Murina distala kolostomi, en ny modell av avledning kolit i C57BL/6 möss

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Murina distala kolostomi ger en murin modell för mänskliga avledning kolit, en huvudsakligen lymfatisk kolit i kolon segmentet uteslutna från fekal strömmen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Avledning kolit (DC) är ett frekvent kliniska tillstånd som förekommer hos patienter med tarm segment uteslutna från fekal strömmen till följd av en avleda enterostomy. Etiologin till denna sjukdom är fortfarande oklara men verkar skiljer sig från klassiska inflammatoriska tarmsjukdomar som Crohns sjukdom och ulcerös kolit. Forskning som syftar till att dechiffrera de patofysiologiska mekanismer som leder till utvecklingen av denna sjukdom har hämmats allvarligt av bristen på en lämplig murina modell. Detta protokoll genererar en murin modell DC som underlättar studier av immunsystemets roll och dess interaktion med mikrobiomet i utvecklingen av DC. I denna modell använder C57BL/6 djur, är distala delar av kolon undantagna från fekal strömmen genom att skapa en distala kolostomi, utlöser utvecklingen av mild till måttlig inflammation i segmenten uteslutna tarm och reproducera hallmark lesioner av mänskliga DC med en måttlig systemisk inflammatorisk reaktion. I motsats till råtta modell finns ett stort antal genetiskt modifierade murina modeller i C57BL/6 bakgrunden. Kombinationen av dessa djur med vår modell tillåter potentiella roller enskilda cytokiner, chemokiner eller receptorer av bioaktiva molekyler (t.ex., interleukin (IL) -17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine receptorer CXCR5 och CCR7 och sfingosin-1-fosfat receptorn 4) bedömas i patogenesen av DC. Tillgången på congenic mus stammar i C57BL/6 bakgrunden underlättar i hög grad överföring experiment för att fastställa rollerna för olika celltyper som är inblandade i etiologin av DC. Slutligen, modellen erbjuder möjlighet att bedöma påverkan av lokala ingripanden (t.ex., ändring av den lokala mikrobiomet eller lokal antiinflammatorisk terapi) på slemhinnor immunitet i drabbade och icke-drabbade tarm segment och på systemiska immun homeostas.

Introduction

Under de senaste åren ett stort antal icke-infektiös kolit enheter skiljer sig från klassiska inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs; dvs., Crohns sjukdom eller kolit ulcerosa) har karaktäriserats av kliniskt och histopatologiskt hos människor. De patofysiologiska mekanismer som leder till utvecklingen av dessa kolit former är inte helt förstås delvis, eftersom lämpliga djurmodeller är knappa. Avledning kolit är en av entiteterna nyligen beskriven. Även om Termen myntades år 1980 av Glotzer1, gavs den första beskrivningen av en liknande fenotyp 1972 av Morson2. Sjukdomen utvecklas i 50% till 91% av patienter med avleda enterostomy och dess kliniska intensitet varierar3,4. Denna sjukdom enhet med tanke på den årliga incidensen av runt 120.000 kolostomi patienter i Amerikas förenta stater, och utgör ett viktigt hälsoproblem.

Det övergripande målet att utveckla detta protokoll var att ge en murin DC-modell som bygger på en kolit utlösa liknande som ses hos människa DC och som återger de primära histopatologiska funktionerna den mänskliga sjukdomar. I motsats till andra murina kolit modeller, kolit induktion i vår modell kräver inte genetiskt modifierade djur (t.ex., IL-7 transgena möss, N-cadherin dominerande negativa möss eller TGFβ- / - möss), tillämpningen av kemiskt irriterande ämnen (t.ex., dextran sulfat natrium (DSS) - inducerad kolit eller trinitrobenzene sulfonsyra (TNBS) - inducerad kolit) eller överföring av särskilda cellpopulationer i immun bristfällig möss (som i CD45RBhög överföring modell av kolit) (för en genomgång, se5). Till skillnad från andra modeller tillåter intakt immunsystem med vår DC-modell bedömning av den immunologiska mekanismen inblandad i DC utveckling. Begränsning av slemhinneinflammation till segmentet uteslutna tarm tillåter bedömning av dess återverkan på slemhinnor immunitet i andra delar av mag-tarmkanalen, på immun homeostas i andra immun delar i tarmkanalen (t.ex. , Peyers patchar och mesenteriale lymfkörtlar), och på immun homeostas av hela organismen. Slutligen, vår modell utgör ett lämpligt verktyg för att undersöka de mekanismer som styr lokala inflammatoriska stimuli som härrör från förändringar i den normala lokala miljön för både den lokala mikrobiomet samt mag-tarmkanalen antigener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den veterinära myndigheten (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, (LALLF M-V)).

1. preoperativa omsorg och förberedelse av djuret

  1. Vid ankomsten i djuranläggningen, dela in djur (C57Bl/6) i grupper av liknande storlek, Bur varje grupp tillsammans och hålla grupper konstant under experimenten.
    Obs: Använd djur av samma kön. Resultaten beskrivs erhölls med manliga möss.
    Obs: Om male djur används, Bur grupper tillsammans börjar när de är 7 veckors ålder så att en hierarki kan fastställas, vilket minimerar risken att aggressivt beteende under experiment.
  2. Minst en vecka före operation, växla till en hög energi (> 14 MJ/kg) och hög proteinhalt (> 20%) foder som innehåller alla viktiga spårämnen och vitaminer (för detaljer, se lista över material).
    Obs: Försäkra alla möss väga minst 25 g när kirurgi utförs.
  3. Inducera anestesi och analgesi av intraperitoneal injektion av ketamin (87 mg/kg i.p.) och Xylazinhydroklorid (13 mg/kg i.p.). Vänta tills musen tål mekanisk stimulering, e.g. tå planen, utan motor svar.
  4. Säkra narcotized musen med band i ryggläge på en värme underlag placerad vid drift skrivbordet, att garantera stabil positionering under drift och undvika en överväldigande förlusten av kroppsvärme.
    Obs: Det värme underlaget bör ha en yttemperatur på 36 ° C till 40 ° C; operationssalen temperaturen bör vara 21 ° C.

2. distala kolostomi drift

  1. Raka buk håret. Innan du börjar kirurgi, desinficera fältet operation tre gånger med alkohol 70% och en iodophor. Drapera fältet operation att garantera för aseptiska förhållanden.
  2. Utföra en 15 mm median laparotomi genom öppning av magmusklerna och bukhinnan längs linea alba, sålunda minimizing blodförlust.
  3. Använd två DeBakey atraumatiska tång, dra försiktigt blindtarmen, terminal ileum, och stigande och tvärgående tjocktarmen från i bukhålan.
    Obs: Var noga med att strikt begränsa mekanisk manipulation av tarmen att förhindra skada för mesenterica strukturer.
  4. Identifiera cecal pole, stigande tjocktarmen och tunntarmen (figurerna 1a och 1b).
    Obs: Korrekt identifiering av stigande kolon är grundläggande för korrekt placering av kolostomi. I fall där anatomin i regionen ileocecal är tvetydig, förekomsten av Peyers identifierar tunntarmen och förekomsten av bildade avföring kännetecknar kolon.
  5. Använd en linjal för att bestämma positionen för den framtida kolostomi. Det bör placeras 20 mm distalt till ileocecal ventil för en distala kolostomi.
  6. Gör en andra 3-mm snitt i bukväggen i övre högra kvadranten. Dra segmentet tidigare identifierade kolon genom detta snitt att bilda en ögla, vara noga med att inte snedvrida slingan.
  7. Försiktigt passera en 22 gauge flexibla i.v. kanyl genom mesocolon. Se till att inte skada mesenterica vaskulära strukturer.
  8. Tillbaka tarmen till i bukhålan.
  9. Fixa båda ändarna av flexibla röret till huden med hjälp av enkla stygn och en resorberbar sutur(t expolyglactin 910 eller polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Innan du stänger laparotomi, utföra fluid resuscitation använder en intraperitoneal injektion av 0,5 mL 0,9% saltlösning.
  11. Nära bukhinnan och muskellagrar med en kontinuerlig sutur med en resorberbar sutur (t ex polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1/2 c). Nära huden med en kontinuerlig sutur med en resorberbar sutur (t ex polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Öppna exteriorized kolon slingan genom att utföra en delsumma transection med en bra sax. Undvik alla skada krös. Inte transekt kolon helt.
  13. Fixa varje kolostomi öppning med hjälp av tre enda fullhudsskador stygn till bukhinnan och hud med en monofil resorberbar sutur (t exPolydioxanon eller monofil 6-0 3/8s). Afferenta slingan, som är en funktionell slutet-stomi, och efferent loop, som är en slemhinnor fistel, separeras tydligt på denna punkt (figur 1 c).
    Obs: Operationstiden bör vara mindre än 20 minuter att begränsa vätska och termiska förluster.
  14. Efter avslutad kirurgi, desinficera instrument med en aldehyd-fri desinfektion lösning i ett ultraljudsbad enligt anvisningarna från tillverkaren.

3. sham drift (Colotomy)

  1. Utför steg 1,1. genom 2.4.
  2. Använd en linjal för att bestämma framtida colotomy position. Colotomy bör placeras på samma avstånd från den ileocecal ventilen som kolostomi i experimentgruppen.
  3. Öppna tjocktarmen åtminstone två tredjedelar dess omkrets med fina sax.
  4. Stäng colotomy med ett enda lager, fullhudsskador avbryts sutur med en monofil resorberbar sutur (t ex Polydioxanon, monofil 6-0 3/8s).
    Obs: Operationstiden bör vara mindre än 20 minuter för en experimenterade kirurg, begränsa vätska och termiska förluster.
  5. Utför steg 2.10. , 2.11. och 2.14.

4. postoperativ vård

  1. Tillbaka djur till sina burar. Ge en väl härdat atmosfär av 37 ° C (t.ex., med en infraröd lampa) tills mössen är helt vaken. Sedan, hålla möss i en temperatur och luftfuktighet-reglerad miljö (21 ° C, 30% ± 10% relativ fuktighet). Ge fri tillgång till mat och dricksvatten. För att underlätta vätska upptag, ge extra vatten-indränkt djurfoder.
  2. Starta postoperativ analgesi genom att injicera 0,1 mg/kg kropp vikt buprenorfin s.c. När djur visar svar på mekanisk stimulering. Var noga med att undvika andningsdepression.
  3. Komplettera dricksvatten med 1 mg/mL tramadol för fortsatt smärtlindring under första postoperativa veckan.
  4. För att kompensera för minskad vätskeintag på grund av nedsatt rörlighet, leverera en Solid dricka Pad i bur under första postoperativa veckan.
  5. Väga djuren och Poäng djurs beteende dagligen under den första veckan, varannan dag under resten av den första månaden, och varje tredje dag under den andra månaden som använder sjukdom svårighetsgrad Poäng beskrivs i Kleinwort o.a. 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kirurgi tolereras väl både i experimentella (kolostomi) och sham (colotomy) grupper. Perioperativ mortalitet bör inte överskrida 10% vid kirurgi och perioperativ hantering utförs korrekt. I den första postoperativa veckan ses betydande viktminskning i båda grupperna experimentella och simulerade. Djur i gruppen sham uppnå deras vikt nadir vanligtvis mot den fjärde postoperativa dagen, men det förekommer en dag senare i den experimentella gruppen. Viktminskning är mer uttalad i gruppen experimentell når 21,7% av ursprungliga kroppsvikt. Däremot förlorar sham djur 10,8% av deras ursprungliga kropp vikt (figur 2)6. Efter vikt nadir i den första postoperativa veckan ökar kroppsvikt kontinuerligt i både experimentella grupper, men med en långsammare lutning i experimentgruppen. Tecken och symtom på allvarlig tarminflammation (dvs, blodiga flytningar eller flytande avföring förekomma vare sig i den experimentella eller sham grupp6). Totala dödligheten under de första 60 dagarna är postoperativt omkring 40 procent i gruppen kolostomi och ca 10% i gruppen colotomy. De flesta dödsfallen inträffar under första postoperativa veckan (61% i experimentgruppen, 66% i gruppen sham). Dödsorsaker visas i figur 3.

Distala kolostomi hos möss resulterar i utvecklingen av huvudsakligen lymfatisk kolit reproducera hallmark histologisk funktioner i mänskliga DC. Dessa förändringar ökar med intestinal uteslutningen. Crypt längd förkortas betydligt i uteslutna tarm segment. Denna förkortning når statistisk signifikans efter 14 dagar av fekal avledning (figur 3a). Goblet cell-bärande crypt längden reduceras efter 30 dagar i uteslutna tarm segment (figur 3b). Absoluta goblet cell nummer är också signifikant i kryptor i segmentet uteslutna tarm efter 14 postoperativ dagar (figur 3 c). Hallmark lesionen DC, utvecklingen av lymfoida folliklar i slemhinnan, kräver en längre varaktighet av pall avvikelse. Även om ett ökat antal lymfoida folliklar kan observeras så tidigt som två veckor, blir skillnaderna betydande efter två månader (siffror 5a-c). Alla histopatologiska förändringar beskrivs innan är mer uttalad i distala än i proximala regioner i segmenten uteslutna tarm. En typisk neutrofil infiltrat som tecken på akut inflammation vanligtvis inte observeras (siffrorna 5 d-e).

Som ett tecken på en systemisk återverkning av lokala tarminflammation, är neutrofila betydligt ökade kolostomi djur så tidigt som 14 dagar efter operation. Denna skillnad bibehålls fram till slutet av observationsperioden (60 dagar). Trombocyter är ökade något i djur med kolon avledning efter 60 dagar (figur 6). Hemoglobin och hematokrit är minskas 14 dagar efter operation i gruppen kolostomi jämfört med sham gruppen.

Det har visat att vitaminbrist i gnagare orsakar minskad genomsnittlig korpuskulära volym (MCH) och menar korpuskulära (MCV) värden7. I vår modell ser vi första ökar i båda dessa parametrar efter 14 till 30 dagar. Både MCV och MCH återgå till normala värden efter längre uppföljning (figur 7). Detta visar att distala kolostomi inte resulterar i kliniskt signifikanta vitaminbrist under långsiktig uppföljning.

Figure 1
Figur 1: anatomi av regionen cecal och det kirurgiska ingreppet. (a) grafisk representation av postoperativ anatomi. (b) topografi cecal pol och anatomiska landmärken. (c) grafisk representation av kolostomi öppningarna. Figur 1a har ändrats från Kleinwort et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: kropp viktutveckling. Kroppsvikt visas i procent av den preoperativa kroppsvikten. Kroppen vikt kurvor av kolostomi och sham (colotomy) djur visar att den initiala postoperativa viktminskningen var signifikant högre i gruppen kolostomi jämfört med sham gruppen (p < 0,001). Värden är medel ± standardfel av medelvärdet över 21-26 djur per grupp (21 djur fick colostomies; 26 djur var i gruppen sham). Denna siffra har ändrats från Kleinwort et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Diagram 3: dödsorsaker. Komplikationer är representerade som procentandelar av totalmortalitet och illustreras i ett cirkeldiagram (a kolostomi gruppen, (b) sham gruppen). Postoperativa komplikationer bestämdes genom obduktion. Wasting syndrome definierades som kontinuerlig vikt förlust större än 33% av den ursprungliga kroppsvikten och inga andra fynd vid obduktion. Tarmvred och anastomotic läckage diagnostiserades vid obduktion. Stomi komplikationer definierades som peristomal abscesser och mukokutan separationer. Andra komplikationer består av laparotomi, ischemi av blindtarmen, sårruptur på såret och fall klart inte vid obduktion. Betydande skillnader i fördelningen av postoperativa komplikationer sågs mellan grupperna (p = 0,021, analyseras med Fisher exakta testet för dubbelsidig analys av upp till 6 × 6 korstabeller). Det fanns 39 djur i gruppen kolostomi och 29 i gruppen sham. Denna siffra har ändrats från Kleinwort et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Crypt längd och goblet cell befolkningen. Crypt längd och goblet cell nummer bestämdes med hjälp av paraffin avsnitt av ändtarmen efter Perjodsyra-Schiff färgning. (a) crypt längd minskade avsevärt i ändtarmen av djur med avledning kolit (DC). (b) längd i regionen goblet cell-lagret i kryptan var mätt och anges som förhållandet till full crypt längd. Trettio och sextio dagar postoperativt, minskade andelen crypt-längd-bärande bägarceller i gruppen DC. (c) Goblet cell nummer betydligt i DC djur jämfört med sham gruppen. Diagrammen i (a) till (c) visar medel och standardavvikelser över 5 till 9 djur per grupp (kolostomi 14 och 30 dagar, sham 14 dagar: n = 8; kolostomi 60 dagar: n = 5; sham 30 och 60 dagar: n = 9); ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Denna siffra har ändrats från Kleinwort et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: lymfoida folliklar och inflammatoriska infiltrat. (a) lymfoida folliklar vidarekopplas kolon och sham djur räknades på paraffin avsnitt av ändtarmen färgas med hematoxylin och eosin. Grafen visar medel och standardavvikelser över 5 till 9 djur per grupp (kolostomi 14 och 30 dagar, sham 14 dagar: n = 8; kolostomi 60 dagar: n = 5; control 30 och 60 dagar: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. (b) och (c) representativa exempel på delar av ändtarmen av kolostomi (b) och sham (c) djur 60 dagar färgas postoperativt med hematoxylin och eosin. En framstående lymfoida follikel (∗) var närvarande i slemhinnan i en kolostomi mus. Skala staplarna representerar 100 µm. (d) och (e) färgning med chloroacetate esteras reaktion på paraffin avsnitt genomfördes för att upptäcka neutrofila granulocyter. På tvärsnitt av vidarekopplas ändtarmen observerades en akut inflammatorisk neutrofil infiltrera i gruppen kolostomi (d) varken i sham djur (e) upp till 60 dagar postoperativt. Skala staplarna representerar 100 µm. Denna siffra har ändrats från Kleinwort et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: antal neutrofiler och trombocyter. Blodvärden av venöst blodproverna bestämdes genom en veterinärmedicinska hematologi analyzer. (a) antal neutrofila granulocyter ökades betydligt i gruppen kolostomi jämfört med sham djur upp till 60 dagar postoperativt. (b) trombocytantalet var något förhöjda i gruppen kolostomi 60 dagar postoperativt. Grafen visar medel och standardavvikelser över 5 till 9 djur per grupp (kolostomi 14 och 30 dagar, sham 14 dagar: n = 8; kolostomi 60 dagar: n = 5; sham 30 och 60 dagar: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: röda blodkroppar. Blodvärden av venöst blodproverna bestämdes genom en veterinärmedicinska hematologi analyzer. (a) hemoglobin och hematokrit (b) minskade signifikant i gruppen kolostomi jämfört med sham-gruppen. (c) Genomsnittlig korpuskulära volym (MCH) var signifikant förhöjda 14 och 30 dagar postoperativt i gruppen kolostomi jämfört med sham gruppen men återgick till det normala efter 60 dagar. (d) menar korpuskulära (MCV) värden var förhöjda efter 30 dagar men inte längre efter 60 dagar postoperativt i gruppen kolostomi jämfört med sham djur. Grafen visar medel och standardavvikelser över 5 till 9 djur per grupp (kolostomi 14 och 30 dagar, sham 14 dagar: n = 8; kolostomi 60 dagar: n = 5; sham 30 och 60 dagar: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Murina modellen av DC som presenteras i detta protokoll tillförlitligt återger histopatologiska funktioner i mänskliga DC (t.ex., det de novo utveckling av lymfoida folliklar i submucosa av inflammerad tarm segment, crypt förkorta och minskningar i Goblet cell nummer). Bortsett från denna fördel, denna modell framkallas av en mycket liknande utlösande faktor och presenterar med en klinisk kurs av måttlig till lindrig svårighetsgrad som är fallet i mest drabbade människor.

För att få reproducerbara resultat och godtagbar perioperativ mortalitet, krävs lite övning i mikrokirurgiska tekniker. Men både kolostomi och sham drift (colotomy) kan utföras med mycket låg perioperativa mortaliteten (< 10%). Vissa operativa stegen är av stor betydelse: 1) identifiera kolon och terminal ileum. I fall där anatomin i regionen ileocecal inte klart, kan tjocktarmen identifieras genom närvaron av bildade avföring och terminal ileum av närvaron av Peyers plack. (2) när exteriorizing kolostomi slingan, försäkra krös inte är förvridet, därmed undvika mesenterica ischemi och mekanisk ileus. (3) när punktera krös med flexibel slang, försäkra en fartyget-fri sektor väljs, vilket förhindrar blödningar och mesenterica ischemi. (4) när du skapar små snitt i bukväggen, kontrollera tillräckligt hemostas. Om nödvändigt, använda thermo-koagulering för att stoppa blödning från muskel fartyg. (5) försäkra den kolon slinga är öppen minst två tredjedelar av dess omkrets och att den bakre väggen är tillräckligt exteriorized, vilket garanterar fullständig blockering av pall passage till de distala tarm segmenten. (6) försäkra att båda kolostomi slutar väl är fast på huden att undvika en öppen passage till i bukhålan vilket resulterar i högre smittorisk eller en mekanisk ileus eftersom fekal strömmen inte kan avsluta. Alla kirurgiska ingrepp kan normalt utföras utan förstoringsglas eller kirurgiska Mikroskop. I allmänhet kräver utnyttjande av dessa enheter vidareutbildning.

Även när komplexiteten av de kirurgiska ingrepp är endast måttligt, finns det många viktiga operativa och perioperativ frågor anses framgångsrikt avsluta experimentet med reproducerbara resultat.

Det är avgörande för långsiktig överlevnad med en permanent stomi att möss har en intakt blindtarmen. En experimentell grupp med proximala colostomies angränsande till ileocecal ventil dök en dödlighet på 100% i den första postoperativa veckan på grund av bestående viktminskning (inga data anges). Därför är det av yttersta vikt att välja webbplatsen kolostomi minst 20 mm distalt från den Bauhin ventil. Denna observation kan bero på fysiologi gnagare matsmältningen. Retrograd transport från proximala kolon till blindtarmen förekommer i dessa arter. Blindtarmen är där syntesen av näringsämnen genom den bakteriella mikroflora occurs8. Normalt MCV och MCH värden under långtidsuppföljning indikerar att djur med distala colostomies inte lider betydande vitaminbrist. Dessutom är coprophagy en viktig del av näringsmässiga beteendet hos gnagare i deras naturliga miljöer. Vid fastställandet av modellen, var vi mycket oroad att störande i coprophagy till följd av förekomsten av en permanent kolostomi kan leda till näringsbrist, (t.ex., B-vitamin). Men det är ett problem under förhållanden där tillgången till näringsämnen är begränsad, har det tidigare visats att coprophagy förlorar dess näringsmässiga betydelse under experimentella förhållanden med gratis överskott till vatten och näringsmässigt balanserad mat9 . Under våra experimentella förhållanden är det viktigt att optimera villkoren för postoperative näringsintag. Vi använt djurfoder som hade en hög proteinhalt, optimerad proteinkvalitet och ökade energitäthet. Djur var acklimatiserad till denna diet i minst två veckor före operation. Postoperativt, erbjöds vatten-indränkt foder ad libidum att underlätta mat och vätskeintag.

Det är viktigt att utnyttja möss av samma kön i både experimentell och simulerade grupper. Kön har visat att väsentligt påverka kursen inte bara av systemisk inflammation, men också av intestinal inflammation i olika kemiskt inducerad kolit modeller10,11,12. I allmänhet kommer att handjur utveckla mer uttalad sjukdom med ökad inflammation, mer crypt skada, mindre regenerering, högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner och långsammare återvinningar från vikt förlust10. En ytterligare fördel med handjur är bättre åldersmatchade preoperativ kroppsvikter, leder till bättre ersättning för perioden första postoperativa vikt förlust. Honmöss kan dock användas i protokollet om särskilda frågor (t.ex., påverkan av kön hormoner på manifestationen av DC är tas upp. Använda hanmöss kräver mer ansträngning att upprätthålla stabila boendeförhållanden. Manliga möss är mer benägna att aggressiva interaktioner som leder till skador och dödsfall. Manliga möss lever i etablerade hierarkier med en dominant hane. När hierarkin i gruppen är etablerad, är fortsatte striderna mindre vanliga13,14. Av denna anledning vi bildade de experimentella grupperna vid ankomsten av möss i vår djuranläggningen minst två veckor före operationen och underhålls dessa grupper tills experiment slutade. I allmänhet hölls experimentella grupper av 5 till 7 djur i en bur. Underhåll av stabila sociala och boendeförhållanden var av yttersta vikt inte bara för att minimera aggressiva beteenden av försöksdjur. Bostäder villkor har visat sig påverka viktökning samt immunologiska parametrar15,16,17.

Känslighet för kemiskt inducerad och genetiskt modifierade kolit modeller varierar avsevärt mellan mus stammar18,19,20. Detta protokoll fastställdes i C57Bl/6 möss, en mus stam med en väldefinierad genetisk bakgrund och en välkarakteriserad immunsystemet21,22,23 som visar mellanliggande till starka inflammatoriska svar i dextran sulfat natrium-inducerad kolit modell20 och anses en prototypiska Th1 stam23. Användning av andra musen stammar kan anses när allvarligare sjukdom aktiviteter eller Th2-miljö krävs.

Sammanfattningsvis utgör vår protokollet ett värdefullt verktyg för bedömning av rollen av olika typer av immunceller, cytokiner, chemokiner och andra signalmolekyler i patogenesen av DC. Ett stort antal genetiskt modifierade möss-modeller finns tillgängliga med bakgrunden i C57BL/6 och kan kombineras med vår modell (t.ex., möss bristfällig för IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine-receptorer CXCR5 och CCR7 och sfingosin-1-fosfat receptorn 4). Tillgången på congenic mus stammar i C57BL/6 bakgrunden till stor del underlätta överföring experiment för att fastställa rollen av olika celltyper som är inblandade i etiologin av DC. Slutligen, modellen erbjuder möjlighet att bedöma påverkan av lokala ingripanden (t.ex., ändring av lokala mikrobiomet och lokal antiinflammatorisk terapi) på slemhinnor immunitet i drabbade och icke-drabbade tarm segment och systemisk immun homeostas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
  2. Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
  3. Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
  4. Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
  5. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  6. Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
  7. Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
  8. Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
  9. Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
  10. Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
  11. Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
  12. Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
  13. Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
  14. Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
  15. Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
  16. Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
  17. Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
  18. Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
  19. Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
  20. Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
  21. Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
  22. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
  23. Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics