डायबिटीसे चूहे में पुराने घाव बनाने के लिए प्रोटोकॉल

Medicine

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Summary

क्रोनिक घाव एक पूर्ण thickness त्वचीय घाव के बाद ऑक्सीडेटिव तनाव के उच्च स्तर को प्रेरित करके एक मधुमेह माउस मॉडल पर तीव्र घावों से विकसित कर रहे हैं। घाव कैटालेस और ग्लूटाथिओन peroxidase के लिए inhibitors के साथ इलाज किया जाता है, त्वचा microbiome में मौजूद बैक्टीरिया द्वारा बिगड़ा चिकित्सा और biofilm विकास में जिसके परिणामस्वरूप.

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Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

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Abstract

पुराने घाव उचित उपचार में शामिल एक या एक से अधिक जटिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं में दोषपूर्ण विनियमन का एक परिणाम के रूप में विकसित. वे अकेले अमेरिका में $ 6.5M लोगों और लागत $ 40B/वर्ष को प्रभावित करते हैं। हालाँकि इंसानों में पुराने घाव कैसे विकसित होते हैं, यह समझने में एक खास मेहनत का निवेश किया गया है, लेकिन बुनियादी सवाल अनुत्तरित हैं। हाल ही में, हम मधुमेह पुराने घावों के लिए एक उपन्यास माउस मॉडल विकसित की है कि मानव पुराने घावों के कई विशेषताओं है. db/db-/- चूहों का उपयोगकरके, हम घाव के तुरंत बाद घाव के ऊतकों में ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) के उच्च स्तर को प्रेरित करके पुराने घाव उत्पन्न कर सकते हैं, एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों कैटालेस के लिए विशिष्ट अवरोधकों के साथ एक बार के उपचार का उपयोग करके और ग्लूटाथिओन पेरोक्सिडस। इन घावों में ओएस का उच्च स्तर होता है, स्वाभाविक रूप से बायोफिल्म विकसित होता है, उपचार के बाद 20 दिनों के भीतर पूरी तरह से पुरानी हो जाती है और 60 से अधिक दिनों के लिए खुला रह सकता है। इस उपन्यास मॉडल मनुष्य में मधुमेह के पुराने घावों के कई विशेषताएं हैं और इसलिए कैसे घाव पुरानी हो की मौलिक समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर सकते हैं. यह एक बड़ी सफलता है क्योंकि मनुष्यों में पुराने घाव रोगियों के लिए महत्वपूर्ण दर्द और संकट का कारण बनते हैं और यदि अनसुलझे विच्छेदन होते हैं। इसके अलावा, इन घावों का इलाज करने के लिए बहुत महंगा है और समय लेने वाली हैं, और रोगियों को व्यक्तिगत आय का महत्वपूर्ण नुकसान होता है। हमारे पुराने घाव मॉडल के उपयोग के माध्यम से अध्ययन के इस क्षेत्र में प्रगति काफी लाखों जो इस दुर्बल हालत के तहत पीड़ित के लिए स्वास्थ्य देखभाल में सुधार कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम तीव्र घाव ों को पुरानी बनने के लिए कारण प्रक्रिया के विस्तार में वर्णन करते हैं, जो पहले नहीं किया गया है।

Introduction

घाव भरने जटिल सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं है कि लौकिक और स्थानिक विनियमित कर रहे हैं शामिल है, अनुक्रमिक और ओवरलैपिंग चरणों में आयोजित किया है कि सहित कई अलग अलग सेल प्रकार शामिल है, लेकिन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और संवहनी तक ही सीमित नहीं प्रणाली1| इसके तुरंत बाद त्वचा एक चोट को बनाए रखती है, कारकों और रक्त कोशिकाओं घाव साइट के लिए कुल और एक थक्का बनाने के लिए जमावट झरना आरंभ. homeostasis प्राप्त करने के बाद, रक्त वाहिकाओं घाव साइट ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, एंजाइमों, एंटीबॉडी और chemotactic कारक है कि chemoattract polymorphonucleocytes विदेशी मलबे के घाव बिस्तर को साफ करने के लिए और स्रावित proteolytic एंजाइमों में जाने के लिए फैलाने के लिए 2. सक्रिय प्लेटलेट्स घायल क्षेत्र को फिर से epithelialize करने के लिए घाव के किनारे पर keratincytes को प्रोत्साहित करने के लिए विकास कारकों की एक किस्म स्रावित करता है। घाव स्थल पर भर्ती किए गए मोनोसाइट्स मैक्रोफेज में अंतर करते हैं जो फागोसाइटोज बैक्टीरिया और मृत न्यूट्रोफिल और केराटिनोसाइट प्रोलाइफरी और प्रो-माइग्रेट सिग्नल बनाए रखने के लिए अतिरिक्त कारकों को स्रावित करते हैं। प्रसार चरण में, जबकि पुन: एपिथेलाइजेशन जारी रहता है, नए दानेदार ऊतक फाइब्रोब्लास्ट्स से बना, मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज, लिम्फोसाइटों, और एंडोथेलियल कोशिकाओं के पुनर्निर्माण की प्रक्रिया2जारी है। एंजियोजेनेसिस एंडोथेलियल सेल प्रसार और प्रवास को बढ़ावा देने के द्वारा प्रेरित है, जिसके परिणामस्वरूप नए पोत विकास में होती है। Epithelialization और extracellular मैट्रिक्स के remodeling पर्यावरण के खिलाफ एक बाधा का निर्माण. के रूप में घाव भर देता है और दानेदार ऊतक एक निशान में विकसित, apoptosis अतिरिक्त ऊतक क्षति के कारण के बिना भड़काऊ कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, और endothelial कोशिकाओं को समाप्त. ऊतक की तन्य शक्ति फाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा बढ़ाया जाता है जो कोलेजन की तरह एक्स्ट्राकोल्यूलर मैट्रिक्स के विभिन्न घटकों को फिर से तैयार करता है, ताकि नवगठित ऊतक लगभग उतना ही मजबूत और लचीला हो जितना कि unwounded त्वचा2।

घाव बंद करने की दिशा में इस अत्यधिक ठोस प्रगति सेकोई विचलन बिगड़ा और / पुराने घावों में बढ़ते ऑक्सीडेटिव तनाव, पुरानी सूजन, क्षतिग्रस्त माइक्रोवास्कुल्चर, और घाव4में असामान्य कोलेजन मैट्रिक्स की विशेषता है। ऑक्सीडेटिव तनाव, विशेष रूप से घाव में, घाव बंदकरने मेंदेरी कर सकता है 2,5. जब, घाव भरने के पहले चरण में, सूजन चरण अनियमित हो जाता है, मेजबान ऊतक सूजन कोशिकाओं की निरंतर प्रवाह के कारण व्यापक क्षति मानता है5 जो साइटोटॉक्सिक एंजाइमों को रिलीज करता है, मुक्त ऑक्सीजन कण में वृद्धि, और अनियमित भड़काऊ मध्यस्थों, सेल मौत6,7में जिसके परिणामस्वरूप .

इस विनाशकारी सूक्ष्म पर्यावरण में, बायोफिल्म बनाने वाले बैक्टीरिया मेजबान पोषक तत्वों का लाभ उठाते हैं और मेजबान ऊतक2के नुकसान में योगदान देते हैं। इन biofilms को नियंत्रित करने और हटाने के लिए मुश्किल है क्योंकि हाइड्रेटेड extracellular बहुलक प्रोटीन से बना पदार्थ, डीएनए, आरएनए, और polysaccharides बैक्टीरिया के भीतर आश्रय पारंपरिक एंटीबायोटिक चिकित्सा के लिए सहिष्णु होने के लिए और बचने की अनुमति देता है मेजबान की सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया2,8,9.

पुराने घावों का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है क्योंकि वे केवल10वर्ष में अमेरिका में 6.5 मिलियन डॉलर और $ 40 बिलियन प्रति वर्ष की लागत को प्रभावित करते हैं . मधुमेह के रोगियों को पुराने घावों को विकसित करने के लिए जोखिम बढ़ गया है जिसके लिए संक्रमण के प्रसार को रोकने के लिए विच्छेदन की आवश्यकता होती है। इन रोगियों को विच्छेदन के 5 वर्षों के भीतर 50% मृत्यु का खतरा होता है जो मधुमेह11के पैथोफिजियोलॉजी तंत्र के कारण होता है . मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली और घाव भरने में microbiome के बीच संबंध चल रहे अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण विषय है क्योंकि पुराने घावों के परिणाम, अगर अनसुलझे, विच्छेदन और मौत12शामिल हैं.

हालांकि एक महत्वपूर्ण प्रयास को समझने में निवेश किया गया है कि कैसे पुराने घाव मनुष्यों में विकसित, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कैसे और क्यों पुराने घाव फार्म. बिगड़ा चिकित्सा के तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोगों मनुष्यों में आचरण करने के लिए मुश्किल है, और घाव चिकित्सा विशेषज्ञों केवल पुराने घाव है कि पहले से ही महीनों के लिए सप्ताह के लिए पुरानी पनाह तक पहुँच चुके हैं के साथ रोगियों को देखते हैं. इस प्रकार, विशेषज्ञ यह अध्ययन करने में असमर्थ हैं कि कौन सी प्रक्रियाएं गलत हुई ं हैं जिससे घाव को पुरानी2बनने के लिए विकसित किया जा सकता है। वहाँ पशु मॉडल है कि मानव पुराने घावों की जटिलता recapitulate की कमी है. जब तक हमारे मॉडल विकसित किया गया था, पुरानी घाव अध्ययन के लिए कोई मॉडल अस्तित्व में.

पुरानी घाव मॉडल चूहों कि लेप्टिन रिसेप्टर में एक उत्परिवर्तन है में विकसित किया गया था (db/db-/-)13. इन चूहों मोटापे से ग्रस्त हैं, मधुमेह, और बिगड़ा उपचार है, लेकिन पुराने घाव विकसित नहीं14. रक्त शर्करा का स्तर औसत लगभग 200 मिलीग्राम/डीएल, लेकिन 400 मिलीग्राम/डीएल15के रूप में उच्च हो सकता है। जब घाव के ऊतकों में ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) के उच्च स्तर को घाव करने के तुरंत बाद प्रेरित किया जाता है, घाव पुरानी16हो जाता है। db/db-/- घावों को 20 दिनों तक पुरानी माना जाता है और 60 दिनों या उससे अधिक के लिए खुला रहता है। बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित बायोफिल्म को घाव के तीन दिन बाद विकसित होते देखा जा सकता है; एक परिपक्व biofilm घाव के बाद 20 दिन देखा जा सकता है और या तो घाव बंद होने तक बनी रहती है. इन चूहों में हम पाते हैं biofilm बनाने बैक्टीरिया भी मानव मधुमेह पुराने घावों में पाए जाते हैं.

ऑक्सीडेटिव तनाव एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों, कैटालेस और ग्लूटाथिओन पेरोक्सिडेज के दो अवरोधकों के साथ घावों के इलाज से प्रेरित होता है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड को तोड़ने की क्षमता के साथ दो एंजाइम। हाइड्रोजन पेरोक्साइड एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति है और प्रोटीन, लिपिड, और डीएनए के ऑक्सीकरण के माध्यम से सेलुलर नुकसान पैदा कर सकता है। कैटालेस हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अपघटन को कम हानिकारक रसायनों ऑक्सीजन और पानी में उत्प्रेरित करता है। 3-एमिनो-1,2,4-त्रिजोल (एटीजेड) विशेष रूप से और सहसंयोजक रूप से एंजाइम के सक्रिय केंद्र के लिए बाध्यकारी द्वारा कैटालेस को रोकता है, यह17,18,19inactivating. एटीजेड का उपयोग इन विट्रो और विवो दोनों में कैटालेस20,21,22,23,24के निषेध के माध्यम से ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है . ग्लूटाथियोन पेरोक्सिडेज एंटीऑक्सीडेंट, ग्लूटाथियोन के माध्यम से हाइड्रोजन पेरोक्साइड की कमी को उत्प्रेरित करता है, और एक महत्वपूर्ण एंजाइम है जो कोशिका को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है25. Mercaptosuccinic एसिड (एमएसए) थायोल के साथ एंजाइम के सेलेनोसिस्टीन सक्रिय साइट के लिए बाध्यकारी द्वारा glutathione peroxidase रोकता है, यह26inactivatating. एमएसए का प्रयोग विट्रो और विवो में ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है , साथ ही20,27,28.

पुरानी घावों के इस उपन्यास मॉडल का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है क्योंकि यह मानव मधुमेह पुराने घावों में मनाया एक ही सुविधाओं के कई शेयरों, वृद्धि हुई ओएस और त्वचा microbiome से प्राकृतिक biofilm गठन से लंबे समय तक सूजन सहित. घावों में त्वचा-एपिडर्मल इंटरैक्शन, असामान्य मैट्रिक्स जमाव, खराब एंजियोजेनेसिस और क्षतिग्रस्त वास्कुलेचर खराब हो गया है। पुराने घाव दोनों पुरुष और महिला चूहों में विकसित होगा, तो दोनों लिंगों पुराने घावों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, पुरानी घाव मॉडल इस तरह के घावों के शुरू होने के मौलिक समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण योगदान कर सकता है। इस पुरानी घाव मॉडल का उपयोग कैसे पुरानीता शुरू की है के बारे में मौलिक सवालों के जवाब प्रदान कर सकते हैं /

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Protocol

सभी प्रयोगों के अनुसार और संघीय नियमों और कैलिफोर्निया नीति और प्रक्रियाओं के विश्वविद्यालय के अनुपालन में पूरा किया गया कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, Riverside IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. पशु

  1. मधुमेह और मोटापे से ग्रस्त B6 का प्रयोग करें. बीकेएस (डी)- पुरानी घाव मॉडल के लिएLeprdb/ क्रय विकल्प या तो प्रजनन के लिए विषमयुग्मज या प्रयोगों के लिए सीधे homozygotes शामिल हैं.
  2. प्रजनन उत्पन्न करने के लिए विषमयुग्मज पुरुषों और मादाएं को जन्म दें। केवल कूड़े का एक चौथाई, सांख्यिकीय, मधुमेह और मोटापे से ग्रस्त हो जाना होगा (db/db-/-).
  3. wean और घर db/db-/- चूहों के साथ उनके littermates के साथ 3 सप्ताह के जन्म के बाद. अलग db/db-/- चूहों उनके littermates से 5 सप्ताह के जन्म के बाद और अन्य db/db-/- चूहों के साथ घर जब तक वे 5-6 महीने पुराने हैं और पुराने घाव मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस समय के दौरान, एक परिपक्व और जटिल त्वचा microbiome विकसित कर सकते हैं.
    नोट: db/db-/- चूहों आसानी से 3-5 सप्ताह की उम्र के बीच littermates से नेत्रहीन पहचान कर रहे हैं. db/db-/- चूहों मोटापे से ग्रस्त हैं, मधुमेह हैं, और जंगली प्रकार और विषमयुग्मज litermates की तुलना में काफी बड़ा और राउंडर हो जाएगा. उनके पेट थोड़ा गुलाबी और उनके कूल्हों बड़ा दिखाई दे सकता है. बढ़ी हुई वजन सर्जरी से पहले की पुष्टि की जानी चाहिए. इसके अलावा, रक्त में ग्लूकोज के उच्च स्तर को मापने के लिए संभव है और लेप्टिन रिसेप्टर में उत्परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए माउस जीनोटाइप।

2. विवेरियम और हस्बैंडरी

  1. घर db/db-/- चूहों एक पारंपरिक vivarium में (नहीं एक बाधा / विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त सुविधा) ताकि एक माइक्रोफ्लोरा db/db-/- चूहों की त्वचा पर स्थापित किया जा सकता है. पुराने घावों से पीड़ित मनुष्यों को विशेष रूप से मॉडल करने के लिए, रोगजनकों के संपर्क को रोकने के लिए विशेष सावधानी न बरतें।
  2. vivarium के भीतर संक्रमण के प्रसार को कम करने के लिए माइक्रो आइसोलेटर सबसे ऊपर के साथ पिंजरों को सुरक्षित रखें। नए बिस्तर के साथ सप्ताह में दो बार पिंजरों को बदलें और नियमित रूप से vivarium चाउ के साथ चूहों फ़ीड. या तो बिस्तर या भोजन autoclave न करें।
  3. वर्ष के समय के आधार पर मामूली उतार-चढ़ाव के साथ, 21 और 24 डिग्री सेल्सियस के बीच के लिए कमरे का तापमान सेट करें। नमी, जलवायु और स्थान के चिंतनशील, 19 और 70% के बीच की सीमा होगी.

3. पुराने घावों के विकास के लिए आवश्यकताएँ

  1. केवल पुरुष और महिला चूहों कि phenoआम रूप से मोटापे से ग्रस्त हैं का उपयोग करें, मधुमेह, और पुराने घावों के विकास के लिए उम्र के कम से कम 5-6 महीने. इन चूहों का वजन 40-80 ग्राम के बीच भिन्न होता है, जो लगभग 60 ग्राम औसत होता है।
  2. उन चूहों का उपयोग न करें जिन्हें मोटापे से ग्रस्त माना जाता है लेकिन उनका वजन 50 ग्राम से कम है।
    नोट: सभी चूहों इस प्रोटोकॉल में संदर्भित योग्यता यहाँ वर्णित पास जब तक अन्यथा उल्लेख किया.

4. शेविंग और डेपिलेटरी लोशन के आवेदन

नोट: घाव से पहले माउस के डोर्सम पर अवांछित बाल निकालें. निम्नलिखित प्रक्रिया लाइव db/db-/- चूहों कि संज्ञाहरण के तहत सर्जरी से पहले दिन नहीं कर रहे हैं पर किया जाता है. तनाव और जानवर को नुकसान को रोकने के लिए सावधानियां बरतें।

  1. शेविंग
    1. माउस को एक साफ सतह पर रखें और माउस की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए अंगूठे और दूसरी उंगली के साथ माउस की पूंछ के आधार को पकड़ें। माउस कूद या अचानक आंदोलनों कर सकते हैं; अगर ऐसा होता है, जल्दी से जवाब और चोट को रोकने के लिए क्लिपर वापस खींच.
    2. एक बाल क्लिपर के साथ माउस के बाल दाढ़ी (चित्र 1A, 1B). माउस की त्वचा के समानांतर ब्लेड स्थिति और गर्दन से पूंछ के लिए पूरी पीठ दाढ़ी, पूंछ के चारों ओर सहित, एक बड़े पर्याप्त सतह क्षेत्र के लिए अनुमति देने के लिए एक पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग जगह (सामग्री की तालिकादेखें). हल्के सबसे कुशल कटौती के लिए बाल विकास की दिशा के खिलाफ ब्लेड चलाते हैं. (चित्र 1बी)
      1. ब्लेड को त्वचा में गहराई से न दबाएं, क्योंकि यह चोट या काटने से त्वचा को नुकसान पहुंचा सकता है।
  2. विपथी लोशन का अनुप्रयोग
    नोट: पारदर्शी ड्रेसिंग मजबूती से पालन कर सकते हैं ताकि एक बहुत चिकनी त्वचा प्राप्त करने के लिए depilatory लोशन का प्रयोग करें।
    1. पहले से ही कटौती त्वचा के खिलाफ नीचे गीला करने के लिए पर्याप्त दबाव के साथ मुंडा त्वचा के खिलाफ एक भीग कागज पोंछे हल्के से दबाने से रासायनिक जलने को रोकने के लिए पानी के साथ माउस की त्वचा को भिगो दें।
    2. जबकि त्वचा गीला है, हल्के से depilatory लोशन के एक छोटे से गुड़िया के साथ माउस की त्वचा रगड़ ( सामग्री की तालिकादेखें) 15-20 एस के लिए ( चित्र1C, 1D). जहां भी बाल कम कर दिया गया है पर लोशन पूरी तरह से फैलाएं। अधिक लोशन का प्रयोग करें यदि माउस बड़ा है.
    3. माउस, पूंछ, या चेहरे के पास कहीं भी के कान पर लोशन लागू न करें। यदि लोशन कान या पूंछ पर हो जाता है, बस rinsing जब तक एक गीला कागज पोंछ के साथ पोंछ. यदि लोशन माउस के चेहरे पर हो जाता है, तो तुरंत चलने वाले नल या deionized पानी के नीचे माउस धोने के लिए आंखों, नाक, और मुंह को नुकसान को रोकने के.
    4. आवेदन के बाद एक अतिरिक्त 20-45 एस के लिए बालों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए लोशन छोड़ दें।
    5. rinsing से पहले, हल्के से विभिन्न स्थानों पर त्वचा से लोशन पोंछते द्वारा depilatory प्रतिक्रिया के पूरा होने की जाँच करें (चित्र 1) एक दस्ताने उंगली या एक पतली धातु spatula के साथ. प्रतिक्रिया पूरा हो गया है अगर त्वचा काले बालों की उपस्थिति के बिना गुलाबी है. यह जल्दी से जाँच करने के लिए सबसे अच्छा है कि बाल वास्तव में समय से पहले rinsing से पहले हटा दिया गया है और फिर लोशन फिर से लागू करने के लिए होने.
  3. Rinsing
    नोट: एक बार बालों को हटाने की प्रतिक्रिया के पूरा होने की पुष्टि की गई है, चल नल या deionized पानी के साथ माउस धोने depilatory लोशन को दूर करने और रासायनिक जलने को रोकने के लिए.
    1. बाएं दस्ताने हाथ पर माउस प्लेस और चारों ओर जाने से माउस को रोकने के लिए बाएं अंगूठे के साथ हथेली के खिलाफ पूंछ के आधार दबाएँ। माउस को काटने से रोकने के लिए बाकी बाईं उंगलियों को बंद और सीधा करें।
    2. माउस को रखें ताकि चेहरा/सिर क्षेत्र पानी की धारा से दूर हो और गुनगुने पानी की धारा सिर के पीछे और केवल पीठ पर गिर सकती है। जल्दी से लेकिन धीरे से लोशन दूर धोने के लिए सही दस्ताने हाथ से माउस के पीछे रगड़.
    3. एक बार माउस की त्वचा लोशन से मुक्त हो जाने के बाद, अधिकांश जल को अवशोषित करने के लिए माउस को कागज तौलिया से जल्दी से पोंछ लें (चित्र 1)।
  4. शेविंग और बालों को हटाने के बाद देखभाल
    1. जाँच करें और किसी भी अवशिष्ट depilatory लोशन है कि कान और पूंछ पर एक गीला कागज पोंछे के साथ रह सकते हैं साफ.
    2. माउस को अपने व्यक्तिगत पिंजरे में वापस रखें और पिंजरे को लगभग 30 मिनट के लिए एक हीटिंग पैड (40-45 डिग्री सेल्सियस) पर रखें। माउस सामान्य व्यवहार करने के लिए वापस जाना चाहिए, चारों ओर scurry, और खुद को कुछ ही मिनट के भीतर दूल्हे.
    3. प्रयोग की अवधि के दौरान एक अलग पिंजरे में प्रत्येक माउस घर. चूहों की त्वचा अब सुरक्षित नहीं है और आसानी से खरोंच और अन्य चूहों द्वारा काटा जा सकता है.
    4. चूंकि depilatory लोशन मामूली परेशान प्रभाव है कि के साथ हस्तक्षेप या घाव भरने की प्रक्रिया को बदल सकते हैं हो सकता है, सर्जरी से पहले 18-24 एच प्रतीक्षा माउस त्वचा शांत करने के लिए और माउस को अपनी पीठ पर बालों की कमी को समायोजित करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  5. डार्क पिगमेंटेशन के साथ त्वचा से बालों को हटाना
    नोट: कुछ db/db- /- चूहों संभवतः त्वचा है कि बाल वापस तेजी से बढ़ रहा है और इन पैच के बिना त्वचा की तुलना में मजबूत होगा में काले धब्बे होगा. (चित्र2) त्वचा के ये काले क्षेत्र मध्य देर से एनेजेन चरण बाल follicles और /
    1. यदि काले धब्बे देखा जाता है, तो फिर से depilatory लोशन लागू होते हैं, लेकिन केवल इन क्षेत्रों में, और दोहराने चरण 4.2 और 4.3(चित्र 2B, 2C).
      नोट: त्वचा के काले धब्बे प्रयोग की अवधि के दौरान तेजी से बाल विकसित होगा, तो बाल कम हर 3-5 दिन क्लिप, जब आवश्यक हो. घाव के वांछित स्थान से एक पैच या दो दूर स्वीकार्य है। यदि माउस के पीछे काफी इन अंधेरे पैच द्वारा कवर किया जाता है, पुरानी घाव मॉडल के लिए इस माउस का उपयोग न करें.

5. अभिकर्मक सेटअप

नोट: db/db-/- चूहों में पुराने घावों का विकास कैटालेस और ग्लूटाथिओन पेरोक्सिडेज, 3-एमिनो-1,2,4-ट्रायज़ोल (एटीजेड) और मर्केप्टोसुसिनिक एसिड (एमएसए) के लिए विशिष्ट अवरोधकों के साथ उपचार द्वारा पूरा किया जाता है। . निम्नलिखित प्रक्रिया खुराक और माउस के वजन के आधार पर analgesia और inhibitors के प्रशासन का विवरण.

  1. बाँझ पीबीएस में 0.05 मिलीग्राम/किलोग्राम माउस पर दर्द रिलीवर Buprenex इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन। सर्जरी से पहले लगभग 30 मिनट के लिए एक 60 ग्राम माउस के लिए 120 $L की मात्रा इंजेक्शन। सर्जरी के बाद एक और खुराक 6 एच प्रशासन। आवश्यकतानुसार एक अतिरिक्त खुराक दी जा सकती है।
  2. बाँझ पीबीएस में 1 ग्राम/ सर्जरी से पहले लगभग 20 मिनट के लिए एक 60 ग्राम माउस के लिए 480 $L की मात्रा इंजेक्शन। पेट के बाईं ओर और दाईं ओर दूसरी छमाही में आधे मात्रा को इंजेक्ट करें।
  3. पारदर्शी ड्रेसिंग और बाँझ पीबीएस में 150 मिलीग्राम/किलोग्राम माउस पर घाव के बीच घाव पर एमएसए को शीर्ष रूप से जमा करें। सर्जरी के बाद 10 मिनट के भीतर एक 60 ग्राम माउस के लिए 60 $L की मात्रा प्रशासन.

6. सर्जरी

नोट: पुरानी घाव मॉडल की सफलता गैर बाँझ शर्तों पर निर्भर करता है। इन चूहों रोगाणु मुक्त नहीं कर रहे हैं और एक पारंपरिक vivarium में रखे हैं. बैक्टीरिया microbiome है कि त्वचा में रहता है बाद में दीक्षा और एंटी ऑक्सीडेंट एंजाइमों के inhibitors के साथ उपचार पर पुराने घावों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, साइट की पारंपरिक पूर्व सर्जिकल तैयारी विपरीत संकेत दिया है।

  1. इंट्रापर्टोनियल इंजेक्शन
    1. पिंजरे रैक के slanted भाग पर माउस को सुरक्षित और माउस के शरीर की तुलना में कम सिर के साथ खड़े माउस के साथ पूंछ पकड़. यह सुनिश्चित करता है कि हम आंतरिक अंगों को दूर इंजेक्शन बिंदु से दूर ले जाने का प्रयास करें।
    2. मूत्राशय, या अन्य पेट के अंगों में इंजेक्शन से बचने के लिए पेट के निचले दाएँ वृत्त का चतुर्थ भाग में सुई डालें।
    3. इंजेक्शन से पहले सुई को प्रेरित करें।
  2. उपचार और संज्ञाहरण
    1. सर्जरी से पहले Buprenex 30 मिनट और एटीजेड 20 मिनट प्रशासन, के रूप में कदम 5.1 और 5.2 में वर्णित है.
    2. माउस को गर्म हीटिंग पैड के शीर्ष पर एक छोटे प्लास्टिक के कंटेनर में रखें जैसा कि चित्र 3 में लगभग 15-20 मिनट के लिए दिखाया गया है। प्रक्रिया से पहले गर्मी का समर्थन प्रदान करना संभावित मृत्यु दर से बचाता है।
    3. बेहतर गर्मी को नियंत्रित करने के लिए छोटे कंटेनर के शीर्ष पर एक कागज पोंछ या कागज तौलिया रखें। माउस शांत हो जाना चाहिए के रूप में यह warms. चित्र 3 बी सर्जरी के लिए आवश्यक सामग्री से पता चलता है।
    4. एक संलग्न कंटेनर है कि रासायनिक हुड में isoflurane vaporizer करने के लिए झुका है अगर एक खुली प्रणाली का उपयोग कर में माउस प्लेस.
    5. एक खुली प्रणाली में, 2-3.5 L/min. की प्रवाह दर पर 1-2 मिनट के लिए 5% isoflurane प्रशासन लगातार माउस की स्थिति की निगरानी.
      1. एक बार माउस बेहोश है या अब आगे बढ़ रहा है, एक सफेद शल्य पैड पर माउस जगह है और एक नाक शंकु है कि vaporizer के लिए सुरक्षित है सर्जरी के दौरान isoflurane के निरंतर प्रशासन की अनुमति के साथ सिर फिट.
    6. एक खुली प्रणाली में, सर्जरी के दौरान एक ही प्रवाह दर पर 2-3% आइसोफ्लुरेन प्रशासन और संज्ञाहरण की गहराई बनाए रखने के लिए आइसोलुरेन के प्रवाह को समायोजित करें।
    7. सर्जरी के दौरान प्रशासित इसोफ्लुरेन की एकाग्रता और अवधि दोनों को कम करें। डी बी/डीबी - /- चूहों संज्ञाहरण के लिए बहुत संवेदनशील हैं तो यह एक न्यूनतम करने के लिए isoflurane जोखिम रखने के लिए सबसे अच्छा है. यदि माउस अभी भी 5% isoflurane पर 2 मिनट के बाद उत्तरदायी है, नाक शंकु सुरक्षित और सर्जरी शुरू करने से पहले 15-30 एस के लिए 3-5% isoflurane प्रशासन.
      1. घाव से पहले उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। संज्ञाहरण की गहराई इस तरह के मजबूत शूरण चुटकी के रूप में शारीरिक उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रिया की कमी से पुष्टि की है। साँस संज्ञाहरण के तहत माउस के समय की लंबाई 5 मिनट के तहत है तो कोई पशु मरहम आंखों के लिए लागू किया जाता है.
  3. घायल
    1. 70% इथेनॉल या एक नैदानिक इथेनॉल तौलिया के साथ एक कागज पोंछ स्प्रे और घाव साइट के क्षेत्र को साफ करने के लिए माउस के पीछे पोंछ। त्वचा की सतह को साफ करें ताकि पारदर्शी ड्रेसिंग मजबूती से पालन कर सके, क्योंकि बिस्तर, भोजन या त्वचा से धूल ड्रेसिंग को ठीक से चिपके रहने से रोक सकती है(चित्र 4ए)। जरूरत से ज्यादा पोंछें नहीं, या त्वचा पर मौजूद बैक्टीरिया को मारने का खतरा होगा।
    2. घाव साइट की स्थिति निर्धारित करें। घाव प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छी जगह माउस के पृष्ठीय पक्ष पर है, केंद्रित और उच्च pigmentation के साथ त्वचा के पैच से दूर.
      नोट: हम अनुभव से निर्धारित किया है कि इन चूहों केवल एक घाव के बोझ का सामना कर सकते हैं.
    3. एक 7 मिमी त्वचा बायोप्सी पंच, चिमटी और शल्य कैंची का उपयोग कर 30-45 एस के भीतर एक घाव बनाएँ। निशा: बायोप्सी पंच को वांछित घाव स्थल पर हल्के से दबाएं और पंच को थोड़ा सा छाप छोड़ने के लए चारों ओर पंच को मोड़ो (चित्र 4ठ) चिमटी के साथ पंच के केंद्र को खींच कर और सर्जिकल कैंची के साथ रूपरेखा के साथ काटने द्वारा उल्लिखित त्वचा उत्पादित (चित्र 4C-4E)।
    4. पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग (6 सेमी x 3.5 सेमी) के टुकड़े के आधे के साथ घाव को मजबूती से कवर करें।
    5. माउस के लिए 2% isoflurane के प्रशासन बंद करो (चित्र 4) .

7. पोस्ट सर्जरी उपचार और वसूली

  1. सर्जरी के बाद एमएसए उपचार प्रशासन पूरा हो गया है और पारदर्शी ड्रेसिंग चरण 5.3 में वर्णित के रूप में लागू किया जाता है। ड्रेसिंग के तहत घाव क्षेत्र पर एमएसए जमा करें।
  2. वसूली के साथ मदद करने के लिए 30 मिनट के लिए हीटिंग पैड पर छोटे कंटेनर में माउस वापस रखें. एक बार माउस गर्म हो गया है, माउस अपने पिंजरे में वापस डाल दिया. isoflurane का प्रभाव अस्थायी है, और माउस के आसपास शीघ्र ही उसके बाद घूम रहा होना चाहिए.
  3. चूहों को उपेक्षित मत छोड़ें और न ही उन्हें जीवालय में वापस न करें जब तक कि चूहों को कठोर अवकम बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न हो जाए।
    नोट: पसंद की संज्ञाहरण जब इन चूहों के साथ काम कर रहा है isoflurane ठीक अपनी त्वरित प्रेरण और संज्ञाहरण से बाद में उद्भव के कारण है.
    1. घर चूहों कि व्यक्तिगत रूप से सर्जरी से आया है एक माउस दूसरे के पुराने घाव के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए. जैसा कि ऊपर कहा गया है, वे पूरी तरह से ठीक होने तक जीवंती में वापस नहीं आते हैं।
  4. सर्जरी के बाद Buprenex 6 एच की दूसरी खुराक प्रशासन.
  5. सर्जरी के बाद पहले 48 एच के लिए चूहों को ध्यान से देखें।
    नोट: सर्जरी, पुराने घाव बनाने के लिए inhibitors के साथ युग्मित, पहले से ही मधुमेह और मोटापे से ग्रस्त है कि जानवर पर बहुत तनावपूर्ण है. चूहे कि सर्जरी के बाद पहले दो दिनों के जीवित आम तौर पर प्रयोग की अवधि बच जाएगा.

8. डेटा संग्रह, जीवन रक्षा रणनीतियाँ, घायल होने के बाद चूहे हैंडलिंग, और अतिरिक्त युक्तियाँ

  1. डेटा संग्रह
    1. सर्जरी के तुरंत बाद के रूप में जल्दी के रूप में तस्वीरें ले लो। Biofilms घायल होने के बाद 5-10 दिनों के बीच कहीं भी देखा जाता है, और के रूप में जल्दी के रूप में 3 दिन.
    2. यदि बैक्टीरिया विश्लेषण का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, 10-15 एस के लिए घाव के आसपास प्रकाश दबाव के साथ एक बाँझ स्वैप रोल झाड़ू, संस्कृति के लिए किसी भी मीडिया के बिना culturing या सूखी के लिए एक उपयुक्त फ्रीजर मीडिया में, -80 डिग्री सेल्सियस पर. एक बाँझ धातु spatula के माध्यम से extracellular बहुलक पदार्थों को एक microcentrifuge ट्यूब में ले लीजिए और विश्लेषण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    3. biofilm संग्रह या चित्र लेने के लिए हैंडलिंग के दौरान माउस को संज्ञाहरण प्रशासन नहीं है. इन प्रक्रियाओं के दौरान, माउस को शांत करने और इसे चलने से रोकने के लिए माउस के सामने भोजन का एक टुकड़ा रखें। अधिकांश चूहों भोजन के शीर्ष पर चढ़ जाएगा, उस पर बैठते हैं, और नहीं ले जाएँ.
  2. माध्यमिक संक्रमण और अवांछित पुराने घाव या अल्सर के रूप में विकसित कर सकते हैं अगर माउस ठीक से नहीं चल रहा है या अगर ड्रेसिंग सही ढंग से लागू नहीं किया जाता है, समय-समय पर माउस की गतिविधि और घावों के लिए अधर पक्ष की जांच करें। त्वचा और गीला बिस्तर के बीच घर्षण(db/db-/- चूहों polyuric हैं) त्वचा को परेशान कर सकते हैं अगर पिंजरों अक्सर नहीं बदल रहे हैं.
    नोट: ड्रेसिंग के तहत द्रव buildup चिपकने वाला अपनी चिपचिपापन खोने के लिए और तरल पदार्थ लीक करने के लिए अनुमति देने के लिए पैदा कर सकता है. मृत त्वचा कोशिका, बिस्तर, और मल पदार्थ तो त्वचा पर छड़ी और कठोर कर सकते हैं. इन सूखे पैच और त्वचा पर समुच्चय एक माध्यमिक संक्रमण को रोकने के लिए तुरंत मंजूरी दे दी जानी चाहिए.
  3. यदि चूहे खड़े हैं या अपने पिछले पैरों पर बैठते हैं, तो इन चूहों को पिंजरे में ले जाएं जहां भोजन और पानी तक पहुंच बहुत कम है। यदि पिंजरे में भोजन और पानी की स्थिति अधिक है, तो माउस खड़े हो सकते हैं या उस तक पहुंचने के लिए अपने पिछले पैरों पर बैठ सकते हैं। अधिकांश चूहों एक समस्या खाने और पीने अगर वे सर्जरी से पहले ऐसा कर सकता है नहीं होगा, हालांकि वहाँ एक संभावना है कि कुछ चूहों पर उनकी पीठ पर फ्लिप हो सकता है. इन "flippers" बहुत कठिनाई पर मोड़ तो वे सहायता और आगे की निगरानी की आवश्यकता होगी हो सकता है.
  4. 20 दिनों के लिए त्वचा पर पारदर्शी ड्रेसिंग छोड़ दो अगर त्वचा मलबे, परतदार त्वचा और बालों से स्पष्ट है. यदि इनमें से कोई भी त्वचा पर होता है, तो पुराने ड्रेसिंग को हटा दें और एक नया टुकड़ा लागू करें।
    1. ड्रेसिंग उतारने के लिए, हल्के से सीधे सिर के पीछे त्वचा चुटकी, तो एक चिकनी गति में सिर से दूर ड्रेसिंग खींच.
    2. सुरक्षित रूप से ड्रेसिंग का एक टुकड़ा जगह है, माउस के रूप में अभी भी संभव के रूप में रहना है. यह महत्वपूर्ण है कि त्वचा साफ है और परतदार मृत त्वचा कोशिकाओं से मुक्त है, बिस्तर से धूल, और भोजन के टुकड़े. जगह है और फिर सुरक्षित करने के लिए घाव के आसपास त्वचा में ड्रेसिंग दबाएँ.
    3. यदि माउस के सामने भोजन का एक टुकड़ा रखने से इसकी गतिविधियों को सीमित नहीं होता है, तो माउस को तार पिंजरे के शीर्ष पर रखें। एक बार माउस पिंजरे पर एक रेल पकड़ लिया है, संभव के रूप में शरीर के करीब के रूप में पूंछ पकड़ और कम से कम बल के साथ खींच. के रूप में माउस आगे खींचती है वापस खिंचाव और आसान आवेदन के लिए सीधा होगा; इस बिंदु पर सुरक्षित रूप से ड्रेसिंग जगह है.
    4. कभी एक पुराने ड्रेसिंग फिर से उपयोग करें. हमेशा सबसे बड़ी आसंजन के लिए पीठ के लिए नए ड्रेसिंग लागू होते हैं।

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Representative Results

चित्र 5 में घाव बंद करने की ओर प्रगति करने वाले अवरोधकों के उपचार के बिना घाव का एक उदाहरण दर्शाया गया है और अवरोधकों के उपचार के साथ एक घाव पुरानी ताने की ओर प्रगति कर रहा है। पारदर्शी ड्रेसिंग पुरानी घाव पर जगह में छोड़ दिया गया है ताकि biofilm और तरल पदार्थ संचय देखा जा सकता है.

क्रोनिक घाव दीक्षा कम से कम 6 घंटे में जगह लेता है और घाव मार्जिन स्पष्ट रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव से बदल जाता है। इस घाव मार्जिन के ऊतकीय सबूत से पता चलता है कि ऊतक नेक्रोटिक है और घाव भरने में भाग नहीं लेगा। घाव में बायोफिल्म बनाने वाले बैक्टीरिया बाद में इस नेक्रोटिक ऊतक का उपयोग पोषक तत्वों और संरचनात्मक घटकों के स्रोत के रूप में बायोफिल्म का उत्पादन करने के लिए कर सकते हैं। एक पुरानी घाव एक घाव है जो खुला रहता है, प्रारंभिक घाव की तुलना में बढ़ा हुआ है, इसमें बायोफिल्म (ईपीएस प्लस रोगजनक जीवाणु मानव पुराने घावों में पाया जाता है) होता है और बायोफिल्म की मात्रा और सामग्री के आधार पर ठीक होने में महीने या साल लगते हैं जो रोकता है सामान्य रूप से हल करने से घाव. पुराने घाव मॉडल में, पूर्ण पुरानीता सर्जरी के बाद 20 दिनों के लिए सेट है क्योंकि घाव inhibitors के साथ इलाज नहीं इस समय तक बंद हो जाएगा (चित्र 5) . हीलिंग आम तौर पर लेता है और 60 दिन और समय घाव में मौजूद प्राथमिक रोगजनक बैक्टीरिया पर निर्भर करता है। कभी-कभी चूहे संक्रमण का शिकार हो सकते हैं जब अधिक आक्रामक बायोफिल्म बनाने वाले बैक्टीरिया, जैसे कि Peudomonas,घाव में प्रबल होते हैं। इस प्रकार, एक पुरानी घाव को एक घाव के रूप में परिभाषित किया जाता है जो 20 दिनों के भीतर बंद नहीं होगा, ठीक होने में 60 से अधिक दिन लगते हैं, और घाव पर बायोफिल्म मौजूद है।

सेक्स मतभेद विभिन्न मधुमेह मॉडल में पाया गया है, db/db-/- माउस मॉडल32,33सहित. हालांकि इस तरह के मतभेद मौजूद हैं, हम सेक्स पुराने घावों के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक नहीं होना देखा है. पुरुष और मादा चूहों में पुराने घाव एक समान हद तक विकसित होते हैं, इसलिए दोनों लिंगों का उपयोग पुराने घावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, इस मॉडल का उपयोग फायदेमंद है क्योंकि मानव क्रोनिक घाव दोनों पुरुष और महिला मधुमेह के रोगियों पर पाया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1 . शेविंग और depilatory प्रक्रिया. () शेविंग से पहले माउस. (बी) माउस की त्वचा पीठ पर बाल के अधिकांश हटाने के लिए मुंडा है. (सी) एक उंगली की नोक पर depilatory लोशन की एक गुड़िया. अधिक माउस बड़ा है, तो प्रयोग किया जाता है। (घ)माउस के पीछे depilatory लोशन के साथ कवर किया जाता है और प्रतिक्रिया करने के लिए छोड़ दिया है. () एक स्पैचुला का उपयोग कुछ लोशन को खत्म करने के लिए किया जाता है ताकि यह देखा जा सके कि बालों को हटा दिया गया है या नहीं। बालों की किसी भी उपस्थिति के बिना उज्ज्वल गुलाबी त्वचा संकेत है कि बालों को हटाने पूरा हो गया है. (च)पीठ पर लोशन बहते पानी से हटा दिया जाता है। माउस की त्वचा थोड़ी गुलाबी होनी चाहिए। यह आंकड़ा किम और मार्टिन्स-ग्रीन31से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . अंधेरे त्वचा के छोटे पैच से बाल निकालना. () माउस पहले से ही एक बार इलाज किया गया है और त्वचा फिर से गीला है जलने को रोकने के लिए. (बी) डिपिलेटरी लोशन केवल त्वचा के पैच पर लागू किया जाता है जो अंधेरा होता है और घने बाल होते हैं। (सी) लोशन बालों के बिना त्वचा के काले पैच प्रकट करने के लिए प्रतिक्रिया के बाद धोया जाता है। यह आंकड़ा किम और मार्टिन्स-ग्रीन31से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . पूर्व सर्जरी की स्थापना की. (ए) जिन चूहों को घायल किया जाना है, वे छोटे प्लास्टिक के कंटेनरों में हीटिंग पैड के ऊपर रखे जाते हैं। (ख) शल्य चिकित्सा में प्रयुक्त कुछ सामग्रियों को दर्शाया गया है। सर्जिकल कैंची को यह सुनिश्चित करने के लिए तेज होने की आवश्यकता है कि कटौती करने पर त्वचा कुचल नहीं है। पारदर्शी ड्रेसिंग आधे में कटौती की है। यह आंकड़ा किम और मार्टिन्स-ग्रीन31से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . चीरा घाव बनाना. ()के बाद माउस संज्ञाहरण के तहत है, माउस के पीछे 70% इथेनॉल के साथ एक बार साफ है. (बी) त्वचा बायोप्सी पंच माउस के पीछे रखा गया है और एक छाप छोड़ने के लिए काफी मुश्किल दबाया. बायोप्सी पंच एक उथले चीरा बनाने के लिए घुमाया जा सकता है। (सी) उल्लिखित क्षेत्र के मध्य में चने की आवाज से चुटकी ली जाती है और प्रारंभिक चीरा बनाने के लिए तेज शल्य कैंची का प्रयोग किया जाता है। (डी)बायोप्सी पंच द्वारा बनाई गई रूपरेखा को काटने के लिए शल्य कैंची को पैंतरेबाज़ी किया जाता है। () बायोप्सी पंप द्वारा उल्लिखित त्वचा का एक क्षेत्र सफलतापूर्वक एक्साइज किया जाता है। (च)पारदर्शी ड्रेसिंग माउस के पीछे स्थित है और सुरक्षित है। यह आंकड़ा किम और मार्टिन्स-ग्रीन31से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . घावों के चित्र. (ए) सर्जरी के बाद लगातार समय पर चूहे पर घाव के रूप में यह सर्जरी के दिन से शुरू होने वाले इतिहास में प्रगति करता है। Biofilm के रूप में 5 दिन के रूप में जल्दी देखा जा सकता है और 3 दिन के रूप में जल्दी का पता चला. घाव 20 दिन पर मजबूत biofilm के साथ पूरी तरह से पुरानी है. (बी)मानव पुराने घावों के उदाहरण, विशेष रूप से मधुमेह पैर अल्सर. यह आंकड़ा किम और मार्टिन्स-ग्रीन31से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक बार चूहों पर पुराने घाव बनाए जाते हैं, मॉडल का उपयोग पुरानी ताने की शुरुआत में शामिल बिगड़ा घाव भरने की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। मॉडल भी रसायनों और दवाओं है कि पुरानी घाव विकास और बिगड़ा चिकित्सा रिवर्स और घाव बंद करने और उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की एक विस्तृत श्रृंखला की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पुरानी ताने की शुरुआत के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं का अध्ययन किया जा सकता है: उदाहरण के लिए, पुरानी ताने की शुरुआत और 20 दिनों के लिए और पूरी ताकत पुराने घावों के लिए घायल होने के बाद 1-5 दिन।

पुरानी घाव मॉडल भी घाव भरने और इस तरह के bioburden और cachexia के रूप में जटिलताओं के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। Bioburden सिर्फ पुराने घावों के कई पहलुओं में से एक है कि इस मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है, क्योंकि यह भी मानव पुराने घावों को प्रभावित करता है. हमारी प्रक्रियाओं और पशु उपयोग प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से एक परिभाषित निगरानी अनुसूची के साथ, निगरानी के लिए लक्षण विज्ञान की पहचान. आई ए सी सी यू अनुमोदित मानदंडों के आधार पर रुग्ण के रूप में पहचाने गए पशुओं को महत्वपूर्ण पीड़ा से बचने के लिए इच्छामृत्यु दी जाती है। इसके अलावा, कैम्पस पशु चिकित्सक और पशु स्वास्थ्य तकनीशियन से परामर्श किया जाता है जब कुछ लक्षण उत्पन्न होते हैं और मानदंडों के मूल्यांकन में सहायक मार्गदर्शन प्रदान करते हैं।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम एक पारंपरिक vivarium में db/db-/- चूहों आवास शामिल हैं, depilatory लोशन के साथ बाल हटाने, और isoflurane प्रशासन से पहले हीटिंग. पुरानी घाव मॉडल में पुराने घावों का विकास गैर बाँझ शर्तों और प्रथाओं पर निर्भर करता है। ये चूहे रोगाणु मुक्त नहीं होते हैं और बहुत साफ जीवालयों में विकसित नहीं होते हैं। माइक्रोफ्लोरा जो त्वचा में रहता है, एंटी ऑक्सीडेंट एंजाइमों के लिए अवरोधकों के साथ उपचार पर बाद में दीक्षा और पुराने घावों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। ये db/db-/- चूहों एक वातावरण है कि बैक्टीरिया होते हैं के संपर्क में होना चाहिए, दोनों commensal और रोगजनक. यदि त्वचा को साफ किया जाता है और सर्जरी से पहले आयोडीन या अन्य एंटीसेप्टिक तरीकों से संक्रमित किया जाता है ताकि त्वचा को "स्टरलाइज़" किया जा सके, तो घाव पुरानी नहीं हो सकता है। त्वचा microbiome में बैक्टीरिया के गठन और biofilm के विकास के लिए आवश्यक हैं, और देरी उपचार और घाव बंद. क्लिनिक में, एक घाव में बायोफिल्म की उपस्थिति घाव भरने की प्रक्रियाको और जटिल हो जाती है और घाव में संक्रमण को नियंत्रित नहीं होने पर मनुष्यों में विच्छेदन का खतरा बढ़ जाता है।

depilatory लोशन के साथ बालों को हटाना अतिरिक्त बालों को हटाने और पारदर्शी ड्रेसिंग मजबूती से पालन करने के लिए एक चिकनी और साफ सतह की अनुमति देने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया depilatory लोशन जलने को कम करने के लिए जोड़ा मुसब्बर के साथ एक रासायनिक depilatory है. इस उत्पाद को त्वचा की आकृति विज्ञान बदलने के साथ ही त्वचा microbiome संरक्षण में कम से कम है. सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध उत्पाद अन्य बाल हटाने के उत्पादों पर सिफारिश की है, शारीरिक और यांत्रिक depilatories सहित (waxes और वाणिज्यिक epilators) कि आगे जला और त्वचा पर tug कर सकते हैं और / हालांकि इस रासायनिक depilatory शारीरिक रूप से कोमल है, यह अभी भी त्वचा थोड़ा परेशान कर सकते हैं, एक प्रभाव है कि घाव भरने की प्रक्रिया को बदल सकता है. इस प्रकार, यह सर्जरी से पहले 18-24 घंटे इंतजार करने के लिए त्वचा प्रक्रिया से उबरने और यह सुनिश्चित करने के लिए त्वचा और घाव से प्रभावित नहीं कर रहे हैं अनुमति देने के लिए सबसे प्रभावी है.

इन चूहों अत्यंत विनम्र और तनाव के लिए गैर-प्रतिक्रियाशील हैं. वे संज्ञाहरण के बिना संभाल करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं। वे काफी शांत करने के लिए एक हथेली पर या दूर चल के बिना एक बेंच के शीर्ष पर जगह है. यदि माउस की पूंछ का आधार अंगूठे और दूसरी उंगली के साथ सुरक्षित है, माउस दूर चलाने के लिए या उनके बड़े पेट के आकार के कारण काटने के लिए वापस बारी करने में सक्षम नहीं होगा. महत्वपूर्ण बात, हमारे अनुभव में, इन चूहों संज्ञाहरण के लिए बेहद संवेदनशील हैं, खासकर के रूप में यह homeostasis के नुकसान से संबंधित है. इस प्रकार, हमारे IACUC के साथ परामर्श में, यह निर्धारित किया गया था कि बेहतर विकल्प संवेदनाहारी प्रशासन को सीमित करने के लिए है.

इस मॉडल का मुख्य उद्देश्य अपनी पीठ पर एक बड़ी unhealing घाव बनाने के लिए है, तो एक बार एक घाव बना दिया है, एक माउस पारंपरिक रूप से पकड़ अतिरिक्त buprenex या अन्य रासायनिक उपचार के आईपी इंजेक्शन समय समय पर असंभव है. पृष्ठीय त्वचा द्वारा माउस पकड़े माउस असुविधा का एक बहुत का कारण बनता है और काफी संभवतः दर्द अगर माउस इस तरह के एक पारंपरिक तरीके से आयोजित किया जाता है; इस प्रकार, माउस के साथ सभी इंजेक्शन सही पक्ष ऊपर है, जबकि यह सभी चार पैरों पर खड़ा है. अन्य प्रयोगों का उपयोग db/db-/- तनाव इन चूहों का उपयोग करें जब वे छोटे हैं और के रूप में ज्यादा वजन नहीं है, इसलिए एक आईपी इंजेक्शन प्रदर्शन के पारंपरिक तरीके का इस्तेमाल किया जा सकता है. चूंकि पुरानी घाव मॉडल चूहों को 6 महीने की उम्र तक इस्तेमाल करता है और इन चूहों को 80 ग्राम तक वजन कर सकते हैं, पारंपरिक विधि इष्टतम नहीं है और संभवतः माउस को चोट पहुंचा सकती है। हम एक माउस इस मोटापे से ग्रस्त के लिए ऊपर वर्णित विधि का उपयोग किया है और किसी भी प्रतिकूल परिणाम नहीं मनाया है जब सफल आकांक्षा के साथ इस विधि के साथ इंजेक्शन.

पहले, केटामाइन और जाइलज़ीन जैसे इंजेक्शन संज्ञाहरण का उपयोग किया गया था; हालांकि, वे db/db-/- चूहों के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल साबित हुआ। कम से कम 5 मिनट की कुल आपरेशन समय के साथ, लंबे प्रेरण और वसूली समय प्रयोग के प्रयोजनों के लिए आवश्यक नहीं था. Isoflurane आसान प्रशासन और अनुमापन, तेजी से शुरुआत और वसूली, और पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई के कारण इस प्रक्रिया के लिए संज्ञाहरण का बेहतर विकल्प होने के लिए निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, isoflurane कम से कम हृदय अवसाद का कारण बनता है और बीपी बहुत अच्छी तरह से बनाए रखताहै 34. इसलिए, पुरानी घाव मॉडल के लिए प्रक्रिया में एक बड़ा परिवर्तन पसंदीदा संज्ञाहरण के रूप में आइसोफ्लुरेन का उपयोग करना था।

सर्जरी से पहले हीटिंग सर्जरी के बाद 2-3 दिनों में मृत्यु को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इन चूहों काफी कम कोर शरीर का तापमान35 है और उनके आनुवंशिक हेरफेर के कारण प्रभावी ढंग से अपने मुख्य शरीर के तापमान को नियंत्रित करने में सक्षम नहीं हैं, इसलिए एक बाहरी हीटिंग स्रोत सर्जरी के खिलाफ की रक्षा करने से पहले प्रदान की जाती है संज्ञाहरण द्वारा प्रेरित कोर शरीर के तापमान में अतिरिक्त गिरावट। हम पहले एक हीटिंग पैड के लिए की जरूरत का आकलन किया है, के दौरान, और सर्जरी के बाद. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि db/db-/- चूहों असामान्य शारीरिक प्रतिक्रियाओं है. अनुभवजन्य रूप से, हमने पाया है कि इन चूहों को पूर्व और बाद के सर्जिकल गर्मी समर्थन के साथ सबसे प्रभावी ढंग से संरक्षित किया जा सकता है। संवेदनाहारी के रूप में isoflurane प्रतिस्थापन करके, हम मापा और निर्धारित किया है कि कोर शरीर का तापमान सर्जरी के कम से कम पांच मिनट के दौरान काफी गिरावट नहीं थी. जबकि हम इन चूहों के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए पूर्व और बाद शल्य चिकित्सा गर्मी समर्थन मिल गया है, हम शल्य गर्मी का समर्थन करने के लिए एक प्रभाव नहीं मिला है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि IACUC अध्यक्ष मार्गदर्शन प्रदान की और हमारे तापमान और संवेदनाहारी प्रभाव से संबंधित परीक्षणों की निगरानी की. जैसा कि हम इस विधि संवाद कर रहे हैं, हम यह इंगित करने के लिए क्या प्रक्रिया की सफलता के लिए आवश्यक है महत्वपूर्ण लगता है.

बायोफिल्म विकास का अध्ययन करने के लिए इस विधि का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि घाव पर मौजूद बैक्टीरिया और बायोफिल्म का निर्माण नियंत्रित नहीं किया जाता है। यदि एक विशिष्ट biofilm बनाने जीवाणु का अध्ययन किया जाना है, इस मॉडल उपयोगी हो सकता है अगर देशी microbiome या तो आयोडीन या अन्य एंटीसेप्टिक तरीकों के माध्यम से घाव से पहले समाप्त कर दिया जा सकता है. ऑक्सीडेटिव तनाव के अत्यधिक स्तर के जवाब में, त्वचा microbiome में प्रमुख रोगजनक बैक्टीरिया biofilm गठन आरंभ करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. हमारे पुराने घावों में, बायोफिल्म बनाने वाले बैक्टीरिया में शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं, Peudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloae37, 38 , 39, और विभिन्न स्टैफिलोकोकस40,41 और कोरिनेबैक्टीरियम प्रजाति41,42,43,44, 45, जिनमें से सभी मानव पुराने घावों में पाया जा सकता है. बैक्टीरिया39, 40,41,43,44,45 के लिए मानव पुराने घावों पर कई पुराने घाव microbiome अध्ययन किया गया है , और कवक46,47 समुदाय , गरीब चिकित्सा48,49के साथ जुड़े अनुदैर्घ्य सर्वेक्षण सहित . इस प्रकृति के दीर्घकालिक अध्ययन भी पुरानी घाव मॉडल के साथ के माध्यम से पीछा किया जा सकता है.

यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न परिणाम विवेरिया स्थितियों, आपूर्ति, और उपकरण, विक्रेताओं, और स्रोत कालोनियों में डीबी/डी बी-/- चूहों के लिए अंतर के कारण प्राप्त किए जा सकते हैं। इस तरह के मतभेदों को कम करने के लिए, प्रोटोकॉल में प्रदान की सटीक चूहों विविधता और स्रोत है कि पुरानी घाव प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है. इन चूहों के पालन के लिए, सटीक बिस्तर और खाद्य ब्रांडों सामग्री की तालिका में उपलब्ध कराया गया है परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए. हमारे प्रयोगों में, हम पाते हैं कि उच्च ऑक्सीडेटिव तनाव आवश्यक है और इन चूहों में पुराने घाव बनाने के लिए पर्याप्त है, जब तक चूहों एक पारंपरिक vivarium में रखे और बैक्टीरिया के संपर्क में हैं. बैक्टीरिया आबादी और समुदायों vivaria के साथ अलग हो सकता है; हालांकि, जब तक एक रोगाणु मुक्त सुविधा चूहों घर के लिए उपयोग नहीं किया जाता है, वे पर्याप्त बैक्टीरिया होना चाहिए, दोनों commensal और रोगजनक, बालों और त्वचा पर रहते हैं.

इस प्रोटोकॉल में पुरानी घाव बनाने की यह विधि पुरानी घावों और बिगड़ा घाव भरने का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि केवल ऑक्सीडेटिव तनाव का स्तर काफी प्रयोगात्मक रूप से बदल जाता है। सामान्य घाव भरने की प्रक्रिया2के लिए ऑक्सीडेटिव तनाव आवश्यक है। यह समय पर विनियमन और घाव भरने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की कार्यक्षमता में एक महत्वपूर्ण घटक के लिए महत्वपूर्णहै 5. हालांकि, जब ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर को नियंत्रित नहीं कर रहे हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों endothelia कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है, केराटिनसाइट कार्यक्षमता को बाधित, और देरी घाव बंद2,5. मानव काल के घावों में ऑक्सीडेटिव तनाव का उच्च स्तरहोता है . माउस मॉडल उच्च रक्त ग्लूकोज है और पहले से ही अपनी रुग्णता के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर में वृद्धि हुई है. इन विशेषताओं को मधुमेह के साथ रहने वाले मनुष्यों के साथ साझा किया जाता है और50चोट को बनाए रखने के बाद इतिहास के लिए एक सूक्ष्म पर्यावरण प्रदान किया जाता है . मनुष्य भी शरीर पर कई स्थानों में विविध और जटिल microbiota मेजबान, त्वचा सहित, तो एक जटिल है, लेकिन प्राकृतिक, microbiome माउस की त्वचा पर विकसित करने की अनुमति दी है.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों की कोई अभिस्वीकृति नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

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References

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