Лазерная захвата Microdissection высоки чисто Трабекулярная сеть от мыши глаз для анализа выражения гена

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы описываем протокол для захвата microdissection воспроизводимый лазер (LCM) для изоляции Трабекулярная сеть (TM) для анализа течению РНК. Возможность анализировать изменения в экспрессии генов в НП поможет понять глубинные механизмы глазных заболеваний, связанных с ТМ.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Лазерная захвата microdissection (LCM) позволило анализ выражения гена одной клетки и обогатили клеточных популяций в разделах ткани. LCM является отличным инструментом для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференцировки клеток и развития и прогрессирования различных заболеваний, в том числе глаукомы. Глаукома, которая включает семейство прогрессивной оптической невропатии, является наиболее распространенной причиной необратимых слепоты во всем мире. Структурные изменения и повреждения в пределах Трабекулярная сеть (TM) может привести к увеличению внутриглазного давления (ВГД), который является основным фактором риска для развития глаукомы. Однако точное молекулярных механизмов все еще плохо поняты. Способность выполнять анализ выражения гена будет иметь решающее значение в получении дальнейшее понимание функции этих клеток и его роль в регуляции ВГД и глаукома развития. Для достижения этой цели, воспроизводимый метод для изоляции высоко обогащенного ТМ от замороженной секции мыши глаза и метод для анализа выражения течению гена, такие как RT-ПЦР и РНК-Seq необходима. Метод, описанный здесь разрабатывается изолировать высоки чисто ТМ от мыши глаз вниз по течению цифровой ПЦР и анализ microarray. Кроме того этот метод может быть легко адаптирована для изоляции других высоко обогащенного глазной клеток и клеточных компартментов, которые было сложно изолировать от мыши глаз. Сочетание анализа LCM и РНК может способствовать более полное понимание сотовой событий, лежащие в основе глаукомы.

Introduction

Глаукома – это группа заболеваний, характеризуется оптической невропатии и ретинопатии, что в конечном итоге приводит к необратимой слепоте1,2. Предполагается, что к 2020 году более 70 миллионов людей во всем мире будет жить с некоторой формой болезни3,4,5,6,7. Первичной открытоугольной глаукомы (POAG), наиболее распространенным типом глаукомы, характеризуется уменьшением оттока водянистой влаги (AH), приводит к увеличению внутриглазного давления (ВГД)8,9,10, 11,12,,13143,,1516,17,18. Левый untreated, хронически повышенным ВГД приводит к прогрессивной и необратимого повреждения сетчатки и зрительного нерва голову, вызывая радиальные слепота1,2,19. Все текущие методы для замедления прогрессирования глаукомы акцент на снижение ВГД, либо снижения темпов производства Ах, цилиарного тела или повышения его отток1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Трабекулярная сеть (TM) играет жизненно важную роль в активное регулирование основной путь оттока AH, и его неправильная функция является причинным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Однако молекулярные механизмы, связанные с дисфункцией ТМ и как он регулирует дренаж AH еще не полностью изучены и в настоящее время является одним из основных направлений глаукома исследование1,2,19, 20. Хотя несколько генома всей ассоциации исследования (GWAS) связывают ряд генов глаукомы и повышенная устойчивость к AH отток объекта на ТМ, точные молекулярные механизмы, которые приводят к болезни не являются полностью осознана21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Животные модели значительно расширили наши текущие знания о прогрессирования заболевания в глаукомы (подробно рассмотрены в3,,1516,26,27,28, 29,-30,-31,-32,-33). Некоторые новаторские методы были разработаны для изучения ТМ34,35,36 , и эти методы широко используются для продвижения нашего нынешнего понимания нормальных и пораженной ткани. Одной из областей, которые не были широко изучены является использование генетически модифицированных мыши модели для изучения молекулярных механизмов ТМ отказа. Трансгенные забивные и нокаут-мыши исследования ТМ связанных генов, например Myocilin (Myoc)37,38 и39 Cyp1b1были основными средствами для изучения молекулярных механизмов ТМ функция. Понятно, что небольшой размер ТМ в мышах представляет серьезное препятствие, которое необходимо преодолеть для того, чтобы начать учиться этой ткани. Мышь модели представляют собой мощный инструмент для изучения генетики и молекулярных механизмов заболевания, хотя достижения в области технологий LCM предоставляют необходимые инструменты для расширения возможностей исследования маленьких и самых деликатных тканей, включая ТМ.

В настоящем докладе надежных и воспроизводимых метод описан для LCM высокообогащенного ТМ от мыши глаз вместе с последующей РНК изоляции и усилители для анализа течению выражение. Подобные методы были использованы успешно мышей изолировать других типов глаз тканей40,41,42,,4344, методологии, сообщили здесь могут быть применены к другой дискретные тканях глаза для изучения белков, ДНК, РНК и микроРНК. Важно отметить, что этот метод позволяет использовать генетически измененных мышей, чтобы лучше понять молекулярный патогенез ТМ обесценения глаукомы и глазные болезни3,,1516,17 ,18,,2631,45,46. Способность изолировать ТМ мыши глаза LCM будет полезным способом в получении дальнейшее понимание молекулярных механизмов нескольких глазных заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Национальный институт экологических медицинских наук (NIEHS) животное уход и использование Комитета (ACUC) одобрил все методологии настоящего исследования под NIEHS животное изучить предложение IIDL 05-46.

1. оптимальное ткани коллекции для лазерной Microdissection

  1. Получить 2-3-месяца old мышей, мужского или женского пола C57BL/6. Усыпить с CO2 минимум 1 мин, или до прекращения дыхания. Удаление животное из клетки и заверить смерти шейки матки дислокации, обезглавливание или торакотомии.
  2. Перед рассечение убедитесь, что все инструменты рассечение чистой и стерилизовать.
    Примечание: Для удаления глаза изогнутые ножницы и щипцы с зубчатыми наконечником (предпочтительный размер чаевых: 0.5 x 0,4 мм) будет необходимо.
  3. Лег мыши на плоской поверхности на его стороне так, что глаз легко доступен. Цепляемся угла глазной щели (угол глаза) с щипцами для стабилизации мыши, а затем с помощью изогнутые ножницы, стоящих перед кривой от глаз, вырезать вокруг глаз, используя глазницы в качестве руководства до глазного яблока, легко могут быть взяты из розетки (не используйте кривой Советы ножниц).
  4. Осторожно потяните и, используя изогнутые ножницы, вырезать зрительного нерва, которая выпускает глаз от орбитального сокета. Осторожно удалите не глазных тканей из глаз и промыть в 1 x-фосфатный буфер (PBS). Повторите 1.3-1.4 для контралатеральной глаз.
  5. Пятно глаз салфеткой ткани, чтобы удалить влагу до внедрения. Место глаз в образец формы (25 x 20 x 5 мм3), так что объектив и зрительного нерва параллельно верхней скамьи для получения сагиттальной секций. Вставлять глаза в оптимальной резки температуры (O.C.T.) соединение и место на сухой лед для замораживания. После того, как замороженные, храните блоков-80 ° c.

2. замороженные раздел Подготовка к лазерной Microdissection

  1. Прежде чем использовать инкубировать Терефталат полиэтилена (любимчик) мембраны слайды в крест-компоновщик УФ на максимальной мощности по 45 мин.
  2. Спрей РНКазы обеззараживания решение на щетку, щипцы, муфты банки и монтажа патрона. Тщательно протрите. Сполосните свободной от нуклеиназы водой и высушите. Протрите криостат с 100% этанола, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  3. Отрегулируйте криостата до-18 ° C. Удалите один из замороженных блок от-80 ° C морозильник одновременно и доставить криостат с сухим льдом. Разрешить замороженные блок, чтобы сбалансировать с температурой криостат для минимум 10 мин.
  4. Выдавить небольшое количество O.C.T. на монтаж блока (рис. 1A) и снимите блок ткани от плесени и осторожно поместите блок на монтажный зажим (рис. 1B). Как только блок ткани на монтажа патрона является замерзла, вставьте держатель образца криостата (рис. 2A).
  5. Отрегулируйте криостата сократить 8 мкм секций и тщательно раздел через O.C.T. блок для достижения образца ткани. Как только ткани наблюдается, остановить секционирование, обрезать замороженных блоков на всех сторонах, с использованием чистого лезвие бритвы и оставляют 3-4 мм O.C.T., окружающие ткани, чтобы включить обработку с кистью (рис. 2B). Используйте новую щетку чистой краской вместо рулон пластины между каждого изменения образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения образца.
  6. Раздел через глаз, работает быстро. Пятно, пятно каждый третий раздел от наводнения на слайд с быстрой одношаговый гематоксилином и эозином (H & E) для 60 s, промыть водопроводной воды, воздух сухой, ясно в таможенного агента и смонтировать на слайде заряженных стекла с coverslip. Просмотр под микроскопом и продолжить резании до тех пор, пока ТМ проявляется в секции отрезока.
  7. Как только ТМ начинает появляться, вырезать 2 секции и смонтировать на заряженных стекла слайд для обычной H & E пятнать сформировать схему для резки с LCM.
    Примечание: Смотрите раздел 3 для карты и окрашивание деталей.
  8. После того, как первый H & E карта слайд, вырезать и линия 6 последовательных 8-мкм толщиной секций в криостат и одновременно подключить на PET мембраны слайд (рис. 3а, B). Придерживайтесь ткани, кратко двигая перчатках пальцем вдоль задней части мембраны. После монтажа, место PET мембраны слайд сразу в поле слайд на сухой лед.
    Примечание: Меньше секций могут быть установлены, однако, рекомендуется установка нескольких разделов на слайд сразу для уменьшения деградации РНК, ограничивая количество времени, каждый раздел подвергается воздействию воздуха комнатной температуры.
  9. Далее раздел глаз, после каждые два PET мембраны слайды с 6 секциями, собрать две секции на слайде заряженных стекла для создания другой слайд карту для H & E пятнать. Продолжить, секционирование, примерно 100 последовательных 8-мкм толщиной секции, пока ТМ больше не видна. Подтвердите, быстро пятнать один раздел на слайде заряженных стекла (см. 2.6).
  10. Хранить все ПЭТ мембраны слайды при температуре-80 ° C для использования в дальнейшем LCM.

3. H & E карта слайд окрашивание протокол и морфологический обзор

  1. Чтобы визуализировать и обзор карты слайды на слайдах заряженных стекла, исправить ткани немедленно передавать в окрашивание кувшин наполнен 100 мл раствора быстрой фиксации для 7 s. полоскания слайд путем окунать его в дистиллированной воде 10 - 20 раз , затем перенесите слайд муфта сосуд с чистой дистиллированной воды.
  2. Удалить слайд из воды и помарки сухой кромки с wipe ткани. Пипетка 200 мкл изменение фильтруют гематоксилином Харрис на каждой секции и Инкубируйте 30 s при комнатной температуре. Тщательно промойте слайд под проточной водой до тех пор, пока вода течет ясно. Пятно конец слайда с wipe ткани между каждым шагом (блот между каждым шагом от 3,2-3,5), чтобы удалить лишнюю жидкость.
  3. Место слайда в однократном ПБС при комнатной температуре за 30 s. Затем, тщательно промойте слайд под проточной водой для 30 s.
  4. Погрузите слайд 3 - 4 раза в 95% этаноле ванну. Применить раствор красителя достаточно эозина Y для покрытия тканей на слайде и Инкубируйте 15 s при комнатной температуре.
  5. Промывайте слайд в 95% этаноле ванна два раза с быстрой провалы 10-20. Промывайте слайд в 100% этанола ванна два раза с быстрой провалы 10-20. Затем промойте слайд два раза в ксилоле ванна (10-20 по быстрой провалы).
  6. Маунт, применяя смолистые монтажа средних тканей, добавить coverslip тщательно, чтобы избежать воздушных пузырей и дайте высохнуть на ночь в капюшоне.
  7. Обзор H & E слайды, визуально или с помощью цифровых слайд сканера. Идентифицировать карту слайды с ТМ четко видны и доступны для резки. Используйте PET мембраны слайды между этими карта слайды для LCM.

4. Полиэтилен полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны слайды протокол обработки и окрашивания

  1. До удаления PET слайды из морозильной камеры сначала подготовить количество кресил фиолетовый раствор путем растворения количество кресил фиолетовый ацетата 0,3 г в 20 мл 75% этанола и поместите на шейкер для 2 h. фильтр решение с 0,22 мкм стерильным фильтр и хранить при 4 ° C не более чем 6 мес тыс.
  2. Подготовьте спиртовым раствором эозина Y с свежими 75% этиловом спирте в соотношении 1:4. Подготовьте фиксации (75% этиловом спирте) и обезвоживания решения (75%, 95% и 100% этиловом спирте) в чистой, свободной от нуклеиназы, 50 мл конические полипропиленовые трубы на льду. Каждое решение добавьте АБС битор РНКазы.
  3. Удалите поле слайд, содержащий разделы замороженные ткани от-80 ° C морозильник и поместите его на сухой лед. Процесс один слайд на время. Исправить слайды, поместив слайд сразу в холодную этанол 75% для 30 s.
  4. Аккуратно погрузите слайд в свободной от нуклеиназы воде на 10-15 s распустить O.C.T. без вмешательства в разделах ткани.
  5. Тщательно Пипетка 300 мкл 1,5% количество кресил фиолетовый ацетата раствор непосредственно на разделы и проинкубируйте 45 s при комнатной температуре. Затем вымойте один раз, поместив его в ванну этанол 75% для 30 s. пипеткой 200 мкл рабочего раствора эозина Y-раствор на разделы и Инкубируйте 3-5 s.
  6. Обезвоживания тканей, поместив слайд впоследствии в 75% этанола 95% этиловом спирте и, наконец, 100% этанола ванна для 30 s каждый. Пятно в конце слайда с wipe ткани между каждый шаг, чтобы удалить лишнюю жидкость. Пусть воздух слайд полностью высушите под капотом на 5 мин. После высыхания, выполняют LCM сразу же после этого.
    Примечание: Рекомендуется избегать использования ксилол для этого шага, он может вызвать разделов ткани неадекватно облигаций на слайд мембраны и снижает эффективность захвата ткани.

5. Лазерная Microdissection с УФ лазер

  1. Включите компьютер и разрешить загрузку. Включите Микроскоп белый свет блок питания. Включите УФ лазер ключ и желтый светодиод загорится. Запустите программу LCM, позволяют полностью загрузки и живое видео будет отображаться. Нажмите кнопку лазера на поле контроллера и загорится зеленый светодиод.
  2. Загрузить новый слайд стекла на сцену Микроскоп, а затем поместить слайд мембраны PET с окрашенных тканей лицевой стороной вниз прямо на вершине стеклянное скольжение. Убедитесь, что мембрана и стеклянное скольжение связыванны плотно на микроскопа.
  3. LCM Пуск первого устанавливая пределы слайда. Выберите низкий 4 X масштаб на панели объективных (рис. 4). Затем определите рабочую область слайда мембраны, перемещая Микроскопы xy этап до тех пор, пока верхний левый угол, где сходятся металла и мембрана видна в живой видео-канал, нажмите кнопку «Предел 1» и красный прямоугольник будет появляться на roadmap. Далее перейти к стадии xy в противоположный угол и нажмите на кнопку «ограничить 2». Нажмите кнопку «Проверка» для создания образа схема оболочек и тканей между установленных лимитов.
  4. Дважды щелкните вблизи ТМ одного из глаз секций в рамках «дорожной карты», ТМ могут быть расположены вблизи вершины угла иридо (Рисунок 5A). После того, как была обнаружена ТМ, увеличьте масштаб до 10 X и вручную фокус на ТМ. Повторите с 20 X и 40 X целей. Когда ТМ находится в фокусе с тем 40 X (Рисунок 5B), перейдите в пустую область рядом (фокус может потребоваться немного скорректированы), выберите «инструмент freehand рисования» и нарисуйте длинной линии на пустой области ткани.
  5. Задайте параметры лазерного, чтобы «отрезока скорость» составляет 34%, «фокус» – 58%, и «власть» составляет 70% (Рисунок 4), а затем нажмите кнопку «Вырезать». Корректировать тонкой лазерная скорость, фокус, и параметры мощности до тех пор, пока четкой и тонкой леской наблюдается (см. рис. 5 c). Для точной резки, убедитесь, что операция резки по следующим нарисованные линии.
  6. Загрузить изоляции труб крышку держателя крышки и откройте трубки. Прикрепите держатель крышка Кап-подъемник и убедитесь, что трубка инвертируется. Заверить, что клей крышка материала выступает за кончик крышку, чтобы убедиться, что нужный ткани должным образом захвачено.
  7. Выберите режим «Вручную» рассечение в панели программного обеспечения. Внимательно изучите, что ТМ, (Рисунок 5B) находится непосредственно под изоляции труб. Установите баланс белого и отрегулировать яркость, чтобы получить оптимальное качество изображения (рис. 4).
  8. Чтобы начать резки, вручную настроить фокус и нарисуйте линию с помощью карандаша, убедитесь, что крышка коллекции остается в верхнем положении, пока не касаясь мембраны. Ничья частичной круги возле где ТМ встречает склеры (рис. 5 c), затем нажмите «Вырезать». После этого первого сокращения, поместите колпачок в нижнем положении и повторно настроить фокус, а затем нарисуйте две линии в открытых или свободного пространства для подключения двух частичных круги, завершить круг вокруг ТМ, затем нажмите «Вырезать» и собирать ткани из раздела , убедитесь, что ТМ была подхвачена microdissection колпачок (Рисунок 5 D-F).
  9. Установите крышку обратно в верхнем положении и повторить (5.2-5.8) на остальных участках. Слегка отрегулируйте положение колпачок, так что все изолированные примеры помещается на крышку и не перекрываются (рис. 5 g). Для обеспечения согласованности окно времени для одного слайда — 20 минут использования меньше секций за животное слайда, если требуется больше времени для изоляции ТМ из всех разделов. Для следующего ПЭТ мембраны Вставьте новый изоляции труб и повторите раздел 5.

6. lysis ткани ТМ Microdissected

  1. Свеже Подготовьте РНК литического буфера для лизируют LCM изолированные ткани. Добавьте 10 мкл β-меркаптоэтанол каждый 1 мл буфера lysis. Храните литического буфера с β-меркаптоэтанол при комнатной температуре не более 1 месяца.
  2. Снять колпачок держателя в течение 20 мин от начала microdissection изоляции труб. Визуализация поверхности колпачок на глаз для обеспечения захвата ТМ.
  3. Тщательно Пипетка 10 мкл буфера lysis на крышке коллекции трубки обеспечение литического буфера полностью покрывает microdissected TM. Аккуратно закройте клей крышка и инкубировать коллекции трубу вверх вниз при комнатной температуре в течение 10 мин. После инкубации центрифуги на 800 x g на 2 мин и lysate на сухой лед. Хранить лизатов на-80 ° C для последующей очистки и анализа.

7. РНК изоляции и анализ качества

  1. Анализировать качество РНК, оттаивания образцов при комнатной температуре. Бассейн вместе все образцы изолированы от мыши в один свободный РНКазы 1,5 мл отцентрифугировать трубку.
    Примечание: например, для каждого биологического реплицировать, 10-12 трубы с microdissected наконечниками в 10 мкл lysate были созданы и все лизатов были переведены в одну трубу для каждого биологического репликации (lysate µL 100-120).
  2. Каждый lysate решение добавьте один объем свежеприготовленные 70% этанола (сделанные с РНКазы свободной воды). Затем очищайте всего РНК после руководство пользователя Комплект изоляции РНК. Обеспечивает удаление геномной ДНК от каждого образца РНК.
    Примечание: Геномной ДНК может мешать течению РНК анализа.
  3. Измерьте качество РНК, изолированные от ТМ путем объединения образцов из каждой мыши и анализа целостности рибосомная РНК (Рисунок 6A).
    Примечание: Из-за небольшого размера ТМ, пики рибосомной РНК не может быть наблюдаемой (Рисунок 6B) на РНК качество профиля (две пики наблюдаются между 1000-4000 bp в рисунке 6A, C) который используется для вычисления числа целостности РНК (Рин) 47.
    1. Получите более точное измерение целостности РНК, изолировать РНК из более обильные оставшиеся ткани на слайде мембраны. Для получения представитель Рин, изолировать РНК от глазных тканей на слайде мембраны дозирования 10 мкл лизис буфера на раздел одной ткани и выполнять РНК изоляции. Анализ качества РНК и рассчитать Рин (рис. 6 c).
  4. Для нисходящие РНК приложения используйте низкий входной РНК комплект для секвенирования и cDNA поколения библиотека для получения воспроизводимых результатов как 80 секций LCM изолированных ТМ.

8. анализ

  1. Чтобы убедиться, что ткани собранные в действительности обогащается в ТМ связанных генов, соберите несколько дополнительных РНК от microdissected весь глаз, склера, Ирис, сетчатки, роговицы и объектив от 3 отдельных мышей. Использовать собранные Эта РНК в сочетании с LCM РНК от изолированных ТМ и цилиарного тела, собранных из 4 отдельных мышей.
  2. Конвертировать РНК из образцов microdissected было cDNA, используя набор cDNA обратной транскрипции. Усилить РНК от изолированных LCM образцов и конвертировать в cDNA, используя низкий вклад cDNA комплект РНК.
  3. Анализировать все РНК для Трабекулярная сеть, выражая генов, myocilin (MYOC) и альфа актин-2 (ACTA2) и нормализации с помощью HSP90a1 уборки гена цифровой ПЦР (рис. 7A-B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LCM собранные РНК от ТМ и цилиарного тела от 4 разных мышей был выделен для того, чтобы иметь возможность анализировать экспрессии генов и сравнить с тем выражение в весь глаз, склера, Ирис, сетчатки, роговицы и объектив изолированы от трех отдельных мышей. ТМ, выражая генов, MYOC48 и49 ACTA2были проанализированы во всех тканях, собранных для подтверждения, что изолированные ТМ образцы были действительно сильно обогащенный в НП. Из-за крайне низкой количество cDNA от образцов LCM цифровой PCR был использован, который было доказано быть более воспроизводимые с менее материала50. Выражение MYOC и ACTA2 нормализуется с использованием HSP90a1 уборки ген, то каждая ткань была по сравнению с весь глаз. Эти результаты показывают, что MYOC (Рисунок 7а) и ACTA2 (Рисунок 7B) очень выражены в проб ТМ, подтверждающий успешное изоляции высокого качества РНК от высокообогащенного ТМ образцов для вниз по течению РНК анализ. Как доказательство концепции этот метод был применен к ТМ изолированные РНК подготовлен от WT мышей и штамм мышей с повышенным ВГД фенотипа и проанализированы microarray. Этот анализ выявил многих генов, причастны глаукомы, которые выражаются дифференциально между ТМ WT мышей и мышей с фенотипом глаукомы (рис. 7 c).

Figure 1
Рисунок 1: размещение замороженные ткани блока в криостата. (A) O.C.T монтаж среднего применяется к криостат монтажа блока. (B) равномерно замороженных образцов блок размещается на монтажа патрона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: секционирование процедура замороженных глаз ткани в криостата. (A) подготовка режущей поверхности для достижения тканей глаза. (B) тримминг O.C.T. замороженных блока перед сбором разделы для лазерной microdissection. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: подготовка замороженных секций в криостата. (A) 6 последовательных 8 µm толщиной секций выстроились в криостата. (B) одновременно разделы монтируются на слайде PET мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рис: скриншот лазерной microdissection программного обеспечения выделения важных особенностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: расположение Трабекулярная сеть и УФ лазер параметров для правильной изоляции Трабекулярная сеть. (A) Low (4 X) увеличение одного раздела на мембране PET, подчеркнув Трабекулярная сеть для лазерной microdissection. (B) высокой (40 X) увеличение Трабекулярная сеть и прилегающих тканей. (C) первой части круга отрубы ТМ вблизи склеры региона с крышкой в верхнем положении. (D) финал сокращений в свободном пространстве, что полный круг вокруг ТМ с крышкой в нижнем положении. (E) ТМ удалены из секции и (F) прилагается к крышке. (G) несколько сократить разделы вырезанные из же ПЭТ мембраны не перекрывающихся приклеенная к крышке. S (склера), SC (шлеммова канала), ТМ (Трабекулярная сеть), AC (передней камеры). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Общая РНК урожайность и качество оценки получены из microdissected ткани Трабекулярная сеть. (A) всего РНК из 80 секций Трабекулярная сеть (размер приближенная области было 0,8 мм2). (B) всего РНК из 20 сегментами Трабекулярная сеть (размер приближенная области был 0,2 мм2). (C) всего РНК от остальных тканей глаза после лазерной microdissection. Рин, РНК целостности номер; BP, пар оснований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: вниз по течению РНК анализ LCM изолированные Трабекулярная сеть. Количественные цифровой анализ ПЦР ТМ связанных генов в изолированные LCM ТМ. TM-связанных генов (A) MYOC (B) ACTA2 сильно выражена в LCM захватили ТМ образцов по сравнению с другими тканей глаза. (C) создается из данных, полученных от microarray анализ Трабекулярная сеть РНК Heatmap изолированы от WT мышей и KO мышей с повышенным ВГД фенотипом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: сравнение подготовки ткани до и после оптимизации. Глаз разделы вырезать и размещены на PET мембраны слайды либо с (A) подготовка обезвоживания Стандартный 95% этанола (B) или подготовка обезвоживания оптимизированный 75% этанола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ТМ играет жизненно важную роль в поддержании активно гомеостатических ВГД и его дисфункции широко признается основным побудительным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Количество единичных нуклеотидных полиморфизмов в нескольких генов определены методом GWAS анализа были связаны с риск увеличения глаукомы и повышенная устойчивость к AH отток объекта на ТМ; Однако точные молекулярные механизмы, которые приводят к этой болезни еще не полностью понял21,,2223,24,25. Генетическая мыши модели могут служить мощным инструментом для изучения молекулярных механизмов глаукомы. Однако небольшой размер мыши ткани ТМ представляет собой грозный вызов для изоляции высокообогащенного ТМ от мыши глаза и высокое качество РНК для анализа выражения гена. LCM — это ценный метод для изоляции одного или низкое количество клеток и может использоваться для изучения экспрессии генов в образцах тканей, обогащенные для типов конкретных клеток. В этом исследовании надежных и воспроизводимых LCM метод описан изолировать высокообогащенного ТМ и высокое качество РНК, которые могут быть использованы для изучения регуляции экспрессии генов и ячейки сигнализации в НП. Кроме того описан метод LCM также может применяться для других тканей внутри глаз.

LCM технологии и большое внимание к деталям для оптимизации обработки ткани играют жизненно важную роль в успешном развитии этого метода. Методология сохранения тканей и изоляции является ключевым компонентом в изоляции высокого качества РНК для профилирования выражения гена. LCM требует очень высокого внимания к деталям в разбор, cryosectioning, фиксация, окрашивание, обезвоживание и длительность лазерного microdissection чтобы быть успешным в получении качество РНК51. Может быть увеличена толщина среза ткани; Однако как толщина увеличивается так УФ лазерного необходимую мощность. Увеличение лазера мощностью результаты широкого пути лазера, который может привести к деградации РНК. Было установлено, что лазер путь с 8 мкм секций был тонким и достаточно ткани течению РНК анализа. Рисунок 8 показывает, как оптимизация подготовки ткани может кардинально изменить способность лазерные вскрыть ТМ от глаз. Оптимизации этот шаг в протоколе (как описано в разделе 4) дали улучшенный иммобилизации глазные ткани и полное удаление O.C.T. (Рисунок 8B), просто используя 75% вместо этанола 95% (рис. 8A) для обезвоживания тканей После инкубации в РНКазы свободной воде для удаления установки средств массовой информации. Дальнейшего обезвоживания и пятнать достигается с помощью спиртовой основе окрашивание реагентов. Кроме того было установлено, что на спиртовой основе окрашивание реагентов дало улучшенные результаты по отношению к водной окрашивание реагентов (на водной основе количество кресил фиолетовый или гематоксилином) и далее помогает сохранить целостность РНК52. В целом обработка глазных тканей, с использованием оптимизированного протокола с на спиртовой основе окрашивание реагентов принесли последовательной глазной-разделов ткани которые были полностью иммобилизованных на слайде PET мембраны.

Наша цель для этого исследования заключалась в разработке прочный и надежный метод для изоляции высокого качества mRNA от ТМ мышь глаз вниз по течению выражение анализа для того, чтобы получить понимание молекулярных механизмов, которые лежат в основе повышенным ВГД и глаукомы. Как показано в heatmap в рисунке 7 c, описанных Протокол изоляции ТМ, LCM обеспечивает весьма надежный способ изолировать РНК от ТМ и изучать различия в экспрессии генов в НП от дикого типа и мутантов мышей. Метод, описанный здесь позволит следователям выполнять молекулярного анализа на ткани, центральное место в патогенезе глаукомы в в естественных условиях системы, которая является относительно простой и надежной и может быть применен к анализ выражения гена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86, (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377, (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32, (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80, (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90, (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82, (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73, (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130, (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14, (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121, (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4, (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8, (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40, (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29, (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4, (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11, (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12, (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57, (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15, (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75, (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24, (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52, (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28, (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183, (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91, (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280, (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30, (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10, (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416, (1), 123-125 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics