Een Model van de ligaturen intestinale lus in narcose van specifieke pathogenen vrije kippen te bestuderen van Clostridium Perfringens virulentie

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een protocol om te 'intestinale ligaturen loops' in kip dunne darmen operatief te maken. Deze procedure kan voor het vergelijken van meerdere Clostridium perfringens stammen virulentie in situ in één host. Deze methode vermindert aanzienlijk het aantal kippen meestal nodig voor soortgelijke in vivo experimenten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Necrotische enteritis werd bestudeerd bij kippen met behulp van verschillende in vivo infectie modellen. Een combinatie van predisponerende factoren zoals coccidiosis en voeding, de meeste van deze gebruiken met maagsonde of administratie via de feed met behulp van Clostridium perfringens. In deze modellen vereist de vergelijking van meerdere C. perfringens stammen voor virulentie studies een groot aantal hosts om significante resultaten te verkrijgen. Sterfte in de loop van de studie kunnen hoge afhankelijk van het experimentele model, vandaar de ethische bezorgdheid met betrekking tot het welzijn van dieren in het onderzoek. De ontwikkeling van nieuwe modellen van de infectie waarbij minder dieren te bestuderen pathogenese, nog het verkrijgen van statistisch significante en geldige resultaten, is belangrijk bij het terugdringen van dierlijke gebruik in onderzoek. Intestinale ligaturen lus modellen zijn gebruikt om de studie van clostridial infecties in verschillende soorten zoals muizen, konijnen en kalveren. Na chirurgische ingrepen om ligaturen lus segmenten te maken, C. perfringens stammen worden geïnjecteerd rechtstreeks in de lussen om een nauw contact tussen de bacteriën en de intestinale mucosa. Monsters van de dunne darm en luminal inhoud worden genomen bij de beëindiging van de procedures na een paar uur. Meerdere bacteriestammen kunnen worden geënt in elk dier, dus vermindering van het aantal vereiste onderwerpen in de experimenten. Ook de procedures worden uitgevoerd onder algehele narcose om dieren pijn te verminderen. Bij kippen zou dit model meer aangewezen dan orale toediening te vergelijken C. perfringens stam pathogeniteit omdat minder dieren nodig zijn, geen predisponerende factoren nodig zijn voor het opwekken van de ziekte en pijn wordt gecontroleerd door pijnstillers . Het model van de intestinale ligaturen lus is slecht beschreven is bij kippen en standaardisatie is essentieel voor het optimale gebruik ervan. Dit manuscript biedt alle nodige stappen om de talrijke intestinale ligaturen loops maken in kippen en brengt informatie van de kritieke punten om geldige resultaten te verkrijgen.

Introduction

Het gebruik van dierlijke modellen om te studeren van besmettelijke ziekten bij mens en dier is een centraal instrument bij de beoordeling van virulentiefactoren regulering van de pathogenese van een bepaalde voorwaarde evenals aan het uitwerken van strategieën om te voorkomen of genezen van ziekten1. Ondanks de talrijke voordelen van het gebruik van dierlijke modellen om te studeren van diverse ziekten, ontstaan ethische bezwaren met betrekking tot deze praktijk. Onderzoekers moeten tot een minimum beperken dierlijke terwijl het verkrijgen van aanzienlijke en geldig resultaten. Het concept van de 3 Rs-beginselen (vervangen, verminderen en verfijnen) werd uitgewerkt om ervoor te zorgen dat sociale kwesties werden behandeld in dergelijke proeven. Kip necrotische enteritis studies, worden in vivo kip modellen gebruikt om te onderzoeken de etiologie, preventie en behandelingen van deze voorwaarde2,3,4,5. Pathogene stammen van C. perfringens uitvoering van specifieke virulentiefactoren, zoals de NetB toxine6, worden beheerd om het necrotische enteritis veroorzaken in kippen7. Het beginsel van vervanging is daarom moeilijk te bereiken in een dergelijk geval ook deze virulentiefactoren niet als kritiek op andere diersoorten mogen. De meeste modellen voor necrotische enteritis in kippen gebruik een combinatie van risicofactoren, zoals coccidiosis en veranderd dieet om te induceren necrotische enteritis gevolgd door middel van een maagsonde voor bouillon cultuur met grote aantallen C. perfringens2. Deze modellen zullen het opwekken van de ziekte in een groot aantal kippen kan, en sterfte belangrijk zijn in dergelijke proeven8, dus bezorgdheid over de vermindering en verfijning principes in het dierlijke onderzoek.

Intestinale ligaturen lussen modellen zijn een wenselijk alternatief voor de studie van ziekten veroorzaakt door intestinale ziekteverwekkers met betrekking tot het beginsel vermindering en verfijning. In deze modellen, worden intestinale segmenten genaamd 'lussen' gemaakt door het plaatsen van ligaturen langs het darmkanaal vormen van onafhankelijke en hermetische compartimenten waar ziekteverwekkers kunnen worden geïnjecteerd alleen9 of met andere moleculen, zoals vaccin kandidaten 10 , 11. de ziekteverwekkers van belang staan in nauw contact met de intestinale cellen en na een paar uur tijd van infectie, intestinale monsters kunnen worden teruggekregen voor verdere analyse. Hierdoor kan het gebruik van meerdere behandeling en controlegroepen in hetzelfde dier. Statistische analyse kan met herhaalde maatregelen modellen, die verhoogt de macht van de discriminatie tussen groepen en vermindert het aantal nodige kippen in vergelijking met mondelinge maagsonde proeven worden uitgevoerd. Ook worden chirurgische ingrepen en latere infectie tijden uitgevoerd onder continue narcose en Analgesie, dus het minimaliseren van de dierlijke pijn. Kringloop ligations zijn een ideale sjabloon voor vermindering van de nummers van de host en het creëren van een meer humane systeem in dierlijke onderzoek.

Intestinale ligaturen lussen modellen zijn ook beschreven in verschillende soorten, zoals kalveren, konijnen en muizen2,9, maar slecht in kippen7beschreven. Voor een optimaal gebruik van deze chirurgische model, zijn de juiste techniek en uitvoering zijn essentieel voor het creëren van ligaturen intestinale lussen om te voorkomen dat schade aan de intestinale integriteit. Het doel van dit manuscript is voor het beschrijven van een stap voor stap methode bij het creëren van meerdere intestinale lussen in een kip-model. Deze techniek wordt beperkt door de surgeon's vaardigheid en ervaring, zoals nauwkeurige procedures essentieel voor het succes van het project zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures met levende dieren gebruik werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Faculteit Diergeneeskunde, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' éthique de l'utilisation des Animaux').

1. overwegingen voor de operatie

  1. Selecteer 10 weken oude specifieke pathogene vrije (SPF) Livorno kippen voor de operatie.
    Opmerking: Hun gewicht moet tussen 1,0 en 1,2 kg.
  2. Trekken de feed 12u voorafgaand aan de procedures voor het leegmaken van het darmkanaal.
  3. Voorafgaand aan de operatie, plaatst u de kuikens onder narcose, volgens een protocol dat is geverifieerd door een anesthesist. Elke kip 15 minuten voorafgaand aan de operatie met een intramusculaire injectie (IM) van midazolam premedicate 1 mg/kg en Butorfanol 4 mg/kg. Herhaal, elke 4 h, de injectie van Butorfanol 4 mg/kg IM of wanneer de ademhaling patroon veranderingen en de frequentie toeneemt tijdens de anesthesie. Voor de narcose, tijdens alle procedures, beheren Isofluraan bij een concentratie tussen 1,5 en 2,5% met een intratracheale buis.
    Opmerking: Het gebruik van premedication voor sedatie en analgesie wordt aanbevolen als ze zal aanzienlijk verbeteren van de diepte van de verdoving, verminderen de hoeveelheid verdoving nodig tijdens alle procedures, evenals inschakelen van onderzoekers om controle van pijn niveaus.
  4. Het controleren van de narcose door het opnemen van de lichaamstemperatuur, hartslag en elektrocardiogram (ECG), respiratoire tempo en ritme, zuurstof saturatie, verlopen kooldioxide (CO2) en neurologische reflexen.
    Opmerking: Een persoon moet worden toegewezen aan deze parameters in alle procedures volgen.
  5. Volg steriliteit beginselen in de chirurgische procedures. Ervoor zorgen dat de chirurg en de assistent-chirurg jurk met steriele jassen, handschoenen, een masker en beschermende bril volgens institutionele preoperatieve protocollen. Ervoor zorgen dat de chirurg scrubs de handen met een chloorhexidine gluconaat geïmpregneerd steriele borstel tot de elleboog met de nadruk op nagels en elk oppervlak van de vinger.
  6. Het steriliseren van de chirurgische instrumenten met een sterilisator.

2. de chirurgische Site-voorbereiding

  1. Ten eerste, handmatig verwijderen van de veren uit de buik met een zachte tractie.
  2. De chirurgische site met een chloorhexidine gluconaat wasmiddel geïmpregneerd steriele borstel schrobben. Scrub zachtjes de huid vanuit het midden naar buiten voor een totale contacttijd van 5 min zonder terugkomen naar het midden.
  3. 3 alternatieve passages op de chirurgische site met een chloorhexidine gluconaat oplossing en isopropyl alcohol met behulp van steriele gauzes uitvoeren.
    Opmerking: De passage moet opstarten vanaf het midden van de chirurgische site aan de grenzen om te voorkomen dat besmetting van de niet-ontsmet gebieden van de chirurgische site.
  4. Plaats de steriele chirurgische draperen over de kip.

3. extractie van de dunne darmen van de buikholte

  1. Incise de chirurgische draperen met een schaar om alleen de huid van de chirurgische site bloot te stellen.
  2. Incise van de huid door het uitvoeren van een '' L'' vorm laag-middellijn sneetje met een scalpel mes #3.
    1. Begint de eerste snede 1 cm caudal aan het borstbeen en eindigt het op 1 cm cranial aan de cloaca.
    2. Voer de tweede snede loodrecht op de eerste snede. Start vanaf het caudal einde van de eerste snede en blijven van 5 cm aan de linkerkant van de buik door het volgen van de bekken-lijn.
      Opmerking: Deze opening ontstaat een klep waarmee een gemakkelijker extractie van de darmen.
  3. Met chirurgie snij schaar, het buikvlies en de buikspieren aan te spannen met de zelfde '' L'' vorm patroon te openen van de buikholte.
    Opmerking: Dit zal blootstellen de lucht zakjes. Darmen bevinden zich onder deze structuren. Air zakjes moeten worden bevochtigde met gauzes verzadigd met steriele zoutoplossing van 0,85% om uitdroging en mogelijke breuk gedurende de hele procedure te voorkomen.
  4. Invoegen een Snook spay haak in de buikholte door het volgen van de links van de buikwand en werk de weg rond de buik air zakjes.
  5. Zacht exteriorize van de darmen en dit verspreid over het chirurgische gebied.
    Opmerking: Houd darmen bevochtigde door sproeien vaak steriele zoutoplossing 0,9% gedurende de gehele procedure. Ook kunnen gauzes bevochtigde met steriele zoutoplossing worden geplaatst op de darmen te voorkomen van uitdroging.
  6. Pak de darmen met behulp van een droog steriel gaas en trek voorzichtig uit de dunne darmen door manuele tractie bloot het jejunum.
    Opmerking: De mesenterische vaartuigen zijn kwetsbaar en overmatige spanning kan scheuren ze die kunnen leiden tot intestinale ischemische laesies en sterk compromis de uitkomst van de procedure.

4. fabricage van intestinale Loops

  1. Oprichting van lus no. 1.
    1. Plaats een eenvoudige ligatuur met een polyglactin multifilamenten absorbeerbare kunststof in de proximale jejunum door het vermijden van de ligatuur van grote mesenterische vaartuigen.
    2. Plaats een distale ligatuur 2 cm afstand van de proximale ligatuur.
      Opmerking: Eenvoudige ligaturen gemaakt met multifilamenten hechtdraad materiaal worden geplaatst langs het darmkanaal om hermetische segmenten te maken. De locatie van alle ligaturen wordt beschreven met een schema (Figuur 1). De lussen bestaan uit een proximale en distale ligatuur gescheiden door 2 cm.
  2. Oprichting van interloop no. 1.
    1. Plaats een eenvoudige ligatuur 0.5 cm aborally tot de distale ligatuur van lus no.1.
      Opmerking: Tussen opeenvolgende lussen, er zijn interloops van 1 cm, d.w.z. segmenten een fysieke scheiding tussen de lussen maken. Als u wilt waarschijnlijk verlagen het risico van kruisbesmetting uit een lus naar de andere, wordt een eenvoudige ligatuur geplaatst in het midden van de interloop (0.5 cm vanaf de distale en proximale ligatuur van 2 aangrenzende loops). Dit vermindert het risico van een mogelijke gelekte verontreinigingen van een lus te bereiken de ligatuur van een aangrenzende lus. Deze segmenten zijn niet verplicht, maar zal verminderen het risico van kruisbesmetting.
  3. Creatie van latere lussen en interloops.
    1. Herhaal stap 4.1 en 4.2 om het aantal gewenste lussen te verkrijgen.
      Opmerking: In dit experiment, 9 loops en 8 interloops werden gemaakt. Totale lengte bedraagt 26 cm. Het aantal lussen kan worden aangepast afhankelijk van de studie.

5. injectie van Clostridium perfringens stammen in de lussen

  1. Injecteren met een steriele spuit en naald 26 G het pathogene agens in lus no.1. Zachtjes invoegen de naald aan de antimesenteric kant van de darm in een hoek van 45°.
    Opmerking: In dit experiment, 0.2 mL hersenen hart infusie (BHI) 1 x 106 kve (kolonie vormende eenheden) van C. perfringens met in het midden log groeifase werd geïnjecteerd in elke lus. 5 verschillende variëteiten waren geïnjecteerd in 5 verschillende loops en de 4 overgebleven lussen werden ingespoten met een negatieve controle met geen bacteriën (steriele BHI), afwisselend van ziekteverwekkers en steriele BHI loops.
  2. Herhaal stap 5.1 te injecteren van alle lussen.
  3. Zachtjes vervangen het darmkanaal in het ruggedeelte van de buikholte, onder de lucht zakjes.

6. afsluiting van de buikholte

  1. De hechtdraad van het buikvlies en de buikspieren aan te spannen.
    1. Het buikvlies en de buikspieren aan te spannen langs het bekken (gemaakt in stap 3.3) met een eenvoudige continu hechtdraad-patroon met behulp van een polyglactin multifilamenten absorbeerbare kunststof Suture.
    2. Suture van het buikvlies en de buikspieren van het borstbeen nog aan de cloaca (gemaakt in stap 3.3. met een eenvoudige continu hechtdraad-patroon met behulp van een polyglactin multifilamenten absorbeerbare kunststof.
  2. De Sutuur (geologie) van de huid.
    1. Met behulp van een polyglactin multifilamenten synthetisch materiaal en het patroon van een eenvoudige continu hechtdraad, sluit de insnijding van de huid langs het bekken gemaakt in stap 3.2.
    2. Met behulp van hetzelfde multifilamenten ligatuur materiaal en het patroon van een eenvoudige continu hechtdraad, sluit de insnijding van de huid van het borstbeen nog aan de cloaca in stap 3.2 gemaakt.

7. conclusie

  1. Na de chirurgische procedures, houden de kip onder narcose met juist gebruik van pijnstillers om te minimaliseren van dierlijke pijn gedurende de tijd van de infectie. Blijven verdoving volgen teneinde een voldoende verdoving niveau te garanderen.
  2. Na de tijd van de gewenste infectie, humaan euthanaseren de kip door cervicale dislocatie onder algemene verdoving.
    Opmerking: Voor deze procedures, de vereiste tijd voor het opwekken van microscopische laesies met C. perfringens pathogene stammen was 7 h.
  3. Met een scalpel blad #3, snijd een 0.5 cm tot 1 cm lange lus gedeelte en plaats deze in 10% formaline voor fixatie overnachting en verdere histopathologische analyse.
  4. Met het dezelfde scalpel blad, het resterende gedeelte van de lus knippen en deze plaatsen in een steriele microcentrifuge buis voor de isolatie van de C. perfringens stammen in elke lus verder bacteriologische analyse voor hun genetische karakterisering.
  5. Herhaal stap 7.2 en 7.3 voor alle lussen door het veranderen van het scalpel blad tussen iedere lus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een schematische voorstelling van de 9 intestinale loops en 8 interloops is afgebeeld in Figuur 1. In dit model, een totaal van 9 loops en 8 interloops worden gemaakt met eenvoudige ligaturen. Een lus bestaat uit proximale en distale ligaturen verdeeld door 2 cm, gemeten vanaf de ligatuur proximale. Twee aangrenzende lussen worden gescheiden door een interloop van 1 cm. Om te verminderen het risico van kruisbesmetting tussen lussen door lekkage van een ligatuur, ligt een interloop ligatuur halverwege weg van de distale ligatuur en de proximale ligatuur van 2 aangrenzende lussen. Het aantal lussen kan worden aangepast afhankelijk van de eisen van de studie.

Figure 1
Figuur 1: schematische weergave van ligaturen intestinale lussen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2A (HPS vlek) toont de microscopische weergave van een intestinale lus geïnjecteerd met een steriele controle-medium. De grens van de mucosal borstel is intact en er is geen necrose aanwezig in de sectie. Milde congestie kan aanwezig zijn in de intestinale lagen (mucosa, submucosa muscularis en sereus vlies) van de segmenten. Figuur 2B (HPS vlek) toont mucosal necrose 7 uur na de injectie van een pathogene stam van Clostridium perfringens hersteld van een klinisch geval van necrotisch enteritis op een kippenboerderij. Villi tips zijn uitgehold met necrotisch enterocyten rondom de villi tips. In het necrotisch materiaal rond de villi, worden clusters van grote staafvormige bacteriën waargenomen (pijlen). Deze bacteriën werden verder geïdentificeerd als gram-positieve bacteriën met een Twort van vlek (niet afgebeeld). Deze bevinding, gecombineerd met het isolement door bacteriologie van grote aantallen Clostridium perfringens, geeft aan dat de letsels werden veroorzaakt door deze bacterie. Figuur 2C (HPS vlek) toont histologische laesies van een ischemische lus, waar necrose is niet gerelateerd aan de injectie van pathogene C. perfringens stammen maar het resultaat van slecht uitgevoerd procedures. Deze vergroting toont ernstige coagulatie necrose die letsels veroorzaakt door Clostridium perfringenskon worden geïnterpreteerd. Echter zijn geen bacteriën in deze sectie waargenomen. Ook zijn de bloedvaten in de spier laag ernstig uitgezet door de opeenhoping van grote aantallen degenererende erytrocyten (pijlen). Dit is een indicatie van de vasculaire congestie en in dit geval de congestie werd veroorzaakt door ligaturen mesenterische bloedvaten. Ischemische lussen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd macroscopisch tijdens de chirurgische procedures; na ernstige vasculaire congestie zullen het sereus vlies donker blauw in plaats van haar normale roze-rood kleuring.

Figure 2
Figuur 2: histopathologische bevindingen 7 h na infectie. (A) er zijn geen necrotische laesies in de mucosa op histopathologisch onderzoek na de injectie van hersenen hart infusie (BHI), een steriele kweekmedium. (B) In lussen geïnjecteerd met een pathogene stam van Clostridium perfringens, er wordt gemarkeerd necrose van de mucosa met talrijke grote gram-positieve staafvormige bacteriën die betrekking hebben op de mucosa. (C) ischemische laesies kunnen necrotische laesies veroorzaakt door C. perfringenslijken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In deze studie, werden lussen ingespoten met een steriele controle kweekmedium (BHI) of één van de vijf verschillende stammen van Clostridium perfringens teruggekregen van verschillende antibiotica vrije kip koppels beïnvloed of niet met necrotisch enteritis12 . In deze studie werden tien kippen gebruikt. Stammen pathogeniteit kon worden vastgesteld op basis van de mogelijkheid om herhaaldelijk compatibel met necrotisch enteritis aan de mucosa/of oogontstekingen veroorzaken. Terwijl stammen verhaald van klinische gevallen van necrotisch enteritis toonde de mogelijkheid tot mucosal necrose 7 h na infectie, stammen verhaald klinisch gezonde kip boerderijen deed niet mucosal necrose veroorzaken en de mucosa was vergelijkbaar met de normale bevindingen van de controlelussen ingespoten met BHI12. Met behulp van talrijke lussen in hetzelfde dier, kunnen vijf C. perfringens spanningen en vier controlelussen worden gebruikt in dezelfde vogel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intestinale lussen modellen zijn beschreven in vele soorten te bestuderen van host-pathogen interactions en pathogenese van ziekten veroorzaakt door verschillende intestinale ziekteverwekkers, zoals Clostridium perfringens, Clostridium difficile en Salmonella enterica7,9,13,14,15. Het is ook gebruikt voor het analyseren van de mucosal immune reactie16, de werkzaamheid van antilichamen aan bacteriële toxines uitgescheiden door intestinale ziekteverwekkers11 te neutraliseren en te evalueren vaccin kandidaten om te voorkomen dat de intestinale ziekten10 . Echter dit model met behulp van talrijke ligaturen lussen in een enkele individuele dier is slecht beschreven is bij kippen en standaardisatie van deze techniek is verplicht om het verkrijgen van geldige resultaten omdat onvoldoende manipulaties tot onjuiste resultaten en verkeerde interpretaties leiden kunnen . Dit manuscript lijst toont het ontwerp van 9 opeenvolgende ligaturen loops, gelegen in het jejunum en het ileum van de kip gastro-intestinale tractus. Deze studie gebruikt specifieke pathogene vrije (SPF) Livorno mannelijke kippen met een gewicht tussen de 1,0 en 1,2 kg. Het maximum aantal lussen toegestaan door dit RAS op dit gewicht was 9, aangezien 26 cm van de dunne darmen kunnen gemakkelijk worden die uit de coelomic holte. Het is niet uitgesloten dat met behulp van een ander ras en/of een zwaardere Livorno mannelijke kip, het totale aantal lussen gemaakt verschillende, zelfs hoger dan 9 worden kan. Intestinale lussen lengte kan ook worden gewijzigd, maar de 2 cm lengte optimale toe sample collectie voor histopathologie en bacteriologie tijdens het gebruik van de maximumcapaciteit van de beschikbare intestinale lengte werd beschouwd.

De techniek van de intestinale ligaturen lus beschreven in dit artikel kan een waardevol alternatief voor de huidige modellen beschikbaar om te studeren necrotische enteritis in kippen veroorzaakt door Clostridium perfringens. Volgens de resultaten die in een vorige artikel12beschreven, was de evaluatie van 5 C. perfringens variëteiten met 10 kippen voldoende om zeer virulente en commensale stammen van C. perfringensonderscheiden. In vergelijking vergt andere modellen van de infectie per os inoculatie te reproduceren necrotische enteritis met C. perfringens met een groot aantal personen om de dezelfde resultaten te verkrijgen. In de literatuur, het aantal vogels nodig om te evalueren van de virulentie van C. perfringens stammen varieert van 10 tot 30 kippen per groep17,18,19 naar honderd hosts per groep20. Met betrekking tot het beginsel van de verfijning voor dierlijk gebruik in onderzoek, zou het worden geadviseerd om de techniek waarbij het laagste aantal hosts gebruiken om significante resultaten te verkrijgen. Het model van de intestinale ligaturen lus beschreven in dit artikel is waarschijnlijk het model waarvoor het laagste aantal kippen te vergelijken van de virulentie van C. perfringens stammen.

Aangezien kruisbesmetting door lekkage van een ligatuur kan alleen na C. perfringens cultuur en karakterisering door veld gelelektroforese (PFGE) vele dagen na de procedures gepulseerde worden geëvalueerd, was het van het grootste belang om te minimaliseren dit risico met inbegrip van 1 cm interloops waarin een manier interloop ligatuur halverwege tussen 2 aangrenzende lussen. Door deze voorzorgsmaatregelen te nemen, was het mogelijk om te voorkomen dat een mogelijke kruisbesmetting. Inderdaad, terwijl pathogene stammen veroorzaakt microscopische necrotische laesies concordant met necrotisch enteritis, er waren geen significante microscopische laesies in de aangrenzende lusjes ingespoten met niet-pathogene stammen van C. perfringens of de BHI cultuur medium negatieve controle. Dit was indicatieve dat verschillende stammen veilig konden worden geïnjecteerd in de aangrenzende intestinale lusjes van de dezelfde kip.

Een van de meest uitdagende problemen met dit model was de exteriorization van de dunne darmen zonder afbreuk te doen aan ventilatie en intestinale vascularisatie. Vogels hebben een verschillende ademhalingswegen dan zoogdieren. Het middenrif is afwezig, en ventilatie wordt beheerd door airsacs, dunwandige structuren in de buikholte. Er zijn 7 van deze kippen en zij zijn verdeeld in de cervicale (1), anterior thoracale (2), posterior thoracale (2) en buik (2) lucht zakjes. Deze ballon-achtige structuren rechtstreeks zijn verbonden met de longen en zorgen voor de beweging van lucht in de luchtwegen. Bij het openen van de buikholte tussen het borstbeen en de cloaca, abdominale airsacs zijn prominente en neiging om gemakkelijk worden gescheurd, vooral als het droog. Om deze reden is constante bevochtiging met gauzes gedempt met steriele zoutoplossing belangrijk om goede ventilatie en anesthesie tijdens procedures verlichten. Ook, kan het moeilijk zijn om te voorkomen dat kleine perforaties in de abdominale airsacs tijdens het exteriorizing van de ingewanden uit de buikholte. Het is belangrijk om te controleren van de verdoving parameters, zoals de ademhaling en patroon, ooglidreflex reflexen, hartslag en kip van bewegingen, om ervoor te zorgen dat de kip blijft onder een voldoende vlak van anesthesie. Kleine lucht lekkage is minder waarschijnlijk invloed op de kwaliteit van de verdoving, maar deze lekkage tot een minimum moet worden beperkt. Het is belangrijk om het hermetisch sluiten het buikvlies na de procedures. Dit zal het herstellen van de interne luchtdruk en ventilatie zal terugkeren naar normale na deze stap. Na de sluiting van deze structuur, moet er geen lucht lekkage uit de buik. Dit kan worden gecontroleerd door het spuiten van een kleine hoeveelheid van de steriele zoutoplossing op de hechtingen en zoekt zeepbel vorming geeft lucht afkomstig van de buikholte. Als dit gebeurt, kunnen extra eenvoudig huid hechtingen worden geplaatst op de site van lucht lekkage.

Een ander technisch uitdagende aspect houdt verband met het risico van ischemische letsels in de dunne darm als gevolg van slecht uitgevoerde chirurgische procedures te ontwikkelen. Ischemie gebeurt er als er een beperking van de bloedtoevoer naar weefsels, waardoor een tekort aan zuurstof en andere moleculen die nodig zijn voor cellulaire metabolisme. In dit geval de darm wordt snel macroscopisch donker blauw in plaats van roze-rood en de intestinale mucosa cellen snel zal ontaarden. Dit zal leiden tot ischemische laesies die niets met de ingespoten pathogen en het zal interfereren met de histopathologische interpretatie. Twee problematische situaties kunnen leiden tot ischemie. Eerst, ligatuur van de mesenterische vaartuigen door inadvertence zal leiden tot deze aandoening. Om deze reden is het van cruciaal belang te letten op de plaatsing van de ligaturen langs het darmkanaal te vermijden, met inbegrip van de mesenterische schepen. Ten tweede, ischemie kan gebeuren als bloeduitstortingen van de mesenterische vaartuigen zich gedurende de procedures voordoen. Deze structuren zijn dun ommuurde en kwetsbaar. Overmatige spanning kan leiden tot hun breuk en terwijl handmatig exteriorizing de darmen, aandacht moet worden besteed aan de spanning op de mesenterische schepen om hun integriteit te garanderen tijdens deze stap. Mesenterische vaartuigen bloeding kan ook optreden als deze zijn doorboord met een chirurgische hechtdraad naald. De chirurg moet zorgvuldig kijken naar de locatie met de naald door het mesenterium doorboord. Bloeden kan in beide situaties worden gestopt, maar het proces van stolling zal stoppen of de bloedstroom tot deze intestinale segmenten, vandaar veroorzaken onomkeerbare letsels en afbreuk te doen aan de geldigheid van de resultaten aanzienlijk te beperken.

Dit model is handig voor de studie van gastheer-pathogeen interacties en pathogenese van intestinale ziekten veroorzaakt door infectieuze agentia. Het voorgestelde model kan worden aangepast afhankelijk van de studie door het aantal lussen gemaakt te wijzigen of door het wijzigen van de lengte van elke lus. Voordat u deze wijzigingen implementeert, is het aanbevolen om het standaardiseren van de methode om significante resultaten te waarborgen. Beperkingen van deze techniek zijn vaardigheid-georiënteerde en alleen goed opgeleide personeel moeten het uitvoeren van deze operatie op levende dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de stoel in pluimvee onderzoek (M. Boulianne) van de Faculteit Diergeneeskunde van de Université de Montréal. Drs. Boulianne en bovenliggende ontwikkelde het model. Drs. Boulianne en bovenliggende uitgevoerd de operaties. Dr. Burns bijgestaan bij de ontwikkeling van het protocol van de verdoving. Dr. Parent de video bewerkt en schreef het manuscript. Drs Burns, Desrochers en Boulianne bewerkt het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2, (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41, (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21, (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56, (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4, (2), e26 (2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32, (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45, (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149, (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47, (1), 52 (2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12, (1), 101 (2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46, (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7, (9), e45608 (2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68, (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40, (1), 5 (2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256, (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16, (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142, (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51, (4), 834-839 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics