Ex Utero Elektroporation og Organotypic skive kulturer af embryonale mus hjerner for Live-Imaging af migrerer GABAergic Interneurons

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her, giver vi en billig og pålidelig metode til at generere electroporated hjerne organotypic skive kulturer fra mus embryoner egnet til Konfokal mikroskopi og live imaging teknikker.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

GABAergic interneurons (INs) er kritiske komponenter i neuronal netværk, at drive kognition og adfærd. INs bestemt til at udfylde cortex migrere tangentielt fra deres oprindelsessted i den ventrale telencephalon (herunder fra de mediale og caudale ganglionære eminences (MGE, CGE)) til den dorsale kortikale plade som svar på en række af indre og ydre stikord. Forskellige metoder er blevet udviklet over årene genetisk manipulere bestemte veje og undersøge hvordan de regulerer de dynamiske cytoskeletal forandringer er nødvendige for korrekt i migration. In utero elektroporation har været flittigt brugt til at studere effekten af gen undertrykkelse eller overekspression i specifikke IN undertyper mens vurderingen af indvirkningen på morfologi og endelige holdning. Men mens denne tilgang er let bruges til at ændre radialt overflytter pyramideformet celler, det mere teknisk udfordrende når målretning INs. In utero elektroporation genererer et lavt udbytte givet nedsat overlevelsesrater for hvalpe når elektroporation udføres før e14.5, som det er sædvane, når man studerer MGE-afledte INs. I en alternativ tilgang, MGE explants giver nem adgang til MGE og lette billeddannelse af genetisk modificerede INs. Men i disse explants, INs overflyttes til en kunstig matrix, blottet for endogene vejledning stikord og thalamic indgange. Dette foranledigede os til at optimere en metode hvor INs kan migrere i en mere naturalistisk miljø, samtidig med at omgå de tekniske udfordringer i utero tilgange. I dette papir beskriver vi kombinationen af ex utero elektroporation af embryonale mus hjerner efterfulgt af organotypic skive kulturer let spore, billede og rekonstruere genetisk modificerede INs migrere langs deres naturlige stier som reaktion på endogene stikord. Denne tilgang giver mulighed for kvantificering af de dynamiske aspekter af migration med time-lapse Konfokal imaging, samt en detaljeret analyse af forskellige morfologiske parametre ved hjælp af neuronal rekonstruktioner på fast immunolabeled væv.

Introduction

Kortikale GABAergic interneurons (INs) er forskellige med hensyn til deres biokemiske egenskaber, fysiologiske egenskaber og tilslutningsmuligheder, og de mægle forskellige funktioner i modne netværk1,2,3 ,4,5. Specifikationen af forskellige undertyper af kortikale INs er tæt reguleret gennem genetisk cascades, der er blevet grundigt undersøgt1,2. Størstedelen (70%) af kortikale GABAergic INs stammer fra stamfaderen i den mediale ganglionære eminence (MGE), en ventrally placeret embryonale struktur, og skal overflytte over relativt lange afstande for at nå den kortikale plade1, 2 , 6. mens kortikale pyramideformet celler vandrer radialt fra den ventrikulære zone (VZ) til kortikale pladen langs den radiale glia stillads, tangerer migration af INs, som ikke er knyttet til sådan et stillads, kræver en række iboende og extrinsiske stikord at tiltrække overflytter neuroner mod den kortikale plade, mens vejlede dem fra ikke-kortikale strukturer2,7,8. Efter spændende cellecyklus, INs er frastødt fra MGE af kemo-frastødende stikord udtrykt i VZ af MGE, der udløser tangential migration mod kortikale plade9,10. Migrere INs undgå striatum ved hjælp af forskellige frastødende stikord11 og, efter at nå det kortikale plade, de skifter fra en tangent til en radial migration og nå deres endelige laminar holdning, dels som reaktion på signaler fra pyramide celler12 og andre cellulære populationer13. Migration af INs, som for andre neuronal befolkningsgrupper, indebærer forskellige dynamiske morfologiske ændringer for at tillade den faktiske bevægelse af neuron. Denne såkaldte neuronal bevægelse er kendetegnet ved gentagne cyklusser af tre successive trin: strækning af en førende proces, en aktiv anterograd bevægelse af kernen (nucleokinesis), og sammentrækning af den efterfølgende proces14. I migration er reguleret af talrige indre og ydre stikord, der drev den forgrening og aktive remodellering af den førende proces til at guide INs i den rigtige retning, bestemme retningen og hastigheden af migration14,15 ,16.

Determinanterne regulering af kortikale i migration er blevet grundigt undersøgt i de seneste år1,2,7,17,18,19,20, og forstyrrelser i nogle af disse molekylære aktører har været postuleret for at føre til forstyrrelser i nervesystemets, såsom pediatric refraktær epilepsi eller autisme spektrum forstyrrelser1,2,21, 22 , 23 , 24. derfor udvikling for forskellige in vitro- og i vivo tilgange har været forfulgt at betydeligt fremme vores evne til at studere denne dynamiske proces, som tidligere gennemgået25. In vitro metoder, herunder Boyden kammer assay og stribe valg Assay, giver den hurtigste og mest reproducerbare middel til vurdering af krav og celle-selvstændig effekt af specifikke gener eller proteiner under neuronal migration, uden indflydelse andre faktorer25. Disse assays er især nyttig, når kombineret med live imaging8,26,27. Med disse teknikker, INs er nemt hentet fra e13.5 MGE og isoleret af enzymatiske og mekaniske dissociation, hvorefter forskellige signaling veje og vejledning stikord kan undersøges, som illustreret tidligere8,28 . Men disse assays finder sted i en kunstig ekstracellulære matrix i mangel af tre-dimensionelle væv arkitektur, som kan ændre neuronal adfærd og celle egenskaber, der potentielt påvirker celle migration og/eller overlevelse25. For at omgå disse begrænsninger, er ex vivo MGE explants blevet udviklet som et alternativ redskab til at kvantificere de dynamiske morfologiske forandringer under migrering sammen med parametre såsom hastighed og retning14, 29. Generere MGE explants er relativt ligetil, og har været udførligt beskrevet andetsteds30. Det indebærer plating af et lille uddrag af MGE på en éncellelag af blandet kortikal celler eller i en blanding af matrigel og kollagen i overværelse af tiltrækkende eller frastødende stikord25, selvom sidstnævnte er valgfri31. MGE explants giver mulighed for høj opløsning imaging af tyndt mærket celler, forenkle undersøgelse af intracellulære processer, såsom cytoskeletal remodeling under førende proces forgrening, som vist tidligere32,33 ,34 , og i den foreliggende undersøgelse. MGE explants har været anvendt med succes til at vurdere dynamiske cytoskeletal ændringer under i migration i et 2D-miljø, for eksempel efter specifik farmakologisk eller kemotaktisk manipulationer (Se for eksempel Tielens et al. 201633) . Men med denne tilgang, INs migrere inden for en kunstig matrix, og dette kan ændre i adfærd og reproducerbarhed og betydningen af de eksperimentelle resultater.

Derimod i utero elektroporation muliggør genmanipulation af INs i deres oprindelige miljø og er en meget anvendt metode til hurtigt og effektivt vurdere virkningen af gevinst og tab af genfunktioner mens omgå begrænsningerne i dyre og tidskrævende knockout og knock-i strategier25,35. In utero elektroporation kan være forudindtaget mod i stamfaderen ved hjælp af celle type specifikke initiativtagere og ved at placere elektroder over ventromedial strukturer, herunder MGE36. Derudover i utero elektroporation giver mulighed for rettidig udtryk for eksperimenterende konstruktioner inden for 1-2 dage, i forhold til de 7-10 dage kræves for at konstruere udtryk ved hjælp af virale vektorer25. Men i utero elektroporation af i ophavene har tendens til at være lav-udbytte. Faktisk, selv om pyramide celle stamfaderen beliggende i den dorsale ventrikulære zone kan være effektivt transfekteret bruger i utero elektroporation, rettet mod mere ventrally placeret strukturer, såsom MGE, mere teknisk udfordrende, især i små e13.5 reducerer embryoner, og den høje sats af embryonale dødelighed yderligere experimental udbytte25.

For at omgå nogle af de tekniske begrænsninger i forbindelse med in vitro- MGE explant eksperimenter og i vivo i livmoderen elektroporation, ex vivo organotypic skive kulturer har været udviklede8,37, 38,39. Hjernen organotypic skive kulturer tilbud fordelen, at efterligne i vivo betingelser, mens mindre dyre og tidskrævende end generere dyret modeller25. Ja, disse præparater tillader en nem adgang til MGE, sammen med den specifikke visualisering af INs, og kan kombineres med fokale elektroporation at undersøge specifikke molekylære veje i INs overflytning i en mere fysiologisk miljø8 , 39 , 40 , 41. vi har derfor optimeret en tilgang til organotypic kulturer38, som vi kombinerede med ex utero elektroporation og time-lapse Konfokal imaging, at yderligere vurdere de morfologiske og dynamisk proces forekommer under tangential migration af MGE-INs. Denne protokol blev tilpasset og optimeret fra andre, der har brugt ex utero eller i utero hjernen elektroporation og organotypic skive kulturer for at studere migration af pyramideformet celler42,43 og kortikale INs36,39,44. Specifikt, mus embryoner er halshugget og MGE er electroporated ex vivo efter intraventrikulært injektion af de eksperimentelle plasmider, giver mulighed for mere effektiv og præcis målretning af MGE stamfaderen end hvad der kan opnås med i utero elektroporation. Hjerner er derefter uddraget og sectioned i hele hjernen koronale skiver, der kan dyrkes i et par dage, således at kontinuerlig sporing og imaging transfekteret ins. Denne tilgang labels typisk 5-20 tangentielt overflytter INs pr. hjerne skive, minimere antallet af eksperimentelle gentagelser kræves for at opnå Statistisk signifikans, mens mærkning en tilstrækkelig sparsomme neuronal befolkning for at sikre nem adskillelse af individuelle neuroner for genopbygning og fine morfologiske vurdering. Desuden, i forhold til MGE explants, organotypic kulturer sikre at overflytte INs er udsat for et mere naturligt miljø, herunder lokalt udskilles kemokiner og indgange fra thalamic afferenter. Denne tilgang er derfor velegnet til at kvantificere direktionalitet og vandrende sti vedtog transfekteret INs, mens der tilbyder tilstrækkelig anatomiske detaljer at tillade karakterisering af finere dynamiske processer som førende proces forgrening, nucleokinesis og afsluttende proces sammentrækning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter, der involverer dyr blev godkendt af Comité Institutionnel des macarons Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) på CHU Sainte-Justine Research Center og blev gennemført i overensstemmelse med den canadiske Rådet på Animal Care guide til Pleje og brugen af forsøgsdyr (udg. 2).

Protokollen beskrevet her var optimeret til elektroporation embryoner på embryonale dag (e) 13,5, på et tidspunkt når MGE-afledte INs er aktivt genereres, før peak af CGE-afledte INs produktion45,46. Endvidere, for at bias elektroporation mod GABAergic INs, bruger vi en promotor selektivt udtrykt i INs (f.eks Dlx5/6 promotor med sin minimal enhancer)47.

1. forberedelse af løsninger for elektroporation og Organotypic skive kulturer

  1. Forberede 125 mL sterilt næringssubstratet.
    1. Måle 125 mL af regelmæssige neuron-specifik næringssubstratet (Se Tabel af materialer til formulering) i en steriliseret flaske i en tidligere UV-steriliseret biosikkerhed kabinet sprøjtes med 70% ethanol. Tilføje 2,25 mL 50 x serumfrit neuron-specifik supplement, 1,75 mL 200mM glutamin (endelig koncentration på 0,5 mM) og 6,25 mL af varme-inaktiverede hest serum tidligere aliquoted under sterile forhold. Blandes grundigt, alikvot i 15 mL sterilt koniske rør, og opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: Forberedt dyrkningsmediet kan opbevares i op til 3 uger ved 4 ° C.
    2. Opdele en 100 X stamopløsning af Botteinstein's N-2 formulering48 i 150 µL delprøver under sterile forhold og fryse ved-20 ° C indtil brug.
  2. Forberede 1 L af sterile kunstige cerebrospinalvæske (ACSF).
    1. Måle 800 mL destilleret vand i et 1 L bæger. Tilføj 25.67 g saccharose, 5,08 g natriumchlorid (NaCl), 2.18 g natriumbicarbonat (NaHCO3), 1,80 g glucose, 0,19 g kaliumchlorid (KCl), 0,15 g af monobasic vandfri natrium fosfat (NaH2PO4), 1 mL 1 M stock CaCl2 .2H2O og 2 mL 1 M lager MgSO4.7H2O. rør til at opløse ved stuetemperatur. Der tilsættes destilleret vand for at nå et samlet volumen på 1 L.
    2. Brug et 0,22 µm filter, filtreres løsningen i en steril flaske i en steriliseret biosikkerhed kabinet og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
  3. Forberede en frisk løsning af 4% Agarosen i ACSF før hvert forsøg.
    1. Mål 25 mL af tidligere forberedt ACSF i et 50 mL sterilt koniske rør og tilføje 1 g af lav-smeltende punkt agarosegelelektroforese.
    2. Varme i 45 s i en mikrobølgeovn. For at undgå at spilde, afbryde varme hver 3-4 s når kogende starter, skal du åbne rør for at lade presset ud, lukke den igen og agitere manuelt for at blande agarosegelelektroforese. Gentag indtil opløsningen Agarosen er homogen. Holde Agarosen løsning på 42 ° C under den resterende del af eksperiment at undgå størkning.
      Bemærk: Højere temperaturer vil skade hjernen væv.

2. forberedelse af plasmider til injektion

  1. Trække et glas mikroinjektion pipette
    1. Angiv mikropipette aftrækker med de korrekte parametre, sikre glas kapillarrør i den angivne plads og sørg for det er centreret med glødetråden.
    2. Tryk på knappen træk.
    3. Fjern forsigtigt de nylavede mikroinjektion pipetter fra varme aftrækker og sted i en boks eller ren petriskål indtil videre anvendelse til at undgå at beskadige spidsen.
  2. Set-up biosikkerhed kabinet med alle instrumenterne behov for dette eksperiment (Se figur 1A), generøst spray alle instrumenter i biosikkerhed kabinet med 70% ethanol og sterilisere de instrumenter og miljø med UV-lys for 15-20 min.
  3. Under trinnet sterilisation tø plasmider på is (4 ° C).
  4. Foranstaltning 10 µL plasmid fra en stamopløsning (4 µg/µL) i en ren 1,5 mL-centrifugerør. Tilføje 0,01% af hurtigt grøn FCF. Bland forsigtigt, spin kort og holde på køl indtil brug.
    Bemærk: Maxi-prep DNA skal udarbejdes ifølge producentens protokollen benytter en endotoxin-fri maxi-prep kit. DNA kan oploeses i TE buffer eller nukleasen-fri H2O og forberedelse af plasmid med farvestof løsning kan, men ikke ikke skal udføres under sterile forhold. Plasmider fra Maxi-prep bør være aliquoted at undgå flere fryse-tø cykler. Aliquoted plasmider bør være blandet med farvestoffet ikke mere at 2 h før brug og må ikke genfryses til yderligere brug.
  5. Efter sterilisation, forberede nano-injektor som følger.
    1. Vælg en af de tidligere parat glas mikroinjektion pipette opbevares i en ren boks eller petriskål og brug små pincetter til at klippe spidsen af pipetten på en skrå måde at opnå en ydre diameter på cirka 15 µm.
      Bemærk: Den udvendige diameter givet her er en omtrentlig foranstaltning til at give brugeren en idé om, hvad vi bruger i vores eksperimenter og er blevet optimeret for at lette piercing af kraniet for plasmid injektion uden at beskadige hjernen, mens gør det muligt for væsken lastning og frigivelse af DNA. Den ydre diameter kan måles ved at kigge på klippe spidsen af glas mikroinjektion pipette apposed til en micrometric skalalinjen under lysfelt mikroskop.
    2. Bruge en sprøjte til at fylde mikropipette med mineralsk olie fra sin unpulled ende (til at udvise al luft).
    3. Indsæt fyldt glas mikropipette i nano-injektor ved at følge producentens anvisninger.
    4. Tom 2/3rds af glas mikropipette (holde nok olie til at forhindre luft post).
  6. Omhyggeligt indsætte den forberedte mikropipette i rør indeholdende plasmid/dye-løsning og fylde glas mikropipette med plasmid/dye-løsning.

3. samling af musen embryoner fra gravide kvinder

  1. Overvåge avl hunner dagligt for at vurdere for vaginal plugging, helst på samme tid dagligt (tidligt om eftermiddagen). Dag e0.5 svarer til den første dag, når en vaginal plug er observeret.
    Bemærk: Eksperimenter beskrevet her kan være udført i wild-type mus. Dog, at lette identifikationen af MGE og mærke alle GABAergic INs (eller bestemte sub sæt såsom MGE-afledte INs) transgene dyr kan bruges (fx: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre med en Cre-reporter allel, etc.47,49). I denne situation bør de eksperimentelle plasmid injiceres express et andet fluorophore (for eksempel mCherry eller TdTomato) for at tillade visualisering af de transfected deltagende (gule) der kan sammenlignes med ikke-transfekteret INs (grøn).
  2. Ofre kvinde på embryonale dag e13.5, ved hals dislokation.
    Bemærk: Bedøvelsesmiddel agenter givet på tidspunktet af ofre kan påvirke i migration og overlevelse50,51 og bør undgås.
  3. Indsamle embryoner af c-sektion som følger.
    1. Generøst spray det kvindelige underliv med 70% ethanol. Træk abdominal huden op med et par af steriliseret pincet, og med anden hånden, brug steriliseret kirurgisk saks til at skære huden fra underlivet.
    2. Med et andet par af steriliseret pincet og saks, trække den abdominale fascia op og klippe det samtidig omhyggeligt undgå livmoderen.
    3. Ved hjælp af et tredje par steriliseret pincet og saks, trække de uterine horn og skære dem ud af bækken hulrummet. Placer dissekeret uterin horn i en steril 60-mm petriskål fyldt med neurale-baserede næringssubstratet suppleret med aminosyrer, vitaminer og uorganiske salte (Se Tabel af materialer til kommercielt tilgængelige produkt).
  4. I en steril biosikkerhed kabinet, skal du bruge to par fine pincet, (en i hver hånd) at dissekere embryoner fra moderkagen og isolere hovedet ved halshugning.
  5. Facet-cut spidsen af en steril 3 mL plastik overførsel pipette, Opsug hovedet og overføre dem i en ny steril 60-mm petriskål lagdelt med størknede sort voks og fyldt med den samme neurale-baserede suppleret næringssubstratet som ovenfor.
    Bemærk: Dette trin minimerer overførsel af forurenende stoffer (mus hår, blod). Den sorte voks bruges til at stabilisere hovedet under dissektion. Kultur medier ikke behøver at blive iltet under disse procedurer.

4. intraventrikulært Plasmid injektioner og Ex Vivo elektroporation i MGE

Bemærk: Følgende trin skal udføres under sterile forhold i den tidligere forberedt biosikkerhed kabinet.

  1. Sted petriskål 60-mm lag med sort voks og indeholder den hoveder i neurale-baserede suppleret næringssubstratet under kikkerter i biosikkerhed kabinet.
  2. Stabilisere hoved, den rostralt del mod højre, med fine pincet med venstre hånd og bruge nano-injektor i højre hånd til at tilføre den højre laterale ventrikel 1-2 µL plasmid/dye-opløsning.
    Bemærk: Co udtryk eksperimenter kan være udført af co-electroporating en redning plasmid og et udtryk for shRNA plasmid ved at blande begge plasmider i equimolar koncentrationer.
  3. Electroporate indsprøjtet hjernen.
    1. Placere hovedet mellem elektroderne med den negative elektrode placeret dorsalt og parallel til hovedet og den positive elektrode mod den ventrale side af hovedet for at målrette MGE.
    2. Når elektroderne er godt placeret, levere 4 firkant pulser af 40 V for 50 ms på 500 ms Inter puls intervaller.
    3. Fjern eventuelle resterende væv fra elektroderne ved hjælp af pincet allerede placeret i biosikkerhed kabinet.
      Bemærk: Disse parametre er blevet optimeret specielt til electroporator vores forsøgsdyr. Vi anbefaler, at brugerne udfører optimering test på forhånd hvis du bruger en anden type af electroporator.
    4. Gentag trin 4.1 til 4.3 for alle resterende hjerner.
      Bemærk: Selv om denne protokol beskriver manipulationer kræves til en hjerne, det er muligt at injicere op til 4 hjerner sekventielt før electroporating hver hjerne, hvilket øger udbyttet. Denne strategi er særligt fordelagtige, når 2 eller flere forskellige plasmider er sprøjtet sekventielt (f.eks. kontrol eller eksperimenterende plasmid) under samme eksperimentet (giver mulighed for sammenligning mellem søskende). Det er derudover muligt at injicere og electroporate samtidig begge sider af hjernen til at øge udbyttet, ved at placere elektroder helt parallel med overfladen, hjernen.

5. hjerne dissektion og Organotypic skive kulturer

  1. Mens stadig manipulere i det sterile miljø for Biosikkerhed kabinet, dissekere hjernen ud af kraniet.
    1. Stabilisere hovedet på lag af sort voks ved at indsætte en nål i hvert øje mens omhyggeligt undgår hjernen.
    2. Brug et par fine pincet til at holde den venstre side af halsen og et andet par fine pincet til at rive huden fra kraniet fra tilbage til forsiden.
    3. Mens du holder hovedet lateralt med pincet i den ene hånd, skal du bruge et andet par pincet i anden hånden til at omhyggeligt skæres kraniet på niveauet af hjernestammen og træk forsigtigt kraniet. Med hver pincet, skåret kraniet i sagittale flyet (midterlinjen) mod fronten, og derefter incise lateralt for at befri kraniet fragmenter.
    4. Løft hjernestammen og skær forsigtigt meninges og hjernenerver før hjernen er helt ude af kraniet.
      Bemærk: Alle trin beskrevet i 5.1 bør udføres under strenge sterile forhold i en biosikkerhed kabinet.
  2. Integrere hjernen i 4% lav-smeltende punkt Agarosen for skæring.
    1. Fyld en 35-mm petriskål med den Agarosen rengøringsopløsning ovenfor (holdes flydende på 42 ° C).
    2. Hurtigt at overføre en electroporated hjerne til Agarosen-fyldt fadet ved hjælp af den tidligere cut overførsel pipette. Holde fadet ved stuetemperatur.
    3. Rør Agarosen med en metal pind at holde hjernen i midten af godt (for at forhindre forlis), og Placer hjernen i et rostro-caudale fly parallel til fadet. Stop omrøring når Agarosen begynder at størkne, for at undgå eventuelle hjerneskade.
    4. Brug et barberblad til at skære Agarosen omkring hjernen for at danne en rektangulær blok, forlader en margin på 1-2 millimeter omkring hjernen. Sikre at den rostralt del af hjernen er vinkelret på den forreste grænse af blok at lette orientering for de efterfølgende skridt, skæring.
    5. Gentag for hver hjerne.
      Bemærk: Det er muligt at skære mere end en hjerne på et tidspunkt (maksimalt 3) af forme separate Agarosen blokke samtidigt med at nedgang hver hjerne i forskellige højder.
  3. Vibratome koronale sektioner og skive kultur.
    1. Tø en alikvot af 100 X N-2 supplere (150 µL) på isen og tilføje til 15 mL aliquoted næringssubstratet under sterile forhold.
    2. Overføre 750 µL af næringssubstratet (med 1 X N2 tillæg) til hver brønd med en 6-godt kultur plade.
    3. Med buet pincet, skal du placere en celle kultur Indsæt (diameter 30 mm, 0.4 µm porestørrelse, PTFE) i hvert medium-fyldt godt.
    4. Fyld vibratome bad med løbende iltet ACSF. Afkøles til 4 ° C med isen omkring badet, eller bruge en nedkølet vibratome.
    5. Indstille vibratome hastighed til 0,150 mm/s og frekvens til 80 Hertz.
    6. Lim Agarosen blok om vibratome platform og rostralt kant nedad og ventral kanten står over for brugeren.
    7. Skære hjernen i koronale sektioner for at få 250 µm tykt sektioner (ved 4 ° C).
    8. Med steriliseret spatler, indsamle 2-3 afsnit indeholdende MGE og sted alle hjernen sektioner fra et dyr på en enkelt 30-mm membran indsætte, mens omhyggeligt undgår overlapning mellem sektioner. Placere indsatsen i et godt af en 6-godt kultur plade (der indeholder 750 µL af suppleret næringssubstrat, som beskrevet ovenfor). Hver sektion kan alternativt placeres på en separat 13-mm diameter membran i en 12-godt kultur tallerken fyldt med 500 µl suppleret næringssubstratet. Mængden af næringssubstratet anbefales til hver brønd tillader afsnittene hjernen til at blive næret af mediet uden at være neddykket.
      Bemærk: Trinene beskrevet i 5.3.6 og 5.3.7 ikke foretages under fuldstændig sterile forhold, medmindre vibratome kan steriliseres og anvendes i et kabinet biosikkerhed. Derfor er det afgørende at gennemføre disse trin omhyggeligt for at undgå kontaminering. Passende beskyttelsesudstyr (ren maske, operationshandsker og laboratoriekittel) skal bæres på alle tidspunkter og kropsdele, selv dækkede, såsom hår, ansigt og hænder, bør aldrig passere over kultur plader (med eller uden næringssubstratet). Det anbefales også at spray 70% ethanol ofte på handsker og spatler bruges til at indsamle hjernen sektioner.
    9. Kultur pladen anbringes i en ventileret sterile inkubator ved 37 ° C med 60% fugtighed og 5% CO2 for 48 eller 72 timer.
      Bemærk: Disse inkuberingstider var optimeret til time-lapse billeddannelse af MGE-afledte INs og konfokal billeddannelse af faste skiver, henholdsvis. Optimal inkuberingstider bør testes på forhånd for hvert eksperimentelle design. Derudover, er hvis den valgte inkubation er 72 h og under, der ingen grund til at ændre næringssubstratet. For længere inkuberingstider bør næringssubstratet ændres, hver 2-3 dage.
    10. Efter den ønskede inkubationstiden, overføre dele af interesse til en 8-chambered coverslip og tilføje 3-5 µL af næringssubstratet. Sted coverslip i en miljømæssig kammer (37 ° C, luftfugtighed 60%, 5% CO2), der er tilsluttet et omvendt spinning disk Konfokal udstyret med en computer-assisteret erhvervelse software til set-up time-lapse imaging sessionen.
      Bemærk: Alternativt sektioner kan være fastgjort med 4% PARAFORMALDEHYD (natten over ved 4 ° C eller 2 timer ved stuetemperatur) og efterfølgende immunostained med forskellige antistoffer til visualisering af de morfologiske træk ved electroporated INs under en Konfokal mikroskop. Selv om eGFP og mCherry kan visualiseres ved konfokalmikroskopi uden Counter farvning procedure, anbefaler vi udfører Immunhistokemi mod normal god landbrugspraksis og mCherry for at forbedre signalet, da optagelsen processen kan reducere fluorescens, reducere påvisning af finere komponenter af embryonale neuroner, såsom mindre grene i de foranstillede eller efterstillede processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit skal give vi repræsentative resultater, der opnås efter ex utero elektroporation af en kontrol plasmid, eller en eksperimentel plasmid rettet mod et gen interesse MGE e13.5 mus embryoner efterfulgt af organotypic skive kulturer inkuberes ved 37 ° C for 48 h (for time-lapse imaging) eller 72 h (for fiksering og immunhistokemiske mærkning) (Se figur 1B for skematisk protokol). Repræsentative eksempler på INs overflytning fra en MGE eksplantat er også illustreret (Se figur 1 c for skematisk protocol) som en sammenligning til metoden beskrevet her. Elektroporation af et plasmid i MGE stamfaderen synes at udsætte afgangen fra INs fra MGE og kultur tiden må justeres i overensstemmelse hermed.

I en vellykket eksperiment, organotypic skiver vises sund under Konfokal mikroskop, dvs kortikale lag er let at skelne bruge tilstanden lysfelt og der er ingen synlig forurening på skive overflade (genkendelige ved intens autofluorescence og tilstedeværelsen af fluorescerende filamenter synlig under epifluorescensmikroskop). I sund kronisk organotypic skiver gennemgå ca 20% af celler apoptose efter 72 h i kultur (figur 2), som tidligere beskrevet i kronisk organotypic kulturer (fx postnatal kulturer)52. Ikke desto mindre forbliver grov cytoarchitectural hjerne struktur veldefinerede, som illustreret her ved hjælp af DAPI farvning (figur 2A). Vores protokol for ex vivo elektroporation i MGE giver et gennemsnit på 50-100 transfected celler pr. Skive (figur 3AB), af hvilke 5-20 celler vil ses migrere dorsalt efter 72 h i kultur. Efter fiksering og immunhistokemisk farvning, kan INs migrere tangentielt mod den kortikale plade let identificeres med konfokalmikroskopi som de præsentere en langstrakt/oval cellen kroppen, den lejlighedsvise afsluttende proces og en førende proces orienterede tangentielt. Den førende proces normalt giver anledning til en eller to grene og er genkendelige ved tilstedeværelsen af en lejlighedsvis hævelse foran kernen (bolig centrosome før nucleokinesis) og vækst kegler i slutningen af hver gren. (Figur 3 c-G).

Denne protokol blev designet til observation af overflytter MGE-afledte INs på én celle niveau ved hjælp af time-lapse billeddannelse. For denne særlige eksperiment (figur 4), blev koronale organotypic hjerne skiver genereret fra Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryoner electroporated på e13.5 med en plasmid udtrykker en eksperimenterende shRNA (rettet mod et gen af interesse) og TdTomato kassette. Skiverne var inkuberes i 48 h, overføres til en 8-godt chambered coverslip parabol (1 skive pr. kammer flyder på et tyndt lag af suppleres med næringssubstratet) og afbildet hver 3 minutter til 6-8 h ved hjælp af en 20 x luft (0,70 NA) mål på en inverteret mikroskop udstyret med en roterende disk Konfokal hoved, en computer-assisteret erhvervelse software og en fase-top miljømæssige kammer. Under imaging, blev skiver blev holdt ved 37 ° C kontinuerligt iltet og fugtet i den miljømæssige kammer (5% CO2 og 60% H2O). Electroporated MGE-afledte INs blev identificeret som sådanne af deres udtryk for eGFP, bekræfter deres GABAergic i identitet og deres udtryk for TdTomato, bekræfter, at de udtrykker den eksperimentelle plasmid (figur 4AB). Electroporated INs er let identificerbare og godt isolerede, som det ses i figur 4, gør det muligt for de finere analyse af migration dynamiske parametre, såsom hastighed og afstand rejste. Derudover mærket INs ses migrere tangentielt mod den kortikale plade, mens i deres naturlige miljø, gør det muligt for os at identificere dynamiske morfologiske ændringer såsom forgrening af førende proces og nucleokinesis (figur 4 c -F).

Ex vivo elektroporation MGE-afledte ins kan også kombineres med MGE explants at aktivere høj opløsning billeddannelse af dynamiske cytoskeletal processer, der forekommer under migration, som et supplement til undersøgelse af direktionalitet og vandrende dynamics i organotypic kulturer. Som et eksempel, forskellige faser af neuronal locomotion minder om dem, der forekommer under tangential migration af INs i organotypic skive kulturer kan iagttages i electroporated INs overflytning fra en MGE explant 48 h efter elektroporation, som førende neurite udvidelse og nucleokinesis (figur 5B-E). Forskellige cytoskeletal processer kan derefter undersøges i høj opløsning i isolerede celler migrerer fra en MGE eksplantat, for eksempel ved farvning F-actin strukturer med phalloidin (figur 6A), som ikke kan opfyldes optimalt i organotypic skiver i betragtning af den høje cellulære tæthed (og dermed cytoskeletal elementer) i et oprindeligt miljø. Disse cytoskeletal processer, og især F-actin remodeling, kan yderligere studeres dynamisk ved at kombinere Lifeact udtryk med time-lapse billeddannelse. For eksempel, viser vi et eksempel på høj opløsning time-lapse imaging af en IN stammer fra en MGE eksplantat fremstillet af en Nkx2.1Cre; RCEEGFP mus hjernen bærer en målrettet sletning af et gen af interesse i INs. Denne IN var transfekteret med mCherry-Lifeact-7 plasmid under for CMV (gave fra Michael Davidson), kontrol ved hjælp af metoden skematiserede i figur 1 c, giver mulighed for sporing af F-actin remodeling forekommer i realtid (figur 6b). således, mens organotypic kulturer der kræves til korrekt vurdering direktionalitet eller migration sti af genetisk modificerede INs, MGE explants kan supplere sådanne undersøgelser ved at give bedre adgang til isolerede celler for høj opløsning billeddannelse af dynamisk cytoskeletal processer.

Tekniske faldgruber kan resultere i svigt af de eksperimenter, der er beskrevet ovenfor. For eksempel, kan embedding hjerner i en Agarosen løsning varmere end 42 ° C resultere i væv destruktion og neuronal død, afsløret af et tab af gennemskinnelighed i hjernen eller skiver, som er blevet uigennemsigtigt. Men temperaturen bør ikke opbevares for lavt, som en solidifying Agarosen løsning kan ødelægge den skrøbelige embryonale hjernen under indlejring processen. For det andet, forurening kan reducere udbyttet af de eksperimentelle metoder beskrevet her. Således bør alle skridt udføres med omhu, under strenge sterile forhold så meget som muligt. Alle løsninger og udstyr skal steriliseres inden brugen og udstyr bør sprayes ofte med 70% ethanol til at undgå forurening fra enten bakterier eller mug. Kontaminering kan ses direkte i brøndene Kultur som næringssubstratet bliver gule eller uigennemsigtig. Forurening kan gå ubemærket hen, når næringssubstratet forbliver klart og flydende. Men et lag af mug på skive overflade kan normalt observeres eller skiver blive alt for skrøbelige under fiksering og farvning trin. Når sådanne skiver er visualiseret under mikroskop, forurening kan manifestere sig som et lag af autofluorescence over mærket neuroner eller blive afsløret ved tilstedeværelsen af lang tid fluorescerende filamenter. Organotypic skiver holdt i forurenede brønde skal smides, men skiver kulturperler i de andre brønde i den samme plade kan opbevares i yderligere trin. Bakteriel forurening er ganske sjældent, men bør tages alvorligt, hvilket betyder, at alt udstyr, herunder fælles væksthuse og kultur værelse bør rengøres manuelt og steriliseret.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentationer af protokollerne for ex utero elektroporation efterfulgt af organotypic skive kultur eller MGE explants. A. eksempel på en biosikkerhed kabinet installationsprogrammet med nødvendige for protokollen beskrevet her alle steriliserede instrumenter. B. skematisk fremstilling af den protokol, der bruges til de ex utero elektroporation og organotypic skive kulturer. Kort, at embryonerne er halshugget, den eksperimentelle plasmid er indsprøjtet i den laterale ventrikel (1) og electroporated i MGE (2). Hjernen er microdissected ud af kraniet (3) og indlejret i Agarosen (4). Organotypic afsnit er genereret på en vibratome (5) og kultur på 37 °C(6) for 48 h for time-lapse mikroskopi (7.1) eller 72 h for celle rekonstruktioner (7.2). C. skematisk gengivelse af protokollen tilpasset fra Myers et al. 201353 og anvendes til generation af MGE explants. Kort, dorsolateral cortex er først dissekeret ud fra e12.5 til e14.5 wild-type mus embryoner (1) og adskilles mekanisk suppleret dyrkningsmedium (2). Kortikale celler er belagt med en tæthed på 5,25 x 105 kortikale celler/cm2 og kulturperler i 2 timer ved 37 ° C i et kollagen/poly-L-lysin-belagt 8-chambered coverslip (3). Derefter, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embryoner behandles for ex utero elektroporation af MGE (4, 5), og MGE er manuelt isoleret fra hjernen og skære i 100 µm2 fragmenter (6). Disse explants er derefter placeres oven på laget tidligere forberedt kortikale feeder, dækket med substratet og co kulturperler for 48 h før time-lapse imaging (7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: konserverede cytoarchitecture i sund organotypic skiver. Generation af organotypic skive kulturer efter ex vivo elektroporation af Nkx2.1Cre; RCEEGFP mus embryoner (A) ikke resulterer i betydelige vævsskade, som det fremgår af bevarede cytoarchitecture (DAPI (blå) og Cre-reporter (NGL)), sammenlignet med en 18 µm tykt cryosection fra en Nkx2.1Cre; RCEEGFP embryo transcardially perfunderet med 4% PFA på e15.5. D og M angiver dorso-ventrale og latero-mediale akser, henholdsvis. (B). høj forstørrelse billeder taget med en inverteret Konfokal mikroskop udstyret med en 63 x / 1.4 olieobjektiv efter farvning med en anti-kløvet-Caspase 3 antistof (Cl-cas3) afslører, at ca. 20% af cellerne i den kortikale plade gennemgå apoptose (hvid pilespidser) efter 72 h i kultur, mens normal god landbrugspraksis-positive INs ophold sunde (hvid pil), som eksemplificeret i mikrofotografier i C-C'' '. Til sammenligning, cellulære apoptose er næsten helt fraværende fra det tynde cryosection fra et perfused dyr (D-D'' '). Skalere barer: 250 µm (A-B) og 15 µm (C-D'' '). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Organotypic skiver af mus hjerne embryoner og høj forstørrelse mikrofotografier af electroporated interneurons (INs). A. en organotypic skive kultur fra et Dlx5/6Cre; RCEEGFP mus hjernen (hvor alle INs er grønne) electroporated med en Dlx5/6::shRNAscrambled-IRES-TdTomato plasmid. Skive var fastgjort med 4% PFA efter 72 h i kultur og immunostained for normal god landbrugspraksis og mCherry. Electroporated INs blev afbildet i 3D (50-60 µm tykt. z-stakke med optisk sektioner taget hver 0,5 µm) ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med en 63 x / 1.3 NA olie mål. INs migrere tangentielt i sub ventrikulær zone i den dorsale pallium er let identificerbar (rød, åben pil). D og M angiver dorso-ventrale og latero-mediale akser, henholdsvis. B. et repræsentativt organotypic skive kultur fra et vildtype (WT) embryo electoporated med en kontrol Dlx5/6::shRNAscrambled-IRES-TdTomato plasmid, fast på 72 h og immunostained for mCherry kun. Electroporated INs (rød) ses migrere dorsalt mod den kortikale plade. Electroporated INs er identificeret ved deres fælles udtryk for TdTomato og EGFP i Dlx5/6Cre; RCEEGFP mus (C-D), eller ved deres udtryk for TdTomato kun i WT mus (E-H), og ved deres typiske morfologi, dvs en oval celle organ, en forgrenet førende proces (hvid pilespidser, D-H), en lejlighedsvis afsluttende proces (hvid pil, C-D) og en lejlighedsvis hævelse af førende processen boliger centrosome før nucleokinesis (hvid stjerne i C-C' og G). Skalere barer: 250 µm (A-B) og 25 µm (C-H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Time-lapse live-billeddannelse af electroporated INs i organotypic skiver kulturperler for 48 h. INs electroporated på e13.5 med en eksperimentel plasmid udtrykker TdTomato kassette og en shRNA rettet mod et gen af interesse er set i tangential migration i en organotypic hjerne skive fremstillet af en Dlx5/6Cre; RCEEGFP mus embryo efter 48 h kultur (A, hvid firkant). B, den samme electroporated i (hvid firkant) ses i nucleokinesis, under overflytning tangentielt i cortex, dvs parallelt med pial overfladen, og er fulgt i time-lapse imaging hver 3 minutter for 8 h under anvendelse af en 20 x / 0.85 NA luft mål (udvidede kasser, C-F). Neuron viser i første omgang et aflangt cellen kroppen (åben pil) i nucleokinesis (C), samt en afsluttende proces (hvid pil) og en forgrenet førende proces (hvid pilespidser). Efter 3 h live Imaging, nucleokinesis er afsluttet, den efterfølgende proces har tilbagetrukket og førende processen er udvide to lange grene (D, hvid pilespidser). Efter 5 h 30 min, en af de førende proces gren har tilbagetrukket (hvid pilespidser) og neuron cellen kroppen (åben pil) har bevæget sig fremad omkring 10 µm (E). Endelig, efter 8 h Imaging, migration er afbrudt, neuron har udvidet sin førende proces igen og en afsluttende proces har optrådt (hvid pil), men kernen (åben pil) endnu ikke er kommet frem (F). Skalere barer: 250 µm (A), 70 µm (B) og 30 µm (C-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Time-lapse billeddannelse af INs stammer fra en MGE eksplantat kulturperler for 48 h. INs ses migrere ud af en MGE eksplantat fremstillet af en Nkx2.1Cre; RCEEGFP mus (i hvilke alle MGE-afledte INs udtrykke eGFP) electroporated med CMV::mCherry-LifeAct-7 plasmid på e13.5, ved hjælp af metoden tilpasset fra Myers et al. 201353 og skematiserede i figur 1 c, og kulturperler for 48 h (A). INs blev visualiseret ved hjælp af time-lapse live-imaging for 5 h (B-E). I dette eksempel, en co udtrykker eGFP og LifeAct ses i første omgang ved at nucleokinesis (åben pil) og udvider to førende proces grene (hvid pilespidser; B). dette IN fuldender nucleokinesis efter 1 time (Se åbne pil), som cellen kroppen bevæget sig fremad og en afsluttende proces har optrådt på den bageste del af cellen kroppen (hvid pil), og stadig viser en førende proces med to grene (hvid pilespidser; C). en anden nucleokinesis er i gang efter 2 h 30 min (åben pile) og den er nu udstyret med to førende processer med oprindelse fra cellen organ og en længere afsluttende proces (hvid pil; D). Endelig, efter 5 h, IN trækker en neurite mens translocating centrosome i den resterende førende proces gren (hvid pilespids) som forberedelse til en tredje nucleokinesis, med en afsluttende proces (hvid pil) stadig er til stede på bagsiden af cellen kroppen (E). Skalere barer: 70 µm (A) og 20 µm (B-E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: høj opløsning time-lapse imaging af actin remodeling i INs fra en MGE eksplantat kulturperler for 48 h. A. En organotypic skive fra en Nkx2.1Cre; RCEEGFP mus hjernen er fast på e15.5, farves med Alexa-594 Phalloidin, giver mulighed for visualisering af filamentøs aktin. INs er afbildet med en 63 x / 1.3 NA olie mål på en Konfokal mikroskop. I sund INs, trådformede actin ses cupping bagsiden af cellen kroppen efter tilbagetrækning af den efterfølgende proces efter afslutningen af nucleokinesis (hvid pil, A'-A'' '). B. en MGE eksplantat fås som ovenfor fra en Nkx2.1Cre; RCEEGFP mus hjernen bærer en målrettet sletning af et gen af interesse og electroporated med en plasmid udtryk for mCherry-Lifeact-7 under kontrol af CMV promotor. Time-lapse live imaging udføres efter 48 h af kultur, og electroporated INs følges hver 3 minutter til 3 h ved hjælp af en 40 x / 0.85 luft mål. Aktive remodellering af actin cytoskelettet opstår i den i transfekteret med LifeAct, som eksemplificeret af rød (white i sort og hvid billeder) bevægelse fluorescerende prikker i de førende proces og vækst kegler (hvid pilespidser) og på bagsiden af den cellen kroppen under nucleokinesis (B-B'' ', hvide pile). Skalere barer: 7 µm (A-A'' ') og 10 µm (B-B'' '). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel leverer vi en pålidelig metode til at udføre ex utero elektroporation mus MGE på e13.5 og for generation af organotypic kulturer af embryonale hjernen skiver. Selv om in vitro- metoder, såsom Boyden kammer Assay, er relativt nemme at udføre og kan bruges til at vurdere forskellige gener og proteiner uden indblanding af andre faktorer, specifikke roller, udelukker de undersøgelse af IN migration dynamics med hensyn til retningslinier og migration vej25. MGE explants give et nyttigt middel til at studere de dynamiske cytoskeletal ændringer forekommer under i migration, som vi viser her, men de er blottet for mest endogene stikord og ofte kræver tilføjelse af vejledning stikord at fremme neuronal migration (selv om dette er væsentligt forbedret når MGE explants er kulturperler på kortikale feeder lag)25,54. Ikke desto mindre kan assays baseret på MGE explants undlade at registrere konsekvenserne af molekylære stikord involveret i mere subtile mekanismer såsom de vejledende specifikke retningslinier eller migration stien til INs29. Problemet blev endelig omgået af i utero elektroporation25, som giver mulighed for den specifikke mærkning af MGE-afledte INs overflytning i deres oprindelige miljø13,29,41. Men denne teknik er skill-udfordrende, på grund af de kirurgiske procedurer, der er involveret, og dets udbytte er begrænset af lav overlevelsesraten af embryoner og det faktum at MGE er vanskelige at målrette i utero, ofte kræver brug af flere kuld til nå betydning55. Derfor, ex utero elektroporation af MGE efterfulgt af organotypic kultur i mus hjernen embryoner giver en billig, tid-effektive og pålidelige metode til undersøgelse af migration dynamics og morfologi af MGE-afledte INs i deres naturlige miljø, samtidig med at omgå de kirurgiske procedurer i utero elektroporation og behovet for vejledning stikord i MGE explants. Desuden, giver denne teknik en nemmere adgang til MGE, som kan målrettes ved direkte apposing den positive elektrode under halsen og den negative, på toppen af hovedet, en konfiguration vanskeligere at vedtage in utero. Alternativt, MGE kan injiceres focally og electroporated direkte efter genererer organotypic skiver13,25,29, men denne teknik har vist sig vanskeligere og mindre effektive i vores hænder end protokollen beskrevet her. Ved at følge de trin, der beskrives i denne artikel, vil man opnå 50-100 electroporated MGE-afledte INs pr. organotypic skive, 5-20 som vil ses migrere tangentielt ud af MGE efter 72 h. Transfected INs kan visualiseres live med time-lapse imaging eller afbildet og rekonstrueret efter fiksering og immunhistokemiske mærkning.

Protokollen beskrevet her var optimeret til at studere i migration ex vivo og var inspireret af forskellige publicerede protokoller beskriver i utero elektroporation MGE-afledte INs, ex vivo MGE injektion og elektroporation, eller den generation af kronisk organotypic hjerne skive kulturer36,38,39,42,43,56,57,58. Vores holdning begrænser potentielle skader på MGE stamfaderen ved hjælp af lavere puls intensitet (40 V) og intraventrikulært plasmid injektioner i stedet intra MGE injektioner med højspænding pulser (100 V), som beskrevet andetsteds39,56 ,57,58. Endvidere, mens andre bruger en kombination af penicillin, streptomycin og phosphatbufferet for at forhindre bakteriel forurening39,56,57,58, har vi valgt for at undgå antibiotika i vores kultur medium da de teoretisk kan påvirke i migration. Især penicillin er en antagonist af GABAA receptor59,60, og GABAA receptor aktivering aktiveres og senere stopper i migration afhængigt af intracellulære chlorid forløb og KCC2 udtryk i forskellige installationsfaser i migration61. Dog kan bruger de forskellige forholdsregler, udtalte i den nuværende protokol, forurening effektivt undgås, selv i mangel af antibiotika.

Trods effektivitet af denne tilgang i vores hænder har ex utero elektroporation også sine ulemper. Mens giver en naturlig tre-dimensionelle miljø for celler til at migrere, kan det være vanskeligt at udføre farmakologisk assays i organotypic skiver i forbindelse med i migration. Faktisk, migration af MGE-afledte INs for det meste afhænger af ekstracellulære stikord2,13,19 og anvendelsen af farmakologiske hæmmere eller aktivatorer på organotypic skiver tillader ikke den præcise dissociation af celle autonome effekter fra globale effekter på den generelle skive sundhed eller aktivitet. For sådanne eksperimenter, kan MGE explants vokset over blandet dissocierede kortikale celler være at foretrække at organotypic skive kulturer, da INs migrere ud af eksplantat kan være mere let isoleret og udsat selektivt for bestemte forbindelser62. Desuden, selv om ex utero elektroporation er lettere at udføre end i utero elektroporation, kan det stadig være teknisk udfordrende på de embryonale aldre illustreret her i betragtning af den lille størrelse og skrøbelige tilstand af embryonale hjerner på E13.5. Inspektørerne skal et par forsøg til effektivt uddrag electroporated hjerner på e13.5 uden at beskadige den hjerne overflade. Desuden, i modsætning til postnatal skiver, embryonale organotypic skiver ikke kan holdes i kultur over lange perioder. Selv om embryonale organotypic skive kulturer kan opbevares i mindst 7 dage in vitro-63, dette var ikke kombineret med elektroporation og eksperimenter beskrevet her har været testet for op til 3 dage i vitro med pålidelige resultater i vores hænder. Derfor, efterforskere bør udføre optimering test på forhånd hvis længere inkuberingstider er nødvendige. Yderligere, undersøgelse af udviklingen på sene embryonale eller tidlige postnatal stadier anbefales ikke med denne teknik, når du bruger e13.5 embryoner25, men kan nås med i utero elektroporation, hvor vellykket electroporated embryoner er sat tilbage i livmoderhulen og kan stå for at blive født og analyseret på senere stadier21,64. Endelig, ex utero elektroporation efterfulgt af organotypic skive kulturer giver mulighed for analyse af både morfologi og migration dynamikken i udviklingslandene INs. Men, som det har været tidligere påpeget for i utero elektroporation teknik36, ex utero electroporations give 50-100 electoporated celler pr. hjerne skive og er således ikke egnede til befolkningen analyse. Sådanne undersøgelser gennemføres bedre i dyremodeller bærer enten en fuld eller betinget sletning eller knock-in gen af interesse. Når tilgængelig, sådanne modeller så kan effektivt bruges til at generere organotypic skive kulturer eller MGE explants for at visualisere den faktiske dynamik i migration, som vist her (Se figur 5 og figur 6).

Mange trin i denne protokol bør foretages omhyggeligt for at opnå optimale resultater. For eksempel, er det altafgørende, at alle trin er udført under strenge sterile forhold som forurening kan forekomme ganske let. Handsker og instrumenter, der anvendes uden for Biosikkerhed kabinet sprøjtes med 70% ethanol ofte under hele proceduren. Derudover løsninger såsom dyrkningsmedier og kunstige cerebrospinalvæsken bør holdes sterilt og kolde (4 ° C), og lavet frisk hver 2-3 uger. Hvis du vil navngive MGE-afledte INs mere specifikt, plasmider, der skal bruges i sådanne forsøg bør blive klonet under kontrol af en IN-specifikke promotor (ex: Dlx5/649, Lhx665), stedet for at bare stole på de anatomiske målretning af MGE. Generation af organotypic skiver kræver hjernen til at holde sig i live. Således, for at bevare celle sundhed og overlevelse, dette eksperiment gennemføres i mindre end 3 timer fra øjeblikket at embryonerne hentes indtil organotypic skiver lægges i kultur. For tiden-effektivitet, kan kultur plader fyldt med hjemmelavet næringssubstratet lige før du starter eksperimentet og sat i 37 ° C celle kultur inkubator indtil brug. Derudover skal hjerner være omhyggeligt dissekeret ud af kraniet uden skader cortical overflade for at opnå korrekt integrering i Agarosen løsning og efterfølgende skæring af vibratome. For eksempel, kan skader kortikale overflade, selv minimal, resultere i detachment af de 250 µm tyk afsnit fra de omkringliggende agarosegel eller forringelse af sektionerne under vibratome skæring. For neuronal overlevelse, det er også afgørende at Agarosen løsning temperatur forbliver tæt på 42 ° C, som højere temperaturer føre til væv skader og celle død, lavere temperaturer vil hinder korrekt integrering af hjernen (eller beskadige det under den indlejring proces). En gang i kultur, for at undgå andre forurening kilder, skiver bør ikke manipuleres indtil de overføres til mikroskop til billedbehandling. Disse trin skal udføres i en steriliseret miljø og skal lægges vægt på ikke at forurene pladerne efter disse manipulationer, især hvis de skal sættes tilbage i kultur for efterfølgende re-tænkelig. Endelig anbefaler vi ikke rekonvalescerende en DNA prøve blandet med indlæsning farvestof fra tidligere eksperimenter til fremtidig brug, så vi observeret en betydelig reduktion i udbyttet af electroporated neuroner med sådant materiale.

Afslutningsvis, ex utero elektroporation og organotypic skive kultur protokollen beskrevet ovenfor giver mulighed for den specifikke mærkning af MGE-afledte INs på én celle-niveau og kan bruges til at genmanipulere specifikke molekylære veje til undersøge deres rolle i regulering af morfologiske forandringer og migration dynamikken i tangentielt overflytter INs. Denne metode giver mulighed for hurtig og billig tidlige funktionelle undersøgelsen af roman kandidat gener identificeret gennem enkelt celle RNA sekventering af vandrende INs66,67 eller næste Generation Sequencing af patienter med Neuro-udviklingsmæssige forstyrrelser68,69,70. Denne teknik har været flittigt brugt til at studere migration i andre cellepopulationer, herunder pyramideformet celler i cortex og hippocampus70,71,72,73. Når styr, kunne det potentielt bruges til at billede genbrug og handel med Membranproteiner, som receptorer og kanaler ved hjælp af normal god landbrugspraksis-tagged proteiner; aktivering af specifik cellulær signalering cascades ved hjælp af biosensorer74; eller endda overvågning og manipulation af cellulære aktivitet ved hjælp af calcium imaging koblet til optogenetics i kortikale INs, men også i andre områder i hjernen, som hippocampus, amygdala eller endda striatum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse. De synspunkter udtrykt heri repræsenterer ikke nødvendigvis synspunkter af sundhedsministeren eller den canadiske regering.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af driftstilskud fra Savoy Foundation og kur epilepsi Foundation og af udstyr tilskud fra den canadiske Foundation for Innovation til E.R (Konfokal mikroskop) og G.H (spinning disk Konfokal mikroskop). E.R. modtager en karriere award fra den Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) samt fra den canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR; Unge Investigator Award). Niels er en ledende lærd af FRQ-S. L.E er modtageren af Steriade-Savoy postdoc training award fra Savoy Foundation, CHU Sainte-Justine Foundation postdoc training award og FRQ-S postdoc training award, i partnerskab med instituttet stjerner. Dette projekt er blevet gjort muligt af hjernen Canada gennem Canada Brain Research Fund, med økonomisk støtte fra Health Canada, tildeles Le

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. 649325 (2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562, (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71, (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38, (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44, (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28, (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59, (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69, (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30, (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25, (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2), a001834 (2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30, (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40, (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23, (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2, (2), e00031 (2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63, (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120, (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165, (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109, (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7, (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25, (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219, (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25, (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22, (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34, (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26, (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15, (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97, (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32, (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27, (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25, (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59, (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20, (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30, (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118, (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92, (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34, (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28, (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19, (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129, (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23, (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496, (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15, (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7, (1), 4897 (2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27, (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93, (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23, (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501, (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33, (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461, (7260), 99-103 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics