Endothelial-mesenchymal संक्रमण के आणविक विश्लेषण विकास कारक बदलने से प्रेरित-β संकेतन

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Biology

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Summary

इन विट्रो में endothelial-mesenchymal संक्रमण (EndMT), जो सेलुलर संकेतन EndMT में शामिल रास्ते की जांच के लिए उपयोगी है की प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । इस प्रयोगात्मक मॉडल में, EndMT एमएस-1 endothelial कोशिकाओं में TGF-β के साथ उपचार द्वारा प्रेरित है ।

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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

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Abstract

endothelial कोशिकाओं की Phenotypic प्लास्टिक हृदय प्रणाली के विकास, हृदय रोगों, और अंग फाइब्रोसिस के साथ जुड़े विभिन्न स्थितियों में निहित है । इन स्थितियों में, विभेदित endothelial कोशिकाओं mesenchymal-तरह phenotypes का अधिग्रहण । इस प्रक्रिया को endothelial कहा जाता है-mesenchymal संक्रमण (EndMT) और endothelial मार्करों के downregulation की विशेषता है, mesenchymal मार्करों के ऊपर, और रूपात्मक परिवर्तन । EndMT विकास कारक (TGF) को बदलने सहित कई संकेत रास्ते से प्रेरित है-β, Wnt, और पायदान, और EMT, ऊतक फाइब्रोसिस के लिए महत्वपूर्ण उपकला-mesenchymal संक्रमण (gastrulation) के उन लोगों के लिए इसी तरह के आणविक तंत्र द्वारा विनियमित, और कर्क मेटास्टेसिस । EndMT के तंत्र को समझना नैदानिक और चिकित्सकीय EndMT लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इन विट्रो में EndMT की मजबूत प्रेरण आम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की विशेषता के लिए उपयोगी है, druggable आणविक तंत्र की पहचान, और EndMT के मॉडुलन के लिए स्क्रीन. यहां, हम EndMT की प्रेरण के लिए इन विट्रो विधि का वर्णन । MS-1 माउस अग्नाशय microvascular endothelial कोशिकाओं TGF के लिए लंबे समय तक जोखिम के बाद EndMT से गुजरना-β और mesenchymal मार्करों और रूपात्मक परिवर्तन के साथ ही कई भड़काऊ chemokines और साइटोकिंस की प्रेरण दिखा । microRNA (miRNA) मॉडुलन के विश्लेषण के लिए विधियाँ भी शामिल हैं. ये विधियां अंतर्निहित EndMT तंत्र और EndMT के लिए miRNAs के योगदान की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं ।

Introduction

Endothelial-mesenchymal संक्रमण (EndMT) प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक विभेदित Endothelial कोशिका आणविक परिवर्तन की एक किस्म से गुजरती है, एक fibroblast की तरह mesenchymal सेल1में जिसके परिणामस्वरूप । EndMT शुरू में दिल2,3के विकास के दौरान एक endothelial सेल परिवर्तन के रूप में वर्णित किया गया था । जल्दी दिल के विकास में, दिल ट्यूब एक भीतरी endocardium और एक बाहरी मायोकार्डियम के होते हैं । इन दो परतों extracellular मैट्रिक्स की एक परत द्वारा अलग कर रहे है कार्डियक जेली कहा जाता है । भ्रूण endocardial कोशिकाओं है, जो endothelial सेल मार्कर, mesenchymal कोशिकाओं में पारगमन प्राप्त, अंतर्निहित कार्डियक जेली आक्रमण, और हृदय कुशन के गठन को बढ़ावा देने, अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक वाल्व और पट के लिए नींव प्रदान और semilunar वाल्व । इसके अलावा, EndMT कोरोनरी वाहिकाओं, उदर महाधमनी, और फुफ्फुसीय धमनी4,5,6सहित अन्य भ्रूण संवहनी प्रणालियों में pericytes और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के स्रोत होने का सुझाव दिया गया है । इसके अलावा, EndMT शारीरिक angiogenic अंकुरण7में फंसा हुआ है ।

सबूत जमा करने का सुझाव दिया है कि EndMT भी कई हृदय रोगों और अंय रोगों में शामिल है1,8। EndMT-संबद्ध शर्तों संवहनी पत्थराना, atherosclerosis, फुफ्फुसीय धमनी का उच्च रक्तचाप, गुफा कुरूपता, अंग फाइब्रोसिस, नस भ्रष्टाचार remodeling, गुर्दा प्रत्यारोपण में allograft रोग, और8कैंसर शामिल हैं, 9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18. हाल की एक रिपोर्ट में वर्णित है कि कई आणविक EndMT मार्करों गुर्दा प्रत्यारोपण में गुर्दे भ्रष्टाचार रोग के निदान और पूर्वानुमान भविष्यवाणी के लिए एक उपकरण हो सकता है17. EndMT से संबंधित सेलुलर संकेतन रास्ते का मॉडुलन पशु मॉडल8,15में हृदय की फाइब्रोसिस और नस भ्रष्टाचार को फिर से मॉडलिंग सहित कई रोग की स्थिति उन्नत करने के लिए दिखाया गया है । इसलिए, EndMT अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए नैदानिक और चिकित्सीय EndMT लक्ष्यीकरण रणनीतियों का विकास महत्वपूर्ण है ।

EndMT सेल-सेल जंक्शनों के नुकसान की विशेषता है, प्रवासी क्षमता में वृद्धि, endothelial जैसे VE-cadherin के रूप में विशिष्ट जीन के downregulation, और mesenchymal-चिकनी मांसपेशी α (actin-SMA) सहित α जीन के विनियमन । इसके अलावा, EndMT और उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT), एक ऐसी ही प्रक्रिया है कि mesenchymal कोशिकाओं के लिए उपकला कोशिकाओं में कनवर्ट करता है, विभिन्न extracellular मैट्रिक्स घटकों के बदल उत्पादन के साथ जुड़े रहे हैं, जो विकास में योगदान कर सकते हैं के टिशू फाइब्रोसिस8,19.

हाल ही में, EndMT के कई इन विट्रो अध्ययनों में EndMT15,20के आणविक तंत्र का आविर्भाव विवरण है । EndMT विकास कारक (TGF) को बदलने सहित विभिन्न संकेतन मार्ग द्वारा प्रेरित है-β, Wnt, और पायदान1. उनमें से, TGF-β दोनों EMT और EndMT की प्रेरण में निर्णायक भूमिकाओं निभाता है । EndMT में, TGF के लिए लंबे समय तक जोखिम-β विभिन्न endothelial कोशिकाओं में EndMT में परिणाम है, जबकि कम प्रदर्शन अपर्याप्त21प्रतीत होता है. हम यहां EndMT प्रेरण, जिसमें मील स्वेन 1 (MS-1) माउस अग्नाशय microvascular endothelial कोशिकाओं के लिए एक सरल प्रोटोकॉल वर्णित EndMT में लंबे समय तक प्रदर्शन के बाद इन विट्रो में TGF-β20से गुजरना । इस मॉडल में, कई अनुप्रवाह विश्लेषण EndMT की पहचान सुविधाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है, रूपात्मक परिवर्तन सहित, endothelial मार्करों के downregulation, mesenchymal मार्करों और भड़काऊ जीन के ऊपर, cytoskeletal rearrangement, और कोलेजन जेल संकुचन ।

MicroRNAs (miRNAs) हैं ~ 22 nt लघु विनियामक RNAs कि विभिन्न mRNA लक्ष्य के प्रत्यक्ष posttranscriptional दमन22,23. बीज अनुक्रम के माध्यम से-मध्यस्थता लक्ष्य मांयता, miRNAs लक्ष्य जीन के सैकड़ों को दबाने और इस तरह के सेल भेदभाव, प्रसार, और गतिशीलता के रूप में विविध सेलुलर कार्यों का नियमन । यह भी EMT और EndMT के विनियमन के लिए मामला है, और कई miRNAs EMT और EndMT24,25के नियामकों के रूप में सूचित किया गया है । इस समीक्षा में प्रस्तुत EndMT मॉडल को EndMT में miRNAs की भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए miRNA मॉडुलन प्रक्रियाओं के साथ आसानी से संयोजित किया जा सकता है. वर्तमान समीक्षा TGF-β-प्रेरित EndMT MS-1 कक्षों में जांच करने के लिए हमारी प्रायोगिक कार्यविधियों को सारांशित करता है और अन्य endothelial कक्षों में TGF-β द्वारा EndMT प्रेरण की शर्तों की तुलना भी शामिल है ।

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Protocol

1. EndMT की प्रेरण

  1. मानक संस्कृति की स्थिति में एमएस-1 कोशिकाओं को बनाए रखने और प्रवाह से बचने के । एमएस-1 कोशिकाओं के एक स्रोत सामग्री की तालिकामें वर्णित है । एमएस-1 कोशिकाओं के लिए, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), ५० यू/एमएल पेनिसिलिन, और ५० μg/एमएल streptomycin के साथ न्यूनतम आवश्यक माध्यम-α (मेम-α) का उपयोग करें ।
  2. धो एमएस-1 कोशिकाओं पर 10 सेमी डिश के साथ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) और थाली के लिए trypsin के १.० मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  3. संस्कृति मीडिया के 9 मिलीलीटर का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए ।
  4. 300 पर सेल निलंबन केंद्रापसारक-400 x जी कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ।
  5. ध्यान से supernatant को हटाने और पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया में सेल गोली निलंबित ।
  6. Trypan ब्लू समाधान और एक मानक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती ।
  7. प्लेट MS-1 पर अनकोट मानक संस्कृति प्लेट पर कोशिकाओं ०.५ x 10 सेमी प्रति3 कोशिकाओं2 के लिए दीर्घकालिक संस्कृति के लिए । उदाहरण के लिए, प्लेट ५.० x 103 एक अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं । FCS की ही एकाग्रता सहित एक ही संस्कृति मीडिया का प्रयोग करें । MS-1 कोशिकाओं में, TGF-β FCS के उपयोग के साथ दीर्घकालिक संस्कृति में EndMT लाती है (कम से कम 48-72 ज).
  8. TGF-β2 के साथ endothelial कोशिकाओं को उत्तेजित (एक अंतिम एकाग्रता के 1 एनजी/
  9. एक humidified मशीन में संस्कृति कोशिकाओं (5% CO2, ३७ ° c) । रूपात्मक परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करते समय प्रतिदिन कक्षों की निगरानी करें ।
  10. TGF के साथ उपचार के ४८ ज के बाद TGF-β2 युक्त ताजा पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के साथ मीडिया की जगह-β दीर्घकालिक संस्कृति में ।
  11. बहाव विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें । आमतौर पर, actin पुनर्गठन 24 उपचार के एच के बाद मनाया जाता है, और endothelial मार्करों के downregulation और mesenchymal मार्करों के विनियमन 48 के बाद मनाया जाता है – TGF-β के साथ उपचार के 72 ज.

2. Immunocytochemical विश्लेषण

  1. मानक culture स्थितियों में MS-1 कक्षों को बनाए रखें ।
  2. प्लेट MS-1 कोशिकाओं पर 4 अच्छी तरह से सेल संस्कृति चैंबर स्लाइड पर १.० एक्स 103 कोशिकाओं के अनुसार अच्छी तरह से (१.७ cm2) । स्लाइड जिलेटिन के साथ पूर्व लेपित हैं । अच्छी तरह से प्रति संस्कृति मीडिया के 0.5-1.0 मिलीलीटर का प्रयोग करें ।
  3. TGF-β2 के साथ endothelial कोशिकाओं को उत्तेजित (एक अंतिम एकाग्रता के 1 एनजी/ EndMT में रॉक की भागीदारी का विश्लेषण करते समय, TGF-β उपचार से पहले एक चट्टान अवरोधक Y-२७६३२ (10 माइक्रोन) 1 ज जोड़ें । TGF-β संकेतन निषेध के प्रभाव का आकलन करते हैं, TGF-β रिसेप्टर कळेनासे अवरोधकों इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. एक humidified मशीन में संस्कृति कोशिकाओं (5% CO2, ३७ ° c) । Actin पुनर्गठन TGF-β के साथ उपचार के 24 घंटे के बाद MS-1 कोशिकाओं में मनाया जाता है । अंय परिवर्तन 48 के बाद स्पष्ट हो-उपचार के 72 एच । ७२ ज संस्कृति के लिए, मीडिया TGF युक्त ताजा मीडिया के साथ बदलें-β TGF के साथ उपचार के ४८ ज के बाद-β.
  5. F-actin धुंधला
    1. TGF-β उपचार के 24 घंटे के बाद, मीडिया को दूर, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1x पंजाब में 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक है, और 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को कुल्ला ।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ०.२% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ मशीन ।
    3. कुल्ला सेल 1x पंजाबियों के साथ तीन बार ।
    4. phalloidin के साथ मशीन-tetramethylrhodamine बी isothiocyanate से Amanita phalloides पतला १५०-कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध के साथ गुना ।
    5. कुल्ला सेल 1x पंजाबियों के साथ तीन बार ।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए cyanine न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी रंगों के साथ नाभिक दाग ।
    7. स्लाइड से कुल्ला करें और coverslips माउंट मीडिया का उपयोग करके स्लाइड पर नीचे चेहरा दबाएं ।
    8. एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण । phalloidin के प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए एक ५४३ एनएम लेजर और 560 के एक उत्सर्जन फिल्टर-615 एनएम का उपयोग करें । एक ६३३ एनएम लेजर और एक उत्सर्जन परमाणु धुंधला के लिए ६५० एनएम से अधिक समय फिल्टर का प्रयोग करें । TGF-β के साथ उपचार पर, मोटी तनाव फाइबर के गठन मनाया जाएगा ।
  6. VE-cadherin और α-SMA धुंधला
    1. TGF-β उपचार के ७२ ज के बाद, मीडिया को हटाने, ठंड ५०% मेथनॉल और ५०% एसीटोन के साथ कोशिकाओं को ठीक (0.5-1.0 एमएल प्रति अच्छी तरह से) 5 मिनट के लिए ।
    2. कुल्ला कोशिकाओं 1x पंजाबियों के साथ तीन बार (0.5-1.0 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) ।
    3. निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता के अनुसार अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बफर अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन । जें का प्रयोग करें-cadherin मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (BV13, 1:100 कमजोर पड़ने) और Cy3-संयुग्मित α-SMA मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1A4, 1:200 कमजोर पड़ने)20.
    4. कुल्ला सेल 1x पंजाबियों के साथ तीन बार ।
    5. एक हरे रंग की डाई-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी VE-cadherin एंटीबॉडी के लिए बफर अवरुद्ध में 1 ज अंधेरे में कमरे के तापमान पर निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता के अनुसार के साथ गर्मी ।
    6. कुल्ला सेल 1x पंजाबियों के साथ तीन बार ।
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए cyanine न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी रंगों के साथ नाभिक दाग ।
    8. स्लाइड से कुल्ला करें और coverslips माउंट मीडिया का उपयोग करके स्लाइड पर नीचे चेहरा दबाएं ।
    9. एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण । α-SMA (Cy3) का पता लगाने के लिए एक ५४३ एनएम लेजर और एक उत्सर्जन फिल्टर 560 – 615 एनएम का उपयोग करें । VE-cadherin का पता लगाने के लिए एक ४८८ एनएम लेजर और 505-550 एनएम के उत्सर्जन फिल्टर का प्रयोग करें । आमतौर पर, TGF-β उपचार के साथ उपचार पर, VE में कमी-cadherin संकेतों और α-SMA संकेतों में वृद्धि मनाया जाएगा ।

3. तीन आयामी कोलेजन जेल संकुचन परख

  1. के साथ एमएस-1 कोशिकाओं की संस्कृति प्रदर्शन TGF-β के लिए ७२ एच कोलेजन जेल संकुचन परख करने से पहले ।
  2. प्रकार मैं बर्फ पर कोलेजन जेल तैयार करते हैं । मिश्रण ठंडा कोलेजन समाधान, 10x केंद्रित मेम मध्यम, और कोलेजन कमजोर पड़ने बफर ०.०५ एन NaOH, २.२% NaHCO3, और २०० mM HEPES पीएच ७.४ युक्त एक 8:1:1 अनुपात में ।
  3. मिक्स २०० नियंत्रण या TGF-β-इलाज endothelial सेल सस्पेंशन के (१.० x 106 कोशिकाओं/200 μL) और ८०० कोलेजन जेल समाधान के μL । TGF-β उपचारित नमूनों के लिए, सेल निलंबन के लिए TGF-β2 (1 एनजी/एमएल) जोड़ें ।
  4. 12 की एक अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए मिश्रण के १.० मिलीलीटर जोड़ें और 30 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में जमना के लिए अनुमति-60 मिनट ।
  5. gelatinization के बाद, 10% FCS, ५० U/एमएल पेनिसिलिन, और ५० μg/एमएल streptomycin युक्त मेम-α के १.० मिलीलीटर ओवरले जेल फ्लोट करने के लिए । TGF-β उपचारित नमूनों के लिए, मीडिया के लिए TGF-β2 (1 एनजी/एमएल) जोड़ें ।
    नोट: TGF-β इलाज नमूनों के लिए, TGF-β दोनों जेल और संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ें ।
  6. ४८ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर फ्लोटिंग जैल मशीन
  7. एक स्कैनर का उपयोग प्लेटों के तल से जैल की छवियों को स्कैन. वैकल्पिक रूप से, जैल जैल के ऊपर एक निश्चित दूरी पर एक डिजिटल कैमरा का उपयोग कर के छवियों को रिकॉर्ड ।
  8. ImageJ का उपयोग कर पिक्सेल संख्या के आधार पर जेल सतह क्षेत्र को बढ़ाता है । एक मुक्तहस्त चयन या संबंधित चयन उपकरण का उपयोग कर जेल का चयन करें, या का उपयोग कर जेल का चयन करें "छवि | समायोजित करें । रंग थ्रेशोल्ड "उपकरण, और फिर का उपयोग कर जेल के क्षेत्र का निर्धारण" विश्लेषण | उपाय "आदेश ।

4. बंद न्यूक्लिक एसिड आधारित miRNA अवरोधकों द्वारा miRNA गतिविधियों के निषेध

  1. मानक culture स्थितियों में MS-1 कक्षों को बनाए रखें ।
  2. Transfect न्यूक्लिक एसिड (LNA) miRNA अवरोधकों, सिंथेटिक miRNA डुप्लेक्स या siRNAs (20 या ५० एनएम) निर्माता के निर्देश के अनुसार lipofection रिएजेंट का उपयोग कर बंद कर दिया । विवरण और LNA miRNA अवरोधकों, सिंथेटिक miRNA डुप्लेक्स, और siRNAs के सूत्रों का वर्णन किया गया हमारी पिछली रिपोर्ट में26,27। MS-1 कक्षों में, निर्माता के निर्देश पर आधारित मानक अभिकर्मक कार्यविधियां LNA miRNA अवरोधकों, सिंथेटिक miRNA डुप्लेक्स या siRNAs की शुरूआत के लिए अच्छी तरह से कार्य करते हैं ।
  3. के बाद 16 – 48 एच, TGF के साथ endothelial कोशिकाओं को उत्तेजित-β2 (एक अंतिम एकाग्रता के 1 एनजी/
  4. आरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण (मात्रात्मक आरटी-पीसीआर और आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-seq) विश्लेषण), immunocytochemical विश्लेषण, और रिपोर्टर परख सहित विभिन्न बहाव विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें । बहाव विश्लेषण हमारी पिछली रिपोर्टों में वर्णित किया गया है20,26,27

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Representative Results

TGF-β विभिन्न endothelial कोशिकाओं में EndMT का एक शक्तिशाली उत्प्रेरण है । के बाद TGF के साथ 24 एच उपचार-β MS-1 कोशिकाओं में, F-actin के लिए दाग से पता चलता है actin तनाव तंतुओं का पुनर्गठन (आंकड़ा 1a)20. एक रॉक अवरोध करनेवाला के साथ उपचार वाई-२७६३२ actin पुनर्गठन20की प्रेरण रोकता है । MS-1 endothelial कोशिकाओं TGF-β उपचार (चित्रा 1b) पर एक mesenchymal धुरी के आकार आकृति विज्ञान के लिए एक शास्त्रीय cobblestone की तरह आकृति विज्ञान से बदल जाते हैं । TGF-β-इलाज कक्ष कक्ष-कक्ष संपर्क खो देते हैं । TGF के साथ उपचार के बाद-β 48 – 72 के लिए एच, immunocytochemical विश्लेषण की कमी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन VE-cadherin और बढ़ी हुई अभिव्यक्ति की α-SMA (चित्रा 1C). TGF-β काफी α-SMA की अभिव्यक्ति में दोनों mRNA और प्रोटीन के स्तर पर एमएस-1 कोशिकाओं के बाद 48 – उपचार के 72 ज (आंकड़े 1 डी और 1E) । स्तनधारी TGF-β में TGF-β1, 2, और 3 isoforms शामिल हैं । एक पिछले माउस का उपयोग कर अध्ययन endocardial तकिया explants दिखाया गया है कि TGF-β2 लेकिन नहीं TGF-β3 endocardial तकिया कोशिकाओं के परिवर्तन के लिए अनिवार्य है28। दूसरी ओर, हम पहले से α-sma अभिव्यक्ति पर तीन isoforms के प्रभाव की तुलना की और पुष्टि की कि सभी isoforms इसी तरह प्रेरित α-sma अभिव्यक्ति MS-1 कक्ष20में । कोलेजन जेल संकुचन परख कोलेजन प्रकार मैं एमएस-1 कोशिकाओं द्वारा जेल TGF-β उपचार (चित्रा 1F) के बाद बढ़ाया संकुचन से पता चलता है । इस आशय के mesenchymal सेल क्षमता के अधिग्रहण extracellular मैट्रिक्स remodel करने के लिए सुझाव है । इन सुविधाओं EndMT20की पहचान लक्षण हैं । हमारी पिछली रिपोर्ट20में, एक चट्टान अवरोधक के साथ उपचार-२७६३२ दृढ़ता से mesenchymal मार्करों α-SMA और SM22α अन्य TGF की प्रेरण के सहवर्ती दमन के बिना प्रेरण दबा-जैसे Fibronectin 1 और एमएमपी-2 के रूप में β लक्ष्य जीन.

EndMT एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है । MS-1 कोशिकाओं में, TGF के प्रभाव-β पर α-SMA अभिव्यक्ति और आकृति विज्ञान प्रतिवर्ती हैं; TGF-β अभाव के बाद, α-SMA अभिव्यक्ति बेसल स्तर (चित्रा 2a) के लिए कम हो जाती है, और कोशिकाओं को एक cobblestone की तरह आकृति विज्ञान (चित्रा बी) पुनर्प्राप्त. इसके अलावा, EndMT और EMT की प्रेरण एकाधिक chemokines और साइटोकिंस की स्रावी क्षमता में गतिशील परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । एकाधिक भड़काऊ chemokines और साइटोकिंस सहित CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6, और Angptl2 द्वारा प्रेरित कर रहे हैं TGF-β MS-1 कोशिकाओं में, जो हम पहले से मनोनीत EndMT-एसोसिएटेड स्रावी phenotype (EndMT-SP)26. यह प्रायोगिक मॉडल EndMT और EndMT-एसपी के ख्यात नियामकों की जांच के लिए उपयोगी है । हमने पहले EndMT में कई miRNAs की भूमिकाओं का अध्ययन किया है miRNA गतिविधियों को बढ़ाने या बाधा26,27। एमएस-1 कोशिकाओं में, miRNA गतिविधियों मजबूती से miRNA oligonucleotides या LNA आधारित miRNA अवरोधकों नकल द्वारा संग्राहक जा सकता है, और आरएनए-seq विश्लेषण सहित कई बहाव परख आसानी से किया जा सकता है (चित्रा 3) । एकीकृत transcriptome विश्लेषण के आधार पर, हम पहले से जुड़ा हुआ है constitutively सक्रिय मीर-31 MS-1 कोशिकाओं में EndMT विनियमन के लिए26। आरएनए-seq विश्लेषण से पता चला कि मीर के निषेध-31 LNA द्वारा mesenchymal मार्करों (चित्रा 3ए) और EndMT-सपा जीन (आंकड़ा 3सी) की प्रेरण के क्षीणन में miRNA अवरोधक परिणाम है, जबकि यह पारंपरिक TGF की प्रेरण को प्रभावित नहीं करता है-β लक्ष्य जीन जैसे Fibronectin 1, पै-1, और Smad7 (चित्रा 3बी) और endothelial मार्करों के downregulation (चित्रा 3d)26. दोनों TGF-β और मीर-31 downregulate Stk40, NF-κB मार्ग का एक नकारात्मक नियामक है, जो EndMT-SP के एक संभावित नियामक के रूप में कार्य करता है । हालांकि TGF-β मीर की अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं करता है-31, TGF-β Stk40 3 ' UTR में आंतरिक पाली (ए) अनुक्रम के वैकल्पिक polyadenylation मध्यस्थता अपवर्जन, जिससे गठित सक्रिय मीर द्वारा Stk40 का लक्ष्यीकरण बढ़ाने-31 और अंत में दबा Stk4026. इसके अलावा, हमने पहले TGF-β-inducible मीर-27b की भूमिकाओं की जांच की EndMT27में । मीर के निषेध-mesenchymal मार्करों के 27 दबा विनियमन (आंकड़ा 3ए) जबकि पारंपरिक TGF पर प्रभाव-β लक्ष्य जीन, EndMT-सपा जीन, और endothelial मार्करों सीमांत थे (आंकड़े 3 बी, ३ सी, और 3d)27 .

Figure 1
चित्रा 1 : TGF-β द्वारा MS-1 कोशिकाओं में EndMT की प्रेरण । (A) TGF-β2 उपचार (1 एनजी/एमएल) के 24 ज के बाद एमएस-1 कोशिकाओं में Actin पुनर्गठन । () TGF-β2 उपचार (1 एनजी/एमएल) के ७२ एच के बाद एमएस-1 कोशिकाओं में रूपात्मक परिवर्तन । () TGF-β2 उपचार (1 एनजी/एमएल) के ७२ एच के बाद MS-1 कोशिकाओं में VE-cadherin और α-SMA के लिए Immunocytochemical विश्लेषण । (डी,) α-SMA में अभिव्यक्ति परिवर्तन, मानक मात्रात्मक आरटी-पीसीआर विश्लेषण (डी) और पश्चिमी दाग विश्लेषण () द्वारा निर्धारित । () कोलेजन जेल संकुचन परख । के साथ ७२ ज संस्कृति के बाद सतह क्षेत्र का अनुपात TGF-β2 उपचार (1 एनजी/एमएल) मूल सतह के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं । स्केल पट्टियां = 20 माइक्रोन (ए और सी), और २०० माइक्रोन (बी) । आंकड़े मिहिर एट अल से संशोधित किए गए हैं । 20. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एमएस-1 कोशिकाओं में TGF-β के प्रतिवर्ती प्रभाव. (A) MS-1 कक्षों में TGF-β2 की वापसी के बाद α-SMA mRNA व्यंजक और (B) कक्ष आकृति विज्ञान । स्केल बार्स = २०० माइक्रोन । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : आरएनए-seq विश्लेषण एमएस-1 कोशिकाओं में । TGF-β2 (७२ ज) के साथ LNA miRNA अवरोधकों और उपचार के परिचय के बाद, आरएनए-seq विश्लेषण26,27प्रदर्शन किया गया था । नेकां: नकारात्मक नियंत्रण । प्रतिनिधि जीन के एक्सप्रेशन परिवर्तन दिखाए जाते हैं (A, mesenchymal markers; B, परम्परागत TGF-β लक्ष्य जीन; सी, EndMT-एसपी जीन; और डी, endothelial मार्करों) । FPKM (प्रति लाख प्रतिलिपि के kilobase प्रति टुकड़ों को मैप पढ़ता) मान एक नियंत्रण नमूने के मूल्यों के साथ सामान्यीकृत किया गया (LNA-नेकां TGF-β2 उपचार के बिना). त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं ।

कक्ष प्रकार mesenchymal मार्कर प्रेरण की दशा संदर्भ
मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाएं (HUVEC) mesenchymal विभेदक माध्यम द्वारा प्रेरण (TGF-β 5 एनजी/एमएल, PDGF-BB 25 एनजी/एमएल), 5-21 दिन । Krenning एट अल.
मानव चर्म microvascular endothelial कोशिकाएँ (HCMEC) TGF द्वारा प्रेरण-β2 (10 एनजी/एमएल), FBS, 2 दिनों के बिना । Medici एट अल.
ह्यूमन कोरोनरी endothelial कोशिकाएं (HCEC) TGF-β1 द्वारा प्रेरण (10 एनजी/एमएल), 6 दिन । बीएमपी-7 द्वारा निषेध । Zeisberg एट अल.
माउस फेफड़ों endothelial कोशिकाओं (आशोधित) TGF द्वारा प्रेरण-β1 (10 एनजी/एमएल), 2% FBS को कम, endothelial mitogen, 2 दिनों के बिना । Zeisberg एट अल.
मूषक ब्रेन endothelial सेल (BEC) TGF-β1 द्वारा प्रेरण (10 एनजी/एमएल), 2 दिन । Krizbai एट अल.
गोजातीय महाधमनी endothelial cells (BAEC) TGF द्वारा प्रेरण-β1 (1 एनजी/एमएल), 5 दिन । Arciniegas एट अल.
अमर गोजातीय रेटिना microvascular endothelial कोशिकाओं (iBREC) TGF द्वारा प्रेरण-β2 (10 एनजी/एमएल), 3-6 दिन । Deissler एट अल.
ovine महाधमनी वाल्व endothelial कोशिकाओं TGF-β1 या 3 (1 एनजी/एमएल), 6 दिनों के द्वारा प्रेरण । Paranya एट अल.
MS-1 माउस अग्नाशय microvascular endothelial कोशिकाओं प्रेरण TGF-β (10 एनजी/एमएल), सक्रिय रास अभिव्यक्ति, 1 दिन । Hashimoto एट अल.
MS-1 माउस अग्नाशय microvascular endothelial कोशिकाओं TGF द्वारा प्रेरण-β2 (1 एनजी/एमएल), 2-3 दिन । मिहिर एट अल.

तालिका 1: TGF द्वारा EndMT की प्रेरण-β विभिन्न endothelial कोशिकाओं में. TGF-β द्वारा EndMT प्रेरण की संस्कृति शर्तों संक्षेप हैं । सीरम एकाग्रता और इसके अलावा या अंय विकास कारकों को हटाने सहित संस्कृति की स्थिति में परिवर्तन भी उल्लेख कर रहे हैं ।

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Discussion

यह सूचित किया गया है कि सक्रिय रास और TGF-β उपचार एमएस-1 कोशिकाओं में 24 एच प्रेरित EndMT के लिए, जबकि TGF-β अकेले इस छोटी अवधि21में EndMT प्रेरित करने में विफल रहा है । लगातार, हमने देखा है कि TGF-β काफी प्रेरित EndMT के बाद अब उपचार (48-72 एच) MS-1 कोशिकाओं में20. EndMT TGF-β (2 – 6 दिन) में विभिन्न endothelial कोशिकाओं जैसे मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC), मानव त्वचा के नीचे microvascular endothelial कोशिकाओं (HCMEC), मानव कोरोनरी endothelial कोशिकाओं के साथ लंबे समय तक इलाज के बाद मनाया गया है ( HCEC), माउस फेफड़ों endothelial कोशिकाओं (आशोधित), चूहे मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BEC), गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं (BAEC), अमर गोजातीय रेटिना microvascular endothelial कोशिकाओं (iBREC), और ovine महाधमनी वाल्व endothelial कोशिकाओं8, 18,29,30,31,३२,३३,३४. 1 तालिकामें, हम विभिन्न endothelial कोशिकाओं में TGF-β द्वारा mesenchymal मार्कर प्रेरण की शर्तों संक्षेप8,18,20,21,29, 30,31,३२,३३,३४. इन रिपोर्टों की तुलना पता चलता है कि प्रत्येक endothelial सेल लाइन EndMT के लिए अलग थ्रेसहोल्ड है । विभेदक संवेदनशीलता TGF-β या अन्य तंत्र विभिन्न अंगों में विविध EndMT से संबंधित रोग की स्थिति आबाद हो सकता है । यह vivo अध्ययन के परिणामों के साथ एक साथ विचार किया जाना चाहिए ।

इन विट्रो EndMT प्रेरण प्रोटोकॉल का विवरण अलग सेल लाइनों में सिलवाया जा करने की आवश्यकता: उदाहरणके लिए, TGF की एकाग्रता-β, सीरम की एकाग्रता, इसके अलावा या अन्य विकास कारकों को हटाने, और संस्कृति अवधि. उदाहरण के लिए, HUVECs अक्सर खराब TGF का जवाब-β और EndMT ऐसे PDGF के रूप में अन्य कारकों के साथ संयोजन द्वारा प्रेरित किया जाएगा-बीबी और भड़काऊ उत्तेजनाओं और/या सीरम एकाग्रता और अन्य मध्यम घटकों के एक लंबे समय तक संस्कृति में मॉडुलन की स्थापना29 , ३५. इसके अलावा, overconfluency TGF-β करने के लिए प्रतिक्रियाओं का शमन होगा ।

EndMT एक गतिशील प्रक्रिया है और एक विपरीत प्रक्रिया mesenchymal कहा जाता है-endothelial संक्रमण (MEndoT) हाल ही में३६की सूचना दी गई है । हालांकि TGF द्वारा mesenchymal मार्करों की प्रेरण-β अकेले एमएस-1 कोशिकाओं (चित्रा 2) में प्रतिवर्ती है, यह सूचित किया गया है कि endothelial मार्करों के downregulation में सक्रिय रास के साथ एमएस-1 कोशिकाओं TGF की वापसी के बाद कायम-β21. अपरिवर्तनीय EndMT भी iBREC और ovine महाधमनी वाल्व endothelial कोशिकाओं३३,३४में सूचित किया गया है । इसके अलावा, एक पिछली रिपोर्ट से पता चला है कि EndMT प्रक्रिया TGF-β के रास-GTP और RASAL1 प्रवर्तक के मानव कोरोनरी endothelial कोशिकाओं३७में मिथाइल के एक निरंतर सक्रियण के कारण की वापसी के बाद बनी । इस प्रकार, इन मॉडलों की तुलना भी endothelial सेल प्लास्टिक के विनियामक तंत्र को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

EndMT प्रेरण करने के लिए endothelial कोशिकाओं की जवाबदेही काफी विषम३८प्रतीत होता है । जिओ एट अल । एक स्तन ट्यूमर मॉडल से ट्यूमर विशिष्ट endothelial कोशिकाओं की रिपोर्ट TGF के जवाब में EndMT के अलग रूपों शो-β उत्तेजना३८. TGF-β-चालित EndMT भी FGF-2, BMP-7, और IL-1β३५,३७,३८सहित अन्य संकेतन मार्ग द्वारा संग्राहक है । हमने यह भी पाया है कि TNF-α TGF-β-प्रेरित EndMT और MS-1 कोशिकाओं में SP---26----EndMT बढ़ाता है । इसके अलावा, यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि EndMT Wnt, पायदान, और हाइपोक्सिया1सहित अन्य संकेतन रास्ते से प्रेरित है. इस प्रकार, विभिन्न endothelial कोशिकाओं में अन्य उत्तेजनाओं के साथ संयोजन EndMT जवाबदेही के विविधता को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है.

यहां प्रस्तुत EndMT प्रोटोकॉल को EndMT के नियामकों की जांच के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है । वास्तव में, हम एमएस में EndMT के विभिंन नियामकों विशेषता है-1 कोशिकाओं20,26,27। एक guanine न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक Arhgef5 और myocardin-संबंधित प्रतिलेखन कारक-a (MRTF-a) Smad संकेतों द्वारा प्रेरित होते हैं, और MS-1 कक्ष20में α-SMA विनियमन में दोनों योगदान करते हैं । इस प्रकार, TGF-β सिग्नलिंग सक्रिय करता है दोनों Rho संकेतों और MRTF-A करने के लिए प्रेरित EndMT. इसके अलावा, हम यह भी पाया कि constitutively सक्रिय मीर-31 और TGF-β-inducible मीर-27b सकारात्मक विनियमित EndMT प्रेरण26,27। MS-1 कोशिकाओं में, constitutively सक्रिय मीर-31 TGF-β-प्रेरित EndMT-SP26के लिए भी आवश्यक है । कुल मिलाकर, इन इन विट्रो EndMT प्रेरण प्रक्रियाओं EndMT के जीव विज्ञान को समझने के लिए उपयोगी होगा, EndMT की पहचान-जीन हस्ताक्षर जुड़े, और रणनीतियों के विकास के लिए इस प्रक्रिया को मिलाना ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

पांडुलिपि तैयार करने में सुझावों के लिए हम Zea Borok और मेंहै Miyazono को धन्यवाद देते हैं । H.I.S. और M.H. उएहारा मेमोरियल फाउंडेशन रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं, और H.I.S. विदेश में अध्ययन के लिए ओसामु Hayaishi मेमोरियल छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है । यह काम टाकेडा साइंस फाउंडेशन (एएस) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

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References

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