive funktionel genet produkt på grund af genetiske sygdom25,26,27. Dog kan ikke-regulerede transgen under kontrol af væv-specifikke eller viral konstitutiv initiativtagere fremkalde hyper-ekspressionen af target-genet, som hæver muligheden for lokal væv skader28,29. Således kunne anvendelsen af en pålidelig gen switch for genterapi undgå uønskede komplikationer. PEUI(+) vektor giver en bekvem og kraftfuld værktøj til at styre transgen udtryk i biologiske og kliniske undersøgelser. I øjeblikket er vi ved at udvikle en ental lentiviral vektor baseret på GvEcR at øge rækken anvendelse af vores system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen interessekonflikter, der er relateret til denne betænkning.

Acknowledgments

Forfatterne takke S-Y Choi (Chonnam National University) for værdifulde kommentarer og grundig læsning af vores manuskript. Dette arbejde blev støttet af en forskningsfond i Chungnam National University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEUI(+) TransLab The patent license was transferred to TransLab Inc. 
Gene-Fect Transfection Reagent TransLab TLC-001
HEK293 ATCC CRL-1573
Tebufenozide Fluka 31652
Cloning cylinder Sigma CLS31668
Puromycin Corning 58-58-2
Antibiotics Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Welgene LS015-01
DMEM Welgene LM001-05
Fetal Bovine Serum Welgene S001-01
Cell culture dish SPL life science 11090
mouse FLAG M2 Sigma F3165
anti-alpha tubulin antibody Calbiochem CP06
Cloning cylinder Sigma CLS31668
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410.1
M-PER Mammalian Protein
Extraction Reagent
Thermo Fisher 78505
100X Protease inhibitor Cock. III T&I BPI-9200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossi, F. M., Blau, H. M. Recent advances in inducible gene expression systems. Curr. Opin. Biotechnol. 9, (5), 451-456 (1998).
  2. Clackson, T. Regulated gene expression systems. Gene Ther. 7, (2), 120-125 (2000).
  3. Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. Viral Gene Therapy. Xu, K. InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system 285-309 (2011).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, (12), 5547-5551 (1992).
  5. Baron, U., Bujard, H. Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances. Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).
  6. Hentges, K. E., et al. FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (24), 13796-13801 (2001).
  7. Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127, (13), 4715-4721 (2005).
  8. Seto, B. Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer. Clin Transl Med. 1, (1), 29 (2012).
  9. Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. Clinical uses of mifepristone (MFP). Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).
  10. Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies. Contraception. 68, (6), 409-420 (2003).
  11. Yao, T. P., et al. Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes. Nature. 366, (6454), 476-479 (1993).
  12. Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. Ecdysone receptors and their biological actions. Vitam Horm. 60, (2000), 1-73 (2000).
  13. Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci USA. 97, (26), 14512-14517 (2000).
  14. Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size. Biotechniques. 39, (2), 191-200 (2005).
  15. Lee, S., et al. Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues. Mol. Ther. Nucleic Acids. 5, (9), e367 (2016).
  16. Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. Small-molecule regulation of zebrafish gene expression. Nat Chem Biol. 3, (3), 154-155 (2007).
  17. Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants. Transgenic Res. 12, (1), 101-109 (2003).
  18. Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (46), 19933-19938 (2010).
  19. Jeong, J. Y., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl Environ Microbiol. 78, (15), 5440-5443 (2012).
  20. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43, (3), 354-359 (2007).
  21. No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (8), 3346-3351 (1996).
  22. Sawada, Y., et al. Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues. Pest Manag Sci. 59, (1), 25-35 (2003).
  23. Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse. Biochem Pharmacol. 37, (6), 1174-1177 (1988).
  24. Carlson, G. R., et al. The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist. Pest Manag Sci. 57, (2), 115-119 (2001).
  25. McConnell, M. J., Imperiale, M. J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy. Hum Gene Ther. 15, (11), 1022-1033 (2004).
  26. Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. Gene therapy for skin diseases. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (4), a015149 (2014).
  27. Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook. Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).
  28. Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats. J Surg Res. 110, (1), 228-234 (2003).
  29. Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter. Mol Ther. 19, (3), 470-478 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics