Murine colostomie distale, un nouveau modèle de colite détournement chez les souris C57BL/6

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Summary

Colostomie distale murin fournit un modèle murin pour la colite détournement humaine, une colite lymphocytaire principalement dans le segment du côlon exclus du flux de matières fécal.

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Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

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Abstract

Colite de dérivation (DC) est une condition clinique fréquente survenant chez les patients avec des segments d’intestin exclus du flux fécal par suite d’une entérostomie détourner. L’étiologie de cette maladie reste mal définie mais semble différer de celle des maladies classiques inflammatoires de l’intestin comme la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Recherches visant à décrypter les mécanismes physiopathologiques menant au développement de cette maladie a été gravement entravée par l’absence d’un modèle murin approprié. Ce protocole génère un modèle murin de DC qui facilite l’étude du rôle du système immunitaire et son interaction avec le microbiome dans le développement de DC. Dans ce modèle à l’aide de C57BL/6 animaux, parties distales du côlon sont exclus du flux de matières fécal en créant une colostomie distale, en déclenchant le développement de légère à modérée de l’inflammation dans les segments de l’intestin exclus et en reproduisant les lésions de la marque distinctive de l’homme DC avec une réponse inflammatoire systémique modérée. Contrairement au modèle de rat, il existe un grand nombre de modèles murins génétiquement modifié sur le fond de C57BL/6. La combinaison de ces animaux avec notre modèle permet les rôles possibles de différentes cytokines, chimiokines ou récepteurs de molécules bioactives (p. ex., interleukine (IL) -17 ; Il-10, chemokine CXCL13, récepteurs de chimiokines CXCR5 et CCR7 et le récepteur de la sphingosine-1-phosphate 4) à évaluer dans la pathogenèse de la DC. La disponibilité de souches congéniques de souris C57BL/6 antécédents facilite grandement les expériences de transfert afin d’établir les rôles de types cellulaires distincts impliqués dans l’étiologie du DC. Enfin, le modèle offre la possibilité d’évaluer l’influence des interventions locales (p. ex., modification du microbiome local ou un traitement anti-inflammatoire local) sur l’immunité mucosale dans les segments concernés et non concernés de l’intestin et le sur homéostasie immunitaire systémique.

Introduction

Ces dernières années, un nombre important d’entités non infectieuses colite différents de maladies inflammatoires de l’intestin classique (DBI ; i.e., ulcéreuse ou colite de Crohn) ont été caractérisés sur le plan clinique et histopathologique chez l’homme. Les mécanismes physiopathologiques menant au développement de ces formes de colite ne sont pas complètement compris partiellement parce que les modèles animaux appropriés sont rares. Colite de détournement est une de ces entités récemment décrites. Bien que le terme a été inventé en 1980 par Glotzer1, la description initiale d’un phénotype similaire a été donnée en 1972 par Morson2. La maladie se développe dans 50 % à 91 % des patients atteints de détourner entérostomie et son intensité clinique varie de3,4. Compte tenu de l’incidence annuelle d’environ 120 000 patients de colostomie dans les États-Unis d’Amérique, cette entité maladie constitue un problème de santé important.

L’objectif général du développement de ce protocole devait fournir un modèle murin de DC qui repose sur un déclencheur de colite similaire à celui observé chez l’humain DC et qui reprend les principales caractéristiques histopathologiques de la maladie humaine. Contrairement aux autres modèles murins de la colite, induction de colite dans notre modèle ne nécessite pas d’animaux génétiquement modifiés (par exemple, les souris transgéniques IL-7, N-cadhérine dominant négatifs souris ou souris- / - de TGFβ), l’application de chimiquement irritant des substances (p. ex., dextran sulfate sodium (DSS) - colite induite ou trinitrobenzène sulfonique (TNBS) - induced colitis), ou le transfert de populations de cellules spécifiques chez les souris déficientes immunitaires (comme dans le transfert dehaute CD45RB modèle de colite) (pour un compte-rendu, voir5). Contrairement aux autres modèles, le système immunitaire intact de notre modèle DC permet d’évaluer le mécanisme immunologique impliqués dans le développement de DC. La limitation de l’inflammation des muqueuses au segment exclus de l’intestin permet d’évaluer sa répercussion sur l’immunité mucosale dans d’autres parties du tractus gastro-intestinal, sur l’homéostasie immunitaire dans les autres compartiments immunitaires du tractus intestinal (par exemple , Mesenteriale ganglions lymphatiques et des patchs de Peyer) et sur l’homéostasie immunitaire de l’organisme tout entier. Enfin, notre modèle constitue un outil approprié pour étudier les mécanismes qui contrôlent les stimuli inflammatoires locales provenant de changements dans l’environnement local normal pour le microbiome local tant que les antigènes alimentaires.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’autorité vétérinaire (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, LALLF M-V).

1. préopératoire soins et préparation de l’Animal

  1. À son arrivée à l’animalerie, divise les animaux (C57Bl/6) en groupes de taille similaire, chaque groupe en cage ensemble et maintenir les groupes constante au cours des expériences.
    Remarque : Utilisez des animaux du même sexe. Les résultats présentés ont été obtenus avec des souris mâles.
    Remarque : Si les animaux mâles sont utilisés, les groupes de cage à partir ensemble lorsqu’ils sont âgés de 7 semaines afin qu’une hiérarchie peut être établie, ce qui minimise le risque d’un comportement agressif au cours d’expériences.
  2. Au moins une semaine avant la chirurgie, passer à une énergie élevée (> 14 MJ/kg) et riche en protéines (> 20 %) contenant tous les oligo-éléments et les vitamines d’alimentation (pour plus de détails, voir la liste des matériaux).
    NOTE : S’assurer toutes les souris peser au moins 25 g lorsque la chirurgie est pratiquée.
  3. Induire l’anesthésie et analgésie par injection intrapéritonéale de kétamine (i.p. 87 mg/kg) et de xylazine (i.p. de 13 mg/kg). Attendez que la souris tolère une stimulation mécanique, p. ex. orteil pitch, sans réponse motrice.
  4. Fixez la souris narcotisée avec bandes en position couchée sur une sous-couche de chaleur placée à la réception de l’opération, garantissant le positionnement au cours de l’opération stable et en évitant une très grande perte de chaleur corporelle.
    Remarque : La sous-couche de chaleur doit avoir une température de 36 ° C à 40 ° C ; la température de la salle d’opération doit être de 21 ° C.

2. opération de colostomie distale

  1. Se raser les cheveux abdominaux. Avant de commencer la chirurgie, désinfecter le champ de l’opération trois fois avec de l’alcool 70 % et un iodophore. Drapez le champ d’opération afin de garantir des conditions d’asepsie.
  2. Effectuer une laparotomie médiane de 15 mm par incision des muscles abdominaux et le péritoine le long de la linea alba, minimisant ainsi les pertes sanguines.
  3. Utiliser deux pinces atraumatiques de DeBakey, retirez avec précaution le caecum, l’iléon terminal et ascendant et côlon transverse de la cavité péritonéale.
    Remarque : Veillez à limiter strictement la manipulation mécanique de l’intestin pour prévenir les blessures aux structures mésentériques.
  4. Identifier le pôle caecum, le côlon ascendant et l’intestin grêle (Figures 1 a et 1 b).
    Remarque : Une identification correcte du côlon ascendant est fondamentale pour la mise en place correcte de la colostomie. Dans les cas où l’anatomie de la région iléo-caecale est ambiguë, la présence de plaques de Peyer identifie l’intestin grêle, et la présence de selles formées caractérise le côlon.
  5. Utilisez une règle pour déterminer la position de la colostomie future. Il doit être placé 20 mm distal de la valve iléo-caecale pour une colostomie distale.
  6. Pratiquez une seconde incision de 3 mm de la paroi abdominale dans le quadrant supérieur droit. Tirez sur le segment du côlon précédemment identifiés par cette incision pour former une boucle, en veillant à ne pas fausser la boucle.
  7. Soigneusement passer une canule de calibre 22 i.v. souple par le biais du mesocolon. Prendre soin de ne pas pour endommager les structures vasculaires mésentériques.
  8. Retourner l’intestin dans la cavité péritonéale.
  9. Fixer les deux extrémités du tube flexible pour la peau à l’aide de points simples et une suture résorbable (p. ex., polyglactine 910 ou polyfil 4-0 1/2C).
  10. Avant de fermer la laparotomie, effectuer la réanimation liquidienne, à l’aide d’une injection intrapéritonéale de solution saline à 0,9 % 0,5 mL.
  11. Fermer le péritoine et la couche musculaire avec une suture continue à l’aide d’une suture résorbable (p. ex., polyglactine 910 ou polyfil 4-0 1/2C). Fermer la peau avec une suture continue à l’aide d’une suture résorbable (polyglactine 910 ou polyfil 4-0 1/2C).
  12. Ouvrir la boucle du côlon extériorisés en effectuant une transection sous-total à l’aide de ciseaux fine. Éviter toute blessure du mésentère. Transect pas complètement le côlon.
  13. Difficulté à chaque ouverture de colostomie à l’aide de trois points de pleine épaisseur unique pour le péritoine et la peau en utilisant un monofil résorbable (p. ex., le polydioxanone ou monofil 6-0 3/8 s). La boucle afférente, qui est une fin-colostomie fonctionnelle, et la boucle efférente, qui est une fistule mucuse, sont clairement séparées à ce stade (Figure 1C).
    Remarque : Les temps de fonctionnement doit être moins de 20 minutes pour limiter les pertes de fluides et thermiques.
  14. Après finition chirurgie, désinfecter les instruments utilisant une solution de désinfection aldéhyde dans un bain à ultrasons conformément aux instructions du fabricant.

3. sham opération (Colotomy)

  1. Effectuez les étapes 1.1. par le biais de 2.4.
  2. Utilisez une règle pour déterminer la position de la future colotomy. Le colotomy doit être placé à la même distance de la valve iléo-caecale que la colostomie dans le groupe expérimental.
  3. Ouvrez les deux points au moins deux-tiers sa circonférence à l’aide des ciseaux.
  4. Fermer la colotomy avec une seule couche, pleine épaisseur interrompu suture utilisant une suture résorbable monofil (p. ex., le polydioxanone, monofil 6-0 3/8 s).
    Remarque : La durée de fonctionnement doit être moins de 20 minutes pour un chirurgien expérimenté, limitant les pertes de fluides et thermiques.
  5. Effectuez les étapes 2.10. , 2.11. et 2.14.

4. postopératoire soins

  1. Retour animaux de leurs cages. Offrent une atmosphère bien tempérée de 37 ° C (par exemple, avec une lampe à infrarouge) jusqu'à ce que les souris sont tout à fait réveillés. Puis, continuez à souris dans un environnement réglementé de température et d’humidité (21 ° C, humidité relative de 30 % ± 10 %). Permettre un accès libre à la nourriture et l’eau potable. Pour faciliter l’absorption de liquide, fournissent des aliments pour animaux imbibées d’eau supplémentaires.
  2. Commencer l’analgésie postopératoire par l’injection de corps de 0,1 mg/kg poids buprénorphine s.c. lorsque les animaux de la réponse à la stimulation mécanique. Soyez prudent afin d’éviter une dépression respiratoire.
  3. Supplément eau potable avec 1 mg/mL tramadol pour l’analgésie continue durant la première semaine post-opératoire.
  4. Pour compenser une diminution apport liquidien due à mobilité réduite, fournir une plateforme de boire solide dans la cage pendant la première semaine post-opératoire.
  5. Peser les animaux et le score de comportement animal tous les jours pendant la première semaine, tous les deux jours pendant le reste du premier mois et tous les trois jours au cours du deuxième mois en utilisant le score de gravité de la maladie décrit dans Kleinwort et al. 6.

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Representative Results

La chirurgie est bien tolérée tant expérimental (colostomie) et groupes d’imposture (colotomy). La mortalité péri-opératoire ne doit pas dépasser 10 % lorsque la chirurgie et périopératoires sont correctement gérées. Dans la première semaine post-opératoire, perte de poids significative est vu dans les deux groupes expérimentaux et sham. Animaux du groupe fictif atteindre leur nadir poids habituellement vers le quatrième jour postopératoire, mais il se produit un jour plus tard dans le groupe expérimental. Perte de poids est plus marquée dans le groupe expérimental, atteignant 21,7 % du poids corporel initial. En revanche, sham animaux perdent 10,8 % de leur corps initial poids (Figure 2)6. Après le nadir de poids dans la première semaine post-opératoire, poids corporel augmente en continu dans les deux groupes expérimentaux, mais avec une pente plus lente dans le groupe expérimental. Signes et symptômes de l’inflammation intestinale sévère (c.-à-d.rejet sanglante ou selles liquides se produire ni dans l’expérimental ni l’imposture groupe6). Mortalité totale pendant les 60 premiers jours après l’opération est d’environ 40 % dans le groupe de colostomie et environ 10 % dans le groupe colotomy. La plupart des décès surviennent pendant la première semaine post-opératoire (61 % dans le groupe expérimental, 66 % dans le groupe fictif). Causes de décès sont indiquées à la Figure 3.

Colostomie distale chez la souris se traduit par le développement de colite lymphocytaire principalement reproduisant les caractéristiques histologiques de poinçon de DC humaine. Ces modifications augmentent avec la durée d’exclusion intestinale. Longueur de la crypte est considérablement réduite dans les segments exclus de l’intestin. Ce raccourcissement atteint une signification statistique après 14 jours de détournement de matières fécal (Figure 3 a). La longueur de crypte portant des cellules caliciformes est réduite après 30 jours dans les segments exclus de l’intestin (Figure 3 b). Nombre absolu de cellules caliciformes est également significativement réduit dans les cryptes dans le segment de l’intestin exclus après 14 jours postopératoires (Figure 3C). La lésion caractéristique de la DC, le développement des follicules lymphoïdes de la muqueuse, nécessite une plus longue durée de la déviation de selles. Bien qu’un augmentation du nombre des follicules lymphoïdes peut être observé dès deux semaines, les différences deviennent significatifs après deux mois (Figures 5 a-c). Toutes les modifications histopathologiques décrites avant sont plus prononcées en distale que dans les régions proximales des segments exclus de l’intestin. Un infiltrat de neutrophile typique comme un signe d’inflammation aiguë n’est habituellement pas observé (Figures 5 d-e).

Comme un signe d’un retentissement systémique de l’inflammation intestinale locale, neutrophiles augmentent considérablement chez les animaux de la colostomie, dès 14 jours après la chirurgie. Cette différence est maintenue jusqu'à la fin de la période d’observation (60 jours). Numération plaquettaire est légèrement augmentée chez les animaux avec dérivation colique après 60 jours (Figure 6). Hématocrite et hémoglobine sont réduits à 14 jours après que l’opération dans le groupe de colostomie comparée à du groupe fictif.

Il a été démontré que la carence en vitamine dans les causes de rongeurs réduit le volume corpusculaire moyen (MCH) et signifie l’hémoglobine corpusculaire (MCV) valeurs7. Dans notre modèle, nous voyons des augmentations initiales de ces deux paramètres après 14 et 30 jours. Les MCV et MCH reviendront à des valeurs normales après un suivi plus long (Figure 7). Cela montre que colostomie distale n’entraîne pas de carence vitaminique cliniquement significative au cours du suivi à long terme.

Figure 1
Figure 1: anatomie de la région caecale et l’intervention chirurgicale. b graphique représentation d’anatomie postopératoire. (b) la topographie du caecum pol et repères anatomiques. représentation graphique (c) des ouvertures colostomie. Figure 1 a a été modifié par Kleinwort et al.,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: développement de poids de corps. Poids corporel est indiqué en pourcentage du poids du corps préopératoire. Le corps de colostomie, les courbes de poids ni truqués (colotomy) animaux révèlent que la perte de poids initial de postopératoire était significativement plus élevée dans le groupe de colostomie, par rapport à du groupe fictif (p < 0,001). Les valeurs sont moyens ± erreurs-types de la moyenne à travers 21-26 sujets par groupe (21 animaux ont reçu colostomies ; 26 animaux avait au groupe d’imposture). Ce chiffre a été modifié par Kleinwort et al.,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Causes de décès. Les complications sont représentées sous forme de pourcentages de mortalité toutes causes et sont illustrées dans un graphique en secteurs (colostomie b group, groupe fictif (b)). Les complications post-opératoires ont été déterminées par l’autopsie. Syndrome de dépérissement était défini comme la perte de poids continue supérieure à 33 % du poids corporel initial et aucune autre constatation à l’autopsie. Iléus paralytique et fuite anastomotique ont été diagnostiqués à l’autopsie. Les complications de stomie étaient définies comme possible abcès et séparations cutanéo-muqueuses. Autres complications comprenant de déhiscence de la plaie de la laparotomie, ischémie du caecum, et cas pas évident lors de l’autopsie. Des différences significatives dans la distribution des complications postopératoires ont été observés entre les groupes (p = 0,021, analysées à l’aide du test exact de Fisher pour la double analyse des tableaux de contingence jusqu'à 6 × 6). Il y avait 39 animaux dans le groupe de colostomie et 29 dans le groupe fictif. Ce chiffre a été modifié par Kleinwort et al.,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: population de longueur et des cellules caliciformes crypte. Numéros de longueur et cellules caliciformes crypte ont été déterminées à l’aide de sections de paraffine du rectum après coloration à l’acide périodique-Schiff. (un) longueur de la crypte a été significativement réduite dans le rectum des animaux souffrant de colite de dérivation (DC). (b) la longueur de la région de cellules caliciformes-roulement de la crypte a été mesurée et définie par rapport à la longueur de la crypte complet. Trente à soixante jours après l’opération, le pourcentage de cellules caliciformes crypte-longueur-roulement a diminué dans le groupe de DC. (c) cellules caliciformes numéros ont chuté chez les animaux DC comparé à du groupe fictif. Graphiques en (a) à (c) montrent des moyens et des écarts-types entre animaux de 5 à 9 par groupe (jours de colostomie 14 et 30, sham 14 jours : n = 8 ; colostomie 60 jours : n = 5 ; simulacre de 30 et 60 jours : n = 9) ; ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. Ce chiffre a été modifié par Kleinwort et al.,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: follicules lymphoïdes et des infiltrats inflammatoires. b lymphoïdes follicules de colones détournés et imposture animaux ont été dénombrés sur les sections de paraffine du rectum coloré à l’hématoxyline et éosine. Le graphique présente des moyens et des écarts-types entre animaux de 5 à 9 par groupe (jours de colostomie 14 et 30, sham 14 jours : n = 8 ; colostomie 60 jours : n = 5 ; contrôle de 30 à 60 jours : n = 9), ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. (b) et (c) représentant des exemples de sections du rectum de colostomie (b) et d’animaux de l’imposture (c) 60 jours après l’opération coloration à l’hématoxyline et éosine. Un éminent follicule lymphoïde (∗) était présent dans la muqueuse d’une souris de colostomie. Barres d’échelle représentent 100 µm. (d) et (e) coloration avec chloroacetate estérase réaction sur des sections de paraffine a été effectuée pour détecter les granulocytes neutrophiles. Sur les coupes du rectum détourné, un infiltrat neutrophile inflammatoire aiguë a été observée dans le groupe de colostomie (d), ni chez les animaux de l’imposture (e) vers le haut à 60 jours après l’opération. Barres d’échelle représentent 100 µm. Ce chiffre a été modifié par Kleinwort et al.,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: nombre de neutrophiles et de plaquettes. Numération globulaire d’échantillons de sang veineux ont été déterminées par un analyseur de hématologie vétérinaire. b les neutrophiles ont été significativement augmentés dans le groupe de colostomie par rapport au sham animaux + à 60 jours après l’opération. (b) numération plaquettaire était un peu élevées dans le groupe de colostomie 60 jours après l’opération. Le graphique présente des moyens et des écarts-types entre animaux de 5 à 9 par groupe (jours de colostomie 14 et 30, sham 14 jours : n = 8 ; colostomie 60 jours : n = 5 ; simulacre de 30 et 60 jours : n = 9), ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: paramètres érythrocytaires. Numération globulaire d’échantillons de sang veineux ont été déterminées par un analyseur de hématologie vétérinaire. b taux d’hémoglobine et l’hématocrite (b) ont été significativement réduites dans le groupe de colostomie, comparé au groupe fictif. (c) volume corpusculaire moyen moyen (MCH) était significativement élevé 14 et 30 jours après l’opération dans le groupe de colostomie comparé à du groupe fictif mais revenue à la normale après 60 jours. (d) signifie que les valeurs d’hémoglobine corpusculaire (MCV) étaient élevées après 30 jours, mais n’est plus après que 60 jours après l’opération dans le groupe de colostomie par rapport au simulacre d’animaux. Le graphique présente des moyens et des écarts-types entre animaux de 5 à 9 par groupe (jours de colostomie 14 et 30, sham 14 jours : n = 8 ; colostomie 60 jours : n = 5 ; simulacre de 30 et 60 jours : n = 9), ∗p < 0,05 ; ∗∗p < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le modèle murin de DC présentée dans le présent protocole fiable reproduit les caractéristiques histopathologiques des DC humaine (p. ex., développement de novo des follicules lymphoïdes dans la sous-muqueuse des segments de l’inflammation de l’intestin, crypte raccourcissement et réductions nombre de cellules caliciformes). En dehors de cet avantage, ce modèle est induit par un facteur de déclenchement très similaire et présente une évolution clinique modérée à gravité légère comme c’est le cas chez les humains les plus touchés.

Pour obtenir des résultats reproductibles et mortalité périopératoire acceptable, certaines pratiques aux techniques microchirurgicales est nécessaire. Cependant, colostomie et sham opération (colotomy) peut être effectuée avec mortalité périopératoire très faible (< 10 %). Quelques étapes opérationnelles sont d’une grande importance : 1) identifier avec certitude l’iléon terminal et le côlon. Dans les cas où l’anatomie de la région iléo-caecale pas clair, les deux points soient reconnaissables par la présence de selles formées et l’iléon terminal par la présence de plaques de Peyer. 2) lorsque l’extériorisation de la boucle de la colostomie, assurer que le mésentère n’est pas déformé, évitant ainsi une ischémie mésentérique et iléus mécanique. 3) quand la perforation du mésentère avec le tube flexible, assurer qu'un secteur exempt de navire est choisi, empêchant ainsi une ischémie mésentérique et de saignement. 4) lorsque vous créez la petite incision dans la paroi abdominale, vérifiez pour hémostase suffisante. Si nécessaire, utilisez thermo-coagulation pour arrêter le saignement des vaisseaux musculaires. 5) assurer la colique boucle est ouvert au moins aux deux tiers de sa circonférence et que la paroi postérieure est suffisamment extériorisée, garantissant ainsi un blocage complet du passage des selles pour les segments de l’intestin distal. 6) s’assurer que les deux extrémités de la colostomie sont bien fixées sur la peau pour éviter un passage ouvert dans la cavité péritonéale, entraînant des risques d’infection plus élevés ou un iléus mécanique parce que le flux de matières fécal ne peuvent pas quitter. Normalement, toutes les interventions chirurgicales peuvent être effectuées sans loupes ou microscopes chirurgicaux. En général, l’utilisation de ces dispositifs exige une formation complémentaire.

Même lorsque la complexité des procédures chirurgicales est seulement modérée, il y a beaucoup de questions essentielles operative et périopératoires à prendre en considération pour terminer avec succès l’expérience avec des résultats reproductibles.

Il est essentiel pour la survie à long terme avec une colostomie permanente que les souris ont un caecum intact. Un groupe expérimental avec colostomies proximales adjacentes à la valve iléo-caecale ont montré un taux de mortalité de 100 % dans la première semaine post-opératoire, en raison de la perte de poids irréversible (données non présentées). Par conséquent, il est primordial de choisir le site de colostomie distale au moins 20 mm de valve de la Bauhin. Cette observation peut être dû à la physiologie de la digestion de rongeur. Transport rétrograde du colon proximal au caecum se produit chez ces espèces. Le caecum est l’endroit où la synthèse des nutriments par l’occurs8 de la microflore bactérienne. Les valeurs de VGM normal et de la santé maternelle et infantile au cours du suivi à long terme indiquent que les animaux avec colostomies distales ne souffre pas de carences en vitamines importantes. En outre, la coprophagie est une partie essentielle du comportement nutritionnel des rongeurs dans leurs milieux naturels. Lors de l’établissement du modèle, nous étions très inquiets que perturbant la coprophagie en raison de la présence d’une colostomie permanente peut entraîner de carences nutritionnelles, (p. ex., vitamine B). Cependant, alors que c’est un problème dans des conditions où accès aux nutriments l'est limité, il a déjà démontré que cette coprophagie perd son importance nutritionnelle dans des conditions expérimentales avec libre excès d’eau et les aliments équilibrés9 . Dans nos conditions expérimentales, il est essentiel d’optimiser les conditions d’apport nutritionnel postopératoire. Nous avons utilisé des aliments pour animaux qui ont une teneur élevée en protéines, optimisé la qualité des protéines et augmente la densité d’énergie. Animaux ont été acclimatés à ce régime au moins deux semaines avant la chirurgie. Après l’opération, imbibées d’eau des aliments pour animaux a été offert ad libitum à faciliter un aliment et apport en liquide.

Il est essentiel d’utiliser des souris de même sexe dans les deux groupes expérimentaux et sham. Sexe a démontré un impact significatif sur le cours, non seulement de l’inflammation systémique, mais aussi de l’inflammation intestinale dans la colite induite chimiquement différents modèles10,11,12. En général, animaux mâles développeront une maladie plus prononcée avec une plus grande inflammation, plus de dégâts crypte, moins régénération, des niveaux plus élevés de cytokines pro-inflammatoires et des récupérations plus lentes de perte de poids10. Un autre avantage de l’utilisation des animaux mâles est mieux appariés selon l’âge préopératoire poids, conduisant à une meilleure rémunération de la période de perte de poids postopératoire initiale. Néanmoins, les souris femelles peuvent être utilisés dans le protocole si spécifiques questions (par exemple, l’influence du sexe hormones sur la manifestation de DC sont à relever. À l’aide de souris mâles nécessite plus d’efforts dans le maintien de conditions de logement stable. Les souris mâles sont plus sujettes à des interactions agressives, conduisant à des blessures et la mort. Les souris mâles vivent dans des hiérarchies établies avec un mâle dominant. Une fois établie la hiérarchie dans le groupe, poursuite des combats sont moins courante13,14. Pour cette raison, nous avons formé les groupes expérimentaux à l’arrivée des souris dans notre animalerie au moins deux semaines avant la chirurgie et maintenus ces groupes jusqu'à fin aux expériences. En général, des groupes expérimentaux de 5 à 7 animaux étaient gardés dans une cage. Maintien de la stabilité sociale et de conditions de logement était d’une importance capitale non seulement pour réduire les comportements agressifs des animaux d’expérimentation. Conditions de logement ont démontré d’influencer la prise de poids, mais aussi les paramètres immunologiques15,16,17.

Susceptibilité aux modèles de colite induite chimiquement et génétiquement modifiés varie considérablement entre les souches de souris18,19,20. Le présent protocole a été établi chez les souris C57Bl/6, une souche de souris avec un bagage génétique bien définie et un bien caractérisé système immunitaire21,22,23 qui montre intermédiaires à fort inflammatoire réponse dans le dextran sulfate colite induite par le sodium modèle20 et est considéré comme un prototype de souche Th123. L’utilisation d’autres souches de souris peut être considérée lorsque les activités plus sévères de la maladie ou à un environnement de Th2 est requis.

En résumé, notre protocole constitue un outil précieux pour évaluer le rôle des différents types de cellules immunitaires, cytokines, chimiokines et autres molécules de signalisation dans la pathogenèse de DC. Un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées sont disponible avec le fond de C57BL/6 et peut être combiné avec notre modèle (p. ex., souris déficientes pour IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine récepteurs CXCR5 et CCR7 et sphingosine-1-phosphate récepteur 4). La disponibilité de souches congéniques de souris sur le fond de C57BL/6 largement faciliter les expériences de transfert pour déterminer le rôle de types cellulaires distincts impliqués dans l’étiologie du DC. Enfin, le modèle offre la possibilité d’évaluer l’influence des interventions locales (p. ex., modification du microbiome local et un traitement anti-inflammatoire local) sur l’immunité mucosale dans les segments concernés et non concernés de l’intestin et systémique homéostasie du système immunitaire.

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Disclosures

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Acknowledgments

Aucun

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6 GraphPad Software, Inc.

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References

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