Lymfkliertest distale colostoma, een nieuw Model van afleiding Colitis in C57BL/6 muizen

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Lymfkliertest distale colostomie biedt een lymfkliertest model voor menselijke afleiding colitis, een overwegend lymfatische colitis in dikke darm segment van de fecale stream uitgesloten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Afleiding colitis (DC) is een frequente klinische toestand optreedt bij patiënten met segmenten van de darm van de fecale stream als gevolg van een onderhoudend enterostomy uitgesloten. De etiologie van deze ziekte blijft vaag, maar lijkt te verschillen van die van de klassieke inflammatoire darmziekten zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. Onderzoek dat gericht is aan het ontcijferen van de pathofysiologische mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van deze ziekte ernstig belemmerd door het ontbreken van een passende lymfkliertest model. Dit protocol genereert een lymfkliertest model van DC, dat de studie van de rol van het immuunsysteem en zijn interactie met de microbiome in de ontwikkeling van DC vergemakkelijkt. In dit model worden weergegeven met C57BL/6 dieren, zijn distale delen van de dikke darm uitgesloten van de fecale stroom door het creëren van een distale colostoma, triggering de ontwikkeling van milde tot matige ontsteking in de darm uitgesloten segmenten en reproduceren van de hallmark laesies van de mens DC met een matige systemische inflammatoire respons. In tegenstelling tot het model van de rat zijn een groot aantal genetisch gemodificeerde lymfkliertest modellen op de achtergrond C57BL/6 beschikbaar. De combinatie van deze dieren met ons model zorgt ervoor dat de potentiële rol van individuele cytokines, chemokines of receptoren van biologische actieve moleculen (bijvoorbeeldInterleukine (IL)-17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine receptoren CXCR5 en CCR7 en de sphingosine-1-fosfaat receptor 4) te worden beoordeeld in de pathogenese van DC. De beschikbaarheid van congenisch stammen van de muis op de achtergrond C57BL/6 vergemakkelijkt grotendeels overdracht experimenten om de rol van verschillende celtypes betrokken in de etiologie van DC. Ten slotte het model biedt de mogelijkheid om de invloeden van lokale interventies (b.v., wijziging van de lokale microbiome of lokale anti-inflammatoire therapie) beoordelen op mucosale immuniteit in segmenten van de darm waarin dit probleem optreedt en niet-getroffen en de op systemische immuun homeostase.

Introduction

In de afgelopen jaren een groot aantal niet-infectieuze colitis entiteiten anders dan klassieke inflammatoire darmziekten (IBDs; dwz., ziekte van Crohn ziekte of colitis ulcerosa) klinisch en histopathologically bij de mens hebben is gekenmerkt. De pathofysiologische mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van deze colitis vormen worden niet volledig begrepen gedeeltelijk omdat passende dierlijke modellen schaars zijn. Afleiding colitis is één van deze recent beschreven entiteiten. Hoewel de term werd bedacht in 1980 door Glotzer1, werd de eerste beschrijving van een soortgelijke fenotype gegeven in 1972 door Morson2. De ziekte ontwikkelt in 50% tot 91% van patiënten met het verleggen van de enterostomy en de klinische intensiteit varieert3,4. Gezien de jaarlijkse incidentie van ongeveer 120.000 colostomie patiënten in de Verenigde Staten van Amerika, vormt deze ziekte-entiteit een belangrijk gezondheidsprobleem.

Het algemene doel van de ontwikkeling van dit protocol was om een lymfkliertest DC model dat berust op een colitis trigger gelijkend op dat gezien in menselijke DC en dat reproduceert de primaire histopathologische kenmerken van de ziekte bij de mens. In tegenstelling tot andere modellen lymfkliertest colitis ulcerosa inductie in ons model vereist geen genetisch gemodificeerde dieren (bijvoorbeeld, IL-7 transgene muizen, N-cadherine dominante negatieve muizen of TGFβ- / - muizen), de toepassing van chemisch irriterende stoffen (b.v., dextran sulfaat natrium (DSS) - geïnduceerde colitis, of trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) - geïnduceerde colitis), of de overdracht van bepaalde cel populaties in immuun deficiënte muizen (zoals in dehoge overdracht van CD45RB model van colitis) (voor een overzicht, Zie5). In tegenstelling tot andere modellen kunt het intact immuunsysteem van ons model DC beoordeling van het immunologische mechanisme die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de DC. De beperking van de mucosal ontsteking aan het segment uitgesloten darm kunt beoordeling van de weerslag op de mucosale immuniteit in andere delen van het maag-darmkanaal, op de immuun homeostase in andere immuun compartimenten van het darmkanaal (bv , Peyer van patches en mesenteriale lymfklieren), en op de immuun homeostase van het hele organisme. Ten slotte, ons model vormt een passend instrument voor het onderzoeken van de mechanismen waarmee lokale inflammatoire stimuli die afkomstig zijn van wijzigingen in de normale omgeving voor zowel de lokale microbiome, evenals voedselbehoefte antigenen worden bestuurd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de regering van de veterinaire autoriteit (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, van LALLF M-V).

1. preoperatieve zorg en voorbereiding van het dier

  1. Bij aankomst in het dier faciliteit, dieren (C57Bl/6) verdelen in groepen van vergelijkbare grootte, cage elke groep samen en groepen de experimenten constant te houden.
    Opmerking: Gebruik maken van dieren van hetzelfde geslacht. De beschreven resultaten werden bekomen met mannelijke muizen.
    Opmerking: Als mannelijke dieren worden gebruikt, kooi groepen samen beginnen wanneer ze 7 weken oud, zijn zodat een hiërarchie ingesteld kan worden, dus het minimaliseren van het risico van agressief gedrag tijdens experimenten.
  2. Ten minste één week voor de operatie, overschakelen naar een energierijke (> 14 MJ/kg) en eiwitrijk (> 20%) voeders die bevatten alle essentiële sporenelementen en vitaminen (voor meer informatie, Zie materiaallijst).
    Opmerking: Verzekeren alle muizen Weeg ten minste 25 g wanneer chirurgie wordt uitgevoerd.
  3. Anesthesie en analgesie door intraperitoneale injectie van ketamine (87 mg/kg i.p.) en xylazine waterstofchloride (13 mg/kg i.p.) veroorzaken. Wachten totdat de muis mechanische stimulatie, bijvoorbeeld teen worp, zonder motor reactie tolereert.
  4. Beveilig de narcotized muis met tapes in een liggende positie op een onderlaag van de warmte gepositioneerd aan de balie van de operatie, waarborging van stabiele positionering tijdens operatie en het vermijden van een overweldigende verlies van lichaamswarmte.
    Opmerking: De warmte ondervloer moet een oppervlakte temperatuur van 36 ° C tot 40 ° C; moet de operatiekamer temperatuur 21 ° C.

2. de distale colostomie operatie

  1. Het buikhaar scheren. Voordat u begint chirurgie, Desinfecteer het operatie gebied drie keer gebruik van alcohol 70% en een iodophor. Drape het operatie gebied voor aseptische condities te garanderen.
  2. Een 15-mm mediaan laparotomie uitvoeren door het gebeuren van de buikspieren aan te spannen en het buikvlies langs de linea alba, dus het minimaliseren van bloedverlies.
  3. Gebruik twee DeBakey atraumatische pincet, Trek voorzichtig de blindedarm, terminal ileum, en oplopende en transverse colon uit de peritoneale holte.
    Opmerking: Wees voorzichtig te strikt beperken mechanische manipulatie van de darm ter voorkoming van schade aan mesenterische structuren.
  4. Identificeer de cecal paal, opgaande dikke darm en dunne darm (figuren 1a en 1b).
    Opmerking: Juiste identificatie van de oplopende dubbelpunt is van fundamenteel belang voor de juiste plaatsing van de colostomie. In gevallen waar de anatomie van de regio ileocecal dubbelzinnig is, de aanwezigheid van Peyer van patches identificeert de dunne darm en de aanwezigheid van gevormde ontlasting kenmerkt de dikke darm.
  5. Een liniaal gebruiken om te bepalen van de positie van de toekomstige colostomie. Het moet worden geplaatst 20 mm distale aan de ileocecal valve voor een distale colostomie.
  6. Maak een tweede 3-mm incisie in de buikwand in de hogere juiste kwadrant. Trek de eerder geconstateerde segment van de dikke darm door middel van deze incisie vormen een lus, voorzichtig om niet te verstoren de lus.
  7. Zorgvuldig passeren een 22-gauge flexibele i.v. canule via de mesocolon. Wees voorzichtig niet te beschadigen mesenterische vasculaire structuren.
  8. De darm terug naar de peritoneale holte.
  9. Bevestig beide uiteinden van de flexibele buis aan de huid met behulp van eenvoudige steken en een resorbeerbare hechtdraad (b.v., polyglactin 910 of polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Uitvoeren alvorens te sluiten de laparotomie, vloeistof reanimatie met behulp van een intraperitoneale injectie van 0,5 mL 0,9% zout.
  11. Sluit het buikvlies en de spier laag met een continue hechtdraad met een resorbeerbare hechtdraad (bijvoorbeeld polyglactin 910 of polyfil 4-0 1/2 c). Sluit de huid met een continue hechtdraad met een resorbeerbare hechtdraad (b.v., polyglactin 910 of polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Open de exteriorized colon lus door het uitvoeren van een subtotaal transect met behulp van een fijne schaar. Vermijd alle schade aan het mesenterium. Niet transect het colon volledig.
  13. Repareren van elke colostomie openen met behulp van drie één volledige-dikte steken naar het buikvlies en huid met behulp van een monofil, absorbeerbare hechtdraad (bijvoorbeeld, polydioxanone of monofil 6-0 3/8s). De afferent loop, oftewel een functionele einde-colostoma, en de efferent loop, oftewel een slijm fistels, duidelijk gescheiden zijn op dit punt (Figuur 1 c).
    Opmerking: Operation time moet minder dan 20 minuten te beperken vloeistof en thermische verliezen.
  14. Na afwerking van chirurgie, desinfecteren instrumenten met behulp van een aldehyde-vrije desinfectie-oplossing in een ultrasoonbad volgens de instructies van de fabrikant.

3. sham operatie (Colotomy)

  1. Voer stap 1.1. via 2.4.
  2. Gebruik een liniaal om de positie van de toekomstige colotomy te bepalen. De colotomy moet op dezelfde afstand van de ileocecal valve als de colostoma in de experimentele groep worden geplaatst.
  3. Openen van de dikke darm ten minste tweederde de omtrek met behulp van fijn schaar.
  4. Dicht de colotomy met een enkellaags, full-dikte onderbroken hechtdraad met behulp van een monofil, absorbeerbare hechtdraad (b.v., polydioxanone, monofil 6-0 3/8s).
    Opmerking: Operation time moet minder dan 20 minuten voor een geëxperimenteerd chirurg, vloeistof en thermische verliezen te beperken.
  5. Stappen 2.10. , 2.11. en 2.14.

4. de postoperatieve zorg

  1. Dieren terugkeren naar hun kooien. Zorgen voor een Wohltemperierte sfeer van 37 ° C (bijvoorbeeldmet een infraroodlamp) totdat muizen volledig wakker zijn. Houd vervolgens, muizen in een omgeving van temperatuur - en vocht-gereglementeerde (21 ° C, relatieve vochtigheid van 30% ± 10%). Gratis toegang tot voedsel en drinkwater. Om te vergemakkelijken de vloeibare opname, bieden extra water doordrenkte diervoeder.
  2. Start postoperatieve analgesie door het injecteren van 0,1 mg/kg lichaam gewicht buprenorfine s.c. Wanneer dieren reactie op mechanische stimulatie vertonen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat respiratoire depressie.
  3. Toeslag drinkwater met 1 mg/mL tramadol voor voortdurende Analgesie, tijdens de eerste week van de postoperatieve.
  4. Ter compensatie van de verminderde vochtinname wijten aan verminderde mobiliteit, leveren een solide drinken Pad in de kooi tijdens de eerste week van de postoperatieve.
  5. Wegen van de dieren en de dierlijke gedrag score dagelijks tijdens de eerste week, elke tweede dag tijdens de rest van de eerste maand en elke derde dag tijdens de tweede maand met behulp van de ziekte ernst score beschreven in Kleinwort et al. 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Chirurgie wordt goed verdragen, zowel in de experimentele (colostoma) en sham (colotomy) groepen. Perioperatieve sterfte mag niet meer dan 10%, wanneer chirurgie en perioperatieve beheer wordt correct uitgevoerd. In de eerste week van de postoperatieve was wordt significant gewichtsverlies gezien in de experimentele en schijnvertoning groepen. Dieren van de sham-groep bereiken hun gewicht nadir meestal naar de vierde postoperatieve dag, maar het komt op een dag later in de experimentele groep. Gewichtsverlies is meer uitgesproken in de experimentele groep, 21,7% van eerste lichaamsgewicht te bereiken. Daarentegen verliezen sham dieren 10,8% van hun aanvankelijke lichaam gewicht (Figuur 2)6. Na de nadir gewicht in de eerste week van de postoperatieve stijgt lichaamsgewicht voortdurend in beide experimentele groepen, maar met een langzamere helling in de experimentele groep. Tekenen en symptomen van ernstige darmontstekingen (d.w.z., bloedige kwijting of vloeibare stoelgang optreden noch in de experimentele noch de schijnvertoning groep6). Totale sterfte tijdens de eerste 60 dagen is postoperatief ongeveer 40% in de groep colostoma en ongeveer 10% in de colotomy-groep. Meeste sterfgevallen zich voordoen tijdens de eerste postoperatieve week (61% in de experimentele groep, 66% in de sham-groep). Doodsoorzaken zijn afgebeeld in Figuur 3.

Distale colostoma in muizen resulteert in de ontwikkeling van overwegend lymfatische colitis reproduceren de hallmark histologische kenmerken van menselijke DC. Deze veranderingen vergroten met de duur van intestinale uitsluiting. Crypt lengte is aanzienlijk verkort in uitgesloten darm segmenten. Deze verkorting bereikt statistische significantie na 14 dagen van fecale afleiding (Figuur 3a). De lengte van de crypte goblet cel dragende is verminderd na 30 dagen in uitgesloten darm segmenten (Figuur 3b). Absolute goblet cel nummers zijn ook aanzienlijk verminderd in cryptes in het segment van de uitgesloten darm na 14 postoperatieve dagen (Figuur 3 c). De hallmark-laesie van DC, de ontwikkeling van lymfoïde follikels in de mucosa, vereist een langere duur van de afwijking van de ontlasting. Hoewel een toenemend aantal de lymfoïde follikels kan zo vroeg als twee weken worden waargenomen, steeds verschillen groter na twee maanden (cijfers 5a-c). Alle histopathologische veranderingen voordien beschreef zijn meer uitgesproken distale dan in proximale regio's van de uitgesloten darm segmenten. Een typische neutrofiele infiltreren als een teken van acute ontsteking (cijfers 5 d-e) meestal niet wordt nageleefd.

Als een teken van een systemische weerslag van lokale darmontstekingen, zijn neutrofiele graven aanzienlijk verhoogd in colostoma dieren zo spoedig 14 dagen na de operatie. Dit verschil wordt gehandhaafd tot het einde van de observatieperiode (60 dagen). Bloedplaatjes graven zijn licht gestegen in dieren met Colon afleiding na 60 dagen (Figuur 6). Hemoglobine niveau en hematocriet worden verlaagd van 14 dagen na de operatie in de colostomie groep ten opzichte van de sham-groep.

Het is aangetoond dat vitamine-deficiëntie in knaagdieren oorzaken verminderd mean corpuscular volume (MCH) en mean corpuscular hemoglobine (MCV) waarden7. In ons model zien we de eerste stijgingen van de beide deze parameters na 14 tot 30 dagen. MCV zowel MCH terug naar normale waarden na langere follow-up (Figuur 7). Dit toont aan dat distale colostomie resulteert niet in klinisch significante vitamine-deficiëntie tijdens langdurige follow-up.

Figure 1
Figuur 1: Anatomie van de cecal regio en de chirurgische ingreep. (a) grafische weergave van postoperatieve anatomie. (b) de topografie van de cecal pol en anatomische bezienswaardigheden. (c) grafische representatie van de openingen colostomie. Figuur 1a is gewijzigd van Kleinwort et al.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Body gewicht ontwikkeling. Lichaamsgewicht wordt weergegeven als percentage van de preoperatieve lichaamsgewicht. Het lichaam rondingen van colostomie gewicht en sham (colotomy) dieren onthullen dat de eerste postoperatieve gewichtsverlies significant hoger in de groep van de colostomie ten opzichte van de sham-groep (p < 0,001 was). Waarden zijn middelen ± standaardfouten van de gemiddelde over 21-26 dieren per groep (21 dieren ontvangen colostomies; 26 dieren waren in de sham-groep). Dit cijfer is gewijzigd van Kleinwort et al.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: oorzaken van de dood. Complicaties worden weergegeven als percentages van all-cause mortality en geïllustreerd in een cirkeldiagram (colostoma (a) groep, (b) sham groep). Postoperatieve complicaties werden vastgesteld door necropsie. Verspillen functioneringssyndroom is gedefinieerd als continu gewichtsverlies meer dan 33% van de initiële lichaamsgewicht en geen andere bevindingen bij de necropsie. Ileus en anastomotic lekkage werden gediagnosticeerd bij de necropsie. Stoma complicaties waren gedefinieerd als peristomal abcessen en mucocutane scheidingen. Andere complicaties bestaat wond dehiscentie van de laparotomie, ischemie van de blindedarm, en gevallen niet duidelijk bij de necropsie. Aanzienlijke verschillen in de verdeling van de postoperatieve complicaties werden gezien tussen groepen (p = 0.021, geanalyseerd met de Fisher exact test voor twee-zijdige analyse van maximaal 6 × 6 contingentie tabellen). Er waren 39 dieren in de groep colostoma en 29 in de sham-groep. Dit cijfer is gewijzigd van Kleinwort et al.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Crypt lengte en goblet cel bevolking. Crypt lengte en goblet cel nummers werden bepaald met behulp van paraffine secties van het rectum na Periodieke Zure Schiff kleuring. (a) de crypte lengte was aanzienlijk daalde in het rectum van runderen met afleiding colitis (DC). (b) de lengte van de goblet cel dragende regio van de crypte werd gemeten en ingesteld als een verhouding op de lengte van de volledige crypt. Dertig en zestig dagen postoperatief, was het percentage crypt-lengte-bevattende goblet cellen daalde in de DC-groep. (c) Goblet cel nummers werden aanzienlijk verlaagd in DC dieren ten opzichte van de sham-groep. Grafieken in (a) tot en met (c) tonen middelen en standaardfouten over 5 tot en met 9 dieren per groep (colostoma 14 en 30 dagen, sham 14 dagen: n = 8; colostomie 60 dagen: n = 5, 30 en 60 dagen sham: n = 9); ∗p < 0.05; ∗∗p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Kleinwort et al.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: lymfoïde follikels en inflammatoire infiltreert. (a) de lymfoïde follikels omgereden dubbele punten en sham dieren werden geteld op paraffine secties van het rectum gekleurd met haematoxyline en eosine. De grafiek toont middelen en standaardfouten over 5 tot en met 9 dieren per groep (colostoma 14 en 30 dagen, sham 14 dagen: n = 8; colostomie 60 dagen: n = 5; controle van 30 en 60 dagen: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0,01. (b) en (c) vertegenwoordiger voorbeelden van secties van het rectum van colostomie (b) en (c) sham dieren 60 dagen postoperatief gekleurd met haematoxyline en eosine. Een prominente lymfoïde follikel (∗) was aanwezig in de mucosa van de muis van een colostoma. Schaal staven 100 µm. (d) en (e) kleuring met chloroacetate nte esterase reactie op paraffine secties werd uitgevoerd om te detecteren neutrofiele granulocyten. Op dwarsdoorsneden van het omgeleide rectum, werd een acute inflammatoire neutrofiele infiltreren waargenomen in de colostomie groep (d) noch in sham dieren (e) van 60 dagen postoperatief. Schaal staven 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Kleinwort et al.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: neutrofiele en bloedplaatjes graven. Bloed graven van veneuze bloedmonsters werden vastgesteld door een veterinaire hematologie analyzer. (a) neutrofiele graven werden aanzienlijk verhoogd in de groep van de colostomie t.o.v. sham dieren omhoog tot 60 dagen postoperatief. (b) bloedplaatjes graven waren iets verheven in de groep colostomie 60 dagen postoperatief. De grafiek toont middelen en standaardfouten over 5 tot en met 9 dieren per groep (colostoma 14 en 30 dagen, sham 14 dagen: n = 8; colostomie 60 dagen: n = 5, 30 en 60 dagen sham: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: parameters van de rode bloedcellen. Bloed graven van veneuze bloedmonsters werden vastgesteld door een veterinaire hematologie analyzer. (a) hemoglobine en (b) hematocriet waren aanzienlijk daalde in de groep van de colostomie ten opzichte van sham groep. (c) mean corpuscular volume (MCH) was aanzienlijk verhoogde 14 en 30 dagen postoperatief in de colostomie groep ten opzichte van de sham-groep maar keerde terug naar normale na 60 dagen. (d) mean corpuscular hemoglobine (MCV) waarden werden verheven na 30 dagen, maar niet meer na 60 dagen postoperatief in de groep colostomie t.o.v. sham dieren. De grafiek toont middelen en standaardfouten over 5 tot en met 9 dieren per groep (colostoma 14 en 30 dagen, sham 14 dagen: n = 8; colostomie 60 dagen: n = 5, 30 en 60 dagen sham: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het lymfkliertest model van DC gepresenteerd in dit protocol betrouwbaar reproduceert de histopathologische kenmerken van menselijke DC (b.v., DOVO ontwikkeling van lymfoïde follikels in de submucosa van ontstoken darm segmenten, crypt verkorten en vermindering van de Goblet cel nummers). Afgezien van dit voordeel, dit model wordt veroorzaakt door een zeer vergelijkbaar activerende factor en presenteert met een klinische cursus van matige tot milde Ernst, zoals het geval is in de meest getroffen mensen.

Om reproduceerbare resultaten en aanvaardbaar perioperatieve letaliteit, sommige praktijk in microchirurgische technieken nodig is. Echter zowel colostoma en sham bewerking (colotomy) kan worden uitgevoerd met zeer lage perioperatieve sterfte (< 10%). Sommige bewerkingsstappen zijn van groot belang: 1) de dubbele punt en terminal ileum positief kan identificeren. In gevallen waar de anatomie van de ileocecal regio niet duidelijk, kan de dikke darm worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van gevormde ontlasting en de terminal ileum door de aanwezigheid van Peyer van patches. 2) wanneer de lus colostomie exteriorizing, verzekeren dat het mesenterium is niet verwrongen, dus het vermijden van mesenterische ischemie en mechanische ileus. 3) wanneer het mesenterium met de flexibele buis prikken, verzekeren dat een vaartuig-vrije sector wordt gekozen, waardoor het bloeden en de lymfklieren ischemie. 4) bij het maken van de kleine incisie in de buikwand, controleren op voldoende hemostase. Indien nodig kunt thermo-stolling stoppen met bloeden uit spier vaartuigen. 5) verzekeren de Colon lus bedraagt open ten minste tweederde van de omtrek en dat de achterste muur voldoende is die, aldus het waarborgen van volledige verstopping van de ontlasting doorgang naar de distale darm segmenten. 6) verzekeren dat beide uiteinden colostomie zijn verholpen, goed voor de huid om te voorkomen dat een open doorgang naar de peritoneale Holte, wat resulteert in hogere infectierisico's of een mechanische ileus omdat de fecale stream kan niet afsluiten. Normaal gesproken, kunnen alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd zonder vergrootglazen of microscopen chirurgische. In het algemeen nodig gebruik van deze apparaten bijscholing.

Zelfs wanneer de complexiteit van de chirurgische procedures slechts matig is, zijn er vele essentiële operatieve en perioperatieve kwesties om te worden beschouwd als het experiment met reproduceerbare resultaten met succes te beëindigen.

Het is essentieel voor het voortbestaan op lange termijn met een permanente colostomie dat muizen een intact blindedarm hebben. Een experimentele groep met proximale colostomies grenzend aan het ileocecal valve toonde een sterftecijfer van 100% in de eerste week van de postoperatieve vanwege onomkeerbare gewichtsverlies (gegevens niet worden weergegeven). Daarom is het van het grootste belang de colostomie site ten minste 20 mm distale om uit te kiezen van de Bauhin ventiel. Deze constatering kan te wijten zijn aan de Fysiologie van knaagdier spijsvertering. Retrograde transport van de proximale dikke darm naar de blindedarm treedt op in deze soorten. De blindedarm is waar de synthese van voedingsstoffen door de occurs8 van de bacteriële microflora. Normaal MCV en MCH waarden tijdens langdurige follow-up geven aan dat dieren met distale colostomies niet aan belangrijke vitamine tekorten lijdt. Bovendien, coprophagy is een essentieel onderdeel van de voeding gedrag van knaagdieren in hun natuurlijke omgeving. Bij de vaststelling van het model, waren we zeer bezorgd dat storing veroorzaakt de coprophagy als gevolg van de aanwezigheid van een permanente colostoma leiden tot kan Voedingstekorten, (b.v., vitamine B). Echter, hoewel het is een probleem onder omstandigheden waar de toegang tot voedingsstoffen is beperkt, eerder is gebleken dat coprophagy verliest de nutritionele betekenis ervan onder proefomstandigheden met gratis overmaat aan water en voedsel wat de voeding betreft evenwichtige9 . Onder onze proefomstandigheden is het essentieel voor het optimaliseren van de voorwaarden van postoperatieve voeding inname. We gebruikten de diervoeders die had een hoog eiwitgehalte, eiwit kwaliteit geoptimaliseerd en verhoogde energiedichtheid. Dieren werden geacclimatiseerd aan dit dieet ten minste twee weken voor de operatie. Postoperatief, werd water doordrenkte diervoeders aangeboden ad libidum meedraagt voedsel-en vochtinname.

Het is cruciaal dat de muizen van hetzelfde geslacht in de experimentele en schijnvertoning groepen gebruiken. Seks is aangetoond dat beduidend beïnvloeden de cursus niet alleen van systemische ontsteking, maar ook van darmontstekingen in verschillende chemisch geïnduceerde colitis modellen10,11,12. In het algemeen, zal de mannelijke dieren ontwikkelen meer uitgesproken ziekte met meer ontsteking meer crypt schade, minder regeneratie, hogere niveaus van pro-ontsteking cytokinen en langzamer terugvorderingen van gewicht verlies10. Een bijkomend voordeel van het gebruik van mannelijke dieren is beter leeftijd-matched preoperatieve lichaam gewichten, wat leidt tot betere vergoeding van de postoperatieve begingewicht verlies periode. Niettemin, vrouwelijke muizen in het protocol kunnen worden gebruikt als specifieke vragen (bijvoorbeeld, de invloed van geslacht hormonen op de manifestatie van DC moeten worden aangepakt. Met behulp van mannelijke muizen vergt meer inspanning in het handhaven van stabiele huisvesting. Mannelijke muizen zijn meer vatbaar voor agressieve interacties leidt tot verwonding en dood. Mannelijke muizen wonen in gevestigde hiërarchieën met een dominante man. Zodra de hiërarchie in de groep wordt gevestigd, is voortdurende gevechten minder gemeenschappelijk13,14. Om deze reden we gevormd van de experimentele groepen bij aankomst van de muizen in onze dier faciliteit ten minste twee weken voor de operatie en onderhouden van deze groepen tot het einde van de experimenten. In het algemeen, werden experimentele groepen van 5 tot en met 7 dieren gehouden in een kooi. Onderhoud van stabiele sociale en huisvestingsomstandigheden was van groot belang niet alleen om te minimaliseren van agressief gedrag van proefdieren. Huisvesting voorwaarden is aangetoond dat de invloed van gewichtstoename, evenals de immunologische parameters15,16,17.

Gevoeligheid voor chemisch geïnduceerde en genetisch gemodificeerde colitis modellen verschilt aanzienlijk tussen muis stammen18,19,20. Dit protocol werd opgericht in C57Bl/6 muizen, de stam van een muis met een welbepaalde genetische achtergrond en een goed gekarakteriseerd immuunsysteem21,22,23 , waarin tussenliggende aan sterke inflammatoire reactie in de dextran lanthaansulfaat natrium-geïnduceerde colitis model20 en wordt beschouwd als een prototypische Th1 stam23. Het gebruik van andere stammen van de muis kan worden beschouwd wanneer de meer ernstige ziekte activiteiten of een Th2-omgeving vereist is.

Kortom vormt ons protocol een waardevol instrument voor de beoordeling van de rol van de verschillende soorten van immuun cellen, cytokines, chemokines en andere seingeving moleculen in de pathogenese van DC. Een groot aantal genetisch gemodificeerde muizen modellen zijn beschikbaar met de achtergrond van de C57BL/6 en kan worden gecombineerd met ons model (b.v., muizen tekort voor IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine receptoren CXCR5 en CCR7, en sphingosine-1-fosfaat receptor 4). De beschikbaarheid van congenisch stammen van de muis op de achtergrond C57BL/6 vergemakkelijken grotendeels overdracht experimenten om de rol van verschillende celtypes betrokken in de etiologie van DC. Ten slotte biedt het model de mogelijkheid om te beoordelen van de invloed van lokale interventies (b.v.wijziging van de lokale microbiome en lokale anti-inflammatoire therapie) op mucosale immuniteit in waarin dit probleem optreedt en niet-getroffen darm segmenten en systemische immuun homeostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Acknowledgments

Geen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics