مورين كولوستومي القاصي، نموذجا جديداً من تسريب التهاب القولون في الفئران C57BL/6

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

مورين كولوستومي القاصي نموذجا مورين لالتهاب القولون تسريب البشرية، التهاب القولون الليمفاوي غالباً في الجزء القولون مستبعدة من مجرى البراز.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تسريب التهاب القولون (DC) حالة سريرية متكررة التي تحدث في المرضى مع قطاعات الأمعاء مستبعدة من مجرى البراز نتيجة تحويل انتيروستومي. مسببات هذا المرض ما زال غير محددة، لكن يبدو أن تختلف عن تلك الأمراض الكلاسيكية التهاب الأمعاء مثل مرض كرون والتهاب القولون التقرحي. البحوث الرامية إلى فك الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تؤدي إلى تطور هذا المرض تعطلت بعدم وجود نموذج مورين مناسب. ينشئ هذا البروتوكول نموذج مورين من العاصمة التي تسهل دراسة دور النظام المناعي وتفاعله مع ميكروبيومي في وضع DC. في هذا النموذج باستخدام الحيوانات C57BL/6، تستبعد الأجزاء البعيدة من القولون من تيار البراز بإنشاء كولوستومي القاصي وأحداث تنمية خفيفة إلى معتدلة التهاب في قطاعات الأمعاء المستبعدة واستنساخ الآفات السمة المميزة للإنسان العاصمة مع استجابة التهابات الجهازية معتدلة. على النقيض من نموذج الفئران، تتوفر عدد كبير من نماذج مورين معدلة وراثيا على خلفية C57BL/6. المزيج من هذه الحيوانات مع نموذجنا يسمح الأدوار المحتملة للفرد السيتوكينات أو المستقطبات أو مستقبلات الجزيئات النشطة بيولوجيا (مثلاً، انترلوكين (إيل)-17؛ IL-10، تشيموكيني CXCL13، ومستقبلات تشيموكيني CXCR5 و CCR7، ومستقبلات سفينجوسيني-1-فوسفات 4) إلى تقييم في الآلية المرضية للعاصمة. توافر سلالات الماوس كونجينيك على خلفية C57BL/6 يسهل إلى حد كبير نقل التجارب تحديد دور كل من أنواع الخلايا المتميزة المشاركة في المسببات للعاصمة. وأخيراً، يقدم النموذج الفرصة لتقييم تأثيرات التدخلات المحلية (مثلاً، تعديل ميكروبيومي المحلية أو العلاج للالتهابات المحلية) على حصانة المخاطي في قطاعات الأمعاء المتضررة وغير المتضررة وفي التوازن المناعي الجهازية.

Introduction

في السنوات الأخيرة، عدد كبير من الكيانات غير المعدية التهاب القولون مختلفة من أمراض التهاب الأمعاء الكلاسيكية (إيبدس؛ أي.، المرض أو التهاب القولون التقرحي كرون) اتسمت سريرياً وهيستوباثولوجيكالي في البشر. الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تؤدي إلى تطوير هذه أشكال التهاب القولون هي ليست مفهومة تماما جزئيا لأن المناسبة نماذج حيوانية نادرة. تسريب التهاب القولون واحد من هذه الكيانات وصف مؤخرا. على الرغم من أن المصطلح أطلق في عام 1980 من Glotzer1، وصف الأولى النمط الظاهري مماثلة قدمت في عام 1972 مورسون2. تطور المرض في 50% إلى 91% مرضى مع تحويل انتيروستومي، وتتفاوت شدته السريرية3،4. ونظرا للإصابة السنوية بحوالي 000 120 مريض كولوستومي في الولايات المتحدة الأمريكية، يشكل هذا الكيان المرض مشكلة صحية هامة.

وكان الهدف العام المتمثل في وضع هذا البروتوكول تقديم نموذج DC مورين التي تعتمد على الزناد التهاب القولون مشابهة للتي تشهدها العاصمة البشرية وأن يستنسخ الميزات نسيجية الأولية للأمراض البشرية. خلافا لنماذج أخرى مورين التهاب القولون، التهاب القولون التعريفي في نموذجنا لا تتطلب الحيوانات المحورة وراثيا (مثلالفئران المعدلة وراثيا إيل-7، N-كادهيرين الفئران السلبية السائدة أو الفئران-/- TGFβ)، التطبيق كيميائيا غضب من المواد (مثلاً, ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS)-التهاب القولون المستحث، أو حامض السلفونيك ترينيتروبينزيني (تنبس)-التي يسببها التهاب القولون)، أو نقل السكان خلية معينة في الفئران القصور المناعي (كما هو الحال في نقلعالية CD45RB نموذج لالتهاب القولون) (استعراض، انظر5). خلافا لنماذج أخرى، المناعي سليمة لنموذجنا DC يسمح تقييم الآلية المناعية التي تشارك في تطوير العاصمة. الحد التهاب الغشاء المخاطي للجزء المتعلق بالامعاء المستبعدة يسمح تقييم انعكاساتها على حصانة المخاطي في أجزاء أخرى من الجهاز الهضمي، في التوازن المناعي في المقصورات الأخرى محصنة من الأمعاء (مثلاً ، بير في بقع والغدد الليمفاوية ميسينتيريالي)، وفي التوازن المناعي في الحي كامل. وأخيراً، لدينا نموذج يشكل أداة مناسبة للتحقيق في آليات السيطرة المحلية المحفزات الالتهابات الناشئة عن التغيرات في البيئة المحلية العادية لكلا ميكروبيومي المحلية، فضلا عن المستضدات غير معروف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها السلطة الحكومية البيطرية (لانديسامت für لاندويرتشافت und لبينسميتيلسيتشيرهيت مصائد الأسماك مكلينبيرج-فوربوميرن، (ﻷلف M-V)).

1-قبل الجراحة الرعاية وإعداد الحيوانات

  1. لدى وصوله إلى مرفق الحيوانية، تقسيم الحيوانات (C57Bl/6) إلى مجموعات ذات حجم مماثل، قفص كل مجموعة معا، وإبقاء المجموعات ثابتة طوال هذه التجارب.
    ملاحظة: استخدام الحيوانات من نفس الجنس. تم الحصول على النتائج المذكورة مع الفئران الذكور.
    ملاحظة: إذا تم استخدام الحيوانات الذكور، مجموعات قفص بدءاً معا عندما تكون 7 أسابيع عمر حيث أنه يمكن إنشاء تسلسل هرمي، وبالتالي تقليل مخاطر السلوك العدواني خلال التجارب.
  2. أسبوع واحد على الأقل قبل الجراحة، قم بالتبديل إلى بالطاقة عالية (> 14 مللي جول/كغ)، ونسبة عالية من البروتين (> 20%) الأعلاف التي تحتوي على جميع العناصر النزرة الأساسية والفيتامينات (لمزيد من التفاصيل، انظر قائمة المواد).
    ملاحظة: أؤكد لجميع الفئران وزنها على الأقل 25 ز عندما يتم إجراء عملية جراحية.
  3. حمل التخدير والتسكين بالحقن داخل الكيتامين (القائمة 87 مغ/كغ) وهيدروكلوريد إكسيلازيني (القائمة 13 مغ/كغ). انتظر حتى تتسامح الفأرة الميكانيكية التحفيز، مثل الملعب أخمص القدمين، دون استجابة المحرك.
  4. تأمين الماوس ناركوتيزيد مع الأشرطة في موقف ضعيف في موضعها حرارة وضع مكتب العملية، وضمان تحديد المواقع أثناء عملية مستقرة وتجنب خسائر ساحقة من حرارة الجسم.
    ملاحظة: يجب أن يكون موضعها الحرارة درجة حرارة سطحية من 36 درجة مئوية إلى 40 درجة مئوية؛ يجب أن تكون درجة حرارة الغرفة التشغيل 21 درجة مئوية.

2-القاصي كولوستومي العملية

  1. حلق شعر البطن. قبل البدء بعملية جراحية، تطهير الحقل العملية ثلاث مرات باستخدام الكحول 70% وإيودوفور. ثني الميدانية العملية لضمان ظروف معقمة.
  2. القيام فتح البطن 15 ملم وسيط قبل إينسيسينج عضلات البطن والصفاق على طول ينيا ألبا، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد من فقدان الدم.
  3. استخدام الملقط أتروماتيك دبغي اثنين، بعناية سحب الأعور والمحطة الطرفية الدقاق، وتصاعدي والقولون عرضية من التجويف الصفاقى.
    ملاحظة: كن حذراً تحد بشكل صارم التلاعب الميكانيكية للامعاء لمنع الإصابة بهياكل المساريقي العلوي.
  4. تحديد القطب سيكل وتصاعدي القولون والأمعاء (الأرقام 1a و 1b).
    ملاحظة: تحديد الهوية الصحيحة من القولون تصاعدي شرطا أساسيا للموضع الصحيح كولوستومي. في الحالات التي يكون فيها تشريح منطقة اللفائفيه غامضة، يحدد وجود البقع في بييير الأمعاء، ووجود البراز شكلت يميز القولون.
  5. استخدم مسطرة لتحديد موقف كولوستومي مستقبلا. ينبغي أن توضع 20 مم القاصي الصمام اللفائفيه كولوستومي البعيدة.
  6. جعل شق 3 مم ثانية في جدار البطن في الربع الأيمن العلوي. سحب الجزء القولون التي سبق تحديدها من خلال هذا الشق لتشكيل حلقة، مع الحرص على عدم تشويه في الحلقة.
  7. تمرير بعناية قنية رابعا 22-قياس مرونة من خلال ميسوكولون. الحرص على عدم إتلاف هياكل الأوعية الدموية المساريقي العلوي.
  8. عودة الأمعاء إلى التجويف الصفاقى.
  9. إصلاح طرفي أنبوب مرن للجلد باستخدام غرز بسيطة وخياطة ريسوربابل (مثلاً، بوليجلاكتين 910 أو بوليفيل 4-0 1/2 (ج)).
  10. قبل إغلاق فتح البطن، تؤدي السوائل الإنعاش باستخدام حقن المحلول الملحي 0.9% 0.5 مل داخل.
  11. إغلاق الصفاق وطبقة العضلات مع خياطة مستمر استخدام خياطة ريسوربابل (مثلاً، بوليجلاكتين 910 أو بوليفيل 4-0 1/2 (ج)). إغلاق الجلد بخياطة مستمرة استخدام خياطة ريسوربابل (على سبيل المثال، بوليجلاكتين 910 أو بوليفيل 4-0 1/2 (ج)).
  12. فتح حلقة القولون اكستيريوريزيد بأداء ترانسيكشن المجموع فرعي استخدام مقص ما يرام. تجنب كل ضرر مساريق. لا قطاع القولون تماما.
  13. إصلاح كل افتتاح كولوستومي باستخدام ثلاث غرز كامل-سمك واحد للصفاق والجلد استخدام مونوفيل، وخياطة قابلة للامتصاص (مثلاً، بوليديوكسانوني أو مونوفيل 6-0 3/8s). حلقة الزبائ، الذي نهاية-كولوستومي وظيفية، وحلقة ناقل، وناسور الأغشية المخاطية، يفصل بوضوح في هذه المرحلة (الشكل 1 ج).
    ملاحظة: يجب أن يكون وقت العملية أقل من 20 دقيقة للحد من الخسائر الحرارية والسوائل.
  14. بعد الانتهاء من الجراحة، وتطهير الأدوات استخدام حل خالية من ألدهيد تطهير في حمام الموجات فوق الصوتية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

3-الشام العملية (كولوتومي)

  1. نفذ الخطوات 1.1. من خلال 2.4.
  2. استخدم مسطرة لتحديد موضع كولوتومي المستقبل. يجب أن ترحل إلى كولوتومي نفس المسافة من الصمام اللفائفيه كولوستومي في المجموعة التجريبية.
  3. فتح القولون على الأقل ثلثي محيط استخدام مقص جيد.
  4. إغلاق كولوتومي مع طبقة واحدة، توقف كامل-سمك خياطة استخدام مونوفيل، وخياطة قابلة للامتصاص (مثلاً، بوليديوكسانوني، مونوفيل 6-0 3/8s).
    ملاحظة: يجب أن يكون وقت العملية أقل من عشرين دقيقة على جراح جربت، الحد من الخسائر الحرارية والسوائل.
  5. نفذ الخطوات 2.10. ، 2.11. و 2.14.

4-بعد العملية الجراحية الرعاية

  1. إرجاع الحيوانات إلى اقفاصها. توفير مناخ جيد خفف من 37 درجة مئوية (مثلاً، مع مصباح الأشعة تحت حمراء) حتى الفئران مستيقظا تماما. وبعد ذلك، الحفاظ على الفئران في بيئة تنظيم درجة الحرارة والرطوبة (21 درجة مئوية؛ 30% ± 10% رطوبة نسبية). السماح بحرية الوصول إلى الغذاء ومياه الشرب. لتسهيل امتصاص السوائل، توفير العلف الحيواني إضافية غارقة في المياه.
  2. بدء التسكين بعد العملية الجراحية عن طريق حقن البوبرينورفين وزن الجسم 0.1 مغ/كغ الليبي عند الحيوانات تظهر استجابة للتحفيز الميكانيكي. كن حذراً لتجنب هبوط في التنفس.
  3. الملحق مياه الشرب مع ترامادول 1 ملغ/مل لاستمرار المسكنات خلال الأسبوع الأول بعد العملية الجراحية.
  4. للتعويض عن انخفاض كمية السائل نظراً لانخفاض التنقل، وتوفير "منصة متينة تشرب" في القفص خلال الأسبوع الأول بعد العملية الجراحية.
  5. وزن الحيوانات وسلوك الحيوانات نقاط يوميا خلال الأسبوع الأول، كل يوم الثاني خلال الفترة المتبقية الشهر الأول، وفي كل يوم الثالث خلال الشهر الثاني باستخدام درجة شدة المرض الموصوفة في كلينورت et al. 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

جراحة هو جيد التحمل في المجموعات الشام (كولوتومي) والتجريبية (كولوستومي) على حد سواء. الوفيات المحيطة بالجراحة يجب إلا تتجاوز 10% عندما يتم بشكل صحيح تنفيذ إدارة الجراحة والمحيطة بالجراحة. في الأسبوع الأول بعد الجراحة، يعتبر فقدان الوزن الكبير في كلتا المجموعتين التجريبية والشام. حيوانات مجموعة الشام بلوغ بهم نادر الوزن عادة نحو اليوم الرابع بعد العملية الجراحية، ولكن حدوثه يوم واحد في وقت لاحق في المجموعة التجريبية. فقدان الوزن هو أكثر وضوحاً في المجموعة التجريبية، وصلت إلى 21.7 في المائة وزن الجسم الأولية. وفي المقابل، تفقد الحيوانات الشام 10.8 في المائة من الوزن (الشكل 2) الهيئة الأولى على6. بعد نادر الوزن في الأسبوع الأول بعد الجراحة، ووزن الجسم يرتفع باستمرار في كلتا المجموعتين التجريبية، ولكن مع منحدر أبطأ في المجموعة التجريبية. علامات وأعراض التهاب الأمعاء الحاد (أي، دموية التفريغ أو السائل الأمعاء تحدث لا في التجريبية ولا مجموعة شام6). مجموع الوفيات خلال الستين يوما الأولى بعد هو حوالي 40 في المائة في المجموعة كولوستومي وحوالي 10% في مجموعة كولوتومي. تحدث معظم الوفيات خلال الأسبوع الأول بعد العملية الجراحية (61 في المائة في المجموعة التجريبية، 66% في مجموعة الشام). وترد أسباب الوفاة في الشكل 3.

نتائج كولوستومي القاصي في الفئران في تطوير التهاب القولون غالباً الليمفاوي استنساخ ملامح مميزة النسيجي DC البشرية. هذه التعديلات زيادة مدة الاستبعاد المعوية. هو تقصير طول سرداب كبير في قطاعات الأمعاء المستبعدة. هذا تقصير يصل إلى دلالة إحصائية بعد 14 يوما تسريب البراز (الشكل 3a). يتم تقليل طول سرداب قدح الخلية الحاملة بعد 30 يوما في قطاعات الأمعاء المستبعدة (الشكل 3b). أرقام مطلقة قدح الخلية هي أيضا إلى تخفيض كبير في أقبية في الجزء المتعلق بالامعاء مستبعدة بعد 14 يوما بعد العملية الجراحية (الشكل 3 ج). الآفة السمة المميزة للعاصمة، تطوير المسام اللمفاوية في الغشاء المخاطي، يتطلب مدة أطول من الانحراف البراز. على الرغم من أن يمكن أن يلاحظ زيادة عدد المسام اللمفاوية أقرب وقت أسبوعين، تصبح الاختلافات الهامة بعد شهرين (الأرقام 5a-ج). جميع التغيرات التشريحية المرضية الموصوفة من قبل، هي أكثر وضوحاً في البعيدة عن المناطق الدانية للفئات المستبعدة من الأمعاء. عادة ما لا يحترم من ارتشاح بالعدلات نموذجي كعلامة على التهاب حاد (الأرقام 5 د-ه).

كدلالة الانعكاسات الجهازية لالتهاب الأمعاء المحلية، العَدلات التهم الموجهة إليه هي زيادة كبيرة في الحيوانات كولوستومي أقرب وقت 14 يوما بعد الجراحة. يتم الحفاظ على هذا الفرق حتى نهاية فترة الملاحظة (60 يوما). الصفائح الدموية التهم هي زيادة طفيفة في الحيوانات مع تسريب colonic بعد 60 يوما (الشكل 6). يتم تقليل مستوى الهيموغلوبين والهيماتوكريت 14 يوما بعد العملية في مجموعة كولوستومي بالمقارنة مع مجموعة الشام.

فقد ثبت أن نقص فيتامين في أسباب القوارض انخفض متوسط حجم كوربوسكولار (صحة الأم والطفل) وتعني قيم الهيموغلوبين corpuscular (MCV)7. في نموذجنا، نحن نرى الزيادة الأولية في كل من هذه المعلمات بعد 14 و 30 يوما. MCV وصحة الأم والطفل على حد سواء العودة إلى القيم العادية بعد متابعة أطول (الشكل 7). وهذا يبين أن كولوستومي القاصي لا تؤدي إلى نقص فيتامين هام سريرياً أثناء المتابعة طويلة الأمد.

Figure 1
الشكل 1: تشريح منطقة سيكل وإجراء العمليات الجراحية. (أ) رسومي للتشريح بعد العملية الجراحية. (ب) طبوغرافية بول سيكل والمعالم التشريحية. (ج) جرافيكال التمثيل الفتحات كولوستومي. وقد تم تعديل الشكل 1a كلينورت et al.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: هيئة التنمية الوزن. ويرد وزن الجسم كنسبة مئوية من وزن الجسم قبل الجراحة. الجسم الوزن منحنيات كولوستومي وشام تكشف الحيوانات (كولوتومي) أن فقدان الوزن بعد العملية الجراحية الأولى كان أعلى بكثير في المجموعة كولوستومي مقارنة بمجموعة شام (ف < 0.001). القيم هي وسائل ± الأخطاء المعيارية للوسط عبر 21-26 الحيوانات كل مجموعة (21 الحيوانات تلقي كولوستوميس؛ وكانت الحيوانات 26 في مجموعة الشام). وقد تم تعديل هذا الرقم كلينورت et al.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: أسباب الوفاة. يتم تمثيل كنسبة مئوية من جميع أسباب وفيات المضاعفات وموضحة في مخطط دائري (المجموعة (أ) كولوستومي، المجموعة (ب) الشام). مضاعفات ما بعد الجراحة يحددها نيكروبسي. تم تعريف متلازمة الهزال كفقدان الوزن المستمر أكثر من 33% من وزن الجسم الأولية ولا نتائج أخرى في نيكروبسي. تم تشخيص انسداد معوي وتسرب أناستوموتيك في نيكروبسي. تم تعريف مضاعفات ستوما الخراجات بيريستومال وفصل المخاطي. مضاعفات أخرى تضم dehiscence الجراح لفتح البطن، الاسكيمية الأعور، والحالات غير الواضح في نيكروبسي. وشوهدت فروق كبيرة في توزيع مضاعفات ما بعد الجراحة بين المجموعات (p = 0.021، تم تحليلها باستخدام اختبار فيشر الدقيق لتحليل وجهين ليصل إلى 6 × 6 للطوارئ الجداول). وهناك 39 الحيوانات في المجموعة كولوستومي و 29 في المجموعة الشام. وقد تم تعديل هذا الرقم كلينورت et al.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: سرداب طول وخلية قدح للسكان. وحددت الأرقام طول وخلية قدح سرداب استخدام مقاطع البارافين المستقيم بعد تلطيخ حمض الدوري-شيف. (أ) سرداب طول كان تناقص في المستقيم للحيوانات مع تسريب التهاب القولون (DC). (ب) طول المنطقة الحاملة للخلية قدح من السرداب كان قياسها وتعيين كنسبة إلى طول سرداب كامل. ثلاثين وستين يوما بعد، قد انخفضت نسبة الخلايا قدح سرداب طول الحاملة في فريق العاصمة. كانت أرقام قدح الخلية (ج) انخفاضا كبيرا في العاصمة الحيوانات مقارنة بمجموعة الشام. إظهار الرسومات البيانية في (أ) إلى (ج) الوسائل وأخطاء قياسية عبر الحيوانات 5 إلى 9 كل مجموعة (كولوستومي 14 و 30 يوما، شام 14 يوما: n = 8؛ كولوستومي 60 يوما: n = 5; شام 30 و 60 يوما: n = 9)؛ ∗p < 0.05؛ ∗∗p < 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم كلينورت et al.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: المسام اللمفاوية وتتسرب التحريضية. (أ) اللمفاوية المسام نقطتين المحولة والحيوانات الشام أحصى في مقاطع البارافين المستقيم الملون والهيماتوكسيلين ويوزين. يظهر الرسم البياني الوسائل وأخطاء قياسية عبر الحيوانات 5 إلى 9 كل مجموعة (كولوستومي 14 و 30 يوما، شام 14 يوما: n = 8؛ كولوستومي 60 يوما: n = 5؛ ومراقبة 30 و 60 يوما: n = 9)، ∗p < 0.05؛ ∗∗p < 0.01. (ب) و (ج) الممثل أمثلة المقاطع المستقيم كولوستومي (ب) والشام (ج) الحيوانات 60 يوما بعد الملون والهيماتوكسيلين ويوزين. جريب اللمفاوية بارزة (∗) كان حاضرا في الغشاء المخاطي بالماوس كولوستومي. تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر-(د) و (ه) تلطيخ مع تشلورواسيتاتي ورد فعل استراز في مقاطع البارافين أجرى لكشف المحببة العَدلات. في المقاطع العرضية للمستقيم المحولة، ارتشاح بالعدلات التهابات حادة لوحظ في المجموعة كولوستومي (د) ولا في الشام الحيوانات (ه) تصل إلى 60 يوما بعد. تمثل أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم كلينورت et al.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: حساب العَدلات والصفائح الدموية. تعداد الدم لعينات الدم الوريدي يحددها هو محلل الدم بيطرية. (أ) العَدلات التهم كانت زيادة كبيرة في المجموعة كولوستومي مقارنة بالحيوانات شام تصل إلى 60 يوما بعد. (ب (الصفيحات التهم كانت مرتفعة قليلاً في المجموعة كولوستومي 60 يوما بعد. يظهر الرسم البياني الوسائل وأخطاء قياسية عبر الحيوانات 5 إلى 9 كل مجموعة (كولوستومي 14 و 30 يوما، شام 14 يوما: n = 8؛ كولوستومي 60 يوما: n = 5; شام 30 و 60 يوما: n = 9)، ∗p < 0.05؛ ∗∗p < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: معلمات خلايا الدم الحمراء. تعداد الدم لعينات الدم الوريدي يحددها هو محلل الدم بيطرية. (أ) خضاب الدم و (ب) الهيماتوكريت قد تناقص في المجموعة كولوستومي مقارنة بمجموعة الشام. (ج) يعني حجم كوربوسكولار (صحة الأم والطفل) كانت مرتفعة إلى حد كبير 14 و 30 يوما بعد في المجموعة كولوستومي مقارنة بمجموعة الشام لكن عاد إلى طبيعته بعد 60 يوما. (د) يعني قيم الهيموغلوبين corpuscular (MCV) كانت مرتفعة بعد 30 يوما ولكن لم يعد بعد 60 يوما بعد في المجموعة كولوستومي بالمقارنة مع شام الحيوانات. يظهر الرسم البياني الوسائل وأخطاء قياسية عبر الحيوانات 5 إلى 9 كل مجموعة (كولوستومي 14 و 30 يوما، شام 14 يوما: n = 8؛ كولوستومي 60 يوما: n = 5; شام 30 و 60 يوما: n = 9)، ∗p < 0.05؛ ∗∗p < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج مورين من العاصمة التي عرضت في هذا البروتوكول موثوق يستنسخ نسيجية ملامح العاصمة البشرية (مثلاً، و حيثياته تطوير المسام اللمفاوية في submucosa قطاعات الأمعاء الملتهبة وسرداب تقصير، والتخفيضات في أرقام الخلية قدح). وبصرف النظر عن هذه الميزة، هذا النموذج هو الناجمة عن عامل المسبّب مشابهة جداً ويقدم بدوره سريرية من متوسطة إلى خفيفة الشدة كما الحال في البشر الأكثر تضررا.

للحصول على النتائج استنساخه والفتك المحيطة بالجراحة مقبولة، بعض الممارسات في مجال تقنيات ميكروسورجيكال ضروري. ومع ذلك، يمكن إجراء العملية كولوستومي والشام (كولوتومي) مع نفوق المحيطة بالجراحة منخفضة جداً (< 10%). بعض خطوات تنفيذية ذات أهمية كبيرة: 1) التعرف على الدقاق القولون والمحطة الطرفية. في الحالات حيث تشريح منطقة اللفائفيه غير واضحة، يمكن التعرف على القولون بوجود المشكلة البراز والدقاق المحطة الطرفية بوجود البقع في بير. 2) عندما اكستيريوريزينج في حلقة كولوستومي، أؤكد لا ملتوية في مساريق، وبالتالي تجنب الاسكيمية المساريقي العلوي وانسداد معوي الميكانيكية. 3) عند ثقب مساريق مع أنبوب مرن، أؤكد لاختيار قطاع خالية من السفينة، وبالتالي منع الاسكيمية المساريقي العلوي والنزيف. 4) عند إنشاء شق صغير في جدار البطن، تحقق من الأرقاء كافية. إذا لزم الأمر، استخدام التخثر الحراري لوقف النزيف من الأوعية العضلات. 5) أؤكد colonic حلقة مفتوح على الأقل في ثلثي محيط به وأن الجدار الخلفي هو اكستيريوريزيد بما فيه الكفاية، مما يضمن انسداد كامل لمرور البراز إلى قطاعات الأمعاء القاصي. 6) أؤكد أن كلا طرفي كولوستومي جيدا ثابتة على الجلد لتجنب ممر مفتوح إلى التجويف الصفاقى أسفر عن ارتفاع مخاطر الإصابة أو انسداد معوي ميكانيكية لأنه لا يمكن الخروج من تيار البراز. عادة، يمكن إجراء جميع العمليات الجراحية دون النظارات المكبرة أو المجهر الجراحي. بشكل عام، والاستفادة من هذه الأجهزة يتطلب المزيد من التدريب.

حتى عندما تعقد الإجراءات الجراحية فقط معتدلة، وهناك العديد من المسائل الأساسية المنطوق والمحيطة بالجراحة النظر إلى إنهاء هذه التجربة مع النتائج استنساخه بنجاح.

من الضروري للبقاء الطويل الأجل مع كولوستومي دائم أن الفئران الأعور سليمة. وأظهرت مجموعة تجريبية مع الدانية كولوستوميس المتاخمة للصمام اللفائفيه بمعدل وفيات بنسبة 100% في الأسبوع الأول بعد العملية الجراحية بسبب فقدان الوزن لا رجعة فيه (البيانات لا تظهر). ولذلك، أنها ذات أهمية قصوى لاختيار الموقع كولوستومي القاصي مالا يقل عن 20 مم من صمام بوهين. قد تكون هذه الملاحظة بسبب فسيولوجيا الهضم القوارض. النقل إلى الوراء من القولون الدانية للأعور يحدث في هذه الأنواع. الأعور مكان تجميع للمواد الغذائية التي occurs8 النبت البكتيرية. تشير القيم MCV طبيعي وصحة الأم والطفل أثناء المتابعة طويلة الأمد إلى أن الحيوانات مع كولوستوميس القاصي لا يعانون من نقص الفيتامينات الهامة. وعلاوة على ذلك، كوبروفاجي جزء أساسي من السلوك الغذائي للقوارض في بيئاتها الطبيعية. عند إنشاء النموذج، كنا قلق بالغ أن مقاومة كوبروفاجي نتيجة لوجود كولوستومي الدائمة يمكن أن يؤدي في حالات نقص التغذية (مثلاً، فيتامين ب). ومع ذلك، في حين أنها مشكلة في ظروف حيث يقتصر الوصول إلى المواد الغذائية، سابقا قد ثبت كوبروفاجي أن يفقد أهميته الغذائية تحت ظروف تجريبية مع فائض مجاناً إلى الماء والغذاء المتوازن غذائياً9 . لدينا ظروف تجريبية، أنها حيوية لتحسين ظروف المدخول الغذائي بعد العملية الجراحية. فنحن نستخدم علف الحيوان محتوى نسبة عالية من بروتين، وتحسين نوعية البروتين، وزيادة كثافة الطاقة. كانت أقلمة الحيوانات لهذا النظام الغذائي من أسبوعين على الأقل قبل الجراحة. بعد، وتغذية غارقة في المياه قدمت ليبيدوم الإعلانية لتيسير الغذاء وتناول السوائل.

من المهم الاستفادة من الفئران من نفس الجنس في كلتا المجموعتين التجريبية والشام. وقد ثبت الجنس يؤثر تأثيراً كبيرا على مسار التهاب النظامية بل أيضا من التهاب الأمعاء في القولون التي يسببها كيميائيا مختلف نماذج10،11،12. بشكل عام، سيتم وضع الحيوانات الذكور المرض أكثر وضوحاً مع التهاب أكبر، المزيد من الضرر سرداب، أقل من التجدد، مستويات أعلى من السيتوكينات الموالية التحريضية، والمبالغ المستردة أبطأ من فقدان الوزن10. وثمة ميزة أخرى لاستخدام الحيوانات الذكور هو أفضل تطابق العمر الجسم قبل الجراحة الأوزان، مما أدى إلى تعويض أفضل فترة فقدان الوزن بعد العملية الجراحية الأولى. ومع ذلك، يمكن استخدام الفئران الإناث في البروتوكول إذا كان محدد الأسئلة (مثلاً، تأثير الجنس الهرمونات على المجاهرة بالعاصمة التي سيتم التصدي لها. استخدام الفئران الذكور يتطلب المزيد من الجهد في الحفاظ على ظروف السكن المستقر. الفئران الذكور هم أكثر عرضه لتفاعلات العدوانية تؤدي إلى الإصابة والوفاة. تعيش الفئران الذكور في التسلسلات الهرمية الراسخة مع أحد الذكور المسيطرة. حالما يتم إنشاء التسلسل الهرمي في المجموعة، استمرار القتال هو أقل شيوعاً13،14. ولهذا السبب، شكلت مجموعات تجريبية لدى وصوله من الفئران في منشآتنا الحيوان أسبوعين على الأقل قبل الجراحة، والحفاظ على هذه المجموعات حتى انتهاء التجارب. وبصفة عامة، أبقى المجموعات التجريبية من 5 إلى 7 الحيوانات في قفص واحد. وكان الحفاظ على الاستقرار الاجتماعي، وظروف السكن أهمية قصوى ليس فقط للحد من السلوكيات العدوانية للحيوانات التجريبية. أظهرت ظروف الإسكان للتأثير على زيادة الوزن وكذلك المعلمات المناعية15،،من1617.

قابلية للنماذج التي يسببها كيميائيا ووراثيا التهاب القولون يختلف اختلافاً كبيرا بين الماوس سلالات18،،من1920. وأنشئ هذا البروتوكول في الفئران C57Bl/6، سلالة ماوس مع خلفية وراثية محددة تحديداً جيدا والجهاز المناعي جيدا تتسم21،22،23 يوضح متوسط إلى قوي التحريضية كبريتات الصوديوم الناجم عن التهاب القولون النموذجي20 ردا ديكستران ويعتبر من سلالة Th1 تنميط23. يمكن اعتبار استخدام سلالات أخرى الماوس عندما يكون مطلوباً أكثر شدة المرض الأنشطة أو بيئة Th2.

وباختصار، لدينا بروتوكول يشكل أداة قيمة لتقييم دور مختلف أنواع الخلايا المناعية، السيتوكينات، المستقطبات، والجزيئات الأخرى التنبيه في الآلية المرضية للعاصمة. عدد كبير من نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة مع الخلفية C57BL/6 ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع نموذجنا (مثلاً، الفئران ناقصة لايل--17، إيل-10، تشيموكيني CXCL13، CXCR5 تشيموكيني-مستقبلات CCR7، وسفينجوسيني-1-فوسفات مستقبلات 4). إلى حد كبير تيسير توافر سلالات الماوس كونجينيك على خلفية C57BL/6 تجارب نقل لإنشاء الدور لأنواع الخلايا المتميزة المشاركة في المسببات للعاصمة. أخيرا، يوفر الطراز الفرصة لتقييم تأثير التدخلات المحلية (مثلاً، تعديل ميكروبيومي المحلية وعلاج الالتهابات المحلية) على حصانة المخاطي في قطاعات الأمعاء المتضررة وغير المتضررة والجهازية التوازن المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أن تعلن جميع المؤلفين أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

لا شيء

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics