Murine distalen Kolostomie, ein neuartiges Modell Ablenkung Colitis bei C57BL/6 Mäusen

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Summary

Murine distalen Kolostomie bietet ein Mausmodell für menschliche Abzweigung Kolitis, eine vorwiegend lymphozytären Kolitis im Dickdarm-Segment aus dem fäkal Strom ausgeschlossen.

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Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Patrzyk, M., Heidecke, C. D., Schulze, T. Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (137), e57616, doi:10.3791/57616 (2018).

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Abstract

Ablenkung Colitis (DC) ist eine häufige klinische Zustand auftreten bei Patienten mit Darm-Segmente aus dem fäkal Strom durch eine kurzweilige Enterostomy ausgeschlossen. Die Ätiologie dieser Erkrankung unterscheidet sich von der klassischen entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa scheint aber bleibt unklar. Forschungsarbeiten zu entschlüsseln, die pathophysiologischen Mechanismen, die zur Entwicklung dieser Krankheit wurde stark durch das Fehlen einer entsprechenden Mausmodell behindert. Dieses Protokoll generiert ein Mausmodell der DC, der die Untersuchung der Rolle des Immunsystems und seine Wechselwirkung mit der Microbiome bei der Entwicklung von DC erleichtert. In diesem Modell mit C57BL/6 Tiere sind distalen Teile des Dickdarms aus dem fäkal Strom ausgeschlossen, durch die Schaffung einer distalen Kolostomie, die Entwicklung von leichten bis mittelschweren Entzündung in den Segmenten ausgeschlossenen Darm auslösen und Markenzeichen Läsionen der menschlichen Reproduktion DC mit einem moderaten systemische entzündliche Reaktion. Im Gegensatz zu der Rattenmodell gibt es eine große Anzahl von genetisch veränderten murinen Modelle auf dem C57BL/6-Hintergrund. Die Kombination dieser Tiere mit unserem Modell ermöglicht die möglichen Rollen der einzelnen Zytokine, Chemokine oder Rezeptoren von bioaktiven Moleküle (z. B.Interleukin (IL)-17; Il-10, Chemokin CXCL13, Chemokin-Rezeptoren CXCR5 und CCR7 und Sphingosine-1-Phosphat-Rezeptor 4) in der Pathogenese der DC beurteilt werden. Die Verfügbarkeit von Congenic Mausstämme auf dem C57BL/6 Hintergrund erleichtert weitgehend Transfer Experimente durchführen, um die Rollen der unterschiedlichen Zelltypen beteiligt in der Ätiologie von DC zu etablieren. Schließlich bietet das Modell die Möglichkeit, die Einflüsse der lokalen Interventionen (z.B. Änderung der lokalen Microbiome oder lokale antientzündliche Therapie) zu bewerten auf Schleimhaut Immunität im Darm von betroffenen und nicht betroffenen Segmente und die auf systemische immun Homöostase.

Introduction

In den letzten Jahren eine beträchtliche Anzahl von nicht-infektiösen Kolitis Entitäten anders als klassische entzündliche Darmerkrankungen (Fahrradhändler; dh., Crohn Krankheit oder Colitis Ulcerosa) sind klinisch und histopathologisch beim Menschen charakterisiert. Die pathophysiologischen Mechanismen, die zur Entwicklung dieser ulcerosa Formen sind teilweise nicht vollständig verstanden, weil geeignete Tiermodellen knapp sind. Ablenkung Colitis ist einer dieser kürzlich beschriebenen Entitäten. Obwohl der Begriff im Jahr 1980 von Schlachter1geprägt war, wurde die Erstbeschreibung einer ähnlichen Phänotyp Morson21972 zugesprochen. Die Krankheit entwickelt sich in 50 % bis 91 % der Patienten mit Umleitung Enterostomy, und seine klinische Intensität variiert3,4. Die jährliche Inzidenz von rund 120.000 Kolostomie Patienten in den Vereinigten Staaten von Amerika gegeben, stellt dieser Krankheit Einheit ein wichtiges Gesundheitsproblem.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokoll zu entwickeln war, ein DC-Mausmodell, das stützt sich auf eine Kolitis Trigger ähnlich gesehen im menschlichen DC und reproduziert, die die primäre histopathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit. Im Gegensatz zu anderen Modellen murinen Kolitis ulcerosa Induktion in unserem Modell erfordert keine gentechnisch veränderte Tiere (z.B., IL-7 Transgene Mäuse, N-Cadherin dominant negativen Mäuse oder TGFβ- / - Mäusen), die Anwendung von chemisch reizende Stoffe (z.B. Dextran Sulfat Natrium (DSS) - induzierte Kolitis oder Trinitrobenzene sulfonsäure (TNBS) - induzierte Kolitis) oder die Übertragung von bestimmten Zellpopulationen immun mangelhaft Mäusen (wie in der CD45RBhohe Übertragungsraten Modell der Kolitis) (eine Übersicht finden Sie unter5). Im Gegensatz zu anderen Modellen erlaubt intakte Immunsystem unseres Modells DC Einschätzung des immunologischen Mechanismus DC Entwicklung beteiligt. Die Begrenzung der Schleimhaut Entzündung zum Segment ausgeschlossenen Darm ermöglicht die Bewertung des seine Rückwirkung auf Schleimhaut Immunität in andere Teile des Gastrointestinaltraktes, auf die immun Homöostase in anderen immun Abteilungen des Verdauungstraktes (z.B. , Peyer Patches und Mesenteriale Lymphknoten), und auf das Immunsystem Homöostase des gesamten Organismus. Schließlich bildet unser Modell ein geeignetes Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die lokale entzündliche Reize aus Veränderungen in der normalen Umgebung für sowohl die lokalen Microbiome sowie nährende Antigene zu kontrollieren.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden vom zuständigen Veterinär Regierung (Forschungsdefizite Für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit Und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF M-V)) genehmigt.

1. präoperative Pflege und Vorbereitung des Tieres

  1. Bei der Ankunft in der Tierstation Teile von Tieren (C57Bl/6) in Gruppen von ähnlicher Größe, Käfig jede Gruppe zusammen und Gruppen während der Experimente konstant zu halten.
    Hinweis: Verwenden Sie Tiere des gleichen Geschlechts. Beschriebenen Ergebnisse wurden bei männlichen Mäusen.
    Hinweis: Wenn männliche Tiere verwendet werden, Käfig Gruppen zusammen ab, wenn sie 7 Wochen alt sind, so dass eine Hierarchie aufgebaut werden kann, minimiert so das Risiko von aggressivem Verhalten während der Experimente.
  2. Mindestens eine Woche vor der Operation zu wechseln, um eine hohe Energie (> 14 MJ/kg) und proteinreiche (> 20 %) feed mit allen essentiellen Spurenelementen und Vitaminen (siehe Materialliste).
    Hinweis: Versichern Sie alle Mäuse wiegen mindestens 25 g, wenn Chirurgie durchgeführt wird.
  3. Anästhesie und Analgesie durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (87 mg/kg i.p) und Xylazin-Hydrochlorid (13 mg/kg i.p) induzieren. Warten Sie, bis die Maus mechanische Stimulation, z.B. Zehe Stellplatz ohne motorische Reaktion toleriert.
  4. Sichern Sie die narkotisierte Maus mit Bändern in Rückenlage auf einer Wärme-Unterlage aufgestellt am Schreibtisch Betrieb garantieren stabile Positionierung während des Betriebs und die Vermeidung von einem überwältigenden Verlust von Körperwärme.
    Hinweis: Die Hitze-Unterlage sollte eine Temperatur von 36 ° C bis 40 ° C haben; die Operating Raumtemperatur sollte 21 ° C.

(2) distale Kolostomie Betrieb

  1. Der Bauch Haare zu rasieren. Desinfizieren Sie vor Beginn der Operation das Operationsfeld dreimal mit Alkohol 70 % und eine jodophor. Drapieren Sie das Operationsfeld zu aseptischen Bedingungen garantieren.
  2. Führen Sie eine 15 mm mediane Laparotomie durch Einritzen der Bauchmuskulatur und das Bauchfell entlang der Linea Alba, Blutverlust minimiert.
  3. Verwenden Sie zwei DeBakey atraumatische Pinzetten, ziehen Sie vorsichtig den Blinddarm, terminal Ileum und aufsteigend und Colon transversum aus der Bauchhöhle.
    Hinweis: Seien Sie vorsichtig, mechanische Manipulation des Darms zum Schutz vor Verletzungen, mesenterialen Strukturen strikt zu begrenzen.
  4. Identifizieren Sie den cecal Mast, der aufsteigende Dickdarm und Dünndarm (Abbildungen 1a und 1 b).
    Hinweis: Korrekte Identifizierung des aufsteigenden Dickdarms ist von grundlegender Bedeutung für die korrekte Platzierung der Kolostomie. In Fällen, wo die Anatomie der Ileocecal Region nicht eindeutig ist, das Vorhandensein von Peyer Patches identifiziert den Dünndarm, und das Vorhandensein von geformten Stuhl kennzeichnet den Doppelpunkt.
  5. Verwenden Sie ein Lineal, um die Position der zukünftigen Kolostomie bestimmen. Es sollte 20 mm distal der Ileocecal Ventil für eine distale Kolostomie platziert werden.
  6. Machen Sie einen zweiten 3-mm-Schnitt in der Bauchdecke in der oberen rechten Quadranten. Ziehen Sie die zuvor identifizierten Doppelpunkt-Segment durch diesen Schnitt zu einer Schleife, wobei Sie darauf achten, nicht um die Schleife zu verzerren.
  7. Übergeben Sie sorgfältig eine flexible i.v. 22-Gauge-Kanüle durch das Mesocolon. Achten Sie darauf, nicht um mesenterialen vaskuläre Strukturen zu beschädigen.
  8. Den Darm in die Bauchhöhle zurück.
  9. Befestigen Sie beide Enden des Schlauches auf der Haut mit einfachen Stichen und einer resorbierbaren Naht (z.B., Polyglactin 910 oder Polyfil 4-0 1/2 c).
  10. Führen Sie vor dem Schließen der Laparotomie, Fluid Reanimation mit einer intraperitonealen Injektion von 0,5 mL 0,9 % Kochsalzlösung.
  11. Schließen Sie das Peritoneum und die Muskelschicht mit einer kontinuierlichen Naht mit einer resorbierbaren Naht (z. B. Polyglactin 910 oder Polyfil 4-0 1/2 c). Schließen Sie die Haut mit einer kontinuierlichen Naht mit einer resorbierbaren Naht (z. B. Polyglactin 910 oder Polyfil 4-0 1 / 2c).
  12. Öffnen Sie die exteriorized Doppelpunkt Schleife durch Ausführen einer Zwischensumme Durchtrennung mit einer feinen Schere. Vermeiden Sie alle Verletzungen, das Mesenterium. Den Doppelpunkt nicht vollständig Transekt.
  13. Jede Kolostomie Öffnung durch drei einzelne voll Dicke Nähte, das Peritoneum zu beheben und die Haut mit einem Monofil, resorbierbaren Naht (z.B.Polydioxanon oder Monofil 6-0 3/8 s). Der afferenten Schleife, die eine funktionelle Ende-Kolostomie ist, und die ableitenden Schleife, die eine schleimige Fistel ist, sind klar getrennt, an dieser Stelle (Abbildung 1 c).
    Hinweis: Betriebszeit weniger als 20 Minuten sollte die Flüssigkeit und thermische Verluste zu begrenzen.
  14. Nach Beendigung der Operation, Desinfektion von Instrumenten mit einem Aldehyd-freie Desinfektionslösung in ein Ultraschallbad gemäß den Anweisungen des Herstellers.

(3) Sham-Betrieb (Colotomy)

  1. Führen Sie Schritte 1.1. durch 2.4.
  2. Verwenden Sie ein Lineal zur Bestimmung der zukünftigen Colotomy. Die Colotomy sollte den gleichen Abstand vom Ileocecal Ventil wie die Kolostomie in der experimentellen Gruppe positioniert werden.
  3. Öffnen Sie den Dickdarm zu mindestens zwei Dritteln seines Umfangs mit einer feinen Schere.
  4. In der Nähe der Colotomy mit einer einzigen Schicht voll-Dicke unterbrochen Naht mit einem Monofil, resorbierbaren Naht (z. B. Polydioxanon, Monofil 6-0 3/8 s).
    Hinweis: Betriebszeit sollte weniger als 20 Minuten für einen erfahrenen Operateur, flüssig und thermische Verluste zu begrenzen.
  5. Führen Sie Schritte 2.10. , 2.11. und 2.14.

4. postoperative Pflege

  1. Tiere in ihren Käfigen zurück. Sorgen für eine wohltemperierte Atmosphäre von 37 ° C (z.B.mit einer Infrarotlampe) bis Mäuse ganz wach sind. Dann halten Sie Mäuse in einer Umgebung von Temperatur und Feuchtigkeit reguliert (21 ° C; 30 % ± 10 % Relative Luftfeuchtigkeit). Freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser zu ermöglichen. Um flüssige Aufnahme zu erleichtern, bieten Sie zusätzliche Wasser getränkten Tierfutter.
  2. Postoperative Analgesie durch die Injektion von 0,1 mg/kg Körper Gewicht Buprenorphin beginnen s.c. wenn Tiere Reaktion auf mechanische Stimulation zeigen. Seien Sie vorsichtig, Atemdepression zu vermeiden.
  3. Ergänzen Sie Trinkwasser mit 1 mg/mL Tramadol für kontinuierliche Analgesie während der ersten postoperativen Woche.
  4. Als Ausgleich für verminderte Flüssigkeitsaufnahme aufgrund eingeschränkter Mobilität, liefern eine solide trinken Pad im Käfig während der ersten postoperativen Woche.
  5. Wiegen der Tiere und Partitur Tierverhalten täglich während der ersten Woche jeden zweiten Tag während der Rest des ersten Monats und jeden dritten Tag im zweiten Monat mit der Krankheit schwere Partitur in Kleinwort Et Al. beschrieben 6.

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Representative Results

Operation ist gut verträglich, sowohl in der experimentellen (Kolostomie) und Schwindel (Colotomy) Gruppen. Perioperative Mortalität sollte 10 % nicht überschreiten, wenn Chirurgie und Perioperative Management korrekt durchgeführt wird. In der ersten postoperativen Woche sieht erheblichen Gewichtsverlust in der experimentellen und Sham Gruppen. Tiere der Sham-Gruppe erreichen ihre Gewicht Tiefpunkt in der Regel in Richtung der vierten postoperativen Tag, aber es tritt einen Tag später in der experimentellen Gruppe. Gewichtsverlust ist stärker ausgeprägt in der experimentellen Gruppe, 21,7 % des ursprünglichen Körpergewichts erreicht. Im Gegensatz dazu verlieren Schein Tiere 10,8 % ihrer ursprünglichen Körper Gewicht (Abbildung 2)6. Nach dem Gewicht Tiefpunkt in der ersten postoperativen Woche steigt Körpergewicht stetig in beiden experimentellen Gruppen, aber mit einer langsameren Steigung in der experimentellen Gruppe. Anzeichen und Symptome einer schweren Darmentzündung (d.h., blutige Entladung oder flüssiger Stuhlgang auftreten, weder in der experimentellen noch der Sham-Gruppe-6). Gesamtmortalität während der ersten 60 Tage ist postoperativ rund 40 % in der Gruppe Kolostomie und ca. 10 % in der Colotomy-Gruppe. Die meisten Todesfälle treten während der ersten postoperativen Woche (61 % in der experimentellen Gruppe, 66 % in der Sham-Gruppe). Todesursachen sind in Abbildung 3dargestellt.

Distale Kolostomie bei Mäusen führt die Entwicklung vorwiegend lymphozytären Kolitis der typischen histologischen Merkmale des menschlichen DC zu reproduzieren. Diese Veränderungen erhöhen mit der Dauer der Darm Ausschluss. Krypta Länge in ausgeschlossenen Darm Segmenten deutlich verkürzt. Diese Verkürzung erreicht statistischen Signifikanz nach 14 Tagen der fäkale Ablenkung (Abb. 3a). Die Becher-Zelle-lagerlänge Krypta wird nach 30 Tagen in ausgeschlossenen Darm Segmenten (Abb. 3 b) reduziert. Absolute Goblet Zelle Zahlen sinken auch beträchtlich in Krypten im Segment ausgeschlossenen Darm nach 14 postoperativen Tagen (Abb. 3 c). Die Markenzeichen Läsion der DC, die Entwicklung der lymphatischen Follikeln in der Schleimhaut, erfordert eine längere Dauer der Hocker Abweichung. Obwohl eine erhöhte Anzahl von lymphoide Follikel bereits nach zwei Wochen beobachtet werden kann, werden Unterschiede erhebliche nach zwei Monaten (Figuren 5a-c). Alle beschriebene vor histopathologische Veränderungen sind stärker ausgeprägt als in proximalen Regionen der ausgeschlossenen Darm Segmente distalen. Eine typische neutrophile Infiltrat als Zeichen einer akuten Entzündung (Zahlen 5 d-e) in der Regel nicht eingehalten ist.

Als ein Zeichen für eine systemische Auswirkungen des lokalen Darmentzündung sind Neutrophilenzahl zählt bei Kolostomie Tieren bereits 14 Tage nach der Operation deutlich zu. Dieser Unterschied bleibt bis zum Ende der Beobachtungszeit (60 Tage). Thrombozytenwerte sind leicht gestiegen, bei Tieren mit Kolon Abzweigung nach 60 Tagen (Abbildung 6). Hämoglobinwert und Hämatokrit werden 14 Tage nach der Operation in der Kolostomie-Gruppe im Vergleich zu der Sham-Gruppe reduziert.

Es hat sich gezeigt, dass Vitamin-Mangel in Nagetieren Ursachen reduziert mittleren korpuskulären Volumens (MCH) und meine Korpuskuläre Hämoglobin (MCV) Werte7. In unserem Modell sehen wir anfängliche Anstieg des beide Parameter nach 14 bis 30 Tagen. MCV und MCH zurück auf normale Werte nach längeren Follow-up (Abbildung 7). Dies zeigt, dass das distale Kolostomie während Langzeitstudien nicht zu klinisch signifikanten Vitamin-Mangel führt.

Figure 1
Abbildung 1: Anatomie der cecal Region und den chirurgischen Eingriff. (a) grafische Darstellung der postoperative Anatomie. (b) Topographie des cecal Pol und anatomischen Landmarken. (c) grafische Darstellung der Kolostomie Öffnungen. Abbildung 1a wurde von Kleinwort Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Body Gewicht Entwicklung. Körpergewicht wird als Prozentsatz des präoperativen Körpergewichts angezeigt. Der Körper Gewicht Kurven Kolostomie und sham (Colotomy) Tiere zeigen, die die ersten postoperativen Gewichtsverlust signifikant höher in der Kolostomie-Gruppe im Vergleich zu der Sham-Gruppe (p < 0,001 war). Werte sind Mittel ± Standardfehler des Mittelwerts über 21-26 Tiere pro Gruppe (21 Tiere erhalten verdauungsbrei; 26 Tiere waren in der Sham-Gruppe). Diese Zahl wurde von Kleinwort Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Ursachen des Todes. Komplikationen als Prozentsätze der Gesamtmortalität dargestellt werden und sind in einem Kreisdiagramm (Fraktion Kolostomie (a), (b) Schein) dargestellt. Postoperative Komplikationen wurden durch Autopsie ermittelt. Wasting-Syndrom wurde als kontinuierliche Gewichtsabnahme größer als 33 % des ursprünglichen Körpergewichts und keine anderen Befunde bei Autopsie definiert. Ileus und Anastomosen Leckage bei Autopsie diagnostiziert. Stoma Komplikationen wurden als parastomale Abszesse und mukokutane Trennungen definiert. Andere Komplikationen umfasste Wunde Dehiszenz der Laparotomie, Ischämie der Blinddarm und Fällen nicht klar auf Autopsie. Signifikante Unterschiede in der Verteilung der postoperativen Komplikationen wurden gesehen zwischen den Gruppen (p = 0,021, mit der exakten Fisher-Test für zweiseitige Analyse von bis zu 6 × 6 Kontingenztabellen analysiert). Es gab 39 Tiere in der Gruppe Kolostomie und 29 in der Sham-Gruppe. Diese Zahl wurde von Kleinwort Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Krypta Länge und Goblet Zelle Bevölkerung. Krypta Länge und Goblet Zelle Zahlen wurden mit Paraffin Abschnitte des Mastdarms nach Perjodsäure-Schiff Färbung bestimmt. (a) Krypta Länge war im Rektum von Tieren mit Umleitung Kolitis (DC) deutlich verringert. (b) die Länge des Rayons Goblet Cell-Lager der Krypta wurde gemessen und als Verhältnis der vollen Krypta Länge. Dreißig bis sechzig Tagen wurde der Anteil der Krypta tragende Länge Becherzellen postoperativ, in der DC-Gruppe verringert. (c) Becher Zellzahlen wurden in DC Tiere im Vergleich zu der Sham-Gruppe deutlich reduziert. Diagramme in (a) bis (c) zeigen Mittel und Standardfehler über 5 bis 9 Tiere pro Gruppe (Kolostomie 14 und 30 Tage, 14 Tage sham: n = 8; Kolostomie 60 Tage: n = 5, 30 und 60 Tagen sham: n = 9); ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Diese Zahl wurde von Kleinwort Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: lymphoide Follikel und entzündliche Infiltrate. (a) lymphoide Follikel umgeleitete Doppelpunkte und Sham Tiere wurden auf Paraffin Abschnitte des Mastdarms gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin gezählt. Das Diagramm zeigt Mittel und Standardfehler über 5 bis 9 Tiere pro Gruppe (Kolostomie 14 und 30 Tage, 14 Tage sham: n = 8; Kolostomie 60 Tage: n = 5, 30 und 60 Tagen zu steuern: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. (b) und (c) Vertreter Beispiele für Abschnitte des Mastdarms Kolostomie (b) und (c) Schein Tiere 60 Tage postoperativ gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Eine prominentere lymphoide Follikel (∗) war in der Schleimhaut eine Kolostomie-Maus. Maßstabsleisten stehen 100 µm. (d) und (e) Färbung mit Chloroacetate Esterase Reaktion auf Paraffin Abschnitten wurde durchgeführt, um die Neutrophilen Granulozyten erkennen. Auf Querschnitten des umgeleiteten Mastdarms wurde eine Akute entzündliche neutrophile Infiltrat Kolostomie-Gruppe (d) weder im Schein Tiere (e) bis auf 60 Tage postoperativ beobachtet. Maßstabsleisten darstellen 100 µm. Diese Zahl wurde von Kleinwort Et Al.6geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Anzahl der Neutrophilen und Thrombozyten. Blutwerte von venöser Blutproben wurden von einem Veterinär Hämatologie-Analysator bestimmt. (a) Neutrophilen Grafen wurden in die Kolostomie-Gruppe im Vergleich zu Schein Tieren bis zu 60 Tage postoperativ signifikant erhöht. (b) die Thrombozytenwerte waren leicht in der Kolostomie Gruppe 60 Tage postoperativ erhöht. Das Diagramm zeigt Mittel und Standardfehler über 5 bis 9 Tiere pro Gruppe (Kolostomie 14 und 30 Tage, 14 Tage sham: n = 8; Kolostomie 60 Tage: n = 5, 30 und 60 Tagen sham: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Erythrozyten-Parameter. Blutwerte von venöser Blutproben wurden von einem Veterinär Hämatologie-Analysator bestimmt. (a) Hämoglobin und Hämatokrit (b) wurden in der Kolostomie-Gruppe im Vergleich zur Sham-Gruppe deutlich verringert. (c) mittlere Korpuskuläre Volumen (MCH) war deutlich erhöhten 14 und 30 Tage nach der Operation in der Kolostomie-Gruppe im Vergleich zu der Sham-Gruppe kehrte aber normal nach 60 Tagen. (d) mittlere Korpuskuläre Hämoglobin (MCV) Werte wurden erhoben, nach 30 Tagen aber nicht mehr nach 60 Tagen nach der Operation in der Kolostomie-Gruppe im Vergleich zu Tieren sham. Das Diagramm zeigt Mittel und Standardfehler über 5 bis 9 Tiere pro Gruppe (Kolostomie 14 und 30 Tage, 14 Tage sham: n = 8; Kolostomie 60 Tage: n = 5, 30 und 60 Tagen sham: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Mausmodell der DC präsentiert in diesem Protokoll zuverlässig reproduziert die histopathologische Merkmale des menschlichen DC (z. B., de Novo Entwicklung der lymphatischen Follikeln in der Submukosa der entzündeten Darm Segmente, Krypta, die Verkürzung und Senkung der Goblet Zelle Zahlen). Abgesehen von diesem Vorteil dieses Modell wird durch eine sehr ähnliche auslösende Faktor induziert und präsentiert mit einer klinischen Verlauf von mäßigen bis leichten schwere, wie der Fall in den am stärksten betroffenen Menschen ist.

Um reproduzierbare Ergebnisse und akzeptable Perioperative Letalität zu erhalten, ist einige Übung in mikrochirurgischen Techniken notwendig. Jedoch kann Kolostomie und Sham Betrieb (Colotomy) mit sehr geringen perioperativen Sterblichkeit durchgeführt werden (< 10 %). Einige Arbeitsschritte sind von großer Bedeutung: 1) Doppelpunkt und Terminal Ileum positiv zu identifizieren. In Fällen, wo die Anatomie der Ileocecal Region nicht klar, erkennbar durch die Anwesenheit von geformten Stuhl und terminal Ileum Dickdarm durch die Anwesenheit von Peyer Patches. (2) bei die Kolostomie Schleife exteriorizing, versichern Sie, dass das Mesenterium nicht verdreht ist, wodurch mesenterialen Ischämie und mechanischen Ileus. (3) Wenn das Mesenterium mit den biegsamen Schlauch punktieren, versichern Sie, dass ein Schiff-freien Sektor ausgewählt ist, verhindert Blutungen und mesenterialen Ischämie. (4) Wenn den kleinen Schnitt in der Bauchdecke erstellen, überprüfen Sie für ausreichende Blutstillung. Verwenden Sie ggf. Thermo-Koagulation um von Muskel Schiffe Blutung zu stoppen. (5) versichern Sie das Kolon Schleife öffnen mindestens zu zwei Drittel seines Umfangs ist und der hintere Wand ausreichend verwirklicht ist, gewährleistet eine vollständige Blockade der Hocker Durchgang auf die distale Darm-Segmente. (6) versichern Sie, dass beidseitig Kolostomie gut auf der Haut zu vermeiden, einen offenen Durchgang in der Bauchhöhle, wodurch höhere Infektionsgefahren oder einen mechanischen Ileus weil die fäkale Stream verlassen kann nicht behoben werden. Normalerweise können alle chirurgischen Eingriffe ohne Lupen oder Operationsmikroskopen durchgeführt werden. Nutzung dieser Geräte erfordert im allgemeinen Weiterbildung.

Auch wenn die Komplexität der chirurgischen Eingriffe nur moderat ist, gibt es viele wesentliche Operative und Perioperative Probleme erfolgreich zu beenden, das Experiment mit reproduzierbaren Ergebnissen berücksichtigt werden.

Es ist wichtig für das langfristige Überleben mit einer permanenten Kolostomie, dass Mäuse eine intakte Blinddarm haben. Eine experimentelle Gruppe mit proximalen verdauungsbrei angrenzend an das Ileocecal Ventil zeigte eine Mortalität von 100 % in der ersten postoperativen Woche wegen irreversible Gewichtsverlust (Daten nicht gezeigt). Daher ist es von größter Bedeutung für die Kolostomie Seite mindestens 20 mm distal aus der begründete Ventil zu wählen. Diese Beobachtung kann aufgrund der Physiologie der Verdauung Nager sein. Retrograder Transport von der proximalen Colon, der Blinddarm tritt bei dieser Spezies. Der Blinddarm ist, wo die Synthese von Nährstoffen durch die bakteriellen Mikroflora-occurs8. Normal MCV und MCH Werte während Langzeitstudien zeigen, dass Tiere mit distalen verdauungsbrei nicht an bedeutenden Vitaminmangel leiden. Koprophagie ist darüber hinaus ein wesentlicher Bestandteil das Ernährungsverhalten von Nagetieren in ihrem natürlichen Lebensraum. Wenn das Modell zu etablieren, waren wir sehr besorgt, dass sind die Koprophagie als Folge das Vorhandensein einer permanenten Kolostomie führen könnten, Ernährungsmängel, (z.B. Vitamin B). Jedoch während es ein Problem unter Bedingungen ist, wo Zugang zu Nährstoffen beschränkt, hat sich zuvor gezeigt, dass Koprophagie verliert seine Ernährungsphysiologische Bedeutung unter experimentellen Bedingungen mit freien Überschuss an Wasser und ernährungsphysiologisch ausgewogene Nahrung9 . Unter unseren experimentellen Bedingungen ist es wichtig, die Bedingungen der postoperative Nahrungsaufnahme zu optimieren. Wir verwendeten Futtermittel, die hatte eines hohen Eiweißgehalt, optimierte Protein-Qualität und erhöhte Energiedichte. Tiere wurden mindestens zwei Wochen vor der Operation zu dieser Diät akklimatisiert. Postoperativ, bot Wasser getränkten Futter Ad Libidum zu erleichtern Nahrung und Flüssigkeitszufuhr.

Es ist entscheidend für die Mäuse des gleichen Geschlechts in der experimentellen und Sham Gruppen nutzen. Sex hat nachweislich wesentlich beeinflussen den Verlauf einer systemischen Entzündung, sondern auch der Darmentzündung in verschiedenen chemisch induzierten Kolitis Modelle10,11,12. Männliche Tiere werden in der Regel ausgeprägter Erkrankung mit größeren Entzündung mehr Krypta Schaden, weniger Regeneration, höhere Pro-inflammatorischen Zytokinen und langsamer Rückforderungen von Gewicht-Verlust-10entwickeln. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von männlicher Tieren ist besser Alter abgestimmt präoperative Körpergewicht, was zu besseren Ausgleich der ersten postoperativen Gewicht Verlust Periode. Weibliche Mäuse können jedoch im Protokoll verwendet werden, wenn bestimmte Fragen (z.B., der Einfluss des Geschlechts Hormone auf die Manifestation der DC müssen behandelt werden. Mit Hilfe von männlichen Mäusen erfordert mehr Aufwand bei der Aufrechterhaltung der stabile Wohnverhältnisse. Männliche Mäuse sind anfälliger für aggressiven Interaktionen zu Verletzungen und zum Tod führen. Männliche Mäuse leben in etablierten Hierarchien mit einem dominanten Männchen. Sobald die Hierarchie in der Gruppe besteht, ist die anhaltenden Kampfhandlungen seltener13,14. Aus diesem Grund wir mindestens zwei Wochen vor der Operation die experimentellen Gruppen bei der Ankunft der Mäuse in unserer Tierstation gebildet und gepflegt diese Gruppen bis Experimente beendet. Im allgemeinen wurden experimentelle Gruppen von 5 bis 7 Tiere in einem Käfig gehalten. Wartung der stabile soziale und Wohnbedingungen war von größter Bedeutung nicht nur für das aggressive Verhalten von Versuchstieren zu minimieren. Gehäuse Bedingungen haben gezeigt, dass Gewichtszunahme sowie immunologische Parameter15,16,17beeinflussen.

Anfälligkeit für chemisch induzierte und genetisch veränderten ulcerosa Modelle variiert erheblich zwischen Maus Stämme18,19,20. Dieses Protokoll wurde bei C57Bl/6 Mäusen, eine Maus-Sorte mit einem klar definierten genetischen Hintergrund und ein gut charakterisierten Immunsystem21,22,23 , die mittlere bis starke zeigt entzündliche Reaktion in der Dextran Sulfat Natrium-induzierte Kolitis Modell20 und gilt als eine prototypische Th1 Stamm23. Die Verwendung von anderen Mausstämme kann betrachtet werden, wenn schwerer Krankheit Aktivitäten oder eine Th2-Umgebung erforderlich ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen stellt unser Protokoll ein wertvolles Instrument für die Beurteilung der Rolle der verschiedenen Immunzellen, Zytokine, Chemokine und andere Signalisierung Moleküle in der Pathogenese der DC. Eine große Anzahl von genetisch veränderten Mäusen Modelle gibt es mit dem C57BL/6-Hintergrund und können mit unserem Modell kombiniert werden (z.B., Mäuse mangelhaft für IL-17, IL-10, Chemokin CXCL13, Chemokin-Rezeptoren CXCR5 und CCR7 und Sphingosine-1-Phosphat Rezeptor 4). Die Verfügbarkeit von Congenic Mausstämme auf dem C57BL/6 Hintergrund weitgehend erleichtern Transfer Experimente, die Rolle der unterschiedlichen Zelltypen beteiligt in der Ätiologie von DC zu etablieren. Zu guter Letzt bietet das Modell die Möglichkeit zur Bewertung des Einflusses von lokalen Eingriffen (z.B.Änderung der lokalen Mikrobiom und lokale antientzündliche Therapie) auf Schleimhaut Immunität im Darm von betroffenen und nicht betroffenen Segmente und systemische immun-Homöostase.

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Disclosures

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Acknowledgments

Keine

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt ThermoLux, Witte + Sutor GmbH 461265
Ethanol 70% (with methylethylketon) Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length Centramed GmbH, Germany 8308370 for disinfection of operation field
Scissor Aesculap (BRAUN) BC064R
Atraumatic DeBakey forceps Aesculap (BRAUN) OC021R
Needle holder Aesculap (BRAUN) BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G Braun Melsungen AG, Germany 4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm ETHICON, Inc. VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm ETHICON, Inc. Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) BD Medical 305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) ANTISEPTICA, Germany 18824-01 disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 9089.01.00 87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH 400300.00.00 13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9% Braun Melsungen AG, Germany 6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Bayer, Germany PZN: 01498870 0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) Grünenthal GmbH, Germany 10116838 1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)  Cephasaar GmbH, Germany PZN: 08844252 25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL Braun Melsungen AG, Germany PZN: 05543515 12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich ssniff, Germany  V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches TripleATrading, the Netherlands SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L Nikon Instruments Europe BV, Germany light microscopy
VetScan HM 5  Abaxis, USA 770-9000 Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) Bandelin electronics, Germany RK 100 H disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software Nikon Instruments Europe BV, Germany
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References

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