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생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

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Developmental Biology

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Summary

이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.

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Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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Abstract

인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 분 비 decidua에 구와 같은 모습에서의 분화는 어머니 자 궁의 자 궁 내벽에 배아 이식에 필요한 변환입니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 성공적인 출생의 속도 향상에 유리 하다. Vivo에서 기반 인공 decidualization의 연구는 종종 동물 모델에서 변환 합병증 뿐 아니라 인간의 연구와 관련 된 윤리적 딜레마 때문 제한 됩니다. 결과적으로, 기본 세포 배양을 통해 분석 실험 체 외에 호르몬을 통해 decidualization의 변조를 탐험 자주 활용 됩니다. 이 연구는 HESC 고립과 자란 보통 호르몬의 보충을 통해 후속 인공 decidualization에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 연구 하면 잘 설계 된 최저에 관심사의 어떤 유전자 지질 기반 siRNA transfections를 활용 하 여 있습니다. 이 프로토콜 허용 기본 decidualization, 및의 후속 정량화 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 신뢰할 수 있는 방법으로이 모델을 활용 하는 능력을 극대화 함으로써 제품의 수율 뿐 아니라 문화 순도의 최적화 decidualized 자궁내 막 기질 세포에 의해 분 비 대리인입니다.

Introduction

Menarche의 단계와 폐 경, 생식 연령의 여성 호르몬 규제 자궁내 막 증식, 차별화, 임신 생리1 이라는 프로세스에 대 한 준비에 후속 흘리기의 월별 주기 받아야 ,2. 인간의 endometrium의 실제 수정 등은 자 궁 벽1에 적절 한 배아 이식 필요 합니다. 난소 스테로이드 호르몬 에스트로겐과 황 체 호르몬 (P4)를 통해 생리 주기 변경 endometrium, 형태학 및 생화학 적인 적응을 포함 하 여의 중재는3,,45. 증식 (follicular) 단계 내 preovulatory 에스트로겐 수준의 증가, endometrium 두껍게 시작. 배 란, 다음 분 비 (또는 luteal) 단계 반올림, 상피 같은 decidual 셀 구와 같은 모습에서 자궁내 막 기질 세포 (ESC)의 형태학 상 변화를 유도 하는 P4 농도에 상당한 증가 촉진 decidualization4,6로 알려진 프로세스. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산4,,78에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 진단과 초기 임신 손실의 처리에 유리 하다.

현재, 자궁내 막 기질 세포에서 decidualization의 기본 효과 탐험 여러 방법론 활용 됩니다. Vivo에서, 마우스 궁 기계적 자극 (즉,긁 적)를 통해 decidualization에 대 한 인위적으로 유도 될 수 있다 또는 기름9hormonally 끝났다 자 궁 주입. 다른 인간,이 합성 자극 blastocyst 존재, 설치류10,11decidualization의 개시에 필요한 단계의 모양을 제공 하 여 자 궁 루멘의 분화를 촉진 합니다. 따라서, 동물 모델 및 인간에서 vivo에서 기반 연구를 둘러싼 윤리적 딜레마와 관련 된 변환 합병증으로 인해 decidualization 기반 모델은 가장 성공적으로 공부 생체 외에서.

이 연구에서 과목 두 지역 영어와 스페인어 신문에서 광고의 배치를 통해 채용 됩니다. 과목이이 연구에 대 한 적합 한 후보자로 식별 되는 가져온 연구 코디 네이 터, 잠재적인 위험의 전체 공개 토론 된다와 나. 관련 된 잠재적인 위험에 대 한 완전 한 이해의 확인, 과목의 동의 서 면과 구두 모양에서 달성 했다. 주제 동의 (1) 받을 미래 연구 목적을 위해 그들의 조직의 정 (2) 장기 저장 (3) 수집 된 조직 표본에서의 기본 문화 창조에 동의 하는 권한이 포함 됩니다. 동의 다음 과목 인종/민족성의 비공개에 대 한 권리는 허용 된 자가 식별에 완료 하는 폼을 받는다. 후속 방문 endometrium 생의 생리 주기에 따라 달성 예정 이다. 이 연구에 모집 하는 자원 봉사자로 2012 인구에 의해 문서화 세인트 루이스 수도권의 민족과 인종 인구를 반영 하 고 임산부, 태아, 태아를 포함 하 여 모든 취약 한 주민들의 참여를 포함 하지 않았다 나이, 또는 다른 취약 한 그룹의 18 세 미만 어린이. 생 검 샘플 컬렉션에 참여 하기 위한 자격 요건 포함 (1) 일반 생리 주기 (25-32 일) (3) 현재 임신 이나 호르몬 자궁내 장치 피임약의 사용 하는 데는 데 18-45 년 (2)의 나가 사이 되 고 현재 질 감염이 나 성병 (5) 없는 현재 항생제 치료와 (6) 등록 (4) 전 30 일에 대 한 없음 현재 비정상적인 경부 데.

이 연구에서 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 배양 하 (estradiol (e 2), medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 순환 아데노신 호르몬의 보충을 통해 생체 외에서 decidualization을 인위적으로 유발 monophosphate (캠프)) 매체에. 이 방법에서는, decidualization의 정도 호르몬 치료의 일의 총 수에 따라 변경 됩니다. Cytoskeletal 재배치와 함께, 호르몬 보충 decidual 세포 분 비 같은 자질2,4를 경험 하는 생 화 확 적인 적응을 유도 합니다. Prolactin (PRL)와 인슐린 같은 성장 인자 의무적인 단백질 1 (IGFBP1), 같은 각 인 유전자의 표정은 확인 하 고 계량 HESC decidualization5,12, 의 정도를 이용 될 수 있다 13 , 14. 중요 한 것은,이 프로토콜을 유전자 특정 최저 생존도 시연 했다.

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Protocol

세인트 루이스, 산부인과 학과에서 워싱턴 대학에서이 연구를 위해 수집 하는 모든 인간의 endometrium biopsies 달성 했다 고 부인과 기관 검토 위원회 (IRB)를 사용 하 여 서 면된 동의서를 승인.

1입니다. 준비

  1. 100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 미디어 포함 병 (HBSS + 매체 추가 참조)에 추가 하 여 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 500 mL를 준비 합니다.
  2. Dulbecco의 수정이 글 중간의 500 mL를 준비: 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (최종 농도 추가 하 여 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F12) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 그리고 0.25 µ g/mL Fungizone) 병 (HESC 절연 매체로 참조 추가)를 포함 하는 미디어를.
  3. 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 x 나2HCO3및 1%를 추가 하 여 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM HEPES DMEM/F12의 500 mL를 준비 페니실린 (10000 U/mL)와 스 (10000 µ g/mL) (펜 Strep) 미디어 (추가 병 포함 HESC 미디어로 참조).
  4. 2%의 감소 혈 청 L-글루타민, 2.4 g/L 나트륨 중 탄산염와 HEPES 500 mL를 준비 숯 박탈 태아 둔감 한 혈 청 (csFBS)와 1% 펜 Strep 병 (Decidualization 미디어 추가 참조)를 포함 하는 미디어.
  5. 페 놀 레드 숯불 2%를 추가 하 여 무료 DMEM/F12 (더 변경 미디어 참조) 병을 포함 하는 미디어에 소 태아 혈 청 (csFBS) 박탈의 500 mL를 준비 합니다.
  6. 10 nM estradiol (e 2), 1 µ M medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 15 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브, 50 µ M 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 준비 하 고 이전 준비 decidualization 미디어 생체 외에서 의 잘 약 수 당 2 mL에 추가 decidualization 분석 결과 (EPC 미디어 추가 참조).
  7. 50 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브 (고정 미디어 추가 참조)에서 90 %FBS 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 미디어를 동결을 준비 합니다.
  8. 전 콜라와 DNase의 5 mg 25 밀리 그램 무게 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에-20 ° c.에 게 나

2. 인간의 Endometrium 생 검 획득

  1. HBSS에 IRB 승인 클리닉에서 생리 주기의 증식 단계 (하루 9-12 일)에서 수집 된 인간의 endometrium 생 샘플을 가져옵니다.
  2. Prewarmed 37 ° C HBSS + 매체 1 mL와 함께 생 검 견본을 세척 하 고 부드럽게 흔들어 과잉 혈액을 제거 하 고 점액.

3. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC)의 절연

참고:이 격리 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. 포함 된 10 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 관으로 소독된 겸 자 생 검 전송 신선한 HBSS.
  2. 90 x 500g에 실 온에서 생 검 원심 s.
    1. 셀 펠 릿 파열 90 2000 x g에 생을 다시 회전 경우 s.
  3. 1 mL를 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 37 ° C의 10 mL로 씻어 HESC 격리 미디어 500 x 90 g에서 원심 분리 뒤 prewarmed s.
  4. 1 mL 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 적극적으로 생 검 꺼내 려 신선한 HESC 격리 미디어의 3 mL를 추가 합니다.
  5. HESC 격리 미디어의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 생 검을 가만히 따르다.
  6. 약 20 분 동안 #5 집게와 좋은 스트레이트 스티치가 위를 사용 하 여 가능한 작은 조각으로로 생을 말하다.
  7. DNase 준비 나 하 고 미리 무게 DNase를 HESC 격리 미디어의 10 mL를 추가 하 여 콜라 효소 나 (0.5 mg/mL)와 콜라 (2.5 mg/mL). 피펫으로 믹스.
  8. 피 펫 1 mL를 피펫으로 새로운 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브로 사용 하 여 조직 샘플을 잘라. HESC 격리 미디어의 7 mL로 세척 하 고 전체 샘플 얻으려고 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가.
  9. 2 분에 대 한 원심 분리기 샘플 800 x g에 실 온에서 부드럽게 피 펫은 상쾌한을 제거 합니다.
  10. 어 0.2 µ m 필터를 통해 콜라 솔루션 10 mL 주사기 펠 릿에 직접에 연결 하는 DNase를 필터링 합니다.
  11. 10 소용돌이 펠 릿 resuspend s.
  12. 1.5 h에 대 한 37 ° C 물 목욕, vortexing 10에 대 한 다이제스트의 조직 소화 될 때까지 철저 하 게 모든 10 분.
  13. 필터 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플 상피 세포와 조직 파편을 제거 하는 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 쌓입니다.
    참고: Stromal 세포 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 있습니다.
  14. 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 원심 부드럽게 1 mL 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다.
  15. HESC 격리 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
  16. 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 하 고 혼합 HESC 미디어 정방향 및 역방향 피 펫의 6 mL에 셀 resuspend.
  17. 천천히 밀도 그라데이션 미디어 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 되 고 stromal 세포에서 남아 있는 혈액 세포를 분리 하는 resuspended 세포를 3 mL에 레이어.
  18. 실 온에서 30 분 400 x g에서 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 원심
  19. 새로운 50 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한의 5 mL을 수집 하 고 셀을 resuspend 하는 추가 5 mL HESC 미디어 추가.
  20. 실내 온도에, 뒤에 상쾌한의 제거 및 추가 6 mL HESC 미디어의 2.5 분 800 x g에서 원심. 소용돌이 10 s를 pipetting으로 혼합 샘플 앞으로 반전 5 번.
  21. Aliquot 10 µ L 셀 개수에 대 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 다시 일시 중단 된 세포의.
  22. 0.4 %Trypan 푸른 얼룩 약 수를 셀을 피펫으로 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 약 수의 10 µ L을 로드 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
  23. 15 mL HESC 미디어에서 총 세포 수에 따라 적절 한 플라스 크에 세포 격판덮개
    1. 셀의 총 수 1 백만 보다는 더 적은 인 경우에, 25 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 6 mL 접시. 경우 셀의 총 수는 1 백만 이상, 75 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 15 mL 접시.
  24. 문화는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 최소 6 h 적절 한 세포 접착을 보장 하는 HESC 미디어는 미디어 변경에 대 한 셀.
  25. 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.
  26. HESC 미디어 매 2 일 변경.
    1. 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
    2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
    3. 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.
  27. HESC 되 면 80-90% 합칠, 전송 셀 75 cm 플라스 크를 25 cm 또는 한 75 cm 플라스 크에서 세 75 cm 플라스 크.
    참고: HESC 냉동 고 미래 실험을 위해이 이번에 최신 사용을 위해 저장 될 수 있습니다.

4. 중지 및 재개 HESCs

  1. 75 cm 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.
  2. 세포는 플라스 크에서 빠질 때까지 37 ° C에서 2-3 분 5% CO2 배양 기에서 품 어.
  3. 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.
  4. 800 x g 2.5 분에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
  5. 레이블 셀 라인, 날짜, 및 통로 수 튜브를 동결.
  6. 다시 미디어를 동결의 5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
  7. -80 ° C 냉장고를 각 튜브 및 전송 관에 다시 중단된 HESC의 aliquot 1 mL.
  8. 24 시간 이내에 액체 질소를 튜브를 전송 합니다.
    참고: 즉시 미래에 있는 세포를 해 동 계획 저장 냉동된 셀-80 ° C에서 한 달 동안.
  9. 녹고 있는 HESCs 대 한 HESC 미디어 20 분 예 열.
  10. 25 cm 플라스 크를 데워 HESC 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
  11. 액체 질소 탱크 또는-80 ° C에서 냉동 관을 검색 하 고 세포를 해 동 1-2 분 동안 37 ° C 물 목욕에서 튜브 잠수함.
  12. 해 동된 HESC HESC 미디어 25 cm 플라스 크를 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 5% CO2 배양 기에서 품 어
  13. 다음 날, HESC 미디어를 변경 하 고 2-3 일 HESC confluent 되 고 아래에 설명된대로 프로토콜 5 75 cm 플라스 크에 세포를 전송 될 때까지 기다립니다.
    1. 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
    2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
    3. 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.

5. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 경작

참고:이 Culturing 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. 20-30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 사전 열 HESC 미디어.
  2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 0.25% Trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (1 개 mL를 추가 25 cm 플라스 크 또는 75 cm 플라스 크 2 mL).
  3. 셀 꺼내 때까지는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 2-3 분 동안 품 어.
  4. 부드럽게 플라스 크 벽 꺼내 나머지 셀을 누릅니다. 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.
  5. 피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물.
  6. 발음은 상쾌한 고 다시 셀 펠 릿 HESC 미디어에서 일시 중지.
    1. 25 cm 플라스 크 또는 45 mL 플라스 크 75 cm (각 15 mL)에 대 한 15 mL를 추가 합니다.
  7. 각 25 cm 또는 75 cm 플라스 크에 각각 5 mL 또는 15 mL 셀 정지를 추가 합니다.
  8. 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.
  9. HESC 미디어 매 2 일 변경.
    1. 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
    2. 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
    3. 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.

6. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 도금 및 siRNA Transfection

참고:이 transfection 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. 75 cm 플라스 크에서 HESC 미디어를 발음 하 고 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 추가 합니다.
  2. 셀을 꺼내 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 5% CO2 인큐베이터에서 품 어.
  3. 일단 세포는 플라스 크에서 빠질 HESC 미디어의 7 mL를 추가 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 역 5 번.
  4. 피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물. 발음은 상쾌한 고 다시 HESC 미디어 10 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단.
    참고: 둘 이상의 플라스 크에서 셀 도금, 경우 단순히 HESC 미디어 볼륨 증가.
  5. Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    1. Aliquot 10 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 다시 일시 중단 된 세포의.
    2. 0.4 %Trypan 파랑 셀 aliquot 얼룩 및 앞으로 pipetting으로 혼합 및 반전의 10 µ L를 추가 합니다.
  6. 6 잘 플레이트에 잘 당 0.8 x 10 접시5 셀. 이틀 후, 셀 최적의 transfection에 대 한 60-70% 합칠 이어야 한다.
  7. 각 siRNA transfection 샘플에 대 한 단지 transfection 시 약에 siRNA (60 nanomoles)를 사용 하 여 준비 합니다.
  8. Transfection 시에 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 150 µ L의 5 µ L를 희석 하 고 5 분 동안 품 어.
  9. 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 100 µ L에 siRNA의 60 nanomoles 희석 하 고 5 분 동안 품 어.
  10. 5 분 후 희석된 transfection 시 솔루션 희석된 siRNA를 결합 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 5 번 역.
    참고: 하나 이상의 siRNA에 여러 우물을 transfecting, 준비 10 mL에 마스터 믹스 폴리스 티 렌 튜브.
  11. 실 온에서 5 분에 대 한 siRNA transfection 시 약 단지를 품 어.
  12. 이 부 화 하는 동안 각 잘을 변경 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
  13. 외피의 5 분 후 솔루션을 수집 하 여 siRNA transfection 시 약 단지의 250 µ L 각 잘 셀 및 미디어를 포함을 추가 2 분 동안 500 x g에서 튜브 원심.
  14. 락을 부드럽게 혼합 하 고 37 ° c 5 h 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
  15. 5 h 후 HESC 미디어 미디어 변경 합니다.
  16. 생체 외에서 decidualization 분석 결과 대 한 준비에 2 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.

7. 생체 외에서 Decidualization 분석 결과

참고:이 분석 결과 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.

  1. Camden 에 설명 된 대로 생체 외에서 decidualization 치료를 시작 하기 전에 EPC 미디어 준비 3 (1.6 참조).
  2. 게시물 48 시간 단계 6.16에서에서 incubated HESC의 transfected 라인에서에서 미디어 발음
  3. 각 우물에 EPC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.
    참고:로 컨트롤을 두고 한 일련의 셀의 EPC 미디어와 치료. 대신, 컨트롤 우물에 HESC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.
  4. 6 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
    1. EPC 미디어 48 시간 마다 변경 됩니다.
      1. 따뜻한 고 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 EPC 미디어를 준비 합니다.
      2. 우물에서 미디어를 발음 하 고 신선한 EPC 미디어를 추가 합니다.
      3. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓습니다
  5. 6 일 후 (아래와 같이) ELISA와 qRT-PCR을 통해 stromal 세포 decidualization의 정도 분석 합니다.

8. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사

참고: qRT-PCR Kommagani 10에 앞에서 설명한 완료 됩니다.

  1. 상용 RNA 격리 키트에서 프로토콜을 활용 하는 HESC에서 총 RNA 격리 합니다.
    1. RNA의 양과 순도 (는260/A280) 가르시아-일 라이 어스 15에 설명 된 대로 NanoDrop 또는 유사한 방법론을 사용 하 여 분석 합니다.
  2. 상업적으로 이용 가능한 반전 녹음 방송 키트 프로토콜을 통해 총 RNA의 1 µ g에서 cDNA를 음성 합성.
  3. 상용 qRT-PCR 키트 프로토콜에 설명 된 대로 qRT-PCR 반응을 실행 합니다.
    1. 상업적으로 사용 가능한 실시간 PCR 주인 혼합을 사용 하 여 반응을 수행 하 고 내부 시스템 컨트롤 (18s, PRLIGFBP1) 함께 특정 유전자 프로브.

9. ELISA를 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사

  1. 계량 상용 Prolactin ELISA 키트를 활용 하 여 조직 문화 매체에서 secreted Prolactin 수준.

10. Phalloidin 얼룩을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사.

  1. 12 잘 플레이트의 각 음에 살 균 coverslips를 삽입 합니다.
  2. 6.1-6.5 단계를 반복 합니다.
  3. 12 잘 플레이트의 당 0.8 x 10 접시5 셀.
  4. 2 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
  5. 미디어 발음
  6. 7.3-7.4 단계를 반복 합니다.
  7. 30 분 동안 실내 온도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 셀을 수정.
  8. 고정 솔루션을 발음 하 고 3 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 씻어.
  9. 침투성 증가 고정된 셀에 5 분에 대 한 PBS에 0.1% 비 이온 계면 활성 제 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octyl 페 닐 에테르를 추가 합니다.
  10. 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.
  11. Phalloidin 솔루션 coverslip 당 100 µ L을 추가 하 고 90 분 동안 실 온에서 품 어.
    1. 5 µ L 당 1 단위에서 phalloidin 재고 솔루션을 사용 하 여 PBS에 1: 100 희석을 준비 합니다.
  12. 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.
  13. 설치 매체를 포함 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)와 슬라이드를 탑재 합니다.
  14. Confocal 현미경을 이용 하 여 세포를 관찰 합니다.

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Representative Results

HESC 문화 decidualization

절연, 다음 인간 자궁내 막 기질 세포 80-90 %confluency 단층 형성에 교양 있었다 및 10 nM E2, MPA, 1 개의 µ M, 50 µ M 캠프와 치료에 의해 생체 외에서 decidualization에 대 한 유발 (EPC). 생체 외에서 decidualization와 관련 된 형태학 변화 그림 1A에서 구상 했다. Decidualization, 시 HESCs 둥근된 epithelioid 세포에 길쭉한, fibroblastic 세포에서 cytoskeletal 재배열을 겪는 다. 따라서, phalloidin 얼룩 HESC decidualization 중 cytoskeletal 개편을 확인 하기 위해 수행 되었다. Phalloidin cytoskeletal 재배치 (그림 1B) 생체 외에서 decidualization와 일치 함으로써 시각화 걸 필 라 멘 트에 대 한 얼룩에 이용 되는 높게 선택적인 bicyclic 펩 티 드 이다.

게시물 EPC 치료의 6 일, PRLIGFBP1 mRNA 수준 qRT-PCR decidualization (그림 2A)의 정도 확인을 통해 평가 됐다. PRLIGFBP1 수준을 크게 제어 차량으로 치료 하는 HESC에 비해 증가 했다 (p < 0.001). Decidualization와 관련 된 생화학 변화 자란 매체 (그림 2B)에서 분 비 PRL 레벨의 정량화를 통해 평가 했다. 성적 수준으로 일관 된, PRL 수준에서 매우 높은 했다 EPC HESC 컨트롤에 비해 교양 (p < 0.001).

특정 유전자 HESCs decidualization의 세포 및 분자 변화에 폐지의 효과 SRC-2 를 사용 하 여 후보 유전자 (그림 3)로 평가 됐다. Transfection 제어 또는 SRC-2 siRNA의 48 시간, 다음 HESC EPC 미디어에서 6 일 동안에 경작 되었다. 제어 siRNA 페 시연 하는 HESC 세포 및 분자 변화 PRLIGFBP1decidualization 마커의 증가 성적 수준과 조약돌 형태학 상 변화를 포함 하 여 적절 한 decidualization와 일치. SRC-2 siRNA 최저로 예상 대로 컨트롤 siRNA에 비해 외관에 fibroblastic 남아 HESC 페 HESC (그림 3A). 이 세포 변화와 일치, PRLIGFBP1 성적 레벨은 크게 SRC-2 siRNA 내 감소 페 HESC, SRC-2 최저와 decidualization 프로그래밍에 탈을 나타내는 (* * *p < 0.001). SRC-2 성적 수준이 크게 감소 했다 SRC-2 에 siRNA HESC 비해 siRNA, 우리의 방법으로 효율적인 유전자 침묵을 나타내는 제어 하 페 (* * *p < 0.001) (그림 3B).

Figure 1
그림 1 : 동안 인간의 자궁내 막 기질 세포의 세포질 변화 생체 외에서 decidualization. HESCs 고립 되었고 차량 또는 E2, MPA 및 캠프 (EPC)를 포함 하는 미디어에서 6 일 동안 경작. A) 셀 이미지 epithelioid 세포에 fibroblastic에서 세포 형태학에 있는 변화를 보여주는. B) Phalloidin 스테인드 HESC cytoskeletal 변화 (녹색) 생체 외에서 decidualization, 블루 (DAPI) 핵을 나타냅니다와 관련 된 설명의 이미지. 빨간색 화살표는 decidualized 셀을 나타냅니다. 검은색 화살표 fibroblastic 셀을 보여 줍니다. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 인간의 자궁내 막 기질 세포 동안에 분자 변화 생체 외에서 decidualization. A) 총 RNA HSECs 차량 또는 E2, MPA 및 캠프 (EPC)를 포함 하는 미디어에서 6 일 동안 경작 으로부터 격리 되었고 PRLIGFBP1 증명서 수준 감지 qRT-PCR 분석을 복종. 문화 미디어로 분 비 하는 PRL의 수준 B) EPC 어느 차량에 6 일 동안 배양 하는 HESC에서 ELISA 근거한 분석 결과 사용 하 여 측정 되었다. p < 0.05 * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 SRC-2 의 최저에 영향을 미치는 생체 외에서 decidualization. SiRNA에 A) 형태학 상 변화 페 HESC EPC 미디어와 문화의 6 일 다음 (상위 패널: 시간 제어 siRNA 포인트 0 일과 하루 6, 하단 패널: 0와 하루 6 시간에서 SRC-2 siRNA 포인트). SRC-2, PRL, IGFBP1 0 및 EPC 하루 6의 B) 성적 수준 제어 또는 SRC-2 siRNA 페 HESC 취급. 검은색 화살표 decidualized 셀을 나타냅니다. 흰색 화살표는 fibroblastic 셀을 보여 줍니다. 눈금 막대: 200 µ m. * * * p < 0.001.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여성 생식 생리 주기는 라운드, 상피 같은 분 비 세포3,8에 ESC의 decidualization를 유도 함으로써 상승 luteal 단계 내내 황 체 호르몬 수준에 의해 특징입니다. Decidualization의 개시는 종 의존. 인간에서는, decidualization 발생 합니다 자연 호르몬 농도의 증가 따라 쥐 해야 blastocyst 존재10,11. Decidualization에서의 이러한 불일치는 인간의 세포에 세포 분화의 변환 혜택을 예로 보여주. 1 차 세포 배양을 통해 생체 외 분석 실험 호르몬4,,610통해 decidualization의 변조를 탐험을 종종 활용 됩니다. 그러나,이 방법의 제한 주기 단계 및 임신 역사에서 중요 한 변화 없이 인간의 조직의 큰 샘플 크기의 obtainability에 따라 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 충분 한 샘플을 보장 하기 위해 사전에 충분 한 연구와 증식 단계 (하루 9-12 일) 월 경 주기의 일정 biopsies 계획 하 여 제한 최소화 되도록 조치를 취할 수 있습니다.

이 연구에서 HESC 배양 하 Brosens 그 외 여러분 에서 처음 설명한 소설 방법을 통해 인위적으로 decidualized 16 어떤 호르몬에서 E2, P4, 그리고 캠프 6 일간 잠복기를 걸쳐 자란 보통 보충 된다. 일반적으로, 양자 택일 방법12,14 액 셀 확장된 14 일간 잠복기를 통해 e 2와 MPA의 추가 통해 인공 decidualization에 대 한 문화. 자란 미디어 캠프의 보충 synergistically 증폭 하면서 동시에 upregulating 캠프 응답 요소 발기인 지구 (즉, 포함 된 유전자의 표정 단축된 기간에 ESC의 decidualization PRLIGFBP1)12,13. Kommagani 에 설명 된 프로토콜에 따라이 메서드 10, 고립의 최적화와 HESC의 문화 수 있습니다. 셀 문화 순도 실질과 상피 세포 라인을 40 µ m 셀 스 트레이너를 이용 하 여 최적화 되었다. 또한, Ficoll-Paque 플러스 시 약 샘플에서 혈액 세포의 제거에 따라 순수 stromal 세포의 가능한, 높은 수확량 격리를 보장 하기 위해 적용 되었습니다. 추가 원심 분리 단계 (30 분 400 x g)은 세포 인구에서 혈액 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 포함된 다음 Ficoll 추가 이었다. 마지막으로, HESC 생존 및 수율 95% confluency decidualization에 대 한 때까지 세포 배양 시 최적화 했다. 다음 추가 단계 보장 가능한, 높은 수확량 HESC의 순수한 문화.

Decidualization 정도의 qRT-PCR, ELISA, 및 phalloidin cytoskeletal 재배치와 각 인 유전자의 upregulation를 얼룩을 활용 하 여 평가 했다. QRT-PCR, PRLIGFBP1 decidualization 마커의 성적 수준은 평가 했다. HESC의 decidualization, 이전 연구6에서 설정 된 시간에 따라 패션에서 PRLIGFBP1 수준 증가. PRL 레벨 분의 시간에 따른 증가 또한 ELISA 통해 HESC 조직 문화 미디어를 검사 하 여 확인 되었다. 또한, decidual 세포로 stromal 세포의 형태학 변경 phalloidin 및 핵 마커 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17통해 걸 필 라 멘 트의 costaining를 통해 시각 수 있습니다. 함께, 이러한 실험 결과 HESC E2, MPA, 캠프의 보완을 통해 배양의 효과를 확인 했다.

이 프로토콜의 기능을 유전자 특정 최저 공부 SRC-2에 대 한 siRNA를 활용 하 여 평가 했다. 형태학 상으로, SRC-2 페 HESC HESC epithelioid 세포에 decidualized 컨트롤 siRNA로 치료 하는 반면 fibroblastic, 남아 있었다. SRC-2 최저 효율 대 본 단계를 통해 평가 되었다 고 했다 크게 감소 하 고, 우리의 프로토콜 특정 유전자의 성공적인 입을 나타내는. 따라서, 우리의 프로토콜 묘사 endometrial decidualization에 특정 gene(s)의 역할에 관심을 가진 수 사관에 대 한 유용한 리소스를 수 있습니다.

Decidualization의 기본 분자 메커니즘을 이해에 있는 전진 한 동안 상당한 지식 격차는 여전히 특성에 존재 합니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 후속 초기 태아 유산4,6,,710에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 추가 탐사 후 성적인 요소와 분자 통로의 특성에 관한 진단과 임신 실패의 치료를 위해 필요 하다.

결론적으로,이 연구를 통해 제시 하는 프로토콜 인간의 자궁내 막 기질 세포의 순수 하 고 가능한 라인 문화를 격리 하는 효율적인 방법을 설정 합니다. 호르몬 E2, MPA, 그리고 자란 미디어 캠프를 보완 하 여 인공 decidualization 유도 될 수 있다 qRT-PCR, ELISA에 의해 확인 및 Phalloidin 얼룩이 지기. 또한, 우리의 프로토콜 siRNA와 transfections 지질 기반을 사용 하 여 관심사의 특정 유전자의 효율적인 최저에 필요한 자세한 단계를 설명 합니다. 전부,이 메서드는 기본 세포 및 분자 따라 장치를 마더보드에 HESC decidualization와 관련 된 공부 하는 능력을 제공 합니다.

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Disclosures

이 작품은 여에서 국립 보건원 (NIH) 자금 지원/아동 건강과 인간 발달 (NICHD) 그랜트 (R00 HD080742)와 워싱턴 대학의과 대학 시작의 국립 연구소 R.K.에 자금 우리는 워싱턴 대학 불 임 클리닉 자궁내 막 생 검 견본을 제공 하기 위한 감사 하 고 싶습니다.

Acknowledgments

저자는 공개 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

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References

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