最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

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Developmental Biology

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Summary

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。

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Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

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Abstract

機能的ひと多能性幹細胞由来心筋前駆細胞の大量および定義された中心領域の原点の心筋細胞の生成は、セルベースの心臓治療法や疾患モデリングの前提です。我々 は最近、Id 遺伝子が必要と脊椎動物の開発中に最初の心臓フィールドの前駆細胞を指定するのに十分なことを示しています。この分化プロトコルは、これらの知見を活用し、最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 前駆細胞を生成する強力な指定する手がかりとしてアクチビン A との組み合わせで Id1 の過剰発現を使用します。重要なは、結果前駆細胞のような心室心筋細胞 (〜 70-90%) を効率的に区別します。ここで我々 は 1) Id1 過剰発現 hPSCs を生成し、2) 前駆細胞について-L cryopreservable のような心室心筋細胞のスケーラブルな量を区別するための詳細な方法をについて説明します。

Introduction

ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の大規模な生産-派生心臓前駆細胞と心筋細胞は幹細胞ベースの治療1、病モデル2,3との迅速な評価の前提新規経路心筋分化4,5,6と生理7,8を規制します。,15が非常に効率的な前述した研究9,1011,12,13,14の数hPSCs から心筋分化誘導方法、どれもが対処にもかかわらず左違いの重要な分子の同定の結果心筋細胞の心臓領域の原点 (最初ハート フィールド) と右の (2 番目のハート フィールド)心室心筋細胞16と心フィールド固有の先天性心疾患の存在すなわち、左心低形成症候群17または不整脈原性右室異形成症18。したがって、心臓前駆細胞の生成と定義されたハート フィールド hPSCs 由来の心筋細胞は治療としての妥当性を高めるために必要になっていると疾患モデリング ツール。

このプロトコルは、Id1、最近同定された5最初ハート フィールドを指定するキュー アクチビン A との組み合わせでは必要であり、hPSCs での心臓を開始するための十分な学会の構成に依存します。特に、カニンガム(2017)5を示して、Id1 誘起前駆細胞具体的表現 (HCN4TBX5) 最初のハート フィールドが 2 番目のないハート フィールド マーカー (SIX2ISL1) 心筋分化を遂げる。さらに、著者はまたしたトランスジェニック マウス胚の遺伝子 (Id1-4)、家族Idを欠けている開発最初心臓フィールド心臓前駆細胞より内側と後部の心臓前駆細胞 (間を形成することがなく、表示します。2 つ目のハート フィールド) はそれにより Id 蛋白質初めてハート フィールドの心臓生体内での開始に必須を示唆、まだ形成できます。便利な Id1 誘起前駆細胞凍結保存することができ、自発的に心室固有マーカー (IRX4, MYL2) 式を含め、心室のような特性を表示する心筋細胞に分化し、ような心室の活動電位。

ここで Id1 過剰 hPSCs から最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するシンプルかつスケーラブルな手法について述べる。このプロトコルの重要な機能は、便利な冷凍保存の手順を使用してその後心筋細胞生産から心臓前駆細胞生成を切り離すことです。要約すると、このプロトコルは (1) Id1 過剰発現の hPSCs を生成する、(2) hPSCs から急性肝不全-L 心臓前駆細胞を生成する、(3) 結果前駆細胞の凍結、(4) 再開について L 心臓前駆細胞の分化に必要な手順の詳細し、を生成高濃縮 (> 70-90%) のような心室心筋細胞を打ちます。

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Protocol

1. Id1 ウイルス作製と感染症

  1. PCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR、pMD2.G、pCMVDR8.74 の共同株 Id1 過剰発現レンチ ウイルスを生成 (Addgene: プラスミッド #107735) HEK293T 細胞に。ウイルス粒子を収集、濾液、上清から浄化、北村のように-80 ° C で保存(2003 年)19します。 また、pCDH ef1 〜 Id1 PGK PuroR をレンチ製造ベンダーに送信することによって商業 Id1 レンチ ウイルスを生産。
    注意: は、レンチ ウイルスに関する安全規制および標準的な操作のプロトコルに従ってください。
    注: 重要: 最適なウイルス価は少なくとも 10 をする必要があります 108 9 Transducing 単位/ml (TU/mL)。
  2. 感染前にコートのコーティング剤、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫細胞 (材料の表を参照) によって分泌されるゼラチンのタンパク質混合物通常の 50 μ l で 96 well プレートの 1 つの井戸を実行します。
  3. 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA を追加することによって 6 ウェル プレートで育った多能性幹細胞の 1 つの井戸を切り離して考えます。
    注: 解離時間は 3-10 分から異なります。プレートの底から細胞の 80% 以上を取り外したら、次のステップに進みます。
  4. 滅菌ピペットで細胞を懸濁液を 15 mL プラスチック遠心管にまとめます。
  5. 5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。
  6. 遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。
  7. 上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。
  8. 幹細胞培地 1 ml を再停止します。
  9. ベンダーの指示に従って自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  10. あたり 20,000 実行可能な細胞は幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤の 50 μ L でよく (96 ウェル プレート) をコーティング (表 1 と 2を参照)。
  11. 24 h 後セル添付ファイルを監視し、2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine ブロマイドを添加した 100 μ l 幹細胞メディアでメディアを交換して (表 1および2を参照)、レンチ ウイルス感染前に 1 h。
    注: の細胞は、プレートの底にしっかりと固定する必要があります。
  12. 氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。
  13. 3 μ L/ウェル精製レンチ ウイルスを追加 (ウイルス価は 10 の間にする必要があります8 ~ 109 TU/mL)、し、プレートを携帯文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO220% O2) に転送。
  14. 24 時間後のウイルス感染、感染した細胞に新鮮な幹細胞培地の 100 μ L を追加。
  15. 48 時間後にレンチ ウイルス感染、新鮮な幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L でメディアを含む置換ウイルス。
  16. 幹細胞培地 1 μ G/ml ピューロマイシンの 200 μ L で毎日メディアを更新します。
  17. 文化が 80% の confluency に達したら、Ca2 +と Mg2 + + 0.5 mM EDTA なし 200 μ L の PBS (96 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。
  18. 細胞懸濁液を遠心管にまとめます。
  19. 5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。
  20. 遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。
  21. 上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。
  22. 再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 1 ml を中断します。
  23. 12 ウェル プレートのコーティング (1 mL) のすべてのセルに転送します。
  24. 24 h 後幹細胞培地の 1 mL でよくと置換メディアに付着のためのモニターは 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 ng/mL hexadimethrine 臭化物、伝達の前に 1 つの h を補充しました。
  25. 氷上 Id1 レンチ ウイルスを解凍します。
  26. ウェル (12 ウェル プレート) あたり純化ウイルスの 5 μ L を追加します。
  27. 24 h 後レンチ ウイルス感染、1 ml の新鮮な幹細胞培地 3 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを含む置換ウイルス。
  28. 48 h レンチ ウイルス感染ウイルス含有 1 ml の新鮮な幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンのメディアを交換してください。
  29. 文化が 80% の confluency に達したら、500 μ L の PBS Ca2 +と Mg2 +と 0.5 mM EDTA (12 ウェル プレートのウェル 1 個) を使用してセルを切り離して考えます。
  30. 半分を転送 (250 μ L) コーティング剤の 1 つの井戸に細胞懸濁液のコーティング幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 mL を含む 6 ウェル プレート。
  31. その他の半分を使用 (250 μ L) RNA の抽出およびレンチウイルスベクターを介したId1表現のレベル、コーラのようにを定めるために qRT PCR のサンプルの(2012 年)4
    注: 重要な: Id1 mRNA 発現レベルよりも低い場合 (qRT PCR のプライマーの表 3を参照) GAPDH発現レベルの 0.005 倍、Id1 表現のレベルを超過するまで、上記のように感染プロセスを繰り返す、しきい値。

2. hPSCsId1メンテナンス

  1. 文化の hPSCsId1コーティング 6 ウェル プレートで、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。
  2. HPSCsId1が 80% の confluency に達したら、通路のベンダーのガイドラインに従う酵素無料解離試薬を用いた集計値 (1:6 分割比) と細胞、幹細胞培地 6 μ G/ml ピューロマイシンの井戸あたり 3 mL で育ちます。

3. 差別化の hPSCsId1の準備

  1. コーティング剤の井戸あたり 500 μ L で 12 ウェル プレートをコートします。
  2. 5-10 分チェック解離過程、毎分Id1に達する 90% の confluency hPSCs 1 mL の PBS Ca2 +と Mg2 +とよく当り 0.5 mM EDTA を追加することによって細胞を分離するとき、80% の細胞をプレートから解離する一度、次の手順に進みます。
  3. 細胞懸濁液を遠心管にまとめます。
  4. 5 ml の PBS を含む Ca2 +と Mg2 +の解離試薬を中和します。
  5. 遠心分離 (3 分 200 g x) によって細胞をペレットします。
  6. 上清を除去し、ペレットを除去するためにチューブを優しくフリックします。
  7. 再幹細胞培地 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤 2 ml を中断します。
  8. 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  9. 井戸幹細胞培地培養孵卵器に 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤と 6 μ G/ml ピューロマイシン転送プレートと補足の 1 mL あたりプレート 300,000 セルです。
  10. 幹細胞培 6 μ G/ml ピューロマイシン文化まで 90% の confluency 地 2 mL を毎日メディアを更新します。この時点で、心臓の分化を開始 (次の手順)。

4. hPSCsId1の最初のハート フィールドのような心臓前駆細胞 (CPs について L) への分化

  1. 12 ウェル プレート形式の幹細胞培地を 1.5 mL の誘導培 (表 1) に置き換えることによって開始分化 (0 日目) はアクチビンと補足 (100 ng/mL) (表 2の推奨されるボリュームとアクチビン A の濃度を参照してください。異なるプレート フォーマット)。
  2. (24 h 分化開始後) 1 日に 2 ml (/12 ウェル プレートのウェル) アクチビン A せず誘導メディアのメディアを交換します。
  3. 3 日目、アクチビン A なし (/12 ウェル プレートのウェル) 誘導メディアの 2 mL でメディアを置き換えます。
  4. 5 日目、凍結保存用について L CPs を収集 (次の手順)。
    注: 重要な: 凍結をお勧めこの時点で心臓前駆細胞の後心筋細胞生産とバイオバンク大きなバッチから世代を切り離すことが可能。メモ、または、5 日目について L CPs は、分化を続行し、手順 5.1-5.5 passFHF L の CPs を参照してくださいステップ 6.5 に差別化のために進みますたてコーティング プレートに渡すことができます。

5. 急性肝不全-L CPs の凍結保存

  1. 5 日目を含む井戸からすべてのメディアを吸引について L CPs とすぐに暖かい (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加 (材料の表を参照してください)。組織文化のインキュベーターでプレートを配置します。
  2. 1 分後プレートをインキュベーターを左右に振る。
  3. 2 分 (合計時間) 後インキュベーターからプレートを削除し、10 %fbs メディアの 1 つの mL を追加します。
  4. 優しくピペットでのセルを上下プレートから細胞の剥離を容易にするために 5 mL をピペットで移しなさい。
  5. 3 分間 200 × g で遠心分離遠心チューブ、ペレット細胞を細胞懸濁液を収集します。
  6. 再凍結保存試薬の 2 mL の細胞ペレットを中断します。
  7. 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
  8. 凍結保存試薬を追加 (材料の表を参照) を目的濃度 (通常 5-10 x 106セル/mL) で細胞を凍結保存するための十分なボリュームで。
  9. 凍結保存バイアルにセルを転送し冷却装置 (1 ° C/分) でバイアルに、一晩-80 ° C のフリーザーで冷却装置を置きます。
  10. 24 h 後に、長期保存用液体窒素に凍結バイアルを転送します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

6. 急性肝不全-L CP のような心室心筋細胞分化

  1. ドライアイスの容器に液体窒素から 5 日目凍結について L CPs バイアルを転送します。
  2. 細胞懸濁液は、完全に解凍するまで 2 〜 3 分の 37 ° C の水浴のバイアルを配置します。
    注: 重要な: 解凍処理は一刻を争う。時間の過剰な量の細胞凍結保存メディアを公開する (すなわち、 10 分) 細胞生存率が低下します。
  3. 解凍バイアル数に応じて、15 または 50 の mL の遠心管にセルを転送します。
  4. 滴 (5 滴 30 秒ごと) に予め温めておいた (37 ° C) 心原性メディア (表 1) 携帯ソリューションを調剤します。1:3 凍結保存メディアまでこのプロセスを続行: 心原性メディア比に達する。この時点で、1:10 まで心原性メディアの添加率を高める凍結保存メディア: 心原性メディア比に達する。
    注: 重要な: 急速な浸透圧の変化が、解凍処理中に細胞死を増加したがって、心原性メディアの滴下前述のよう強くお勧めします。
  5. 細胞懸濁液とペレットを遠心分離機、遠心分離 (3 分 200 g x) によって。
  6. 上清を除去し、やさしく細胞ペレットを取り除くため遠心管をフリックします。
  7. 再 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した心原性のメディアでセルを中断します。
    注: セル実行可能性は、雪解けから解凍して、一般に変わることができる、> 65% 生存率が良いめっき効率を予測します。
  8. 希釈濃縮細胞懸濁液めっき用目的のセルの濃度を取得する 2 μ M ・ ロー/ロック経路の阻害剤を添加した心原性のメディア (異なるプレート形式の表 2を参照)。
    注: 重要な: 細胞はまばらすぎる播かれる場合心筋分化効率が低下することに注意してください。
  9. プレート上の種子のセル。
  10. 組織文化のインキュベーターに転送する前に 20 分のティッシュ文化フード プレートをしてください。
  11. 6 日目に分化、細胞接着を監視します。
    注: 心臓前駆細胞は分化の 5 日目に凍結しました。細胞を解凍後 24 h は分化の 6 日目になります。
    注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。
  12. 7 日にメディアの 50% を吸引し、新鮮な心原性メディアの等しい量に置き換えます。
    注: 心原性メディアにロー/ロック経路阻害剤の追加はこのポイントの後必要ありません。
  13. その他毎日心原性メディアでメディアの 50% を置き換えます。
  14. 11 日目と 13 日目の間に自発的な鼓動するメモが表示されます。
  15. 15 日に DAPI (核染色) と ACTC1 を用いた蛍光抗体法による心筋分化効率の定量化 (パン心臓マーカー)。

7. 渡す、のような心室心筋細胞のメンテナンス

注: 日 14-16 のような心室心筋細胞を自発的に契約の単分子膜を得られなければならない.この時点で、切り離して、再度文化を均質化し、セルがプレートからデタッチすることを防ぐために心筋細胞をプレートすることをお勧めします。

  1. 井戸からすべてのメディアを吸引し、迅速に予め温めておいた (37 ° C) 1 x の酵素を含む解離試薬 1 mL を追加します。
    メモ: 酵素を含む解離試薬ボリューム x 1 プレート形式によって異なりますが完全によく画面の下部をカバーする必要があります。
  2. 組織文化のインキュベーターにプレートを転送します。
  3. 軽く板側に剥離プロセスを加速するインキュベーター内 2 分ごとを振る。
  4. 5-15 分後にプレートの底から細胞の 80% 〜 100% を取り外したら、インキュベーターからプレートを取り外し、10 %fbs メディアの等しい量を追加することによって酵素含有解離試薬活性 x 1 を阻害します。
    注: このプロセスの 1 x 酵素を含む解離でインキュベーション時間もバッチごとに変わります。
  5. 細胞懸濁液を遠心管に収集します。
  6. 自動化された細胞カウンターを使用してカウントのピペットで移しなさい細胞と細胞懸濁液を混ぜます。
  7. 目的のセルの濃度に細胞懸濁液を希釈 (異なるプレート形式の表 2を参照) 2 μ M ・ ロー/ロック経路阻害剤を添加した保守メディアで。
  8. プレート上に心筋細胞を播種後セルを均等にして細胞は、組織文化のインキュベーターにプレートを転送する前に 10-20 分を添付します。
  9. 24 h 再メッキ後は、細胞接着と回復を監視します。
    注: 浮動 (死んだ) 細胞の存在は、一般的です。48-72 時間後再メッキ、心筋細胞は自発的な収縮を再開しなければなりません。
  10. 心筋細胞培養を維持するために保守メディアでその後の実験のような心室の心筋細胞が使用されるまで、その他の毎日メディアの 50% を置き換えます。

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Representative Results

HPSCs の生成Id1ライン
hPSCs は、Id1 過剰発現 (図 1A) を仲介するレンチ ウイルスに感染しています。HPSCId1が生成される遺伝子発現は qRT PCR (図 1B) によって定量化されます。GAPDHの 0.005 倍を超えるレベルでId1 mRNA を表現する hPSCId1線だけは差別化のために使わなければなりません。

hPSCsId1メンテナンスおよび開発のための準備ifferentiation
最適な培養条件が必要かつ重要な成功の最初のハート フィールドのような心臓前駆細胞分化 (図 2A)。hPSCId1文化は、幹形態メンテナンスおよび継続的な増殖のため毎日監視する必要があります。堅く詰められた幹細胞のコロニーに達するとき、分化を開始する必要があります > 90% の confluency (図 2B)。場合は最適の confluency 前に分化を開始すると、細胞死が向上し、差別化効率が低下する (図 2C)。同様に、草に覆われた文化は悪い (図 2D) を実行します。

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞 (CPs について L) からの生成hPSCsId1
日 1 (24 h ポスト分化開始)、細胞は幹の形態 (細胞が平坦と幹細胞よりも暗い表示) の損失を観察する監視必要があります。細胞死は分化の最初の日の間に共通ですが、セルの合流点で維持されるべき > 75% (図 2E)。分化の 24 h 後に覆われた面積の 50% 以上失われます、セルを破棄しなければなりません。

3 日目、細胞クラスター化しておくし、初期の 24 h (図 2F) の期間中に作成されたギャップを埋めています。独立して成長しているフラットのセルは最適分化条件を示しています。

4 日は、継続的な拡大とプレートの報道に最適な分化が表示されます。

5 日にセルを収穫して凍結しました。最適な分化は、均質な形態の外観 (図 2G) と密接に接続された細胞塊になります。フラット セルの低密度クラスター マーク次善の分化の結果であることに注意してください。様々 なウェルあたり心臓前駆細胞 5 文化形式の日の平均収量は表 2を参照してください。

急性肝不全-L CPs からのような心室心筋細胞の生成
日 5 について L CPs は、プレート形式に依存した密度の心臓の分化の能力を最大化するためにテーブル 2で説明した (図 3および表 2) で解凍します。融解後の生存率は、監視する必要があります。一般に、生存率 70-80% からの範囲します。生存率は 60% 未満、心筋細胞の収量が影響を受けます。

日 6 (分化の復帰後 24 h)、急性肝不全-L CPs がカバーすべき > 90% 使用可能な面積し、細胞 (図 3B) の均一な 1 つのレイヤーとして表示されます。6 日目に低合流について L CPs 心筋細胞分化が低くなります。

結果心筋細胞は、分化 (図 3C映画 1) の日 11-13 でビートを開始します。14-16 日目 replating プロセス中にさまざまな文化形式の井戸あたり心筋細胞の平均収量の表 2を参照してください。分化効率通常の心臓 (ACTC1)、(TAGLN) 線維芽細胞と血管内皮マーカー (CDH5) ・核 (DAPI) マーカーの蛍光抗体法によって評価されます。・ カニンガムと同様に、自動イメージングおよび定量化を使用して系列の定量化を行い(2017)5 (図 3D 電子)。その結果心筋細胞のサブタイプの特性は qRT PCR (図 3F) と活動電位の過渡解析運動イメージングと電圧プローブ (図 3G と映画 2) を使用してによって実行されます。McKeithanで説明した電圧プローブと活動電位トレース分析結果 (図 3H) の蛍光定量を実行します。(2017)7

Figure 1
図 1: hPSC の世代Id1 .(A) hPSCsId1世代プロトコルの概略図。(B)代表Id1 mRNA レベルの hPSCId1 hESC 1行を含む個別の行と hPSC 行の 2 行からレンチ ウイルスによる発現によって生成されたを示す qRT PCR の結果の例です。点線はId1表現しきい値、どちらの hPSCId1下行は、Id1 レンチ ウイルス感染のサイクルを受ける必要があります。"p"は、通路番号を示します。かっこ内の数値は、Id1 レンチ ウイルス感染のラウンドの数を示します。誤差範囲は、3 通実験の標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:世代の最初心臓 Field-Like 心臓前駆細胞 (について L CPs) 分化から hPSCId1。(A)について L CP 世代プロトコルの概略図。HPSCId1最適(B)、(0 日目) の代表的な明るいフィールド画像サブ合流 (黄色の矢印は、セル間無効領域を示します) (C)と過剰合流(D)密度。1 日目の hPSCId1を差別化の代表的な明るいフィールド画像 3 と 5 のそれぞれ(E), (F), (G)。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:について L CPs からのような心室心筋細胞の生成.(A)ような心室心筋細胞世代プロトコルの模式図。(B) 6 日目 (1 日後に解凍) 細胞の分化の明視野像。(C) 12 日暴行文化の明視野像。(D)日 15 文化 (384 ウェル プレート形式) の代表的な蛍光イメージ。ACTC1 マーク TAGLN 心筋細胞: 線維芽細胞/平滑筋, CDH5: 血管内皮細胞および DAPI: 核 (左下の表示)。(E)日 15 文化の系譜定量化。(F) qRT PCR のデータは時間コース 5 日目から 25 日目に心室固有マーカー (IRX4およびMYL2) および発現パン心臓マーカー (MYL7) です。(G)代表的な電位トレースのような心室心筋細胞分化の 25 日から。(H)結果のような心室心筋細胞の期間測定を活動電位 (APD50と APD90) (n = 12)。誤差範囲は、4 連で実験 (限り時) の標準偏差を表します。スケール バー = 100 μ m. RFU、相対的な蛍光ユニット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

媒体 基本培地 添加剤
幹細胞培地 mTesR1 n/a
誘導メディア RPMI 1640 媒体 B-27 無血清サプリメントはインスリン、1 x
誘導メディア RPMI 1640 媒体 ピューロマイシン、6 μ g/ml
誘導メディア RPMI 1640 媒体 ペニシリン-ストレプトマイシン、1 x
心原性のメディア RPMI 1640 媒体 B-27 無血清サプリメント、1 x
心原性のメディア RPMI 1640 媒体 ペニシリン-ストレプトマイシン、1 x
保守メディア RPMI 1640 媒体 B-27 無血清サプリメント、1 x
保守メディア RPMI 1640 媒体 ノックアウト血清交換、2%
保守メディア RPMI 1640 媒体 ペニシリン-ストレプトマイシン、1 x

表 1: メディア コンポーネント (基本メディアと添加物の材料表を参照)。

よく 384 96 よく よく 12 よく 6 100 mm 150 mm
(よく) あたり塗布量 10 Μ L 50 Μ L 500 Μ L 1 mL 5 mL 10 mL
中量
(よく) あたり
100 Μ L 300 Μ L 2 mL 5 mL 12 mL 30 mL
分化 0 日アクチビン濃度 (ng/mL) 100 100 100 300
心臓前駆細胞
5 日目収穫
(細胞/ウェル)
1.0 – 1.2 10 x5 2.5-3.0 10 x5 1.0 〜 1.5 10 x7 2.0 – 3.0 10 x7
心臓前駆 5 日目 replating または融解密度 (細胞/ウェル) 2.0 × 104 7.5 x 105 4.5 x 106 8.0 x 106 2.2 × 107
心室のような心筋
14-16 日降伏
(細胞/ウェル)
2.0-5.0 10 x4 0.8-1.2 x 106 3.5 〜 5.0 x 106 0.8-1.2 × 107 1.8-2.5 × 107
心室のような心筋細胞密度を replating
(細胞/ウェル)
2.5 x 104 1.0 x 106 4.5 x 106 1.0 x 107 2.2 × 107

表 2: スケーラブルな分化のパラメーター (塗布量、中量、アクチビン A 濃度、密度を replating 利回り)。

遺伝子名 遺伝子バンク加盟 シーケンス
GAPDH NM_001256799 F: GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
R: GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
マウス Id1 NM_010495 F: CCTAGCTGTTCGCTGAAGGC
R: CTCCGACAGACCAAGTACCAC
IRX4 NM_016358 F: GGCTCCCCAGTTCTTGATGG
R: TAGACCGGGCAGTAGACCG
MYL2 NM_000432 F: TTGGGCGAGTGAACGTGAAAA
R: CCGAACGTAATCAGCCTTCAG
MYL7 NM_021223 F: GCCCAACGTGGTTCTTCCAA
R: CTCCTCCTCTGGGACACTC

表 3: qRT PCR のプライマー シーケンス。

Movie 1
映画 1: 明るいフィールド レコーディング (100 フレーム/秒) 15 日心筋細胞自発収縮が観察することができるのですしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

Movie 2
映画 2: 日 25 id1 誘起のような心室心筋の電位感受性蛍光プローブの運動イメージング (100 フレーム/秒) ですしてくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

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Discussion

正常な分化、密接に上記の指示に従うことを確認してください。さらに、ここで我々 は強く分化の結果に影響を与える重要なパラメーターを強調表示します。分化を開始する前に次の 3 つの形態学的パラメーターを観察する必要があります: hPSCsId1、高細胞密度および高い合流の幹の形態 (> 90%) 0 日目で文化。その点で最適な分化条件が単一セルとして解離メッキの hPSCsId1によって作成される最高と 2 〜 3 日のコース中に ~ 90% 合流する成長分子をクラスター化しっかりとフォームにそれらを許可します。逆に、hPSCId1文化ショー悪い細胞コロニー形態、植民地低圧縮と文化の中で分化の大部分の存在、成功について L CP 分化はほとんどありません。

メディア ボリューム アクチビン A の濃度は、重要なパラメーターについて L CP 分化とプレート形式に依存 (表 2参照)。最適アクチビン A の濃度に応じて異なる場合があります注 hPSC ラインを使用し、濃度の最適化が必要な場合があります。

HPSCs でId1の mRNA のレベルは、 Id1レベルについて L 確認次善を効率的に推進する堅牢な急性肝不全-L CP 分化を生成に失敗し、分化の 1 日目で大規模な細胞死が観察されるに重要です。効率的な分化を促進する 0.005 Id1GAPDHの相対式比でなければなりません。ピューロマイシン (6-10 μ g/mL) の高用量を使用して継続的な選択が Id1 のレンチ ウイルスによる発現の高いレベルを維持するためにお勧めします。Id1の mRNA のレベルの評価、すべての 10 の通路をお勧めします。

5 日目の密度をめっきについて L CPsis 心筋分化効率も重要なパラメーターです。場合 5 日目低密度でめっきについて L CPs、相対心臓収量が減少します。最適なめっき密度2 のとおりで、プレート形式に依存。

このプロトコルの主な制限は、結果前駆細胞のような心室心筋細胞の治療上の使用を制限することがあります promoteFHF L CP 分化するレンチウイルスベクターを介した Id1 過剰発現の使用です。また、レンチは、可能性があります潜在的影響 hPSC メンテナンスおよび/または幹細胞性の hPSCsId1コロニー発達可能性監視しなければならない評価サイトで統合可能性がありますので幹遺伝子発現との形態学的兆候を観察差別化。なお Id1 を過剰発現非統合のベクトルを使用してこの制限を克服する、当研究室で現在調査中です。

このメソッドの 1 つの便利な機能は、1 つのサイトカイン、アクチビン A、hPSCsId1から急性肝不全-L CPs を生成するのみ必要があります分化プロトコルのシンプルさです。比較では、他のプロトコル9,1011,12,13,14,15はサイトカインの組み合わせの複雑なシーケンスを必要とするおよび/または小さな分子を促進し、心筋分化を維持するために。さらに、このプロトコルは一意に後続心筋細胞生産から急性肝不全-L CP 生成を切り離すことを可能にする便利な凍結保存手順を説明します。この機能により、バイオバンク大量に心筋分化として融解時に 5 日目から再開について L CPs とすばやく冷凍前駆細胞から心筋細胞を生成します。この戦略は、hPSCs からの心筋分化の開始と比較して時間の 2 週間に 1 を行うことができます。さらに、そして最も重要なは、このプロトコルは定義された中心領域の原点、他プロトコル9,1011,12 中の心筋前駆細胞を生成するまで最初のプロトコル ,13,14,15点で未定義のまま。

要約すると、このプロトコル大量生産は堅牢でスケーラブルな方法の概要を説明 (> 108– 109) 発達に関連した急性肝不全-L CPs のような心室心筋細胞。ターンでは、結果セルは心筋分化および生理学を制御する新規規制経路を識別するために使用できます、再生と疾患モデリングの目的。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

我々 は役に立つ議論のコーラのラボのメンバーと原稿の重要なレビューをありがとうございます。本研究は、NIH/NIEHS R44ES023521-02 でサポートされていたし、CIRM DISC2-10110 博士コーラに付与します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o - insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o - vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

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References

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