La Lambda sélectionnez cII système de détection de Mutation

Immunology and Infection

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Summary

Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le test de la mutation de la cII Lambda sélectionnez en cellules de rongeurs transgéniques ou les animaux correspondants traités avec un agent chimique/physique d’intérêt. Cette approche a été largement utilisée pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères.

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Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

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Abstract

Un certain nombre de modèles animaux transgéniques et les systèmes de détection de mutation ont été développé pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères. Parmi ceux-ci, les souris transgéniques et le Lambda (λ) Select cII système de détection de Mutation ont été employés pour des expériences de mutagénicité par de nombreux groupes de recherche dans le monde entier. Ici, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le test de mutation cII sélectionnez Lambda, qui peut être appliqué à des cellules de souris/rats transgéniques ou les animaux correspondants traitement avec un agent chimique/physique d’intérêt. Le protocole se compose des étapes suivantes : (1) isolement de l’ADN génomique des cellules ou des organes/tissus d’animaux transgéniques traitent in vitro ou in vivo, respectivement, avec un composé ; (2) récupération du vecteur navette lambda portant un gène de journaliste mutationnelle (c.-à-d., cII transgène) de l’ADN génomique ; (3) emballage des vecteurs sauvés dans les bactériophages infectieuses ; (4) infectant une bactérie hôte et mise en culture dans des conditions sélectives pour permettre la propagation des mutations induites cII ; et (5) marquant la cII-mutants et ADN de séquence analyse afin de déterminer la fréquence des mutants cII et spectre de mutation, respectivement.

Introduction

Un large éventail de modèles animaux transgéniques et les systèmes de détection de mutation ont été développés pour les tests de mutagénicité des cancérogènes dans les cellules de mammifères. Parmi ceux-ci, des souris transgéniques de Big Blue (dénommé ci-après BB) et le λ Select cII système de détection de Mutation ont été employées pour des expériences de mutagénicité par ce groupe et de nombreuses autres recherches groupes dans le monde1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Pour les 16 dernières années, nous avons étudié les effets mutagènes des divers agents physiques ou chimiques, à l’aide de ces animaux transgéniques ou traitement avec un composé leurs cultures de cellules de fibroblastes embryonnaires correspondant et par la suite analysé la phénotype et génotype du transgène cII par le λ Select cII dosage et le séquençage de l’ADN, respectivement10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. le génome de ces animaux transgéniques contient un vecteur bactériophage λ navette (λLIZ) intégré sur le chromosome 4 une multi-copie tête-à-queue concatemer1,2,25. Le vecteur navette λLIZ porte deux gènes mutationnelle, à savoir la lacI et cII transgènes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. le λ Select cII est basé sur la récupération des vecteurs navettes λLIZ partir de l’ADN génomique des cellules provenant d’organes/tissus d’animaux transgéniques1,2,25 . Les vecteurs navettes λLIZ récupérés sont ensuite emballés dans têtes de phage λ capables d’infecter un hôte indicateur Escherichia coli. Par la suite, les bactéries infectées sont cultivés en sélectif permettant de notation et de l’analyse des mutations dans le cII transgène1,3.

Ici, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour le dosage de Select cII λ, qui se compose de l’isolement de l’ADN génomique des cellules et des organes d’animaux transgéniques traités in vitro/in vivo avec un test de récupération composé, de le λLIZ navette vecteurs de l’ADN génomique, emballage des vecteurs dans des phages λ infectieuse, une infection de l’hôte Escherichia coli avec les bactériophages, identification de la cII-mutants dans des conditions sélectives afin de déterminer la fréquence des mutants cII , et Analyse de séquence d’ADN pour établir le spectre de mutation cII . Le protocole peut être appliqué aux souris/rat transgénique cell cultures traitées in vitro avec un agent chimique/physique des intérêts, ou tissus/organes des animaux correspondants traités in vivo avec le test agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Une présentation schématique de l’essai de Select cII λ est illustrée à la Figure 1.

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Protocol

1. génomiques isolement des fibroblastes embryonnaires de souris

Remarque : Les fibroblastes embryonnaires de souris primaire sont isolés des embryons provenant de souris transgéniques BB avec le bagage génétique de C57BL/6, selon le protocole publié53. Le produit de départ pour ce protocole se compose de 1 x 106 à 1 x 107 cellules de fibroblastes embryonnaires traitées avec un contrôle composé par rapport de test. La récolte et le comptage de ces cellules à l’aide de méthodes standard sont décrits dans les références10,,du5455.

  1. Préparer un (0,3 M saccharose, KCl 60 mM, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, la spermidine 0,5 mM, spermine de 0,15 mM et 2 mM EDTA) de tampon, tampon B (150 mM NaCl et 5 mM EDTA, pH 7,8) et tampon C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl, EDTA de 20 mM et 1 % SDS) longtemps à l’avance et conserver à température ambiante (RT) jusqu'à une année54,55.
  2. Remettre en suspension les cellules dans le tampon de 2 à 4 mL dans un tube à centrifuger conique 15 mL en pipettant également, à plusieurs reprises et descendre à l’aide d’une échelle d’alésage pointe de pipette 1 000 µL.
  3. Ajouter un volume (2 à 4 mL) tampons A contenant 1 % octylphenoxypolyethoxyethanol (p. ex., Nonidet P40) à l’aide d’une pipette sérologique de verre.
  4. Incuber le tube sur la glace pendant 5 min.
  5. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Jeter le surnageant et laver le culot avec 10 à 15 mL de tampon une aide d’une pipette sérologique de verre.
  7. Resuspendre le culot dans 2 à 4 mL de tampon B.
  8. Ajouter un volume (2 à 4 mL) tampon C contenant 600 µg/mL protéinase K.
  9. Incuber le tube pendant 3 h à 37 ° C.
  10. Ajouter RNase A à une concentration finale de 100 µg/mL.
  11. Incuber le tube pendant 1 h supplémentaires à 37 ° C.
  12. Ajouter un phénol de volume (2 à 4 mL) (saturé en 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0) alcool :chloroform:isoamyl (25:24:1 vol/vol).
    NOTE : Phénol peut poser un danger pour la santé graves et doit être manipulé avec une extrême prudence. Phénol est très corrosive pour la peau et facilement absorbé à travers elle et présente d’autres effets. Lorsque manipulation phénol, utilisez toujours le double gantage, portez des lunettes de protection et travailler sous une hotte chimique.
  13. Bien mélanger en renversant le tube pendant 5 min sur un rotateur de tube à 4 ° C.
  14. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  15. Éliminer la phase aqueuse (couche supérieure) dans un nouveau tube à l’aide d’une pipette sérologique de verre.
  16. Répéter l’extraction de phénol : chloroforme : isoamylique Alcool 1 à 3 fois jusqu'à ce que la phase aqueuse est claire et l’interface n’est plus trouble.
  17. Ajouter l’acétate de Sodium 3M volume 1/10 (200 – 400 µL), pH 5,2.
  18. Ajouter 2,5 volume (5 à 10 mL) 100 % d’éthanol (réfrigéré) et inverser le tube doucement à la main pendant 2 à 3 min.
  19. La bobine de l’ADN avec un crochet de verre et le transférer dans un nouveau tube contenant 1 – 5 mL 70 % éthanol et laver soigneusement. Alternativement, centrifuger le tube à haute vitesse (x 3 500 g) à 4 ° C à l’ADN de granule et laver soigneusement avec de 1 à 5 mL 70 % éthanol.
  20. Centrifuger le tube à haute vitesse (x 3 500 g) à ta, éliminer le surnageant et sécher l’ADN pendant 10-15 min.
  21. Dissoudre l’ADN de 10 à 100 µL de tampon de TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5) et stocker à 4 ° C (pour stockage courte d’environ un mois) ou à-20 ° C (pour une plus longue période de stockage). La concentration optimale pour l’ADN pour le dosage de Select cII λ est de 0,5 à 1,0 µg/µL (dans un tampon TE)56.

2. in Vitro emballage réaction

  1. Par une réaction d’emballage, addition de ~ 5 µg d’ADN génomique (volume final : 8 – 12 µL, ADN génomique a été isolé dans la Section 1 de souris fibroblastes embryonnaires traités in vitro avec une substance d’essai ou de contrôle) dans un tube de microtubes contenant le premier mélange réactionnel (~ 10 µL).
    NOTE : Interne établi ou λ commercialement disponible emballage extraits sont utilisés dans des laboratoires différents. Dans l’emballage commercial extrait kit utilisé ici56 (voir la Table des matières), tubes rouges figurant le premier mélange de réaction (~ 10 µL) et les tubes bleus contenaient le deuxième mélange de réaction (~ 70 µL pour au moins 5 réactions).
  2. Incuber le tube pendant 90 min à 30 ° C.
  3. Ajouter le volume requis (~ 12 µL) de la deuxième mélange de réaction dans le tube.
  4. Incuber le tube pour une supplémentaire de 90 min à 30 ° C.
  5. Ajouter 1,1 mL de tampon de SM dans le tube.
    NOTE : 1 mL de cette solution (c.-à-d., mélange réactionnel emballages) sera utilisé pour dépistage λ cII-mutants. Le reste servira pour le titrage.
    1. Préparer le tampon SM en mélangeant 5,8 g de NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5) et gélatine de 2 % (p/v) de 5 mL. Ajouter dH2O pour un volume final de 1 litre, autoclave pendant 30 min. magasin à température ambiante pendant 1 an.
  6. Vortex le tube contenant l’échantillon d’ADN emballée pour 10 s à ta (agitation vigoureuse).
  7. Impulsion tourner le tube dans un magasin sur la glace et de microcentrifuge jusqu'à utilisation. Si l’échantillon ne va pas être utilisé le jour même de l’emballage, ajouter 50 µL de chloroforme par mL d’ADN emballée échantillonner, vortex, doucement et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.

3. préparer la Culture bactérienne d’e. coli G1250

  1. Au moins deux jours avant l’ensemencement, faire quelques plaques de strie bactérienne d' Escherichia coli (e.coli) G1250 sur plaques de gélose TB1-kanamycine.
    1. Préparer des boîtes de gélose de TB1-kanamycine comme suit. Mix 5,0 g de NaCl peptone de caséine 10,0 g et 12,0 g de gélose. Ajouter 800 mL dH2O. Ajouter 1 mL 0,1 % Thiamine chlorhydrate. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl. Add dH2O pour un volume final de 1 litre.
    2. Bien mélanger et stériliser pendant 30 min. laisser refroidir jusqu'à 55 ° C. Ajouter 50,0 mg kanamycine et mélanger. Verser dans des plats de Pétri stériles 100 mm (20 à 25 mL par plat). Stocker les plaques à 4 ° C pendant deux semaines.
  2. Incuber les boîtes de strie bactérienne dans un incubateur fixe 30 ° C pendant au moins 24 h.
  3. Un jour avant l’ensemencement, mélanger 10 mL de milieu liquide TB1 avec 100 µL de solution de4 M MgSO maltose-1 20 % (p/v) dans un tube à fond conique stérile de 50 mL à bouchon vissé.
    1. Préparer un milieu liquide TB1 comme suit. Mix 5.0 g NaCl peptone de caséine 10,0 g, ajouter 800 mL dH2O, chlorhydrate de Thiamine de 0,1 % de 1 mL et ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl. Puis ajoutez dH2O pour un volume final de 1 litre, bien mélanger et stériliser pendant 30 min. stockent le milieu à RT jusqu'à trois mois.
    2. Préparer 20 % (p/v) Maltose-1 M MgSO4 comme suit. Mélanger 20,0 g Maltose et 24,6 g MgSO4. 7H2O, puis ajoutez dH2O pour un volume final de 100 mL. Filtre à stériliser et conserver à 4 ° C pendant 6 mois.
  4. Ensemencer le milieu liquide contenant plusieurs colonies de la plaque de strie bactérienne à l’aide d’un stérile de boucle inoculer56.
  5. Incuber le milieu liquide du jour au lendemain à 30 ° C secouant incubateur avec agitation vigoureuse (250 – 300 tr/min).
  6. Le jour de l’électrodéposition, centrifuger le tube conique contenant la culture liquide G1250 à 1 500 x g pendant 10 min à RT pour granuler les cellules bactériennes.
  7. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de 10 mM MgSO4.
  8. Mesurer l’absorbance d’un 01:10 par dilution de la suspension cellulaire à longueur d’onde 600 nm à l’aide d’un UV-Vis spectrophotomètre (p. ex., 100 µL de la suspension cellulaire + 900 µL 10 mM MgSO4)56.
  9. Diluer la suspension cellulaire à une finale de l’OD600 de 0,5 à 10 mM MgSO4. La suspension préparée de G1250 e. coli avec OD600 = 0,5 est dénommé « la culture d’électrodéposition G1250 ».
  10. Conserver la culture de placage de G1250 sur la glace et l’utilisation dans 1-2 h.

4. les échantillons d’ADN emballées de placage

  1. Par un échantillon d’ADN emballé, préparer les seize stérile 14 x 100 mm2 fond rond tubes et des plaques de gélose TB1 seize. Dix de chaque jeu sera utilisé pour le dépistage et six pour le titrage (trois pour le titre 20) et trois pour titre 100.
    1. Préparer des boîtes de gélose de TB1 comme suit. Mix 5.0 g NaCl peptone de caséine 10,0 g et 12,0 g Agar, puis ajoutent 800 mL dH2O et chlorhydrate de Thiamine 0,1 % 1 mL. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl et ajoutez dH2O pour un volume final de 1 L.
    2. Bien mélanger et stériliser pendant 30 min. laisser le mélange refroidir à 55 ° C, puis versez-la dans des plats de Pétri stérile 100 mm (20 à 25 mL par plat). Stocker les plaques à 4 ° C pendant deux semaines.
      Remarque : Les géloses TB1 doivent être préparés au moins 24 h avant son utilisation.
  2. Aliquote 200 µL de la culture de placage G1250 dans chaque tube à fond rond.
  3. Pour le titrage, faire une dilution au 1/100 de l’échantillon d’ADN emballée et mélanger bien au Vortex (c.-à-d., 10 µL emballés d’échantillon ADN + 990 µL de tampon de SM).
  4. Ajouter 20 µL de la dilution au 1/100 à chacun des trois tubes de 20 titres.
  5. Ajouter 100 µL de la dilution au 1/100 à chacun des trois titre 100 tubes.
  6. Pour le dépistage, ajouter 100 µL de la 'pur ' emballé échantillon d’ADN de chacun des tubes de dix projection.
  7. Traiter tous les tubes titrage et dépistage (tubes de 2 x 3 + 10 = 16), comme suit : mélangez bien au Vortex pendant environ 10 s et puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre à l’hôte de e. coli pour adsorber les phages.
  8. Ajouter 2,5 mL TB1 fondu au micro-ondes haut agar (refroidi à 55 ° C) pour chaque titre ou dépistage tube, mélanger immédiatement au Vortex (doucement), et verser dans le titre approprié ou plaques de gélose TB1 de dépistage.
    1. Préparer TB1 albums agar comme suit. Mix 5.0 g NaCl peptone de caséine 10,0 g et 7,0 g Agar, puis ajouter le chlorhydrate de Thiamine de 0,1 % mL 800 dH2O. Ajouter 1 mL, puis ajuster le pH à 7,0 avec NaOH ou HCl. Enfin, ajoutez dH2O pour un volume final de 1 litre.
    2. Bien mélanger et stériliser pendant 20 à 25 min. magasin à la température ambiante pendant trois mois.
    3. Avant utilisation, faire fondre l’agar d’Albums de TB1 préparé dans un four à micro-ondes, bien mélanger et laisser refroidir à 55 ° C dans un bain d’eau.
      Remarque : Le haut de TB1 fondu et refroidi est ajouté au contenu de chaque titre ou tube de dépistage et après avoir mélangé, est versé dans le titre approprié ou les boîtes de gélose de dépistage TB1.
  9. Laisser les plaques pendant 15 à 30 min à température ambiante, avec le couvercle entrouvert pour éviter la condensation.
  10. Inverser les plaques et placer les plaques de dix projection dans un incubateur stationnaire 24 ° C et incuber pendant 46 à 48 h (p. ex., conditions sélectives) et les six plaques de titre dans un incubateur stationnaire 37 ° C et incuber pendant 24 h/nuit (c.-à-d., conditions non sélectifs).
    Remarque : Pour l’assurance de la qualité et la normalisation des résultats, contrôle disponible dans le commerce phage solutions contenant un mélange de type sauvage et mutantes cII et mutants connus sont plaquées avec les échantillons d’ADN emballées et incluses dans tous les test court56.

5. examen du titre et des planches de dépistage pour déterminer la cII Mutant fréquence

  1. Après les 24 h/nuit d’incubation à 37 ° C, compter le nombre de plaques formé dans chacune des trois titre 20 plaques et titre 100 plaques. Pour identifier plus facilement les plaques, tenir la plaque à côté d’une boîte à lumière blanche et sur un fond sombre avec couvercle enlevé (voir Figure 2).
  2. Faire une moyenne (moyenne) du nombre de plaques comptée dans chaque titre 20 plaques et titre 100 (triple, chacune).
  3. Choisissez le nombre moyen de l’ensemble des plaques de titre qui tombe le plus proche de la plage de 50 à 200 plaques par plaques ensemble.
  4. Calculer le nombre total de plaques projeté dans les plaques de dix projection comme suit :
    Total des plaques projetés = (nombre moyen de plaques dans le groupe choisi de titre plaques ÷ nombre de µL de la dilution utilisée par plaque de titre choisi) x facteur de Dilution x nombre de µL de l’échantillon d’ADN emballée par dépistage [100 µL/plaque] x nombre de dépistage des plaques [10].
    NOTE : par exemple, si le nombre moyen des plaques par plaques dans l’ensemble du titre 20 plaques est 128 et le nombre correspondant à l’ensemble du titre 100 plaques est 478, le nombre 128 serviront pour le calcul du nombre total de plaques projeté , comme suit :
    (128 ÷ 20) x 100 [facteur de dilution] x 100 [µL/plaque] x 10 [plaques] = 640 000
    Cela revient à multiplier le nombre moyen des plaques de 5 000 ou 1 000, si le nombre moyen est issu des comtes de titre 20 plaques ou titre 100 plaques, respectivement.
  5. Suite de 46 à 48 h d’incubation à 24 ° C, compter le nombre total de plaques formées dans les plaques de dix projection (suivez les instructions fournies dans la Section 5.1).
    Remarque : La fréquence des mutants cII est calculée en divisant le nombre total de plaques formées dans les plaques de dépistage par le nombre total de plaques projeté. À l’aide de l’exemple ci-dessus, si le nombre total de plaques comptées dans les plaques de dix projection est 112, la fréquence des mutants cII pour cet échantillon d’ADN serait 112 ÷ 640 000 = 17,5 x 10-5.

6. vérification de la Putative λ cII Mutants, Amplification par PCR et séquençage de l’ADN

  1. La plaque en question avec un embout de la pipette stérile, de large diamètre de noyau et expulser (par pipetage de haut en bas) dans un tube de microcentrifuge stérile contenant 500 µL de tampon stérile de SM.
  2. Incuber pendant au moins 2 h à température ambiante, ou à 4 ° C durant la nuit, pour permettre les particules phagiques éluer avec l’agar plug.
  3. Dans un tube à fond rond2 stérile 14 x 100 mm, 200 µL de la culture de placage G1250 se mêlent 1 µL de la solution de phage fourrés et incuber 30 min à température ambiante.
  4. Plaque à l’aide de 2,5 mL de 55 ° C fondu TB1 albums agar et incuber la plaque à 24 ° C pendant 46 – 48 h (conditions sélectives), tel que décrit dans les Sections 4.8 – 4.10.
  5. Une fois les plaques secondaires ont formé, utiliser un embout de la pipette pour prélever soigneusement un λ vérifié bien isolé seul cII-plaque mutant (évitez de toucher l’agar inférieur).
    NOTE : Peuvent les plaques mutant putatif cII sert à deux fins : (i) objets de placage peut parfois être confondu avec plaques de petite taille ; et (ii) une carotte d’agarose d’une plaque de dépistage peut-être contenir des phage(s) non-mutant avec un phage mutant. Plaques secondaires d’une faible densité peuvent fournira un modèle mutant non contaminé pour PCR et l’analyse subséquente de la séquence ADN.
  6. Transférer la plaque dans un tube de microcentrifuge contenant de l’eau bidistillée 25 µL par pipetage de haut en bas.
  7. Placer le tube dans l’eau bouillante pendant 5 min.
  8. Centrifuger à vitesse maximale (18 000 x g) pendant 3 minutes à température ambiante.
  9. Transférer 10 µL du liquide surnageant immédiatement dans un nouveau tube de microcentrifuge contenant 40 µL d’une PCR mastermix dans laquelle les concentrations finales des réactifs sont 1 x Taq PCR tampon, 10 pmol chaque des amorces et inverses, 12,5 nmol de chaque dNTP et 2.5 U du Taq ADN polymérase.
    Remarque : Les amorces et inverses sont comme suit : 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (postes -68 à -50 par rapport à la cII start codon) et 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (postes +345 à 365 par rapport à la cII codon de début), respectivement.
  10. Amplifier le modèle en utilisant les paramètres suivants : une dénaturation de 3 min à 95 ° C, suivi de 30 cycles de 30 s à 95 ° C, 1 min à 60 ° C et 1 min à 72 ° C, avec une extension finale de 10 min à 72 ° C.
  11. Purifier le produit PCR bp 432 contenant le gène de la cII et bordant les régions à l’aide de kits de purification PCR commercialement disponibles, selon les instructions du fabricant.
  12. Effectuer le séquençage de l’ADN à l’aide d’une plate-forme de séquençage approprié et d’analyser les séquences d’ADN qui en résultent afin de détecter des mutations dans le transgène cII (voir remarque ci-dessous).
    NOTE : Ceci est mieux assurée en alignement avec la séquence de cII de référence en utilisant le logiciel, comme le serveur d’alignement de séquence T-café basée sur le web. Pour obtenir des instructions sur la façon d’utiliser le programme, visitez : http://tcoffee.crg.cat/

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Representative Results

Fonction de distribution de données, tests paramétriques ou non paramétriques sont utilisés pour déterminer l’importance de la différence dans la fréquence des mutants cII entre les groupes de traitement et de contrôle (c'est-à-direinduite par rapport aux fréquences mutants spontanés) . Comparaison des fréquences mutant induit cII inter-groupe de différence de traitement faite par divers (par paire) les tests statistiques, selon le cas. Le hypergéométriques test d’Adams et Skopek est couramment utilisé pour comparer l’ensemble mutation induite - et spontanée spectres57, bien que les autres tests, comme le χ2 test ou l’analyse de la Variance (ANOVA), peuvent également être utilisés pour comparer la fréquence de chaque type spécifique de mutation (par exemple, transition, transversion, insertion ou suppression) entre les spectres de mutation induite - et le contrôle, ou entre les différents spectres de mutation induites par différents produits chimiques ou agents ou à des doses variables de la même / un agent chimique.

La figure 3 est une compilation de données de la fréquence des mutants d’études publiées dans laquelle nous avons démontré que la mesure d’augmentation relative cII mutants dans les fibroblastes embryonnaires de souris traitées avec divers produits chimiques et/ou physicalagents peut varier de quelques uns-a plusieurs centuple, selon le mutagène «puissance» de la substance d’essai. Pli-une augmentation statistiquement significative de la fréquence de mutant cII est indiquée pour les fibroblastes embryonnaires de souris traitées avec l’acrylamide12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifène18, L’acide δ-aminolévulinique (δ-ALA) et ultraviolet de faible dose de lumière A (UVA : λ > 320−400 nm)15, benzo (a) pyrène diol epoxide(B(a)PDE)19et equilethal doses d’UVA, UVB (λ = 2 80−320 nm) et a simulé des rayons du soleil UV (SSL) 21 (voir Figure 3).

La figure 4 est une démonstration de la « séquence-spécificité » des mutations dans lequel nous avons montré l’induction de certains types de mutation dans le transgène cII dans mouseembryonicfibroblasts irradié avec UVBrelativetocontrol23. Le spectre de mutation induite par UVB est caractérisé par une augmentation significative dans la fréquence relative des transitions de C→T simple ou en tandem à dinucléotides pyrimidine.

Figure 1
Figure 1 : Présentation schématique de l’essai Select cII λ. L’analyse est basée sur l’extraction des vecteurs navettes λLIZ, qui contiennent le transgène cII comme un gène mutationnel journaliste, de l’ADN génomique des cellules cultivées provenant de rongeurs transgéniques traités in vitro avec un composé ou tissus/organes des animaux correspondants traités in vivo avec le produit chimique testé ou l’agent (A et B). Les vecteurs secourues sont empaquetées dans des têtes de phage λ qui peuvent infecter un hôte approprié e. coli (C et D). Les bactéries infectées sont ensuite cultivées dans des conditions sélectives permettant de marquer et de l’analyse des mutations dans le cII transgène1,2,3,25, 52 (E). Détermination de la fréquence des mutants induits cII et la mise en place du spectre mutation par séquençage de l’ADN sont énoncées dans F et G. Les spectres de mutation induite - et spontanés sont visualisées sous différents formats. À des fins d’illustration, nous avons mis en évidence un format dans lequel les mutations induites cII sont de type au-dessus de la séquence de référence, tandis que les mutations spontanées (contrôle) sont de type au-dessous de la séquence de référence (H). La hauteur d’une base de muté représente la fréquence de mutations (c.-à-d., plus la base, le plus fréquemment mutées). Les nombres ci-dessus une base mutante indiquent la fréquence en pourcentage des mutations dans cette base. Les bases supprimées sont soulignés. Les bases insérées sont affichés avec une flèche. Numéros ci-dessous sont les bases de référence des positions nucléotidiques. Les données proviennent d’une étude publiée23. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : comptage de plaques en plaques titre. Pour identifier plus facilement les plaques, plaques sont tiennent à côté d’une boîte à lumière blanche et sur un fond sombre avec couvercle enlevé. Titre 20 tôles (A) et 100 titre (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Fréquences Mutant du transgène cII dans les fibroblastes embryonnaires de souris traitement avec différents produits chimiques et/ou agents physiques par rapport aux contrôles. Les données proviennent d’études publiées sur l’acrylamide12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifène18, acide δ-aminolévulinique (δ-ALA) plus faible dose de rayons ultraviolets A léger (UVA : λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrènediols époxyde (B(a)PDE)19et equilethal doses d’UVA, UVB (λ = 280−320 nm) et a simulé des rayons du soleil UV (SSL)21. Pour métaboliser efficacement le tamoxifène dans les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris, nous avons utilisé le système d’activation-S9 (S9 mix) consistant en des préparations de foie de rat induite par l’Aroclor 1 254 et cofacteur réactifs22. Toutes les différences entre les deux traitement- et des échantillons de contrôle sont statistiquement significatifs à p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les spectres de Mutation du transgène dans les fibroblastes embryonnaires de souris irradiées par UVB par rapport au témoin cII . Les données proviennent d’une étude publiée23. Les homologues de miroir de brin de toutes les transitions (p. ex., G→A et C→T) et transversions (p. ex., G→T, C→A ou G→C et C→G) sont combinées. Ins : insertion ; Del : suppression. Le spectre de mutation induite par UVB est caractérisé par une augmentation significative dans la fréquence relative des transitions de C→T simple ou en tandem à dinucléotides pyrimidine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le test de sélection cII λ est utilisé pour la détection des mutations dans le transgène cII récupéré de l’ADN génomique de cellules provenant d’organes/tissus de BB rongeurs3. Le génome de ces animaux transgéniques contient plusieurs copies en tandem du vecteur navette λLIZ chromosomiquement intégrées, qui transporte la cII (294 bp) et lacI (1 080 bp) transgènes, comme le Rapporteur mutationnel gènes1, 2 , 25. le λ Select cII est basé sur la récupération des vecteurs navettes λLIZ de l’ADN génomique de cellules/tissus des animaux transgéniques, suivies d’emballage des vecteurs sauvés en têtes de phage λ qui peuvent infecter un hôte approprié E. coli. Par la suite, les bactéries infectées sont cultivées dans des conditions permettant à la notation et l’analyse des mutations dans le transgène cII sélectives (voir Figure 1)1,3. Le test de sélection cII λ a été largement utilisé pour les tests de mutagénicité d’un large éventail de produits chimiques et aux agents physiques (révisés dans les références2,49). Le test a été appliqué avec succès à souris/rat transgénique cell cultures traitées in vitro avec divers produits chimiques et/ou agents physiques et les tissus/organes des animaux correspondants traitées en vivo avec différent test produits chimiques/agents4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Le test de sélection cII λ en cellules de rongeurs transgéniques traités avec un test composé représente, à bien des égards, une alternative viable à l’expérimentation mutagénicité in vivo chez les animaux correspondants traités avec le produit chimique testé/agent 3. en règle générale, les modèles in vitro offrent des avantages importants par leur homologue in vivo des modèles animaux, car ils sont beaucoup moins de main-d'oeuvre intensive et coûteuse, nécessitent beaucoup moins de temps à remplir et surtout, ne sont pas impliquent l’utilisation directe des animaux2,50,52. Dans le même temps, les modèles in vitro peuvent récapituler pas pleinement tous les aspects de la mutagénèse en raison de différences dans les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de produits chimiques entre les cellules cultivées in vitro et les animaux de laboratoire en vivo 2 , 3. par exemple, produits chimiques, dont le parcours de l’exposition est l’inhalation (p. ex., vapor cigarette électronique ou fumée de cigarette) ne peuvent être faites à in vitro tests dans des cultures cellulaires, après ils sont convertis de gaz ou de vapeur formes de liquide ou de la condensation, ce qui complique leur pharmacocinétique. En outre, une incomplète ou absente capacité métabolique des cellules cultivées in vitro pour convertir certains produits chimiques génotoxiques espèces ne représentent pas conduit de mutagénicité in animaux exposés in vivo à des produits chimiques génotoxiques2-lésions de l’ADN ,3. Bien que, cet inconvénient peut être compensé, à des degrés divers, par l’addition d’une activation métabolique externe système (c.-à-d., S9 mix) au in vitro cell culture modèles22.

En outre, la réplication de l’exposition humaine aux produits chimiques/agents génotoxiques vraie vie est plus limitée avec in vitro culture modèles cellulaires qu’avec les animaux de laboratoire en vivo3. Généralement, les humains sont exposés à des doses d’agents génotoxiques chroniques sur une période de plusieurs années pour quelques décennies76,77,78. La durée de vie limitée des cellules en culture, par rapport à la durée de vie relativement plus longue des rongeurs (c'est-à-dire, jours/semaines par rapport à quelques années) fait de modélisation d’exposition humaine aux génotoxines plus difficile dans les anciens modèles2, 3. Néanmoins, analyse de mutagénicité avec modèles de culture in vitro cellules peut fournir une première indication du potentiel génotoxique d’une substance chimique donné / agents et les résultats peuvent être utilisé comme un guide pour concevoir des expériences de « raffinée » en vivo qui disposent d’un nombre « réduit » des animaux2,3.

En conclusion, le dosage de Select cII λ en cellules de rongeurs transgéniques traités avec une substance d’essai, ou correspondants animaux traités avec le produit chimique testé/agent, est une approche utile pour le dépistage de la mutagénicité. Nous avons utilisé avec succès de l’approche, comme ont d’autres groupes de recherche partout dans le monde4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,,du7374,75. Plus récemment, nous avons élargi les applications de cette approche en mettant au point une nouvelle technique dans laquelle une modification du test Select cII λ avec le séquençage de nouvelle génération permet d’analyse à haut débit des mutations dans un temps, coût-, et de manière efficace travail23.

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Disclosures

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous tenons à souligner la contribution de tous les collègues et collaborateurs à nos études originales, dont les résultats ont été relatés dans ce manuscrit (à titre illustratif). Les auteurs est pris en charge par des subventions du National Institute of Dental et Craniofacial Research de la National Institutes of Health (1R01DE026043) à AB et de l’Université de California Tobacco-Related programme de recherche de la maladie à (AB TRDRP-26IR-0015) et ST (TRDRP-25IP-0001). Les auteurs de l’étude n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse de données, interprétation des données, rédaction du rapport ou dans la décision de soumettre pour publication.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

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