לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור microdissection לכידה לייזר לשחזור (LCM) לבידוד meshwork trabecular (TM) לניתוח RNA במורד הזרם. היכולת לנתח שינויים בביטוי הגנים ב ה-TM יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מחלות עינית הקשורות TM.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

לייזר לכידת microdissection (LCM) מותר ניתוח ביטוי גנטי של תאים בודדים, מועשר תא אוכלוסיות בסעיפים רקמות. LCM הוא כלי נהדר עבור חקר המנגנונים המולקולריים שבבסיס תאית התמיינות ואת פיתוח ההתקדמות של מחלות שונות, כולל גלאוקומה. גלאוקומה, אשר כוללת משפחה של מחלות עצבים אופטית מתקדמת, היא הסיבה השכיחה ביותר לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם. שינויים מבניים ונזק בתוך meshwork trabecular (TM) יכול לגרום לחץ תוך-עיני מוגבר (IOP), המהווה גורם סיכון עיקרי לפתח גלאוקומה. עם זאת, המנגנון המולקולרי מדויק מעורבים הם הבינו עדיין כהלכה. היכולת לבצע ניתוח ביטוי גנטי תהיה מכרעת בהשגת עוד תובנות הפונקציה של תאים אלה ותפקידו בוויסות IOP ופיתוח גלאוקומה. כדי להשיג זאת, שיטה ישימה עבור בידוד גבוהה מועשר TM ממקטעים קפוא של העכבר ואת שיטת ניתוח ביטוי גנטי במורד הזרם, כגון RT-qPCR ו- RNA-Seq נדרש. השיטה המתוארת במסמך זה מפותח כדי לבודד TM מאוד טהור עיניים העכבר PCR דיגיטלי במורד הזרם וניתוח microarray. בנוסף, טכניקה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של תאים עינית מועשר אחרים, עבורן תא היה קשה לבודד מעיני העכבר. השילוב של הפונקציה LCM וניתוח RNA יכול לתרום להבנה מקיפה יותר של האירועים הסלולר שבבסיס גלאוקומה.

Introduction

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות המאופיינת נוירופתיה אופטית, רטינופתיה שמוביל בסופו של דבר לעיוורון בלתי הפיך1,2. ההערכה היא כי על ידי 2020 נגמר אגור 70 מיליון אנשים ברחבי העולם עם צורה כלשהי של המחלה3,4,5,6,7. ראשי פתוח גלאוקומה (POAG), הסוג הנפוץ ביותר של גלאוקומה, מאופיינת בירידת יצוא aqueous הומור (AH) שמוביל מוגברת לחץ תוך-עיני (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. IOP אינה מטופלת כראוי, באופן כרוני מוגברות השמאלי מוביל לנזק הדרגתיים ובלתי הפיכים הרשתית ואת ראש עצב הראייה גרימת עיוורון רדיאלי1,2,19. כל השיטות הקיימות עבור להאט את ההתקדמות של גלאוקומה דגש על צמצום IOP, או על ידי הפחתת קצב הייצור של AH על ידי הגוף ריסי או שיפור זה תזרים1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. meshwork trabecular (TM) ממלא תפקיד חיוני בוויסות באופן פעיל את השביל הראשי של יצוא AH אשר תפקידה לא תקין הוא גורם סיבתי עבור לחץ דם גבוה גלאוקומה1,2,19. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הקשורים בתפקוד TM איך זה מווסת AH ניקוז אינם עדיין לגמרי מובנים, נמצא כעת והמוקד העיקרי של גלאוקומה מחקר1,2,19, 20. בזמן הגנום כולו האגודה מספר מחקרים (GWAS) יש מקושרים מספר גנים גלאוקומה, עמידות מוגברת למתקן יצוא AH-ה-TM, המנגנונים המולקולריים המדויק להוביל המחלה אינם עוד מובן במלואו21 , 22 , 23 , 24 , 25.

מודלים בעלי חיים יש שיפור משמעותי שלנו הידע הנוכחי של התקדמות המחלה ב גלאוקומה (בהרחבה שבתוך3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). פותחו מספר שיטות חלוצית ללמוד TM34,35,36 , שיטות אלה היה בשימוש נרחב כדי לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של רקמה נורמלית וחולים. תחום אחד כי לא היה חקר בהרחבה הוא השימוש של מודלים מהונדס גנטית עכבר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של כשל TM. הטרנסגניים טוק-in ו העכבר מעלף מחקרים של גנים TM הקשורים, כגון Myocilin (Myoc)37,38 , Cyp1b139, כבר הכלים הראשי עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של TM פונקציה. מובן, גודל קטן של ה-TM בעכברים מייצג משוכה רצינית שחייבים להכריעו על מנת להתחיל ללמוד הרקמה הזאת. העכבר דגמים מייצגים כלי רב עוצמה עבור ללמוד את הגנטיקה ואת המנגנונים המולקולריים של המחלה, כאשר ההתקדמות בטכנולוגיות LCM לספק את הכלים הדרושים כדי להעצים את המחקר של הרקמות הקטן ביותר ועדינים ביותר, כולל ה-TM.

בדו ח זה, מתוארת שיטה לשחזור ועמיד עבור LCM של TM מועשר מעיני העכבר יחד עם עוקבות בידוד RNA ו הגברה לניתוח ביטוי במורד הזרם. שיטות דומות שימשו בהצלחה בעכברים כדי לבודד סוגים אחרים של העין רקמות40,41,42,43,44, המתודולוגיה דיווח בזאת ניתן ליישם את השני רקמות דיסקרטית של העין ללמוד RNA, microRNA, DNA, חלבונים. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת את השימוש עכברים מהונדסים כדי להבין טוב יותר בפתוגנזה מולקולרית של ליקוי TM גלאוקומה, מחלה עינית3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. היכולת לבודד את ה-TM של העכבר עיניים על ידי אופנת LCM יהיה טכניקה שימושית בהשגת עוד תובנות המנגנונים המולקולריים של מספר מחלות עינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הלאומית המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) אישר כל מתודולוגיה של מחקר זה תחת NIEHS החיה ללמוד את ההצעה IIDL 05-46.

1. אוסף רקמה אופטימלית עבור לייזר Microdissection

  1. להשיג 2 לעכברים בת 3 חודשים, זכר או נקבה C57BL/6. המתת חסד עם CO2 למשך תקופה מינימלית של 1 דקות או עד להפסקת נשימה. הסר את החיה לכלוב ולהבטיח מוות על-ידי נקע צוואר, עריפת ראש, או ניקור חזה.
  2. לפני ניתוח, לוודא שכל כלי חיתוך פשוטים ונקיים מעוקר.
    הערה: עבור הסרת העיניים מעוקל מספריים וחדים עם קצה משונן (העדיפו גודל קצה: 0.5 x 0.4 מ מ) יהיה צורך.
  3. הנח את העכבר על משטח שטוח על צידה כך העין הינו נגיש בקלות. להתפס על canthus (בפינה של העין) עם המלקחיים לייצב את העכבר, ואז בעזרת המספריים מעוקל, מול העיקול מן העין, חתך סביב העין באמצעות ארובת העין כמדריך עד גלגל העין יכול להילקח בקלות מהשקע (השתמש העקומה לא טיפים של המספריים).
  4. משוך בעדינות וחותכים, בעזרת המספריים מעוקל, עצב הראייה, אשר משחרר את העין מהשקע מסלולית. הסר בזהירות את הרקמה הלא-העינים מן העין שטיפה 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). חזור על 1.3-1.4 עבור העין contralateral.
  5. כתם העין עם מגבון רקמות להסרת לחות לפני הטבעה. המקום העין לתוך הדגימה עובש (25 x 20 x 5 מ מ3) כך העדשה ואת עצב הראייה מקבילים לפסגה ספסל על מנת לקבל חלקים הווריד. להטביע את העיניים ב אופטימלית חיתוך טמפרטורה (O.C.T.) מתחם ומניחים על הקרח היבש להקפיא. לאחר קפוא, אחסן את רחובות ב-80 מעלות צלזיוס.

2. סעיף. מוקפאים הכנה לייזר Microdissection

  1. לפני השימוש דגירה פוליאתילן terephthalate (PET) ממברנה שקופיות ב- UV מחדש בעוצמה מקסימלית למשך 45 דקות.
  2. תרסיס RNase פתרון טיהור על המברשת, מלקחיים, צימוד צנצנות, והרכבה צ'אק. נגב ביסודיות. לשטוף עם מים ללא נוקלאז ויבש. לנקות את cryostat עם אתנול 100% כדי למנוע זיהום צולב.
  3. להתאים את cryostat ל-18 מעלות צלזיוס. להסיר אחת בלוק קפוא במקפיא-80 ° C בכל פעם ולספק cryostat עם קרח יבש. לאפשר בלוק קפוא equilibrate עם הטמפרטורה של cryostat למשך תקופה מינימלית של 10 דקות.
  4. מחצי כמות קטנה של O.C.T. על גבי גוש הרכבה (איור 1 א'), להסיר את גוש רקמות העובש ומניחים בזהירות את הבלוק על הצ'אק הרכבה (איור 1B). לאחר הרחוב רקמות על הרכבה הצ'אק קפואה, להוסיף על גבי הדגימה האוחז cryostat (איור 2 א).
  5. להתאים את cryostat כדי לחתוך סעיפים 8 מיקרומטר, סעיף בזהירות דרך הרחוב O.C.T. להגיע דגימת הרקמות. ברגע הרקמה נצפית, להפסיק חלוקתה, לקצץ את רחובות קפוא מכל הצדדים באמצעות סכין גילוח נקי ומשאירים 3-4 מ מ O.C.T. את הרקמה שמסביב כדי לאפשר טיפול עם מברשת צבע (איור 2B). השתמש מכחול נקי חדש במקום הצלחת לגלגל בין כל שינוי הדגימה כדי למנוע זיהום צולב את הדגימה.
  6. חתך דרך העין עובדת במהירות. הכתם בכל החלק השלישי על ידי הצפה של השקופית עם hematoxylin בשלב אחד מהיר, אאוזין (H & E) כתם 60 s, לשטוף עם מים מהברז, אוויר יבש, ברור בסוכן סליקה והר על משטח זכוכית טעון עם coverslip. הצג תחת המיקרוסקופ ולהמשיך חלוקתה עד ה-TM מתבטא בסעיפים לחתוך.
  7. לאחר ה-TM מתחיל להופיע, לחתוך 2 סעיפים והר על זכוכית טעונה עבור השגרה H & E מכתים כדי ליצור מפה לצורך חיתוך עם הפונקציה LCM.
    הערה: ראה סעיף 3 מפה ופרטים מוכתמים.
  8. אחרי הראשון H & E למפות שקופיות, לחתוך, בשורה 6 מקטעים בעובי 8-מיקרומטר טורי cryostat והר בו זמנית על גבי השקופית ממברנה PET (איור 3 א, ב'). דבקים הרקמה על ידי הזזה בקצרה בכפפה האגודל לאורך הגב של הקרום. לאחר הרכבה, מקם את השקופית ממברנה חיית המחמד ישר לתוך תיבת שקופיות על קרח יבש.
    הערה: סעיפים פחות עשוי להיות מותקן, עם זאת, הרכבה מספר מקטעים אותן לשקופית בבת אחת מומלץ להפחית RNA השפלה על-ידי הגבלת משך הזמן שכל חלק חשוף לאוויר בטמפרטורת החדר.
  9. המשך סעיף העין, אחרי כל שתי שקופיות ממברנה של PET עם 6 מקטעים, לאסוף שני קטעים על משטח זכוכית טעון כדי ליצור מפה לשקופית אחרת עבור H & E מכתים. המשך חלוקתה, כ 100 8 סדרתי-מיקרומטר עבה מקטעים, עד TM אינה גלויה. אשר על-ידי במהירות מכתים מקטע אחד על משטח זכוכית טעון (2.6 רואה).
  10. אחסן את כל השקופיות ממברנה PET ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש LCM מאוחר יותר.

3. H & E מפה לשקופית מכתים פרוטוקול וסקירה מורפולוגי

  1. כדי להמחיש ולסקור את מפת השקופיות בשקופיות זכוכית טעונה, תיקון הרקמה על ידי העברת מיד לתוך צנצנת מכתימים מלא עם 100 מ של הפתרון תיקון מהיר עבור שטיפה ס' 7 השקופית בטבילת זה לתוך מים מזוקקים 10 - 20 פעמים , ואז להעביר את השקופית צנצנת צימוד עם מים מזוקקים נקיים.
  2. הסר את השקופית של מים, כתם יבש בקצוות עם טישו לנגב. פיפטה 200 µL ששינה מסונן האריס Hematoxylin על כל סעיף, תקופת דגירה של 30 s בטמפרטורת החדר. לשטוף היטב השקופית תחת ברז מים זורמים עד המים זורמים ברורה. כתם בסוף השקופית עם מגבון רקמות בין שלב לשלב (חשופה בין שלב לשלב מ- 3.2-3.5) כדי להסיר את עודפי הנוזלים.
  3. המקום שקופיות ב- 1 x PBS בטמפרטורת החדר במשך 30 s. לאחר מכן, לשטוף בקפידה השקופית תחת ברז מים ל 30 s.
  4. טובלים את השקופית 3 - 4 פעמים לתוך אמבט אתנול 95%. להחיל פתרון לצבוע מספיק אאוזין Y מכסה את הרקמה בשקופית, תקופת דגירה של 15 s בטמפרטורת החדר.
  5. יש לשטוף את השקופית באמבטיה אתנול 95% פעמיים עם 10-20 מהיר מטבלים בכל. יש לשטוף את השקופית באמבטיה אתנול 100% פעמיים עם 10-20 מהיר מטבלים בכל. לאחר מכן, לשטוף שקופית פעמיים באמבטיה קסילן (10-20 מהיר מטבלים כל).
  6. טעינה על-ידי החלת שרפי הרכבה בינונית הרקמה, להוסיף coverslip בקפידה כדי למנוע בועות אוויר והנח לו להתייבש בשכונה בין לילה.
  7. סקירה H & E שקופיות באופן חזותי או באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי. לזהות מפה שקופיות עם TM בבירור לגלוי ונגיש לחיתוך. להשתמש את חיית המחמד ממברנה שקופיות בין אלה למפות שקופיות עבור הפונקציה LCM.

4. פוליאתילן Terephthalate (PET) ממברנה שקופיות פרוטוקול עיבוד וצביעת

  1. לפני הסרת שקופיות חיית המחמד מן המקפיא קודם להכין cresyl, ויולט פתרון מניות על ידי המסת אצטט cresyl, ויולט 0.3 g ב- 20 מ של 75% אתנול ומניחים על גבי שייקרס עבור 2 ח' מסנן הפתרון עם יחידת מסנן סטרילי מיקרומטר וחנות 0.22 ב 4 ° C לא יותר מאשר 6 ב' ths.
  2. להכין אאוזין Y בתמיסה אלכוהולית עם אתנול טריים 75% ביחס של 1:4. להכין קיבעון (75% אתנול) ופתרונות התייבשות (75%, 95% & 100% אתנול) נקי, נטול נוקלאז, 50 מ ל חרוט צינורות פוליפרופילן על קרח. להוסיף RNase המדכא כל פתרון.
  3. הסר את תיבת שקופיות המכילה רקמות קפוא קטעים מ-80 מעלות צלזיוס מקפיא ומניחים אותו על קרח יבש. תהליך שקופית אחת בזמן. לתקן את השקופיות על-ידי הצבת השקופית מיד אל תוך קר 75% אתנול ל 30 s.
  4. בעדינות לטבול את השקופית במים נטולי נוקלאז למשך 10-15 s כדי להמיס O.C.T. ללא הפרעה עם הסעיפים רקמות.
  5. פיפטה 300 µL של 1.5% cresyl סגול אצטט פתרון ישירות על הסעיפים ובזהירות תקופת דגירה של 45 s בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף פעם אחת על-ידי הצבתו לאמבט אתנול 75% לפתרון 30 ס' 200 פיפטה µL אאוזין Y על הסעיפים, תקופת דגירה של 3-5 s.
  6. מייבשים רקמות על-ידי הצבת לשקופית ולאחר מכן ב 75% אתנול, 95% אתנול, ואמבט בסופו של דבר, 100% אתנול ל 30 s כל. כתם בסוף השקופית עם מגבון רקמות בין כל שלב כדי להסיר עודפי נוזלים. תנו לאוויר שקופית להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע למשך 5 דקות. ברגע יבש, לבצע LCM מייד לאחריו.
    הערה: מומלץ להימנע משימוש של קסילן בשלב זה, היא עלולה לגרום מקטעי רקמת להתחבר כראוי אל השקופית ממברנה, מפחית את היעילות של רקמות לכידת.

5. לייזר Microdissection עם לייזר UV

  1. הפעל את המחשב ולאפשר לאתחול. הפעל את אספקת החשמל אור לבן מיקרוסקופ. הפעל את מפתח לייזר UV ואת צהוב LED דולקת. להפעיל את התוכנה LCM, לאפשר זה לטעון באופן מלא ווידאו חי יציג. לחץ על התיבה בקר לחצן לייזר, נורית LED ירוקה דולקת.
  2. לטעון שקופית זכוכית חדשה לבמה מיקרוסקופ ולאחר מכן מקם את השקופית ממברנה חיית המחמד עם הצד רקמות מוכתם כלפי מטה ישירות על השקופית זכוכית. ודא שאת הקרום והחלק זכוכית משויכים בחוזקה על הבמה מיקרוסקופ.
  3. LCM התחל על-ידי הראשון הגדרת הגבולות לשקופיות. לבחור את 4 הנמוך X ההגדלה בחלונית ' ' אובייקטיבית (איור 4). ואז מגדירים את אזור העבודה של השקופית קרום על-ידי הזזת מיקרוסקופים xy-הבמה עד לפינה השמאלית העליונה שבו נפגשים מתכת, ממברנה מוצגת בוידאו חי להאכיל, הקש על לחצן "מגבלת 1" מלבן אדום יופיעו על הדרכים. בשלב הבא, לעבור xy-הבמה לכיוון הפינה הנגדית, לחץ על לחצן "הגבלת 2". לחץ על הכפתור "סרוק" כדי ליצור תמונה של מפת הדרכים של קרום ורקמות בין קביעת מגבלות.
  4. לחץ פעמיים על יד ה-TM של אחד המקטעים העין בתוך הדרכים, ה-TM יכול להיות ממוקם ליד קדקוד הזווית iridocorneal (איור 5A). לאחר ה-TM זוהתה, להגדיל את רמת ההגדלה 10 X וצוות באופן ידני ה-TM. חזור עם 20 X ויעדים X 40. כאשר ה-TM בפוקוס עם המטרה X 40 (איור 5B), לנווט לתוך אזור ריק סמוך (המוקד ייתכן שיהיה עליך להתאימם במקצת), בחר את "כלי ציור ביד חופשית", לצייר קו ארוך על אזור ריק של רקמות.
  5. להגדיר את הפרמטרים לייזר כך "המהירות לחתוך" הוא 34%, "פוקוס" הוא 58% ו- "כוח" 70% (איור 4), ואז לחץ על הלחצן "קאט". לבצע התאמות לייזר בסדר מהירות, מיקוד ופרמטרים כוח עד קו חיתוך ברור וקנס נצפית (ראה איור 5C). לחיתוך מדויק, ודא חיתוך פעולה עוקב אחר קו שצויר.
  6. טען את המכסה צינור בידוד בעל כיפה ופתח הצינור. לצרף את קאפ-מחזיק למעלית קאפ וודא כי הצינור היא הפוכה. מבטיח כי החומר דבק כיפה בולטת מעבר לקצה המכסה כדי להבטיח כי הרקמה הרצויה נלכד כראוי.
  7. בחר את מצב לנתיחה "ידני" בחלונית ' תוכנה '. בעיון זה ה-TM (איור 5B) ישירות מתחת צינור בידוד. להגדיר את האיזון הלבן וכוונן את הבהירות לרכוש איכות מיטבית (איור 4).
  8. כדי להתחיל לחתוך, ידנית להתאים את המוקד, לצייר קו באמצעות הכלי ביד חופשית, ודא כי הכיפה אוסף נשאר במצב למעלה עדיין לא לגעת הקרום. לצייר עיגולים חלקית ליד שם ה-TM פוגש את sclera (איור 5C), ואז הקש "חתוך" ברגע הראשון החתכים נעשים, מקם את הכובע לתוך מטה, מחדש להתאים את המוקד ולאחר מכן לצייר שני קווים בחלל פתוח או חינם כדי לחבר את שני העיגולים חלקית משלים את המעגל סביב ה-TM, ולאחר מכן הקש "חתוך" ולאסוף את רקמת מהסעיף , ודא כי ה-TM נאסף על ידי הכיפה microdissection (איור 5 D-F).
  9. מקם את הכובע בחזרה למצב למעלה וחזור (5.2-5.8) על הסעיפים הנותרים. מעט לכוונן את מיקום הכובע כך כל הדגימות מבודד להתאים אל הכיפה, אינם חופפים (איור 5G). עקביות, חלון הזמן עבור שקופית אחת היא 20 הגבלת שימוש בסעיפים פחות לחיית מחמד להחליק אם עוד פעם יש צורך לבידוד TM של כל המקטעים. עבור ממברנה חיית המחמד הבאה, הכנס צינור בידוד וחזור על סעיף 5.

6. פירוק רקמת TM Microdissected

  1. טרי להכין מאגר פירוק RNA ל lyse LCM מבודד רקמות. להוסיף 10 µL β-mercaptoethanol לכל 1 מ"ל של המאגר פירוק. אחסן את המאגר פירוק עם β-mercaptoethanol בטמפרטורת החדר במשך חודש לא יותר.
  2. הסר את צינור בידוד מחזיק כובע בתוך 20 דקות מתחילת microdissection. דמיינו השטח כובע לפי העין כדי להבטיח לכידת TM.
  3. בזהירות פיפטה 10 מאגר פירוק µL על גבי המכסה של הצינור אוסף הבטחת המאגר פירוק מכסה לחלוטין את microdissected TM. בעדינות לסגור מכסה דבק, דגירה אוסף שפופרת הפוך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר דגירה, צנטריפוגה ב g x 800 למשך 2 דקות ומניחים lysate על קרח יבש. חנות lysates ב-80 מעלות צלזיוס טיהור וניתוח מאוחר יותר.

7. RNA בידוד וניתוח של איכות

  1. לנתח את איכות ה-RNA ידי מפשיר דגימות בטמפרטורת החדר. בריכת יחד כל דוגמאות מבודד עכבר אחת לתוך נטולת RNase שפופרת microfuge של 1.5 mL אחת.
    הערה: לדוגמה, עבור כל שכפול ביולוגי, 10-12 צינורות עם כמוסות microdissected ב 10 µL lysate נוצרו, lysates כל הועברו לתוך צינור יחיד עבור כל שכפול ביולוגי (100-120 µL lysate).
  2. להוסיף אמצעי אחסון אחד של אתנול 70% טריות (עשוי במים נטולי RNase) כל פתרון lysate. לאחר מכן, לטהר RNA סה כ לבצע את ההנחיות משתמש RNA ערכת בידוד. ודא את ההסרה של DNA גנומי כל מדגם ה-RNA.
    הערה: הדנ א הגנומי יכול להתערב עם ניתוח RNA במורד הזרם.
  3. מודדים את האיכות של RNA מבודד מן ה-TM על ידי איגוד יחד דגימות העכבר כל וניתוח תקינות ribosomal RNA (איור 6A).
    הערה: בשל גודלו הקטן של ה-TM, פסגות ribosomal RNA לא יהיה נצפות (איור 6B) בפרופיל איכות RNA (שתי פסגות שנצפה בין 1000-4000 bp ב 6A איור, ג) אשר משמש כדי לחשב את המספר שלמות של RNA (RIN) 47.
    1. להשיג מדד מדויק יותר של RNA שלמות על-ידי בידוד RNA מתוך הרקמה הנותרת שופע יותר בשקופית ממברנה. כדי להשיג נציג רין, RNA ולבודד מן הרקמה העינים בשקופית הממברנה על ידי pipetting 10 µL פירוק מאגר לתוך מקטע אחד רקמות ולבצע בידוד ה-RNA. לנתח איכות RNA ולחשב רין (איור 6C).
  4. ליישומים RNA במורד הזרם, שימוש ערכת ה-RNA קלט נמוך לדור ספריית רצף ו- cDNA להניב לשחזור נובעת מעט ככל 80 קטעים של הפונקציה LCM מבודדים TM.

8. ניתוח

  1. כדי לוודא כי הרקמה שנאספו למעשה מועשר גנים הקשורים TM, לאסוף RNA נוספות מרובות לעין כל microdissected בסקלרה, איריס, רשתית, קרנית, עדשה של 3 עכברים נפרדים. שימוש זה RNA בשילוב עם הפונקציה LCM שנאספו RNA מ מבודדים TM וגוף ciliary שנאסף 4 עכברים נפרדים.
  2. המר שהרנ א בין דגימות microdissected היה cDNA באמצעות ערכת cDNA שעתוק במהופך. להגביר את הרנ א מדגימות LCM מבודדים, להמיר cDNA באמצעות קלט נמוך רנ א cDNA לקיט.
  3. לנתח כל RNA על ביטוי גנים, myocilin (MYOC) ואלפא-אקטין-2 (ACTA2), meshwork trabecular, לנרמל באמצעות הגן משק HSP90a1 על ידי ה-PCR דיגיטלי (איור 7 א).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LCM שנאסף RNA ה-TM, גוף ריסי בלבד עכברים שונים 4 היה מבודד כדי להיות מסוגל לנתח ביטוי גנים ולהשוות את הביטוי עם זה בעין כל בסקלרה, איריס, רשתית, קרנית, עדשה מבודד שלושה עכברים נפרדים. TM ביטוי הגנים, MYOC48 ו ACTA249 נותחו על כל רקמות שנאספו כדי לאשר כי הדגימות TM מבודד היו אכן מאוד מועשר ב TM. עקב כמות נמוכה של cDNA מדגימות LCM PCR דיגיטלי שימשה, אשר הוכח להיות יותר לשחזור עם פחות גשמי50. הביטוי של MYOC ו- ACTA2 היה מנורמל באמצעות הגן משק HSP90a1 , ולאחר מכן כל רקמות היה בהשוואה לזה של העין כולו. תוצאות אלו מראות כי MYOC (איור 7 א) ו- ACTA2 (איור 7 ב) מאוד מבוטאים הדגימות TM, המאשרת את הבידוד מוצלח של RNA באיכות גבוהה מן הדגימות TM מועשר עבור RNA במורד הזרם ניתוח. כמו הוכחת הרעיון, טכניקה זו הונחה על RNA בודדים TM מוכן WT עכברים ומן זן של עכברים עם פנוטיפ IOP מוגברות וניתח מאת microarray. ניתוח זה ניתן לזהות גנים רבים מעורבים גלאוקומה, באים לידי ביטוי באופן שונה בין העכברים TM של WT ואלו של העכברים עם פנוטיפ גלאוקומה (איור 7C).

Figure 1
איור 1: השמה של רקמות קפוא לחסום את cryostat. (א) O.C.T הרכבה בינונית מוחל על גוש הרכבה cryostat. (B) קפוא הדגימה בלוק מושם באופן שווה על הצ'אק הרכבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: חלוקתה הליך של רקמת העין קפוא ב cryostat. (א) הכנת המשטח כדי להגיע אל רקמת העין. (B) זמירה O.C.T. של גוש קפוא לפני איסוף מקטעים עבור לייזר microdissection. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הכנת קפוא במקטעים cryostat. (א) 6 טורי 8 מיקרומטר עבה מקטעים הם נעמדו ב cryostat. (B) סעיפים בו זמנית תיטען בשקופית ממברנה חיית המחמד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: צילום מסך של התוכנה microdissection לייזר הדגשת תכונות חשובות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מיקום trabecular meshwork ואת הגדרות הפרמטר לייזר UV עבור בידוד נאות של trabecular meshwork. (א) נמוכה (4x) הגדלה של מקטע יחיד על קרום חיית המחמד המדגיש את meshwork trabecular עבור לייזר microdissection. הגדלה גבוהה (40 X) (B) של trabecular meshwork ורקמות סמוכים. (ג) מעגל חלקית הראשונה חותך של ה-TM ליד האזור scleral עם הפקק התנוחה למעלה. (ד) גמר קיצוצים מהשטח הפנוי להשלים את המעגל סביב ה-TM עם הפקק במצב סגור. (ה) TM הוסר מן הסעיף (נ) המצורפת את הכובע. (G) מספר מקטעים לחתוך לחתוך מ קרום חיית המחמד אותו לא חופפים מודבקת כובע. S (Sclera), SC (התעלה של Schlemm), TM (Trabecular Meshwork), AC (החדר הקדמי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: הערכת התשואה ואיכות RNA הכולל שהושג מרקמות trabecular meshwork microdissected. (א) RNA הכולל ממקטעים 80 של trabecular meshwork (גודל אזור משוערת היה 0.8 מ מ2). (B) RNA הכולל מ- 20 חלקים trabecular meshwork (גודל אזור משוערת היה 0.2 מ מ2). (ג) סה כ ה-RNA מרקמות עין הנותרת לאחר לייזר microdissection. רין, RNA תקינות מספר; bp, בסיסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: ניתוח RNA במורד הזרם של הפונקציה LCM מבודד trabecular meshwork. כמותיים ניתוח PCR דיגיטלי של גנים הקשורים TM ה-TM מבודדת על ידי אופנת LCM. הגנים הקשורים TM (א) MYOC (B) ACTA2 מאוד שבאה לידי ביטוי הפונקציה LCM נתפס דגימות TM בהשוואה לרקמות אחרות העין. (ג) Heatmap יוצר מתוך בסיס הנתונים המתקבלים microarray ניתוח של trabecular meshwork RNA מבודד מן KO ועכברים WT עכברים עם פנוטיפ IOP מוגברות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: השוואה של רקמות הכנה לפני ואחרי אופטימיזציה. סעיפים העין לחתוך והניח על PET ממברנה שקופיות באמצעות (א) הכנת התייבשות רגילה 95% אתנול (B) או הכנת התייבשות ממוטבת 75% אתנול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ה-TM ממלא תפקיד חיוני בשמירה באופן פעיל homeostatic IOP, תפקוד שלה מקובל כגורם סיבתי מרכזי עבור לחץ דם גבוה גלאוקומה1,2,19. מספר של נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים מספר גנים המזוהה על-ידי ניתוח GWAS היה קשור בסיכון מוגבר גלאוקומה עמידות מוגברת למתקן יצוא AH-ה-TM; עם זאת, המנגנונים המולקולריים מדויק כי להצמיח מחלה זו עדיין אינם מובנים במלואם21,22,23,24,25. העכבר גנטי מודלים יכול לספק כלי רב עוצמה עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של גלאוקומה. עם זאת, גודל קטן של העכבר TM רקמות מייצג אתגר עצום עבור בידוד של TM מועשרת מאוד העכבר עיניים ובאיכות גבוהה RNA לניתוח ביטוי גנים. LCM היא טכניקה יקר עבור בידוד מספר יחיד או נמוכה של תאים והוא יכול לשמש כדי ללמוד ביטוי גנים בדגימות רקמה מועשר עבור סוגי תאים ספציפיים. במחקר זה, שיטה LCM חזקים לשחזור מתואר לבודד TM מועשר הרנ"א באיכות גבוהה יכול לשמש כדי לחקור ברגולציה של ביטוי גנים, התא איתות ב ה-TM. בנוסף, ניתן להחיל שיטת LCM תיאר גם לרקמות אחרות בתוך העין.

LCM וטכנולוגיה של תשומת לב גבוהה פירוט עבור אופטימיזציה של הטיפול ברקמה שיחק תפקיד חיוני בפיתוח מוצלח של שיטה זו. המתודולוגיה של שימור רקמות ובידוד הוא רכיב מפתח לבודד RNA באיכות גבוהה עבור פרופיל ביטוי גנטי. LCM דורש תשומת לב גבוהה מאוד לפרטים לנתח, cryosectioning, קיבוע, מכתים, התייבשות, משך זמן של microdissection לייזר כדי להצליח בהשגת איכות RNA51. עובי סעיף רקמה ניתן להגדיל; עם זאת, כפי העובי גדל כך UV לייזר הכוח הדרוש. גדל לייזר התוצאות כוח בנתיב לייזר רחב יותר שיכולים לגרום השפלה RNA. התברר כי הנתיב לייזר עם 8 מיקרומטר מקטעים היה רזה, סיפקה מספיק רקמה לניתוח RNA במורד הזרם. איור 8 מראה איך אופטימיזציה של הכנת הרקמה יכול לשנות באופן דרסטי את היכולת לייזר לנתח ה-TM מהעין. אופטימיזציה של שלב זה בפרוטוקול (כמתואר בסעיף 4) הניב הנייח העינים-רקמות מעולה, הסרה מלאה של O.C.T. (איור 8 ב') באמצעות 75% במקום 95% אתנול (איור 8A) פשוט מייבשים את הרקמה ואחריו הדגירה במים נטולי RNase להסיר מדיה הרכבה. התייבשות נוסף וצביעת מושגת באמצעות בסיס אלכוהול ריאגנטים מוכתמים. בנוסף, נמצא את בסיס אלכוהול מכתימים ריאגנטים הניב הסופריור תוצאות ביחס מימית ריאגנטים מכתימים (סגול cresyl על בסיס מים או hematoxylin) ומסייע נוסף לשמירה על תקינות RNA52. בסך הכל, עיבוד רקמות עינית באמצעות פרוטוקול ממוטבת עם בסיס אלכוהול מכתימים ריאגנטים הניב עקבי העינים-רקמת חלקים שהיו מלא קיבוע בשקופית ממברנה חיית המחמד.

מטרתנו במחקר זה הייתה לפתח שיטה עמיד ואמין עבור בידוד איכותי mRNA של ה-TM של העכבר עיניים לניתוח ביטוי במורד הזרם על מנת לקבל תובנות המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס IOP והיפתחו גלאוקומה. כפי שמוצג את heatmap ב איור 7C, הפרוטוקול המתואר של TM בידוד על ידי אופנת LCM מספק שיטה אמינה לבודד RNA מ TM וללמוד הבדלים בביטוי הגנים ב TM פראי סוג ועכברים מוטנטים. השיטה המתוארת במסמך זה יאפשר החוקרים לביצוע הניתוח מולקולרית טישו המרכזי בפתוגנזה של גלאוקומה במערכת ויוו זה יחסית קל ואמין, ניתן להחיל על ניתוח ביטוי גנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86, (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377, (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32, (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80, (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90, (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82, (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73, (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126, (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130, (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14, (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120, (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121, (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4, (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8, (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40, (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29, (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4, (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11, (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12, (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57, (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15, (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75, (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120, (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24, (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52, (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28, (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183, (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91, (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280, (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30, (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10, (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416, (1), 123-125 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics