Ex Utero Electroporation og Organotypic stykke kulturer embryonale musen hjerner for Live-Imaging av overføring av GABAergic Interneurons

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her gir vi en rimelig og pålitelig metode for å generere electroporated hjernen organotypic skive kulturer fra mouse embryoer egnet for AC confocal mikroskopi og live-imaging teknikker.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

GABAergic interneurons (INs) er kritiske komponenter i nevrale nettverk som driver kognisjon og atferd. INs skjebnebestemt til å fylle cortex overføre tangentially fra sitt opprinnelsesland i det ventrale telencephalon (inkludert fra de mediale og caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) til dorsal kortikale platen i respons til en rekke indre og ytre signaler. Ulike metoder har blitt utviklet i årene som genetisk manipulere bestemte stier og undersøke hvordan de regulerer dynamisk cellen cytoskjelett endringene som kreves for skikkelig i migrasjon. In utero electroporation har vært mye brukt til å studere effekten av genet undertrykkelse eller overuttrykte i bestemte IN subtyper samtidig vurdere virkningen på morfologi og endelige posisjon. Men mens denne tilnærmingen er lett brukes til å endre radielt overfører pyramidale celler, er det mer teknisk utfordrende når målretting INs. In utero electroporation genererer en lav avkastning gitt redusert overlevelse av pups når electroporation gjennomføres før e14.5, som er vanlig når studere MGE-avledet INs. I en alternativ tilnærming, MGE explants gir lett tilgang til MGE og lette avbilding av genmodifiserte INs. Men i disse explants, INs overføre til en kunstig matrise, uten endogene veiledning signaler og thalamic innganger. Dette bedt oss å optimalisere en metode der moduler kan overføre i et mer naturalistisk miljø, mens omgå tekniske utfordringer i utero tilnærminger. I dette papir beskriver vi kombinasjonen av ex utero electroporation embryonale musen hjerner etterfulgt av organotypic skive kulturer lett spore, bilde og rekonstruere genmodifiserte INs migrere langs deres naturstiene svar endogene signaler. Denne tilnærmingen gir både kvantifiseringen dynamisk aspekter av i migrering med tidsinnstilt AC confocal bildebehandling, i tillegg til detaljert analyse av ulike morfologiske parametere med neuronal rekonstruksjoner på fast immunolabeled vev.

Introduction

Kortikale GABAergic interneurons (INs) er forskjellige med hensyn til deres biokjemiske egenskaper, fysiologiske egenskaper og tilkobling, og de megle ulike funksjoner i eldre nettverk1,2,3 ,4,5. Spesifikasjon av forskjellige undergrupper av kortikale INs reguleres tett gjennom genetisk cascades som har vært grundig studert1,2. Fleste (70%) av kortikale GABAergic INs kommer fra progenitors i den mediale ganglionic anseelse (MGE), en ventrally plassert embryonale struktur, og må overføre over relativt lang avstander til kortikale plate1, 2 , 6. mens kortikale pyramidale celler overføre radielt fra sonen ventrikkel (VZ) til kortikale plate langs radiale glia stillaset, tangentiell migrering av moduler, som ikke er knyttet til slike et stillas, krever en rekke iboende og ytre signaler å tiltrekke migrere neurons mot kortikale platen, mens guiding dem fra ikke-kortikale strukturer2,7,8. Etter spennende cellen syklus, moduler er repelled fra MGE av kjemoterapi-frastøtende stikkordene uttrykt i VZ av MGE, som utløser tangentiell migrering mot kortikale plate9,10. Migrere INs unngå striatum ved hjelp av forskjellige frastøtende stikkord11 og, etter å ha nådd kortikale platen, de bytter fra en tangentiell til en radial overføring modus og nå sitt endelige laminær posisjon, delvis som svar på signaler fra pyramideformet celler12 og andre cellulære bestander13. Migrering av moduler, som for andre neuronal befolkninger, innebærer forskjellige dynamisk morfologiske endringer slik at den faktiske bevegelsen av Nevron. Denne såkalte neuronal bevegelse er preget av repeterende sykluser av tre påfølgende trinn: forlengelse av en ledende prosess, en aktiv anterograd bevegelse av kjernen (nucleokinesis), og tilbakekallingen av den etterfølgende prosess14. I migrasjon er regulert av mange indre og ytre stikkordene som drive på forgrening og aktive ombygging av ledende prosessen å veilede moduler i riktig retning, bestemme både retningen og hastigheten på overføring14,15 ,16.

Determinanter regulere kortikale i overføringen har blitt grundig studert i årene1,2,7,17,18,19,20, og avbrudd i noen av molekylære skuespillere har blitt postulert føre til neurodevelopmental lidelser, som pediatric ildfaste epilepsi eller autisme spektrum lidelser1,2,21, 22 , 23 , 24. derfor utviklingen av ulike i vitro og vivo tilnærminger har vært forfulgt for å fremme betydelig vår evne til å studere denne dynamiske prosessen, som tidligere vurdert25. In vitro metoder, inkludert Boyden kammeret analysen og Stripe valg analysen, gir den raskeste og mest reproduserbar betyr vurdere de krav og celle autonome virkningen av bestemte gener eller proteiner under neuronal migrering uten påvirkning av andre faktorer25. Disse analyser er spesielt nyttige når kombinert med live-imaging8,26,27. Med disse teknikkene, INs lett Hentet fra e13.5 MGE og isolert av enzymatisk og mekanisk dissosiasjon, hvoretter forskjellige signalveier og veiledning signaler kan undersøkes, som illustrert tidligere8,28 . Men finner disse analyser sted i en kunstig ekstracellulær matrix i fravær av tredimensjonale vev arkitektur, som kan endre neuronal atferd og celle egenskaper, potensielt påvirke celle migrasjon og/eller overlevelse25. For å omgå disse begrensningene, er ex vivo MGE explants utviklet som et alternativ for å kvantifisere dynamisk morfologiske endringene skjer under migrering sammen med parametere som hastighet og retning14, 29. Generere MGE explants er relativt enkelt og har blitt grundig beskrevet andre steder30. Det innebærer at belegget av en liten pakke av MGE på en monolayer av blandet kortikale celler eller i en blanding av matrigel og kollagen i nærvær av attraktive eller frastøtende stikkordene25, selv om sistnevnte er valgfritt31. MGE explants tillater for høy oppløsning tenkelig tynt merket celleområde, forenkle studiet av intracellulær prosesser, for eksempel cellen cytoskjelett remodeling under ledende prosessen forgrening, som vist tidligere32,33 ,34 og studien. MGE explants har vært brukt med hell å vurdere dynamisk cellen cytoskjelett endringer under i migrasjon i et 2D-miljø, for eksempel etter bestemte farmakologiske eller chemotactic manipulasjoner (se, for eksempel Tielens et al. 201633) . Men med denne tilnærmingen, INs overføre innenfor en kunstig matrise, og dette kan endre i atferd og reproduserbarhet og betydningen av de eksperimentelle resultatene.

Derimot i utero electroporation gjør genetisk manipulering av moduler i sitt eget miljø og er mye brukt metode for å raskt og effektivt vurdere virkningen av gevinst og tap av gen funksjon mens omgå begrensningene for kostbare og tidkrevende knockout og banke i strategier25,35. In utero electroporation kan være partisk mot i progenitors ved hjelp av celle type bestemt arrangører og posisjonering elektrodene mot ventromedial strukturer, inkludert MGE36. Videre i utero electroporation gir betimelig uttrykk for eksperimentell konstruksjoner innen 1-2 dager, i forhold til 7-10 dager kreves for å konstruere uttrykket bruke viral vektorer25. Men i utero electroporation av i progenitors tendens til å være lav-yield. Faktisk, selv om pyramideformet celle progenitors lokalisert i sonen dorsal ventrikkel kan være effektivt transfected bruker i utero electroporation, målretting mer ventrally ligger strukturer, for eksempel MGE, er mer teknisk utfordrende, spesielt i små e13.5 reduserer embryoer og høyt antall embryonale dødelighet ytterligere eksperimentelle kapasitet25.

For å omgå noen av de tekniske begrensningene forbundet med in vitro MGE explant eksperimenter og i vivo i livmoren electroporation, ex vivo organotypic skive kulturer har vært utviklet8,37, 38,39. Hjernen organotypic skive kulturer tilbyr fordelen av mimicking i vivo forhold, samtidig som mindre dyre og tidkrevende enn generere dyr modeller25. Faktisk disse forberedelsene gir en enkel tilgang til MGE, sammen med spesifikke visualisering av moduler, og kan kombineres med fokal electroporation å undersøke bestemte molekylær stier i moduler migrering i en mer fysiologiske miljø8 , 39 , 40 , 41. vi har derfor optimalisert tilnærming for organotypic kulturer38, som kombineres med ex utero electroporation og tidsinnstilt AC confocal bildebehandling, å vurdere den morfologiske og dynamisk oppstår under tangentiell overføringen av MGE-INs. Nåværende protokollen ble tilpasset og optimert fra andre som har brukt ex utero eller i utero hjernen electroporation og organotypic stykke kulturer for å studere migrering av pyramideformet celler42,43 og kortikale INs36,39,44. Spesielt mouse embryoer er decapitated og MGE er electroporated ex vivo etter intraventricular injeksjon av eksperimentelle plasmider, slik at mer effektiv og nøyaktig målretting av MGE progenitors enn hva som kan oppnås med i utero electroporation. Hjernen er deretter trukket ut og delt i hele hjernen koronale skiver det kan kultivert for et par dager, dermed tillater kontinuerlig sporing og imaging transfekterte ins. Denne tilnærmingen etiketter vanligvis 5-20 tangentially migrere INs per hjernen skive, minimere antall eksperimentelle gjentakelser må nå statistisk betydning, mens merking en tilstrekkelig sparsom neuronal befolkning for å sikre enkel separasjon av individuell neurons for gjenoppbygging og fine morfologiske vurdering. Videre sammenlignet MGE explants, organotypic kulturer sikre det overfører INs utsatt for mer naturlige miljø, inkludert lokalt utskilles chemokines og innspill fra thalamic afferente. Denne tilnærmingen er dermed godt egnet til å kvantifisere den retningen og vandrende bane vedtatt av transfekterte INs, samtidig tilby tilstrekkelig anatomiske detaljer å tillate karakterisering av finere dynamisk prosesser som ledende prosessen forgrening, nucleokinesis og etterfølgende prosessen dementi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter som involverer dyr ble godkjent av Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) på CHU Sainte-Justine Research Center og ble utført i samsvar med den kanadiske Council på Animal Care guide til den omsorg og bruk av forsøksdyr (Red.. 2).

Protokollen beskrevet her var optimalisert for electroporation av embryo på embryonale dag (e) 13,5, samtidig når MGE-avledet moduler er aktivt generert, før på toppen av CGE-avledet INs produksjon45,46. Videre for å skjevhet electroporation mot GABAergic INs, bruker vi en promoter selektivt uttrykt i tillegg (for eksempel Dlx5/6 selskapet med sitt minimale enhancer)47.

1. utarbeidelse av løsninger for Electroporation og Organotypic stykke kulturer

  1. Forberede 125 mL steril kultur medium.
    1. Måle 125 mL av vanlige Nevron-spesifikke kultur medium (se Tabell for materiale for formulering) i en sterilisert flaske i en tidligere UV-steriliseres biosafety CAB sprayet med 70% etanol. Legge til 2,25 mL av 50 x serum-free Nevron-spesifikke supplement, 1,75 mL av 200mM glutamin (siste konsentrasjon på 0,5 mM) og 6,25 mL inaktivert hest serum tidligere aliquoted under sterile forhold. Bland godt, aliquot i 15 mL steril konisk rør, og lagre på 4 ° C.
      Merk: Forberedt kultur medium kan lagres i opptil tre uker på 4 ° C.
    2. Dele en 100 X lagerløsning Botteinstein's N-2 formulering48 i 150 µL dele under sterile forhold og fryse på 20 ° C før bruk.
  2. Forberede 1 L sterilt kunstig cerebrospinalvæske (ACSF).
    1. Måle 800 mL destillert vann i en 1 liters kanne. Legge 25.67 g av sukrose, 5,08 g natriumklorid (NaCl), 2,18 g natriumbikarbonat (NaHCO3), 1,80 g av glukose, 0,19 g av kalium klorid (KCl), 0.15 g av monobasic vannfri natrium fosfat (NaH2PO4), 1 mL 1 M lager CaCl2 .2H2O og 2 mL 1 M lager MgSO4.7H2O. røre å oppløse ved romtemperatur. Legg destillert vann til å nå et samlet volum på 1 L.
    2. Bruke 0.22 µm filtre filtrere løsningen i et sterilt flasken i en sterilisert biosafety skap og lagre på 4 ° C i opptil 1 måned.
  3. Utarbeide en fersk løsning av 4% agarose i ACSF før hvert eksperiment.
    1. Måler 25 mL av tidligere forberedt ACSF i et 50-mL steril konisk rør og legge 1 g av lav-smelter poeng agarose.
    2. Varme i 45 s i en mikrobølgeovn. For å unngå søl, avbryte oppvarming hver 3-4 s når kokende starter, åpne røret for å la press ut, lukke den igjen og agitere manuelt for å blande agarose. Gjenta til den agarose løsningen er homogen. Hold agarose løsningen på 42 ° C i resten av å unngå herding.
      Merk: Høyere temperaturer vil skade hjernen vev.

2. utarbeidelse av plasmider for injeksjon

  1. Trekke en glass microinjection pipette
    1. Angi brønnene puller med riktige parametere, sikre av glass kapillær i gitt plass og kontroller at det er sentrert med filament.
    2. Trykk knappen trekk.
    3. Nøye fjerne nylig gjort microinjection Pipetter fra varme avtrekker og sted i en ren Petriskål eller til fremme bruk å unngå å skade spissen.
  2. Oppsett biosikkerhet kabinett med alle instrumenter nødvendig for dette eksperimentet (se figur 1A), sjenerøst spray alle instrumenter i biosikkerhet kabinett med 70% etanol og sterilisere instrumenter og miljø med UV lys i 15-20 min.
  3. Under det sterilisering steget er tine plasmider på is (4 ° C).
  4. Mål 10 µL av plasmider fra en lagerløsning (4 µg/µL) inn i et rent 1,5 mL sentrifuge rør. Legge til 0,01% av rask grønne FCF. Bland forsiktig, spinn kort og holde på is til bruk.
    Merk: Maxi-prep DNA bør være forberedt i henhold til produsentens protokollen bruker en endotoxin-fri maxi-prep kit. DNA kan bli solubilized i TE buffer eller nuclease gratis H2O og utarbeidelse av plasmider med fargestoff løsning kan, men må ikke utføres under sterile forhold. Plasmider fra Maxi-prep bør være aliquoted å unngå flere fryse-Tin sykluser. Aliquoted plasmider skal blandes med fargestoff ingen mer som 2 timer før bruk og bør ikke være refrozen for videre bruk.
  5. Etter sterilisering, forberede nano-injektor som følger.
    1. Velg en av de tidligere utarbeidet glass microinjection pipette lagret i en ren boks eller Petriskål og bruk små pinsetter å kutte spissen av pipette på skrå måte å oppnå en ytre diameter på omtrent 15 µm.
      Merk: Den ytre diameteren gitt her er et omtrentlig mål å gi brukeren en idé om hva vi bruker i vår eksperimenter og er optimalisert for å lette piercing av skallen injeksjonsvæske plasmider uten å skade hjernen, samtidig som for væske lasting og utgivelsen av DNA. Den ytre diameteren kan måles ved å se på klipp spissen av glass microinjection pipette apposed til micrometric skala bar under lysende felt mikroskop.
    2. Bruk en sprøyte fylle brønnene med mineralolje fra unpulled enden (å utvise luften).
    3. Sett fylt glass brønnene i nano-injektoren ved å følge instruksjonene fra produsenten.
    4. Tom 2/3rds av glass brønnene (holde nok olje til å hindre luft).
  6. Nøye inn forberedt brønnene i røret som inneholder plasmider/fargestoff løsningen og fyll glasset brønnene med plasmider/fargestoff løsningen.

3. samling av Mouse embryoer fra gravide kvinner

  1. Overvåke avl kvinner daglig for å vurdere for vaginal plugge, fortrinnsvis samtidig daglig (tidlig ettermiddag). Dag e0.5 tilsvarer den første dagen når en vaginal plugg er observert.
    Merk: Eksperimenter beskrevet her kan utføres i vill-type mus. Imidlertid rette identifikasjonen av MGE og merke alle GABAergic INs (eller bestemte sub sett som MGE-avledet INs), transgene dyr kan brukes (f.eks: GAD67EGFP; Dlx5/6grobunn med en grobunn-reporter allelet, etc.47,49). I denne situasjonen, bør den eksperimentelle plasmider injisert uttrykke en annen fluorophore (for eksempel mCherry eller TdTomato) for å tillate visualisering av transfekterte INs (gul) som kan sammenlignes med ikke-transfekterte INs (grønn).
  2. Ofre kvinnelige på embryonale dag e13.5, av halsen forvridning.
    Merk: Anesthetic agenter gitt ved offer kan påvirke i migrasjon og overlevelse50,51 og bør unngås.
  3. Samle embryo med c-delen som følger.
    1. Sjenerøst spray kvinnelige magen med 70% etanol. Trekk mage huden med et par sterilisert tang, og med den andre hånden, bruke steriliserte kirurgisk saks til å kutte huden fra magen.
    2. Med et par sterilisert tang og saks, trekke magen fascia opp og skjær den og nøye unngå livmoren.
    3. Med en tredje sterilisert tang og saks, trekke livmor hornene og klippe dem ut av bukhulen. Plass dissekert livmor hornene i et sterilt 60 mm Petriskål fylt med neural-baserte kultur medium med aminosyrer, vitaminer og uorganisk salter (se Tabell for materiale kommersielt tilgjengelig produkt).
  4. I et sterilt biosikkerhet regjering bruke to par fine pinsett (en i hver hånd) å dissekere embryo av morkaken og isolere hodene ved halshogging.
  5. Skråkant-kutt spissen av en steril 3 mL plast overføring pipette, Sug opp hodet og overføre dem i en ny sterilt 60 mm Petriskål lagvis med befestet svart voks og fylt med samme neural-baserte supplert kultur medium som ovenfor.
    Merk: Dette trinnet reduserer overføring av forurensninger (mus hår, blod). Svart voks brukes til å stabilisere hodet under disseksjon. Kultur medier trenger ikke å være oksygen under disse prosedyrene.

4. intraventricular plasmider injeksjoner og Ex Vivo Electroporation av MGE

Merk: Følgende fremgangsmåte må utføres under sterile forhold i den tidligere utarbeidet biosikkerhet kabinett.

  1. Sted Petriskål 60 mm lag med svart voks og inneholder halshugget hodene i nevrale-baserte supplert kultur medium under kikkerten i biosikkerhet kabinett.
  2. Stabilisere hodet, den rostral delen mot høyre, med fine pinsett med venstre hånd og bruke nano-injektoren i høyre hånd for å injisere 1-2 µL av plasmider/fargestoff løsningen i en lateral ventrikkel.
    Merk: Co uttrykk eksperimenter kan være utført av co-electroporating en redning plasmider og en shRNA-uttrykke plasmider ved å blande både plasmider i ekvimolare konsentrasjoner.
  3. Electroporate injisert hjernen.
    1. Plass hodet mellom elektrodene med negative elektroden plassert på ryggen og parallelt med hodet og den positive elektroden mot ventrale hodet mot MGE.
    2. Når elektrodene er godt posisjonert, lever 4 kvadrat pulser av 40 V for 50 ms på 500 ms mellom puls intervaller.
    3. Fjern alle gjenværende vev fra elektrodene ved hjelp av pinsett allerede plassert i fravær av smittefarlige stoffer skap.
      Merk: Disse parametrene er optimalisert for electroporator brukes i vårt forsøk. Anbefaler vi at brukerne utfører optimalisere tester på forhånd hvis bruker en annen type electroporator.
    4. Gjenta trinn 4.1 til 4.3 for alle gjenværende hjerner.
      Merk: Selv om denne protokollen beskriver manipulasjoner kreves for én hjerne, er det mulig å injisere inntil 4 hjerner sekvensielt før electroporating hver hjernen, dermed øke avkastningen. Denne strategien er spesielt fordelaktige når 2 eller flere forskjellige plasmider er injisert sekvensielt (f.eks kontroll eller eksperimentelle plasmider) under samme eksperimentet (muliggjør sammenlikning littermates). I tillegg er det mulig å injisere og electroporate samtidig begge sider av hjernen til å øke avkastningen, ved å plassere elektrodene helt parallelt med hjernen overflaten.

5. hjernen disseksjon og Organotypic skive kulturer

  1. Mens fortsatt manipulerer i sterile miljøet for biosikkerhet regjering, dissekere hjernen av skallen.
    1. Stabilisere hodet på laget av svart voks ved å stikke en nål inn hvert øye og nøye unngå hjernen.
    2. Bruk et par fine pinsett venstre side av halsen og et par fine pinsetter å rive huden fra skallen, fra tilbake til forsiden.
    3. Mens du holder hodet sidelengs med pinsetten i den ene hånden, bruk et par pinsett i den andre hånden til å nøye klipp skallen nivået av hjernestammen, og trekk forsiktig skallen. Hver tweezer, kuttet skallen i sagittal flyet (midtlinjen) mot fronten og deretter incise sidelengs for å frigjøre skallen fragmenter.
    4. Løft hjernestammen, og nøye klippe meninges og Hjernenerve til hjernen er helt ut av skallen.
      Merk: Alle trinnene som er beskrevet i 5.1 bør utføres under strenge sterile forhold i en biosafety kabinett.
  2. Bygge hjernen i 4% lav-smeltende punkt agarose snitting.
    1. Fyll en 35 mm Petriskål med agarose løsning utarbeidet over (holdt flytende på 42 ° C).
    2. Raskt overføre en electroporated hjernen til agarose-fylt parabolen med tidligere kuttet overføring pipette. Holde parabolen ved romtemperatur.
    3. Rør agarose med en metall pinnen å holde hjernen i brønnen (for å hindre synker) og plassere hjernen i et rostro-caudal fly parallelt parabolen. Stopp røring når agarose begynner å stivne, for å unngå noen hjerneskade.
    4. Bruk et barberblad til å kutte agarose omgir hjernen for å danne en rektangulær blokk, forlate en margin på 1-2 millimeter rundt hjernen. Kontroller at den rostral delen av hjernen er vinkelrett på den fremre grensen av blokken å lette orienteringen for påfølgende snitting trinnene.
    5. Gjenta for hver hjernen.
      Merk: Det er mulig å kutte flere hjernen samtidig (maks 3) med forme egen agarose blokker stund innfatning hver hjernen ved ulike høyder.
  3. Vibratome framskaffet og skive kultur.
    1. Tøvær en aliquot av 100 X N-2 supplement (150 µL) på isen og legge til 15 mL aliquoted kultur medium under sterile forhold.
    2. Overføre 750 µL av kultur medium (med 1 X N2 supplement) hver brønn av en 6-brønnen plate.
    3. Med buet pinsetter, plassere en celle kultur setter inn (30 mm i diameter, 0.4 µm porestørrelse, PTFE) i hvert medium-fylt godt.
    4. Vibratome badet fylles med kontinuerlig oksygenrikt ACSF. Cool 4 ° c med is rundt badekaret, eller bruke en nedkjølt vibratome.
    5. Stille vibratome 0.150 mm/s og frekvensen til 80 Hertz.
    6. Fest agarose blokken på vibratome plattform, rostral kanten vender ned og ventrale kanten mot brukeren.
    7. Kuttet hjernen framskaffet å få 250 µm tykke deler (4 ° C).
    8. Med sterilisert spatler, samle 2-3 delene inneholder MGE og sted alle hjernen deler fra en dyr på en enkelt 30 mm membran setter inn, mens nøye unngå overlapping mellom seksjoner. Plass innsatsen i en brønn av en 6-brønnen plate (inneholder 750 µL av supplert kultur medium, som beskrevet ovenfor). Hver inndeling kan også plasseres på en egen 13 mm diameter membran i en 12-brønnen plate fylt med 500 µl supplert kultur medium. Hvor mye kultur medium anbefales for hver brønn gir hjernen delene skal næret av media uten å være neddykket.
      Merk: Trinnene under 5.3.6 og 5.3.7 ikke utføres under komplett sterile forhold, med mindre vibratome kan steriliseres og brukes i en biosafety kabinett. Derfor er det avgjørende å utføre disse trinnene nøye for å unngå enhver kontaminering. Riktig verneutstyr (ren maske, kirurgiske hansker og Laboratoriefrakk) bør brukes på alle tider og kroppsdeler, selv dekket, som hår, ansiktet og hendene, bør aldri gå over kultur plater (med eller uten kultur medium). Det anbefales også å spray 70% etanol ofte på hansker og spatler brukes til å samle delene hjernen.
    9. Plass kultur plate i en ventilert sterilt inkubator på 37 ° C med 60% fuktighet og 5% CO2 for 48 eller 72 h.
      Merk: Disse inkubasjon tider var optimalisert for tidsinnstilt bildebehandling MGE-avledet ins og AC confocal bildebehandling for fast skiver, henholdsvis. Optimal inkubasjon ganger bør testes på forhånd for hver eksperimentell design. Dessuten, er hvis den valgte inkubering 72 h og under, det ikke nødvendig å endre kultur medium. For lengre inkubasjon ganger, bør kultur medium endres hver 2-3 dager.
    10. Etter den ønskede inkubasjon tid, overføre delene av interesse til en 8-chambered dekkglassvæske og legge 3-5 µL av kultur medium. Sted dekkglassvæske i et miljømessig kammer (37 ° C, 60% fukt, 5% CO2) koblet til en omvendt spinning disk AC confocal utstyrt med en computer-assistert oppkjøpet programvare å installere time-lapse tenkelig økten.
      Merk: Alternativt delene kan være fast med 4% paraformaldehyde (overnatting på 4 ° C eller 2 timer ved romtemperatur) og senere immunostained med forskjellige antistoffer for visualisering av den morfologiske funksjoner i electroporated INs under en AC-confocal mikroskop. Selv om eGFP og mCherry kan visualiseres ved AC confocal mikroskopi uten noen mot flekker prosedyre, anbefaler vi utfører immunohistochemistry mot GFP og mCherry for å forbedre signal siden fiksering prosessen kan redusere fluorescens, redusere gjenkjenning av finere komponenter av embryonale neurons, som mindre avdelinger i de innledende eller etterfølgende prosessene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne delen gir vi representant resultatene etter ex utero electroporation en kontroll plasmider eller en eksperimentell plasmider målretting en genet av interesse i MGE av e13.5 musen embryo etterfulgt av organotypic skive kulturer ruges på 37 ° C for 48 h (for tidsinnstilt bildebehandling) eller 72 h (for fiksering og immunohistochemical merking) (se figur 1B for skjematisk protokollen). Eksemplene INs migrerer fra en MGE explant er også illustrert (se figur 1 c skjematisk protokollen) som sammenligningsgrunnlag metoden beskrevet her. Electroporation av en plasmider i MGE progenitors synes å forsinke utgangen av moduler fra MGE og kultur må justeres tilsvarende.

I en vellykket eksperiment, organotypic skiver vises sunn under AC confocal mikroskop, dvs kortikale lag er lett identifiserbar med lyse feltet modus og det er ingen synlig kontaminering på skive overflaten (gjenkjennelig med intens autofluorescence og tilstedeværelsen av fluorescerende filamenter synlig under epifluorescence). I sunn kronisk organotypic skiver gjennomgår omtrent 20% av cellene apoptose etter 72 h i kultur (figur 2), som beskrevet tidligere i kronisk organotypic kulturer (f.eks postnatal kulturer)52. Likevel, brutto cytoarchitectural hjernens struktur fortsatt godt definert, som illustrert her bruker DAPI flekker (figur 2A). Våre Protokoll for ex vivo electroporation av MGE gir et gjennomsnitt på 50-100 transfekterte celler per sektor (figur 3AB), av celleområdet 5-20 vil bli sett migrere ryggen etter 72 h i kultur. Etter fiksering og immunohistochemical farging, kan moduler vandring tangentially mot kortikale platen lett identifiseres med AC confocal mikroskopi som de presenterer en langstrakt/oval celle kroppen, sporadisk etterfølgende prosessen og en ledende prosess orientert tangentially. Ledende prosessen vanligvis gir opphav til en eller to grener og gjenkjennes av tilstedeværelsen av en sporadisk hevelse foran kjernen (boliger centrosome før nucleokinesis) og veksten kjeglene på slutten av hver gren. (Figur 3 c-G).

Denne protokollen ble utformet for observasjon av overfører MGE-avledet INs på encellede nivået med tidsinnstilt bildebehandling. For denne bestemte eksperimentet (Figur 4), ble koronale organotypic hjernen stykker generert fra Dlx5/6grobunn; RCEEGFP embryo electroporated på e13.5 med en plasmider uttrykke en eksperimentell shRNA (målretting en genet av interesse) og TdTomato kassetten. Skiver var ruges i 48 timer, overført til en 8-og kamret dekkglassvæske rett (1 skive per kammer flyter på et tynt lag av supplert kultur medium) og fotografert hver 3 minutter for 6-8 h med en 20 x air (0,70 NA) mål på en invertert mikroskop utstyrt med spinning disk AC confocal hode, en computer-assistert oppkjøpet programvare og en scene-top miljømessige kammer. Under bildebehandling, skiver ble holdt på 37 ° C ble og kontinuerlig oksygenert og fuktet i miljømessige chamber (5% CO2 og 60% H2O). Electroporated MGE-avledet INs ble identifisert som sådan av deres gjengivelsen av eGFP, bekrefter sin GABAergic i identitet og deres gjengivelsen av TdTomato, bekrefter at de uttrykker den eksperimentelle plasmider (figur 4AB). Electroporated INs er lett identifiserbare og godt isolert, som vist i Figur 4, tillater for finere analyse av migrasjon dynamisk parametere som hastighet og distanse reist. I tillegg merket INs sett vandring tangentially mot kortikale platen, mens i sitt naturlige miljø, slik at vi kan identifisere dynamiske morfologiske endringer som forgrening av ledende prosessen og nucleokinesis (figur 4C -F).

Ex vivo electroporation MGE-avledet ins kan også kombineres med MGE explants aktivere høyoppløselig avbilding av dynamisk cellen cytoskjelett prosessene som oppstår under overføring, som et supplement til studiet av retningen og vandrende dynamikk i organotypic kulturer. Som et eksempel, ulike faser av neuronal bevegelse minner om de oppstår under tangentiell overføringen av moduler i organotypic skive kulturer kan observeres i electroporated INs migrerer fra en MGE explant 48 h etter electroporation, som leder neurite forlengelsen og nucleokinesis (figur 5B-E). Ulike cellen cytoskjelett prosesser kan være studerte ved høy oppløsning i isolerte cellene migrerer fra en MGE explant, for eksempel ved farging F-utgangen strukturer med phalloidin (figur 6A), som ikke kan oppnås optimal i organotypic skiver gitt høy mobilnettet tetthet (og dermed av cellen cytoskjelett elementer) i et eget miljø. Disse cellen cytoskjelett prosesser, og spesielt F-utgangen remodeling, kan videre studeres dynamisk ved å kombinere Lifeact uttrykk med tidsinnstilt bildebehandling. For eksempel vi viser et eksempel på høy oppløsning tidsinnstilt bildebehandling av et IN avledet fra en MGE explant fra en Nkx2.1grobunn; RCEEGFP mus hjernen bærer en målrettet sletting av en genet av interesse i moduler. Denne IN var transfekterte med mCherry-Lifeact-7 plasmider under kontroll av CMV arrangøren (gave fra Michael Davidson), med metoden schematized i figur 1 c, slik at sporing av F-utgangen remodeling forekommer i sanntid (figur 6B). dermed mens organotypic kulturer er nødvendig til riktig vurdere retningen eller overføring bane av genmodifiserte INs, MGE explants kan utfylle slike studier ved å gi bedre tilgang til isolerte celler ved høy oppløsning avbildning av dynamisk cellen cytoskjelett prosesser.

Teknisk fallgruver kan resultere i feil av eksperimenter beskrevet ovenfor. For eksempel kan innebygging hjernen i en varmere enn 42 ° C agarose resultere i vev og neuronal død, avslørt av et tap av gjennomskinnelighet i hjernen eller skiver, som blitt ugjennomsiktig. Men burde temperaturen ikke være holdt for lav, som en solidifying agarose løsning kan ødelegge skjøre embryonale hjernen under prosessen med innebygging. Dernest kan forurensning redusere avkastningen av eksperimentelle tilnærminger beskrevet her. Alle trinnene bør derfor utføres med forsiktighet, under strenge sterile forhold så mye som mulig. Alle løsninger og utstyr som skal steriliseres før bruk og utstyr ofte bør sprayes med 70% etanol å unngå forurensning fra enten bakterier eller mold. Forurensning kan vises direkte i kultur brønnene, som kultur mediet blir gule eller ugjennomsiktig. Forurensning kan gå ubemerket hen når kultur medium står klar og væske. Men et lag av mold på skive overflaten observert vanligvis eller skiver bli svært skjøre under fiksering og flekker trinnene. Når slike sektorer er visualisert under mikroskopet, forurensning kan manifestere seg som et lag med autofluorescence over merket nerveceller eller avsløres av tilstedeværelsen av lenge fluorescerende filamenter. Organotypic skiver i forurensede brønner skal kastes, men skiver kultivert i andre brønnene på samme plate kan oppbevares i flere trinn. Bakteriell forurensning er ganske sjeldne, men bør tas alvorlig, betyr at alt utstyr, inkludert delte inkubatorer og kultur rommet bør være manuelt rengjøres og steriliseres.

Figure 1
Figur 1: Skjematiske representasjoner av protokollene for ex utero electroporation etterfulgt av organotypic skive kultur eller MGE explants. A. eksempel på en biosafety CAB oppsett med alle steriliserte instrumenter nødvendig for protokollen beskrevet her. B. skjematisk fremstilling av protokollen som brukes for ex utero electroporation og organotypic stykke kulturer. Kort, embryoene er decapitated, det eksperimentelle plasmider injiseres i laterale ventrikkel (1) og electroporated i MGE (2). Hjernen er microdissected av skallen (3) og i agarose (4). Organotypic inndelinger er generert på en vibratome (5) og plasseres i kultur på 37 °C(6) 48 h for time-lapse mikroskopi (7,1) eller 72 h for cellen rekonstruksjoner (7.2). C. skjematisk fremstilling av protokollen tilpasset fra Myers et al. 201353 og brukt for generering av MGE explants. Kort, dorsolateral halvdelene er først dissekert ut fra e12.5 e14.5 vill-type mus embryo (1) og dissosiert mekanisk supplert kultur medium (2). Kortikale celler er belagt på en tetthet 5,25 x 105 kortikale celler/cm2 og kultivert for 2t på 37 ° C i en kollagen/poly-L-lysin-belagt 8-chambered dekkglassvæske (3). Deretter e13.5 Dlx5/6grobunn; RCEEGFP embryo behandles for ex utero electroporation av MGE (4, 5), og MGE manuelt isolert fra hjernen og kutt i 100 µm2 fragmenter (6). Disse explants er deretter plassert oppå tidligere utarbeidet kortikale mater laget, dekket med kultur medium og co kultivert for 48 timer før tidsinnstilt bildebehandling (7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: bevart cytoarchitecture i sunn organotypic skiver. Generering av organotypic skjær kulturer etter ex vivo electroporation av Nkx2.1grobunn; RCEEGFP mouse embryoer (A) ikke resulterer i betydelig vevsskade, som åpenbart av bevarte cytoarchitecture (DAPI (blå) og grobunn-reporter (GFP)), når sammenlignet med en 18 µm tykke cryosection fra en Nkx2.1grobunn; RCEEGFP fosteret transcardially parfyme med 4% PFA på e15.5. D og M angir dorso-ventrale og latero-mediale akser, henholdsvis. (B). forstørring bilder tatt med en invertert AC confocal mikroskop utstyrt med en 63 x / 1.4 oljeobjektiv etter farging med et anti-kløyvde-Caspase 3 antistoff (Cl-cas3) avslører at omtrent 20% av cellene i kortikale platen gjennomgå apoptose (hvit pilspisser) etter 72 h i kultur, mens GFP-positive INs opphold sunn (hvit pil), som eksemplifisert i photomicrographs i C-C'' '. Sammenligning mobilnettet apoptose er nesten helt borte fra den tynne cryosection fra en perfused dyr (D-D'' '). Skalere barer: 250 µm (AB) og 15 µm (C-D'' '). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Organotypic skiver av mus hjernen embryoer og forstørring photomicrographs av electroporated interneurons (INs). A. en organotypic stykke kultur fra en Dlx5/6grobunn; RCEEGFP mus hjernen (der alle modulene er grønne) electroporated med en Dlx5/6::shRNAforvrengt-IRES-TdTomato plasmider. Stykket ble løst med 4% PFA etter 72 h i kultur og immunostained for GFP og mCherry. Electroporated INs ble fotografert i 3D (50-60 µm tykke z-stabler med optisk deler tatt hver 0,5 µm) ved hjelp av en AC confocal mikroskop utstyrt med en 63 x / 1.3 NA oljeobjektiv. Tillegg migrere tangentially i sonen sub ventrikkel av det dorsal pallium er lett identifiserbare (rød, åpne pil). D og M angir dorso-ventrale og latero-mediale akser, henholdsvis. B. en representant organotypic skive kultur fra en wildtype (WT) fosteret electoporated med kontroll Dlx5/6::shRNAforvrengt-IRES-TdTomato plasmider, fast på 72 h og immunostained for mCherry bare. Electroporated INs (rød) sett vandring på ryggen mot kortikale platen. Electroporated INs identifiseres av deres co uttrykk for TdTomato og EGFP i Dlx5/6grobunn; RCEEGFP mus (C-D), eller ved deres uttrykk for TdTomato bare i WT mus (Eh), og deres typiske morfologi, dvs en oval celle kroppen, en forgrenet ledende prosess (hvit pilspisser, D-H), en sporadiske etterfølgende prosessen (hvit pil, C-D) og en annen hevelse av ledende boliger centrosome før nucleokinesis (hvit stjerne i C-C' og G). Skalere barer: 250 µm (A-B) og 25 µm (C-H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Time-lapse live-avbildning av electroporated moduler i organotypic skiver kultivert for 48 h. INs-electroporated på e13.5 med en eksperimentell plasmider uttrykke TdTomato kassetten og en shRNA rettet mot en genet av interesse er sett i tangentiell migrasjon i en organotypic hjernen stykke fra en Dlx5/6grobunn; RCEEGFP mus embryoet etter 48 h kultur (A, hvite firkanten). B, den samme electroporated i (hvite firkanten) er sett under nucleokinesis, under overføring tangentially i cortex, dvs parallelt pial overflaten, og følges i time-lapse imaging hver 3 minutter 8 h med en 20 x / 0,85 NA luft mål (forstørret bokser, C-F). Nevron viser først en langstrakt celle kroppen (åpne pil) under nucleokinesis (C), og en etterfølgende prosess (hvit pil) og en forgrenet ledende prosess (hvit pilspisser). Etter 3 timer med live bildebehandling, nucleokinesis er fullført, etterfølgende prosessen har trukket og ledende prosessen utvider to lange grener (D, hvit pilspisser). Etter 5 h 30 min, en ledende prosessen grenen har trukket (hvit pilspisser) og Nevron celle kroppen (åpne pil) har flyttet frem 10 µm (E). Endelig, etter 8 h for imaging, overføring er midlertidig, Nevron har utvidet sin ledende prosessen igjen og en etterfølgende prosessen har vært (hvit pil), men kjernen (åpne pil) er ennå ikke flyttet frem (F). Skalere barer: 250 µm (A), 70 µm (B) og 30 µm (C-F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: tidsinnstilt bildebehandling ins avledet fra en MGE explant kultivert for 48 h. Moduler er sett utenfor en MGE explant Hentet fra en Nkx2.1grobunn; RCEEGFP mus (i som alle MGE-avledet INs express eGFP) electroporated med CMV::mCherry-LifeAct-7 plasmider på e13.5, ved hjelp av metoden tilpasset fra Myers et al. 201353 og schematized i figur 1 c, og kultivert for 48 h (A). INs var visualisert bruker time-lapse live bildebehandling for 5 h (B-E). I dette eksemplet i co uttrykke eGFP og LifeAct er sett først under nucleokinesis (åpne pil) og strekker seg to ledende prosessen grener (hvit pilspisser; B). dette i fullfører nucleokinesis etter 1 h (se pilen åpne) som celle kroppen har gått fremover og en etterfølgende prosess har dukket opp på baksiden av celle kroppen (hvit pil), og fortsatt viser en ledende prosessen med to avdelinger (hvit pilspisser; C). en andre nucleokinesis er i gang etter 2 h 30 min (åpne piler) og inn er nå utstyrt med to ledende prosesser fra celle kroppen og en lenger etterfølgende prosess (hvite pilen. D). til slutt, etter 5 h, inn trekker en neurite mens translocating centrosome i den gjenværende ledende prosess grenen (hvitt pilhode) i forberedelsene til et tredje nucleokinesis, med en etterfølgende prosess (hvit pil) fortsatt finnes på baksiden av celle kroppen (E). Skalere barer: 70 µm (A) og 20 µm (B-E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: høyoppløselig time-lapse imaging av utgangen remodeling i moduler fra en MGE explant kultivert for 48 h. A. Et organotypic stykke fra en Nkx2.1grobunn; RCEEGFP mus hjernen fast på e15.5, med Alexa-594 Phalloidin, slik at effekten av trådformede utgangen. Moduler er avbildet med en 63 x / 1.3 NA oljeobjektiv på AC confocal mikroskop. I sunn INs, trådformede begrepsordbok sett Kopping baksiden av celle kroppen etter tilbakekallingen av etterfølgende prosessen etter nucleokinesis (hvit pil, A'-A'' '). B. en MGE explant er oppnådd som ovenfor fra en Nkx2.1grobunn; RCEEGFP mus hjernen bærer en målrettet sletting av en genet av interesse og electroporated med en plasmider uttrykke mCherry-Lifeact-7 under kontroll av CMV arrangøren. Tidsinnstilt live bildebehandling utføres etter 48 timer av kultur og electroporated INs følges hver 3 minutter for 3t bruker en 40 x / 0,85 luft mål. Aktive ombygging av utgangen cytoskeleton oppstår i inn transfekterte med LifeAct, som eksemplifisert ved flytting av rød (hvit i svart-hvitt bilder) fluorescerende prikker i ledende prosessen og vekst koner (hvit pilspisser) og på baksiden av den celle kroppen under nucleokinesis (B-B'' ', hvite piler). Skalere barer: 7 µm (A-A'' ') og 10 µm (B-B'' '). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen gir vi en pålitelig metode for å utføre ex utero electroporation musen MGE på e13.5 og for generering av organotypic kulturer av embryonale hjernen skiver. Selv om i vitro metoder, for eksempel Boyden kammeret analysen, er relativt enkle å utføre, og kan brukes til å vurdere bestemte rollene som ulike gener og proteiner uten forstyrrelser av andre faktorer, utelukker de etterforskningen av IN migrasjon dynamics med hensyn til retningen og overføring bane25. MGE explants representerer en nyttig måte å studere dynamisk cellen cytoskjelett endringene skjer under i migrasjon, viser vi her, men de er blottet for mest endogene signaler og ofte krever tillegg av veiledning signaler å fremme neuronal overføring (selv om dette forbedret når MGE explants er kultivert på kortikale mater lag)25,54. Likevel kan analyser basert på MGE explants ikke oppdage Implikasjonen av molekylære stikkordene involvert i mer subtil mekanismer som de guiding bestemt retningen eller overføring banen til INs29. Dette problemet ble til slutt circumvented ved i utero electroporation25, som tillater spesifikk merkingen av MGE-avledet INs migrering i sine opprinnelige omgivelser13,29,41. Men denne teknikken er dyktighet-utfordrende, på grunn av de kirurgiske prosedyrene som er involvert, og sin avkastning er begrenset av lav overlevelse embryoer og det faktum at MGE er vanskelig å målrette i utero, ofte krever bruk av mangfoldig søppel til nå betydning55. Dermed gir ex utero electroporation av MGE etterfulgt av organotypic kultur av mus hjernen embryo en rimelig, tidseffektive og pålitelig metode for å undersøke migrasjon dynamikken og morfologi av MGE-avledet moduler i deres naturlige miljø, mens omgå de kirurgiske prosedyrene i utero electroporation og behovet for veiledning pekepinner i MGE explants. Dessuten, kan denne teknikken en enklere tilgang til MGE, som kan målrettes etter direkte apposing den positive elektroden under halsen og den negative på toppen av hodet, en konfigurasjon vanskeligere å vedta i utero. Alternativt, MGE kan injiseres focally og electroporated rett etter genererer organotypic skiver13,25,29, men som teknikken har vist seg vanskeligere og mindre effektive i våre hender enn protokollen som beskrevet her. Ved å følge fremgangsmåten som er beskrevet i denne artikkelen, vil man få 50-100 electroporated MGE-avledet INs per organotypic skive, 5-20 som vil bli sett migrere tangentially av MGE etter 72 h. Transfected moduler kan visualiseres live med tidsinnstilt bildebehandling eller fotografert og rekonstruert etter fiksering og immunohistochemical merking.

Protokollen beskrevet her var optimalisert for å studere i migrasjon ex vivo og ble inspirert av ulike publiserte protokoller som beskriver i utero electroporation MGE-avledet INs, ex vivo MGE injeksjon og electroporation, eller generering av kronisk organotypic hjernen stykke kulturer36,38,39,42,43,56,57,58. Vår tilnærming begrenser potensiell fare for MGE progenitors ved hjelp av lavere puls intensiteten (40 V) og intraventricular plasmider injeksjoner i stedet for intra MGE injeksjoner med høy spenning pulser (100 V), som beskrevet andre steder39,56 ,57,58. Videre, mens andre bruker en kombinasjon av penicillin, streptomycin og gentamycin for å hindre bakteriell forurensning39,56,57,58, har vi valgt for å unngå antibiotika i vår kultur medium siden de kan teoretisk påvirke i migrasjon. Spesielt penicillin er en antagonist av GABAA reseptor59,60, og GABAA reseptor aktivisering aktiverer og senere stopper overføring avhengig av intracellulær klorid graderinger og KCC2 uttrykk i forskjellige faser av i migrasjon61. Imidlertid kan bruker forskjellige forholdsregler i gjeldende protokollen, forurensning effektivt unngås selv i fravær av antibiotika.

Til tross for effektiviteten av denne tilnærmingen i våre hender har ex utero electroporation også sine ulemper. Mens gir et naturlig tredimensjonalt miljø for celler overføre, kan det være vanskelig å utføre farmakologiske analyser i organotypic sektorene i sammenheng med i overføringen. Faktisk migrering av MGE-avledet moduler det meste avhengig ekstracellulære stikkordene2,13,19 og anvendelse av farmakologiske hemmere eller aktivator på organotypic skiver tillater ikke den nøyaktige dissosiasjon celle autonome effekter fra global effekter på helse skive eller aktivitet. For slike eksperimenter, kan MGE explants vokst blandet dissosiert kortikale celler være å foretrekke fremfor organotypic skive kulturer, siden INs utenfor explant kan være lettere isolert og utsatt selektivt bestemt forbindelser62. Videre, selv om ex utero electroporation er enklere å utføre enn i utero electroporation, kan det likevel være teknisk utfordrende i embryonale alderen illustrert her gitt de små og skjøre delstaten embryonale hjerner på E13.5. etterforskere må noen forsøk å effektivt pakke electroporated hjernen på e13.5 uten å skade hjernen overflaten. Dessuten, i motsetning til postnatal skiver holdes embryonale organotypic skiver ikke i kultur over lengre tid. Selv om embryonale organotypic skive kulturer kan bli holdt i minst 7 dager i vitro63, dette var ikke kombinert med electroporation og eksperimenter beskrevet her har blitt testet for opp til 3 dager i vitro med pålitelige resultater i våre hender. Derfor utføre etterforskere optimalisering tester på forhånd hvis lengre inkubasjon ganger er nødvendig. Videre etterforskning av utviklingen på slutten embryonale eller tidlig postnatal stadier er ikke anbefalt med denne teknikken når du bruker e13.5 embryo25, men kan oppnås med i utero electroporation, hvor vellykket electroporated embryo settes inn i livmor hulrom og kan stå å være født og analyseres på senere stadier21,64. Til slutt, ex utero electroporation etterfulgt av organotypic skive kulturer gir analyse av både morfologi og migrasjon dynamikken i utvikle moduler. Men som det har tidligere påpekt for den i utero electroporation teknikk36, ex utero electroporations gi 50-100 electoporated celler per hjernen skive og er dermed ikke egnet for befolkningen analyse. Dette er bedre utført i dyremodeller bærer enten en full eller betinget overstrekingen, eller banke i genet av interesse. Når slike modeller kan effektivt brukes til å generere organotypic skive kulturer eller MGE explants for å se faktiske dynamikken i i migrasjon, som vist her (se figur 5 og figur 6).

Mange av trinnene i denne protokollen skal utføres nøye for å oppnå optimale resultater. For eksempel er det opprinnelige at alle trinnene utføres under strenge sterile forhold som forurensning kan skje ganske lett. Hansker og instrumenter brukes utenfor biosikkerhet regjering bør sprayes med 70% etanol ofte under hele prosedyren. I tillegg løsninger som kultur medier og kunstig Cerebrospinalvæske bør holdes sterile og kaldt (4 ° C), og laget fersk hver 2-3 uker. Hvis etiketten MGE-avledet INs mer spesifikt, plasmider som skal brukes i slike eksperimenter skal klones under kontroll av en IN-spesifikke promoter (ex: Dlx5/649, Lhx665), i stedet for bare stole på den anatomiske målretting av MGE. Generering av organotypic skiver krever hjernen til å overleve. Dermed for å bevare cell helse og overlevelse, bør dette eksperimentet gjennomføres på mindre enn 3 timer fra øyeblikket at embryoene hentes før organotypic skiver er satt inn i kultur. For tiden-effektivitet, kan kultur plater pre fylt med hjemmelaget kultur medium like før eksperimentet og sett i 37 ° C celle kultur inkubator til bruk. Videre bør hjernen være omhyggelig dissekert av skallen uten skade kortikale overflaten for å oppnå riktig bygge i agarose løsningen og påfølgende vibratome-skjæring. For eksempel kan skade kortikale overflaten, selv minimal, resultere i brøkdel av delene for 250 µm tykke fra omkringliggende agarose gel eller nedbrytning av inndelingene under vibratome snitting. For neuronal overlevelse, det er også viktig at agarose løsning temperaturen er nær 42 ° C, som temperaturer føre til vev skade og celle død, mens lavere temperaturer vil utelukke riktig innebygging av hjernen (eller skade den under den innebygging prosessen). En gang i kultur, for å unngå andre forurensning kilder, skiver bør ikke endres før de overføres til mikroskopet for bildebehandling. Disse trinnene bør utføres i et sterilisert miljø og oppmerksomhet må betales ikke å forurense platene etter disse manipulasjoner, spesielt hvis de skal tilbakeføres til kultur for etterfølgende re-tenkelig. Til slutt, vi anbefaler ikke rehabilitering en DNA aliquot blandet med lasting fargestoff fra forrige eksperimenter for fremtidig bruk som observerte vi en betydelig reduksjon i avkastningen av electroporated neurons med slikt materiale.

Avslutningsvis ex utero electroporation og organotypic stykke kultur protokollen beskrevet ovenfor gir bestemte merkingen av MGE-avledet moduler på én celle nivå og kan brukes til å manipulere genetisk bestemte molekylær stier til studere deres rolle i å regulere morfologiske endringene og migrasjon dynamikken i tangentially migrere INs. Denne metoden gir rask og rimelig tidlig funksjonelle etterforskningen av Roman kandidat gener identifisert gjennom enkeltcelle RNA sekvensering av trekkfugler INs66,67 eller gjennom neste generasjons sekvensering av pasienter med neurodevelopmental lidelser68,69,70. Denne teknikken er mye brukt til å studere migrasjon i andre celle populasjoner, inkludert pyramideformet celler i den cortex og hippocampus70,71,72,73. Når mestret, kan det potensielt brukes til resirkulering og handel med membran proteiner, som reseptorer og kanalene benytter GFP-merket proteiner; aktivering av spesifikke mobilnettet signalering overlapper med biosensors74; eller overvåking og manipulering av cellulære aktiviteten med kalsium imaging koplet til optogenetics i kortikale moduler, men også i andre hjernen områder, for eksempel hippocampus, amygdala eller selv striatum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre. Synspunktene uttrykt her representerer ikke nødvendigvis synspunktene til helseministeren eller regjeringen i Canada.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av opererer tilskudd fra Savoy Foundation og kur epilepsi grunnlaget og av tilskudd fra det kanadiske stiftelsen for innovasjon E.R (AC confocal mikroskop) og G.H (spinning disk AC confocal mikroskop). Er mottar en career-pris fra de Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) samt fra den kanadiske institutter for Health Research (CIHR; Ung forsker pris). G.H. er seniorforsker i FRQ-S. L.E er Steriade-Savoy postdoktor trening pris fra Savoy Foundation, CHU Sainte-Justine Foundation postdoktor trening award og FRQ-S postdoktor training award, i samarbeid med stiftelsen av stjerner. Dette prosjektet har blitt gjort mulig av hjernen Canada gjennom Canada hjernen Research Fund, med økonomisk støtte av Health Canada, tildeles Le

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. 649325 (2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562, (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71, (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38, (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44, (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28, (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69, (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30, (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25, (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2), a001834 (2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30, (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40, (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23, (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2, (2), e00031 (2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63, (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120, (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165, (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109, (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7, (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25, (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219, (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25, (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22, (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34, (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26, (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15, (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97, (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32, (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27, (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25, (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59, (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20, (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30, (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118, (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92, (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34, (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28, (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19, (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129, (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23, (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496, (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15, (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7, (1), 4897 (2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27, (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93, (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23, (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501, (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33, (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461, (7260), 99-103 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics