Author Produced

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Immunology and Infection
 

Summary

Burada, bir gösteri emme blister kutanöz geri çekme modeli sağlamak. Model insan vivo içinde edinilmiş bağışıklık yanıtı, örneğin aşı geliştirme bağlamında incelemek basit bir erişim sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M., Blauenfeldt, T., Benfield, T., Andersen, P., Akbar, A. N., Ruhwald, M. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (138), e57554, doi:10.3791/57554 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kutanöz antijen-geri çekme modelleri insan hafızası yanıt içinde vivoçalışmalar için izin. Cilt emme blister (SB) indüksiyon ile birleştirildiğinde, bu model antijen spesifik T-hücreleri temsilcisi hücresel hafıza yanıt yanı sıra sitokin microenvironment in situnadir nüfus için erişilebilirlik sunmaktadır.

Bu rapor kutanöz bir hatırlama, bir SB indüksiyon ve antijen spesifik T-hücrelerinin bir hasat pratik yordamı açıklar. Yöntem örneklemek için tüberkülin cilt testi kim, bu çalışmada önce bir enfeksiyonla karşı Bacillus Calmette-Guerin aşı uygulanan bireylerde antijenik geri çağırmak için kullanılan Mycobacterium tüberküloz. Son olarak, kandan izole hücreler ile karşılaştırıldığında bu örnekleme yöntemi tarafından antijen spesifik Polifonksiyonel CD4 + T hücreleri mevcut yüksek kesirler gösteren multiplex ve akış sitometrik analizleri SB örneklerin örnekleri sağlanır.

Burada açıklanan yöntemi güvenli ve minimal invaziv, her ikisi de doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı vivo içindeeğitim için eşsiz bir fırsat sağlar ve geniş bir hücre-aracılı bağışıklık ve insan ile çalışan araştırmacılar topluluğu için yararlı olabilir aşı geliştirme bağlamında bellek yanıtları.

Introduction

Cilt SB hücrelerin ve sıvı cilt üzerinden doğrudan hasat için sağlar bir yapay indüklenen blister olduğu. SBs vakum tarafından yetiştirme tekniği Dermatoloji deri İmmünoloji sağlığı ve hastalıkları1,2,3,4,5, incelenmesi için kullanılan alanı içinde iyi bilinen bir araçtır 6 , 7 , 8. bu raporu nasıl kutanöz antijenik hatırlama (SB kutanöz geri çekme yöntemi) ile kombine SB tekniği doğrudan edinilmiş bağışıklık yanıtı içinde vivokazandırabileceğini gösterir.

SB indüksiyon arkasındaki prensip basittir: bir ışık vakum cildin küçük bir alana uygulanır. Negatif basınç sonunda epidermis ile sıvı ve hücreleri1,2,9dolu bir yerel blister oluşturma dermis, ayırmak için zorlar. Blister sıvısı tarafından ince iğne aspirasyon hasat edilebilir ve içerik-ebilmek var olmak kullanılmış için daha fazla vitroçalışma.

Son yıllarda SB yöntemi vivo içinde bağışıklık yanıtı cilt10,11' e kısıtlanmış hastalıkları dışında çalışma için artan bir ilgi olmuştur. İnsanlarda edinilmiş bağışıklığın çalışmanın lenf nodu veya gastrointestinal mukozal doku invaziv bir örnektir ve etik olmayan kabul edilemez olduğu için hücreleri ve sitokinler ilgi periferik kan örnek ki gerçeği ile sınırlıdır. Bir örnek aşı12' den sonra uzun ömürlü insan hafızası T hücreli yanıt çalışmadır. Bu tür çalışmalarda aracılık bağışıklık hücrelerinin ilgili nüfus lenfoid dokusunda bulunduğundan örnekleme ilgili T-hücrelerinin büyük bir meydan okuma olabilir ve sadece çok sınırlı sayıda belirli T-hücrelerinin periferik kan dolaşımını.

SB teknik bellek T-hücrelerinin incelenmesi için eşsiz bir fırsat ve diğer belirli hücre popülasyonlarının sunar. Kutanöz Aşı antijen, T-hücreleri özel antijen için onların lenfoid Dinlenme mekanlari cilt için işe ve kolayca SB tatmak mümkündür. Bu kutanöz geri çekme modeli metodolojisi ve araştırma uygulamaları Akbar ve ark. tarafından tarif edildi 20132' de. Cilt geri çağırmak için yaygın olarak kullanılan bir antijen mikobakteriler bir tüberkülin cilt testi (TST)13, nerede PPD deri deri tabakası enjekte edilir gerçekleştirmek için kullanılan piyasada bulunan saf protein türev (PPD) biridir. PPD [Örneğin, Mycobacterium tüberküloz (Mtb) enfeksiyon veya bir önceki Bacillus Calmette-Guerin (BCG) aşısı olan bireyler] doğru varolan bir immünolojik bellek ile bireylerde, antijen ifade sonuçlanan bir cilt ve in vivo klonal genişlemesi PPD özel CD4 + T hücreleri2,11,14,15geçiş ile yanıt hatırlayın. Sonuç olarak, PPD özel Polifonksiyonel yüksek kesirler SB örnekleme için hazır deride CD4 + T hücreleri birikir. T-hücreleri bu yöntem tarafından toplanan sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve yeterince uzun bir dizi ve bir uzun vadeli vitro kültür15tarafından karakterize edilebilir bol miktarda bulunmaktadır. Bu nedenle, kutanöz geri çekme modeli ve SB indüksiyon vivo içinde T-hücre yanıt ex vivo analizleri tarafından eğitim için değerli bir yöntem ispat edebilir ve bu yaklaşımın artan bilgi araştırmacılar hücresel immünoloji çıkarları ile yararlanabilir ve vaccinology.

Bu rapor, insan derisi emme kabarcıklar cilt PPD enjekte ikna etmek ilk kademeli kılavuzu sağlar. Kutanöz antijen geri çekme modeli TST BCG aşısı gönüllü olarak kullanarak gösterilmiştir. Son olarak, ilgili ex vivo hücre ve SB tarafından izole sitokinler analizidir örneği. PPD özel T-hücreleri SB yöntemi ile elde edilen phenotypical ve fonksiyonel özellikleri nelerdir iyice başka bir bölümünde2,10,11,16,17, 18 , 19. bu raporu diğer araştırma grupları tarafından bu tekniğin uygulanması kolaylaştırmak için metodoloji, pratik ve immünolojik yönünü amaçlamaktadır.

Protocol

Tüm yöntemler aşağıda açıklanan insan gönüllü, dahil olmak üzere sağlık araştırma etik (H-15002988) ve Danca veri koruma ajansı (jr.nr. 2015-57-0102) Danimarka Komitesi tarafından onaylanmış olması. PPD insan kullanımı için onaylanmış ve üretici tarafından sağlanan doğru dozaj içinde yönetilen sertifikalı bir ürün olması gerekir. Doz veya yönetim olarak herhangi bir sapma ek etik onayları gerektirebilir ve gönüllü onam vermelisin.

1. tüberkülin cilt testi

  1. Yazılı ve sözlü onam gönüllü edinin. Enjeksiyon önce gönüllü anlar ve olası yan etkileri de dahil olmak üzere yordam kabul emin olun.
    Not: Dahil bu protokole özgü Yaş > 18 yaş ve belgelenmiş bir BCG aşısı ölçütlerdir. Katılım kriterleri araştırma soru bağlı olarak farklı olabilir (Örneğin, bir ek katılım kriteri olumlu TST kanıtı olabilir).
  2. PPD hazır bir çözüm insan kullanım [20 tüberkülin birimleri (TU) /mL] kullanın. Bir şişe alkol pamuklu çubuk kullanarak kauçuk kapak dezenfekte.
  3. Enjeksiyon yeri hazırlamak
    1. Gönüllünün önkol ventral tarafta enjeksiyon yeri bulun.
    2. Kol palm kadar düz bir yüzeye yerleştirin ve ön kol, dirsek eklem yaklaşık 5-10 cm üst üçte üzerinde bir alanı seçin. Yara izi, damarları veya hasarlı cilt uzak durun.
    3. Alkollü bir pamuklu çubuk kullanarak alan dezenfekte.
  4. PPD-çözüm hazırlamak
    1. İğne sabit 1 mL steril enjektör ile 27-30 G/kısa (Örneğin, 12 mm) kullanın.
    2. Yavaşça karıştırın ve 0.1 mL PPD çözeltisi aspire. Hava kabarcığı yok görünür olduğundan emin olun.
  5. İntradermal PPD enjeksiyon
    Not: Bu adım tek PPD ifade gerçekleştirmek açıklar, ancak birden çok ifadeleri PPD aynı kol yeri. Ancak, bu belirli etik onay gerektirebilir.
    1. Deri streç ve 5-15 ° açıyla iğneyi cilde eğimi yukarı bakacak şekilde gelin.
    2. İğne ucu cilt dermal tabaka yerleştirin ve ucu ile epidermis neredeyse görünür olduğundan emin olun.
    3. Yavaş yavaş 0.1 mL PPD çözeltisi enjekte et.
      Not: Eğer düzgün yönetilen, 6-10 mm soluk bir papül hemen görünür. Papül yaklaşık 10 dakika sonra kaybolur.
    4. İki veya daha fazla işlemimiz yaparken, dirsek ve bilek alan iyi bir mesafede tutarken bir maksimum ayrılması için (5-10 cm) enjeksiyon sitelerin amacı.
      Not: Bu cilt testi yanıt potansiyel bir izdiham engeller ve kesintisiz iki emme odaları konumlandırma sağlar.

2. Cilt reaksiyon - gün 3 değerlendirilmesi

  1. 48-72 saat sonra cilt reaksiyon boyutuna dikkat edin. Sertlik (şişme) ölçmek ve değil reaksiyon eritem (kızarıklık).
  2. Sabit muayene et parmaklarını kullanarak şişme ve tükenmez kalem kullanarak dizilerinin kenarları işaretleyin. Sertlik çapı ölçmek ve mm sonucu Not için bir cetvel kullanın.
    Not: Sertlik boyutu bir okuma seçtiğiniz delik çapı emme odası için bir yol.

3. emiş Blister indüksiyon - 7 gün

  1. Emme cihazı birimi bir araya getirin.
    Not: Vakum pompaları ile ekli salonları emme blister indüksiyon için emme cihazı birimlerdir. Bu gösteride kullanılan cihaz yapılan özel, ama emme cihazı birimleri de ticari olarak kullanılabilir. Pompa-40 kPa -20 aralığında ayarlanabilir ve istikrarlı ve güvenilir bir negatif basınç sağlamak gerekiyor. Bu yöntemi kullanarak deneyler önce bölgesel etik onay alınmalıdır.
    1. İlk olarak, alt ağız plaka ve pencere plaka odası ve bağlantı hortumu ile birleştirerek emme odası hazırlayın. Odası-bağlama hortum sıkıca vakum pompası iliştirin.
      Not: Odaları insan Ciltle temas uygun olmalıdır, blister indüksiyon için bir delik olan bir alt plaka ve görsel blister izlemek için izin veren bir pencere ile üst plaka içermelidir.
  2. Delik plaka Cilt tepki boyutunda görece en uygun delik çapı belirlemek; delik büyük boyutunu büyük blister.
  3. Dezenfekte orifis plaka ve gönüllü cilt alkol temizleme bezi kullanarak.
  4. Emme odası cilde iliştirin.
    1. Gönüllünün kolu rahat bulunmadığından emin olun.
    2. Böylece cilt reaksiyon Merkezi görülebilir emme odası alt plaka delik PPD tepki üzerinde yer alır emin olun.
    3. Gevşek askıları kullanarak odası güvenli: negatif basınç uygulandığında, odası cilde uygun ve konumunu korumak.
  5. Emme cihazı açmak ve -20 kPa basınç ayarlayın.
  6. 30 dakika sonra-25 kPa negatif basınç artar.
  7. 60 dk sonra-30 kPa negatif basınç daha da artırmak.
  8. Bir blister tam olarak kurulan kadar-30 kPa bastır. Bu protokol için sağlanan negatif basınç için özelleştirilmiş bir enstrüman belirli olduğundan emin olun. Basınç biraz diğer ayarları protokolünde uygularken ayarlamak gerekebilir.
    Not: Blister indüksiyon fazında Blistering kez bir kaşıntılı sansasyon ile ilişkili son 30 dk. içinde meydana gelen gerçek blister oluşumu ile 180 dk (1-3 h) 60 aralıkları. Kabarcıklar tek veya birden çok birleştirme kabarcıklar oluşabilir. Blister yırtılması ya da kanama ortaya çıktıysa, bu yavaş yavaş baskı serbest bırakarak blister indüksiyon sonlandırmak için tavsiye.
  9. Blister tam olarak kurulmuş sonra basınç ve blister rüptür olmadan emme Oda deriden dikkatli bir şekilde çıkarın.
  10. Cilt çevredeki yumuşak bir soyunma uygulamak ve blister üzerinde sabit bir kap (Örneğin, 50 mL plastik tüp) yerleştirin.
  11. Bir yumuşak stretchy bandaj tarafından takip alerjik olmayan cerrahi bant ile kapağı güvenli.
  12. Sonraki 12-24 h blister alan üzerinde aşırı fiziksel yük önlemek için gönüllü talimat.

4. hasat Blister sıvısı - günde 8

  1. 8inci gününde, yavaşça koruyucu soyunma kaldırmak ve blister cilt dezenfeksiyon sprey ile dezenfekte.
  2. 2 mL steril enjektör 23 G iğne ile blister içeriğin hasat için kullanın. İğne blister çatı üst/lateral yan içine yerleştirin ve yavaş yavaş sıvı Aspire edin. Kavite katında dokunmaktan kaçının ama tüm sıvı hasat emin olun.
  3. Bir soyunma daraltılmış blister üzerinde uygulayın.
  4. Blister sıvısı için steril bir tüp aktarın. Birimin unutmayın.
  5. 600 x g masa üstü bir santrifüj 4 min için kullanarak, blister sıvısı aşağı spin.
  6. Süpernatant aktarmak için başka bir tüp ve hücre Pelet cep orta 500 µL içinde resuspend.
    Not: Şimdi sayma ve analiz için daha fazla hazır hücrelerdir. Supernatants-20--80 ° C de kullanımı kadar saklanabilir.

5. analiz emme hücreleri ve sıvıları Blister

Not: hücreleri ve cilt emme kabarcıklar elde edilen sıvı analizi için yönergeler sağlama bu protokol kapsamında değildir. Ancak, bu rapor için temsil edici sonuçlar sağlamak için hücre içi leke akış sitometresi ve multiplex analizleri yapıldı. Metodoloji aşağıda kısaca açıklanmıştır.

  1. Akış Sitometresi
    1. 1 x 105 taze hücre 1 BCG aşısı gönüllü 10 µg/mL PPD ile gelen emme kabarcıklar dan izole süspansiyonlar teşvik etmek ve 37 ° C ve % 5 hücreleri kuluçkaya CO2. Paralel bir kuluçka için unstimulated hücreler içerir.
    2. 1 x 106 PBMCs elde edilen 1 BCG aşısı gönüllü 10 µg/mL PPD ile gelen süspansiyonlar teşvik etmek ve 37 ° C ve %5 karisimin kuluçkaya CO2. Paralel bir kuluçka için unstimulated hücreler içerir.
    3. 2 h sonra Brefaldin A ve monensin içeren tüm hücreleri tedavi etmek ve onları 6 h 37 ° C'de için kuluçkaya
    4. Bir panel canlı/ölü-leke-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 ve anti-IL-2-FITC hücrelerle leke.
    5. FMO denetimler PBMC Masası'nda bulunur.
    6. Akış sitometresi ile bir akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştir ve ilgili yazılım kullanarak sonuçları çözümleyebilirsiniz.
    7. Geçit sitokin üreten CD3 + CD4 + CD8-aşağıdaki gating strateji kullanarak alt kümeleri üzerinde: gömlek - > uygun CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + veya IL-2 +.
    8. Kapı aşağıdaki gating strateji kullanarak efektör bellek hücre popülasyonlarının: gömlek - > uygun CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.
    9. Boole geçişi kullanarak bireysel sitokin profilleri hesaplamak.
  2. Sitokin yayın gösteriler
    1. Vivobir sitokin bir gösteri için yayın, IL-2, IFN-γ, TNF-α, Il düzeylerini ölçmek için çok katmanlı bir analiz kullanın-10 ve IL-13'te 4 gönüllü elde çözdürülen emme blister sıvısı.
    2. Bir gösteri olarak bir sitokin sürümü hücreleri tarafından elde edilen emme ex vivo, kullanım taze emme blister hücreleri kabarcıklar ve PBMCs 1 gönüllü BCG aşı elde.
    3. PBMC bulaştırmak ve 100 koloni oluşturan birim (CFU) Mtb H37Rv hücrelerle blister emiş ve onları 4 gündür kuluçkaya.
    4. IL-2, IFN-γ, TNF-α, Il düzeylerini ölçmek için çok katmanlı bir analiz kullanın-10 ve IL-13'te tüm kültür supernatants.
    5. Yukarıda tahlil hesaplama aralığın üst hesaplama sınırlamak için ölçümleri ayarlayın.

Representative Results

Sekiz sağlıklı yetişkin gönüllü (Medyan yaş: 30 yıl, aralığı: 26-43 yıl) belgelenen önceki BCG aşı ile (BCG aşısı ortalama zaman: 5.5 yıl, aralığı: 1-30 yıl) dahil edildi. Katılımcılar intradermally günde 3 TST değerlendirme ardından PPD 2 TU ile meydan. SBs 7 günde indüklenen ve günde 8 hasat ve 10 mm delik çapları ile emme blister Chambers'ı kullanarak tüm kabarcıklar yetiştirildik. Yedi bireyler verildi 2 ayrı PPD aşı aynı anda 2 paralel SB indüksiyon tarafından takip aynı kol (birden çok PPD işlemimiz Protokolü1.4 adımda aşağıda ilgili not başvurun). Periferik kan yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından günde 7 plazma ve PBMCs yalıtım için çizilmiştir. Plazma ve sıvı supernatants SBs den-20 ° C'de depolanmış Taze SB hücreleri (SBCs) nigrosine leke ve mikroskobu kullanılarak sayıldı.

Klinik TST yanıt ve SBC verim Şekil 1' de sunulmaktadır. 10,25 mm medyan büyüklüğündeydi TST indurations (aralığı: 0 - 20 mm) ve medyan cep numarası blister başına 50.000 (aralığı: 15.000-210.000 hücreleri, kabarcık sayısı: 15). İki gönüllü klinik yanıt 2 TSTs birini ve 15.000 hücreler/blister bir karşılık gelen düşük toplam hücre verim içinde vardı. Hücre verim TST ortalama klinik Yanıt ile ilişkili (Spearman'ın r 0.643, p = 0.094 =).

Figure 1
Resim 1 : Emme blister hücre verim. (bir) Bu panel bir temsilcisi SBs izole nigrosine lekeli hücrelerinin mikroskopisi 7 gün sonrası-TST kaldırdı gösterir. (b) Bu panel 8 BCG aşısı gönüllü olarak ortalama TST sertlik (mm) ve ortalama hücre verim (n/blister) arasındaki ilişkileri gösterir (kabarcık sayısı = 15). Noktalar tek tek ortalama ölçümleri temsil. Unutmayın ki 0 mm TST sertlik ve bir hücre verim 15.000 2 gönüllü olduğu gibi 2 nokta örtüşmez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Akış sitometrik SB karakterizasyonu göstermek için SBCs 30 yıl önce BCG aşısı olan bir Yaş 43 gönüllü elde edilmiştir ve Mtb. SBCs bilinen hiçbir maruz vardı bir tek blister (İndüksiyon takip izole Sertlik: 1.4 mm/100.000 SBCs). Şekil 2 hücre içi sitokin SBCs karşı PBMCs boyama temsilcisi araziler gösterir.

CD3 + CD4 + CD8-PBMCs kısmını sabit kaldı, ancak bu gönüllü, CD3 + CD4 + CD8-SBCs kısmını unstimulated hücrelerde % 67 > %90 PPD vitro restimulation üzerine yükselmiştir (~ % 51, Şekil 2). Üzerinde %92-in vitro PPD-yanı sıra unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs, efektör bellek türü vardı (CCR7 - CD45RA-, veri gösterilmez). Belirli CD3 + CD4 + CD8 hücreleri PPD-stimülasyon tarafından indüklenen genel kesirler için PBMCs karşılaştırıldığında SBCs olarak yüksek bulundu (33.1 vs. %0,2, unstimulated örnekleri çıkartılır). PBMCs, Polifonksiyonel PPD özel CD3 + CD4 + CD8-hücreler kesirler tüm < %0,05 idi.

Figure 2
Resim 2 : SBCs temsilcisi akış sitometresi araziler karşı PBMCs. Panelleri bir ve b göstermek temsilcisi yoğunluğu CD8 + ve CD4 + nüfus (bir) ve araziler unstimulated vs. PPD uyarılmış PBMCs ve (c) SBCs. panelleri b ve d yavaş çizer, hücre içi sitokin (b) PBMCs için PPD uyarılmış CD3 + CD4 + CD8-hücrelerindeki boyama ve (d) SBCs. lütfen bir daha büyük görmek için buraya tıklayın Bu rakam sürümü.

Beklendiği gibi CD3 + CD4 + CD8-SBCs aktif vivo içindeyüksek oranda upregulated sitokinler (%12), boyama hücreleri tarafından resimli, TNF-α ve IFN γ olmak baskın sitokinler ile vardı. Ancak, PPD-stimülasyon hücreleri salgılayan sitokin bir üçlü veya çift-pozitif doğru kaymıştır IFN γ + TNF-α + IL-2 + (% 17) ve IFN γ + TNF-α + (% 15) profil (Şekil 3b, PBMC profilleri aynı donörden buna karşılık için dahil Şekil 3a). Sitokin ifade profilleri PPD uyarılmış efektör bellek CD4 + T hücre alt kümeleri için (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) sunulan rakamlar 2 ve 3 (veri gösterilmez) CD3 + CD4 + CD8-nüfus için karşılaştırılabilir olduğunu.

Figure 3
Şekil 3: PBMCs karşı CD4 + PPD uyarılmış ve unstimulated SBCs profillere sitokin.  Bu paneller sitokin üretmek için bireysel profilleri göster (bir) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs hücreleri ve (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Çubuklar kesirler antijen spesifik sitokin profilleri unstimulated hücrelerde (beyaz çubukları) ve üzerine bir vitro stimülasyon PPD (renkli çubuklar) ile gösterir.

SB sıvı cilt test sitesinde sitokin microenvironment üzerinde bir bilgi kaynağı keşfetmek için SBs indüklenen 7 gün sonrası-TST (4a rakam) hasat sıvı sitokin düzeyleri ölçüldü. 339 pg/mL, 19 pg/mL ve 1 pg/mL, IFN γ, TNF-α ve IL-2 ortalama düzeyde idi (n = 6). Plazma düzeyleri genellikle çok düşük olduğunu. SBs izole hücreler pro-inflamatuar sitokinlerin ex vivo (Şekil 4b) yüksek düzeyde üretti. 1 gönüllü gelen SBCs titrations öldürücü M. tuberculosis huzurunda 4 gün için kültürlü ± otolog PBMCs. IFN γ seviyeleri > SBCs, PBMCs durum ne olursa olsun içeren kültürde 30-fold daha yüksek.

Figure 4
Şekil 4 : SB sıvı, plazma, sitokin düzeyleri ve MTB -enfekte kültür supernatants. (bir) Bu panel sitokin düzeyleri SB sıvı supernatants ve plazma 6 BCG aşısı gönüllüler gösterir. Çubuklar medyan sitokin düzeyleri gösterir; hata çubukları aralığı temsil eder. (b) Bu panel sitokin düzeyleri supernatants kültürlerden 4 paralel 600 µl ex vivo 4 günlük 1 x 106 PBMCs (siyah çubuklar), 1.75 x 105 SBCs (beyaz çubukları) ve 1 x 106 PBMCs 0,5 veya 1.75 x 10 ile çivili gösterir 5 SBCs (gri bar) Mtbile enfekte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu el yazması insan bağışıklık belleği yanıt vivo içindekutanöz antijen hatırlama ve hücre hasat emme blister indüksiyon tarafından kullanarak, çalışma için pratik bir yordam açıklanır. TST intradermal antijen ifade ve BCG aşısı hatırlama bir örnek olarak kullanılmıştır. Bu kabaca üçte biri SB hücreleri gösteren edildi sağlanan antijen spesifik Polifonksiyonel T-hücreleri efektör bellek fenotip, son olarak, bir akış sitometrik ve multiplex sitokin Analizi tarafından SB numune karakterizasyonu örnekti.

Bu protokol kritik adımlar intradermal enjeksiyon tekniği, emme blister indüksiyon ve blister ponksiyon içerir. Öncelikle, doğru intradermal ifade eğitimli personel gerektirir. Yanlış bir ifade suboptimal sonuçlara yol açabilir. PPD genellikle iyi bilinen ve güvenli kutanöz antijen, ama onun kompozisyon karşılaştırılabilir13,20sınırlama üreticileri arasında değişebilir. Bu rapor 2 TU tek intradermal birikimi ve ek etik onay gerektiren paralel isteğe bağlı olarak iki ifadeleri (2 x 2 TU) için yönergeler sağlar. Ancak, diğer çalışmalar 10 TU, güçlü cilt reaksiyon10,21olasılığını artırmak kullandık. SB indüksiyon adımı sırasında negatif basınç kademeli küçük artışlar kanama ve blister rüptürü riskini azaltacaktır. Kırmızı kan hücreleri veya leucocytes gelen kan ile kirlenme genellikle düşük2dir. Aseptik ponksiyon tekniği mikrobiyal kirlenme önler ve ponksiyon iğnesi ve dermal blister katı arasında temas kaçınarak enkaz veya ikamet cilt hücrelerini kirleri azaltır. Ancak, bazı araştırmacılar için delinmiş blister10haddeleme basınç uygulayarak SB sıvı hasat tercih ederim. Blister içinde septa ponksiyon gerekli olabilir. SB kendisi Minimal İnvasif tekniktir; daraltılmış SBs skarlasma olmaksizin iyilesmektedir ve enfeksiyonlar çok nadirdir. 2 ancak, hipo-pigmentasyon ölçüde ortaya çıkabilir ve SB indüksiyon albüminkolloid skarlasma bir geçmişi olan insanlar muhtemelen kaçınılmalıdır.

Teknik sınırlamaları düşük toplam hücresini verimleri ve uzun süreli depolama için sonuç olarak sınırlı seçenekler içerir. Leucocyte verim, klinik TST yanıt, blister ebadı ve eritrosit kirlenme arasındaki ilişkileri oldu iyice başka bir bölümünde2,10. Burada sunulan BCG-geri çekme deneyleri (Şekil 1), ortalama toplam verim her blister üzerinden 50.000, özellikle SBCs okudu yalnız15iseniz bu hücreler kullanarak küçük ölçekli bir deneysel set-up ima yapıldı. Ancak, bir SB örnek belirli T hücreli nüfus çoğunlukla ne her iki göreceli ve mutlak hücre sayımları PBMC örnekleri bulunur aşıyor. Şekil 2' de sunulan örnekte üç kez pozitif PPD özel T-hücreleri 100.000 SB hücreleri bir örnek daha--dan 2 x numara bulunan 1 x 106 PBMCs aynı donörden (veri gösterilmez) daha büyük idi. TST tepkisi görsel bir Puanlama M. tuberculosis bellek değerlendirilmesi için en sık görülen klinik yöntemidir. Belirtmek gerekirse temel edinilmiş bağışıklık reaksiyonu klinik cilt reaksiyon2,21aynı anda zirve değil. Değil tüm BCG aşısı veya Mtb-maruz kalan bireylerin güçlü TST reaksiyonlar ve sınıflandırma ve sigara TST cevaplama yanı sıra çalışma nüfus, önceden varolan bir Mikobakteriyel Sensitizasyonu örnekleri işlenmesi için stratejiler geliştirecektir Bu yöntemi kullanarak bir geri çağırma deneme işlemini başlatmadan önce dikkate alınması gerekir. Ayrıca, hem SB örnekleme ve görsel Puanlama, küresel nedeniyle indirimli cilt yanıt-e doğru kişilerle teorik bir önyargı için bir potansiyel olduğunu veya deri ile ilgili bağışıklık, örneğin, HIV enfeksiyonu ve belirli yaş gruplarına2görüldüğü gibi Engelli, 13,18,20. Ayrıca, tekrarlanan test ile TST tepki bir bağışıklık artırılması iyi bilinen20,22yaşında. TSTs tekrarlanan10olduğunda ancak, SB hücre fenotipleri oldukça sabit kalır. Bu gözlem, hücresel bağışıklık yanıtı boyuna çalışmalarda SB hatırlama rolü destekler.

T-hücre immunologists için yüksek kesirler antijen spesifik hücre hasat için SB geri çekme sağlar. Ancak, SB zamanlaması için bir örnekleme PPD-ifade üzerinden hücresel kompozisyon ve sitokin microenvironment zaman içinde değiştikçe önemlidir. Bu protokol için kabarcıklar indüklenen 7 günlük sonrası challenge ve izole hücreler öncelikle CD4 + efektör bellek T-hücreleri idi hücreleri yüksek kesirler IFN γ, TNF-α ve IL-2 ortak bir ifade ile de dahil olmak üzere. Nasıl T-hücre harekete geçirmek, yayılması ve farklılaşma PPD astarlanmalıdır cilt2,15,21' oluşur açıklayan önceki çalışmalar doğrultusunda bu gözlemler vardır. Kinetik SB çalışmalar PPD duyarlı bireylerde çok erken cilt yanıt belirsiz olduğunu göstermektedir; Ancak, zaten PPD-meydan sonraki ilk gün içinde yanıt CD4 + T (merkezi her iki bellek ve efektör bellek fenotipleri tarif edilmiştir) hücreleri tarafından hakim olur ve, 3 gün sonra yanıt tarafından yüksek kesirler hakimdir PPD özel sitokin CD4 + T hücreleri2,8,10,15,21üreten. Bu adaptif sitokin yanıtın 2 hafta2,8,10,23' den daha fazla bilgi için algılanabilir kalır. Gün 7 mesaj-TST bellek CD4 + T hücreleri2üreten sitokin topluluğu için en uygun zaman noktası gibi görünüyor. Ancak, diğer zaman puan tabii, antijen ve yanıt ilgi bağlı olarak ilgili olabilir. Notun bir çalışmada, adaptif PPD yanıt biraz daha erken zaten de 5 gün mesaj-TST10pro-inflamatuar sitokin salgısının bir azalma ile zirve bildirilmiştir.

SB sıvı pro-inflamatuar sitokinlerin ve cilt microenvironment15,24temsilcisi olarak gösterilen diğer proteinler yüksek düzeyde içerir. TNF-α IFN γ düzeyleri ve bu SB sıvı pik IL-2 düzeyleri zirve sırasında 3 gün sonra 7 gün2,10' dan sonra muhtemelen bu daha sonraki aşamada adaptif yanıt hakimiyeti yansıtan kinetik çalışmalar göstermiştir. SB hücreleri aktif vivo içindeçünkü, onlar yüksek spontan sitokin yayın hem de restimulation (Şekil 3 ve 4) üzerine belirli bir yayın için potansiyel bir sergi.

Bu rapor CD4 + T hücre bağışıklık üzerinde duruluyor. Olarak gösterdiği Rakam2, izole T-hücreleri çoğunluğu gerçekten CD4 + vardı, oradayken neredeyse hiçbir CD8 + T-hücreleri emme sıvı blister. Düşük oranlarda ve CD8 + T-hücreleri CD4 + T hücreleri2,8,10,23için karşılaştırıldığında daha aşağı bir göçmen kapasite raporlama diğer SB PPD-hatırlama çalışmaları doğrultusunda bu. CD8 + katkı daha fazla karakterizasyonu tercih olurdu; Ancak, bu bu raporu kapsamý dýþýndadýr.

T-hücreleri Mtbbağışıklık denetim için temel olarak kabul edilir; Ancak, güvenilir bir ilişkili kan25,26edinilmiş bağışıklık yanıtındaki yansıyan koruma tanımlamak zor olmuştur. Şu anda olduğu gibi büyük ve çok pahalı etkinlik denemeleri27hiçbir alternatif bu barikatı ciddi yeni TB aşıların geliştirilmesi engel. TB aşı geliştiriciler aşı özel T-hücre popülasyonlarının kan28,29küçük ve geçici değişikliklerinin değerlendirilmesi tarafından aşı immünojenisite belirlemek. Ancak, antijen spesifik T-hücreleri kanda bulunan dolaşan küçük kısmını ilgili olup olmadığı sorgulanabilir (yani, bir enfeksiyon ve T hücre zengin microenvironment kontrol temsilcisinin siteye geçirme yeteneğine sahip Mtb) 27 , 30 , 31 .

Önceki çalışmalarda ve burada sunulan veriler temel alınarak, SB kutanöz geri çekme modeli aşı özel T-hücrelerinin incelenmesi için bir kullanılmayan potansiyeli temsil eder. Sadece model bir aşı üretilen yanıt on yıl önce bir geri çağırma izin vermez, aynı zamanda gerçek bellek değerlendirilmesi bir doku özel bağlam15,18,19,21potansiyel sağlar. Roman, aynı zamanda oluşan antijenleri aday alt birim TB aşıların dahil, belirli Cilt testleri bu model28,32kullanarak aşı değerlendirme için yeni fırsatlar öneririz. Ayrıca, bir hücre - mediated bağışıklık yanıtı PPD meydan ciltte oluşturulan Mtbiçinde bulunan Yanıt benzer olduğunu transcriptomic analizleri öneririz-enfekte akciğer18.

Cilt punch biyopsi de deriden bir hücre hasat için izin ve SB örnekleme ile karşılaştırıldığında mekansal bilgi sağlamak belgili tanımlık yöntem daha invaziv ve tek hücreli süspansiyonlar33hazırlamak için enzimatik veya mekanik işlem gerektirir. Sitokinler ve hücre işaretleri ölçümleri arasında iki yöntem2,10karşılaştırılabilir.

Emme blister yöntemi zaten Dermatoloji, yanı sıra tıbbi araştırma birçok alanda tek başına veya birlikte bir sistemik veya yerel cilt meydan okuma ile uygulanmış. Sepsis, Epstein - Barr virüsü ilişkili lenfoproliferatif hastalığı, diyabetik nöropati, glukokortikoid alımı etkileri ve insan denemeler terapötik antikorlar veya modelleri T hücre hedeflenmiş tedaviler10 için test çalışmaları örnek gösterilebilir ,34,35,36,37,38.

Terapötik bir bakış açısından SB kutanöz geri çekme yöntemi merkezi T-hücre bellek potansiyel çalışmaya benzersiz avantajlar sunuyor ve -her iki biyolojik ve teknik bakış açısı-cilt ilgili örnekleme yuvası2, sağlamak gibi görünüyor 15,18,19,21. Özellikle, PBMCs dolaşan geleneksel, pasif örnekleme kıyaslandığında, SB kutanöz geri çekme yöntemi yanıt-e doğru onların ilgili antijen lenf düğümünde geçirmek ve yerel tamamlamak yeteneği kanıtlanmış T-hücreleri çalışma için sağlar genişleme ve farklılaşma bir doku özgü vivo içinde bağlam15,18,19,21.

Sonuç olarak, model burada insan edinilmiş bağışıklığın ve T hücreli hedefleme aracılarının (yani, bulaşıcı hastalık vaccinology veya kanser araştırma) alanındaki araştırmacılar için ilgili olabilir gösterdi. Bu protokol için uygulanan TST modeli olduğunu, tabii ki, TB vaccinology alanında özel konu ile ilgili. Ancak, bu model temel kavramı diğer araştırma alanlarında son derece geçerlidir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgements

Mads Radmer Jensen onun pratik ve akademik danışmanlık için teşekkür etmek istiyorum; Lau Lindqvist ve teknik uzmanlık sağlamak için Kaare Svejstrup; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt ve Solveig W. Harpøth kendi teknik yardım için; Gentofte TB polikliniğine PPD yönetim eğitimleri için de personel; ve tüm gönüllü çalışmaya katıldığınız için. Bu proje Avrupa Komisyonu H2020 program [grant numarası TBVAC2020 643381] tarafından finanse edilen ve konsorsiyum ortaklarının verimli tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50, (2), 129-137 (1968).
  2. Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173, (2), 163-172 (2013).
  3. Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172, (2), 323-330 (2015).
  4. Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
  5. Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44, (2), 256-262 (2017).
  6. Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23, (1), 3-12 (2017).
  7. Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11, (10), (2016).
  8. Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97, (1), 101-110 (1987).
  9. Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6, (12), 4790-4795 (2015).
  10. Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65, (5), 389-404 (2016).
  11. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107, (2), 93-101 (2006).
  12. Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30, (33), 4907-4920 (2012).
  13. CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
  14. Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190, (3), 977-986 (2013).
  15. Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199, (10), 1433-1443 (2004).
  16. Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195, (1), 386-392 (2015).
  17. Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132, (1), 114-123 (2012).
  18. Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12, (3), e1005469 (2016).
  19. Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41, (11), 3253-3260 (2011).
  20. Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3, (1), 2-6 (2012).
  21. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107, (2), 93-101 (2006).
  22. Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, (1), 15-21 (1999).
  23. Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21, (2), 369-376 (1991).
  24. Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7, (20), 3638-3650 (2007).
  25. Flynn, J. L., Chan, J. Immunology of tuberculosis. Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).
  26. Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182, (8), 1073-1079 (2010).
  27. García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15, (7), 799-801 (2016).
  28. Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33, (33), 4130-4140 (2015).
  29. Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9, (2), e87340 (2014).
  30. Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10, (2), 555-564 (2016).
  31. Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11, (1), e1004603 (2015).
  32. Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5, (4), 259-268 (2017).
  33. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).
  34. Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61, (1), 53-61 (2017).
  35. Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45, (4), 444-449 (2018).
  36. Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37, (3), 357-374 (2018).
  37. Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102, (11), 4031-4040 (2017).
  38. Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83, (9), 1976-1990 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics