Bioinspired 메서드를 사용 하 여 기능성 실리 카의 준비

Chemistry
 

Summary

여기, 우리는 bioinspired 실리 카 재료를 합성 하 고 거기에 효소를 무력화 하는 프로토콜을 제시. 실리 카는 규 산 나트륨 및 '첨가제'는 아민 제어 속도로 중화 결합 하 여 합성 됩니다. 제자리에서 효소 동원 정지 또는 캡슐화 된 첨가제의 합성 후 산 차입 하 여 물성 및 기능을 변경할 수 있습니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Manning, J. R., Routoula, E., Patwardhan, S. V. Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method. J. Vis. Exp. (138), e57730, doi:10.3791/57730 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

여기에 설명 된 프로토콜의 목표 bioinspired 실리 카 재료 합성, 효소 캡슐화를, 수행 하 고 부분적으로 또는 완전히 정화 같은 산 차입에 의해 것입니다. Polyfunctional bioinspired 첨가제와 규 산 나트륨을 결합 하 여 실리 카 중화 시 주변 조건에서 급속 하 게 형성 된다.

실리 카 수확량에 중화 및 biomolecule 추가 포인트의 효과 조사 하 고 biomolecule immobilization 효율성은 추가 포인트 변화에 대 한 보고. 다른 다공성 실리 카 합성 방법을 달리 온화한 조건 bioinspired 실리 카 합성에 필요한 섬세 한 생체의 캡슐화와 완벽 하 게 호환 되는지 표시 됩니다. 또한, 온화한 조건 만들기 bioinspired 실리 카 스케일 업 및 상용화 유망 대상 맨 자료와 적극적인 지원 매체 모든 합성 및 수정 단계에 걸쳐 사용 됩니다.

그러나 합성은 표시 조건, 즉, 중화 속도 최종 합성 pH에 매우 민감한에서 높은 재현성으로 이어지는 자동 적정 메서드를 사용 하 여 이러한 매개 변수 제어 시연 꽉 반응 진행 경로 항복입니다.

따라서 실리 카 bioinspired 우수한 활성 소재 지원 선택, 미래의 응용 프로그램에서 많은 현재 응용 프로그램을 시연, 그에 국한 되지 않음 그리고 힘으로 다양성을 보여주는입니다.

Introduction

산업 촉매에 대 한 구조 지원으로 실리 카의 사용은 잘 설립 하 고, 향상 된 촉매 활동, 안정성 및 가공 성, 따라서 잠재적으로 운영 비용을 절감1 . 이러한 혜택으로 실리 카 기 공 시스템 내에서 스토리지 무료 그것의 대조 물 효소 수명에 상당한 혜택을 부여 수 있습니다 효소 동원 정지의 경우 혼합은. 따라서, 많은 노력 연결할 효소 실리 카 종, 규 산 고체 지원에 동원 정지의 다른 방법을 사용 하 여 조사를 비교 하는 여러 리뷰와 함께 가장 좋은 방법을 찾는 소비 되어 있다. 2 , 3 , 4

효소는 physisorption 또는 다공성 재료 내에서 캡슐화 이외에 공유 결합을 통해 일반적으로 연결 됩니다. 그러나 5 , 있다 각 방법에 관련 된 중요 한 단점: 실리 카와는 허용 되지 않는에 지도 하는 반응 조건에 의해 아주 쉽게 약화 수 있습니다 biomolecule 사이 과도 표면 상호 작용에 의존 하는 physisorption 효소 거 르 기입니다. 훨씬 더 강한 공유 첨부 활성 종의 감소 구조적 자유 때문에 낮은 활동 일반적으로 발생합니다. 캡슐화는 효소 어려움 또는 diffusional 한계 때문에 감소 된 활동에서 발생할 수 있습니다. 6

온화한 (종종 별명된 ' bioinspired') 실리 카 종합의 분야에서 최근 개발 현장에서 의 캡슐화 생체 및 다른 활성 종 소재 합성 동안 설립 했다. 7 , 8 , 9 이 방법은 기존의 동원 정지의 단점의 많은 원소-chemisorption 접근 달리는 biomolecule의 구조적 자유 약한 noncovalent 상호 작용의 주위 공 구멍 형태로 사용에 의해 유지 된다 biomolecule, 여전히 방지 leaching. 사실, 캡슐화 생체 및 전체 셀,10 의 범위에 대 한 작동 하도록 입증 되었습니다 하 고 bioinspired 비활성화 때문에 가혹한 과정 등 실리 카 효과에 캡슐화를 통해 상태를 피할 수 있다. 7 , 11

여기 설명 하는 방법의 목표 bioinspired 유기 첨가제를 사용 하 여 주위 조건 하에서 제어할 수 있는 속성을 가진 다공성 실리 카를 준비 하는 것입니다. 메서드는 선택 표시 한다 무기 또는 bioorganic 분자의 캡슐화를 포함 하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 우리는 더 산 차입을 통해 유기 서식 파일을 제거 하 여 원하는 대량 속성 및 정화를 달성 하기 위해로 synthesised 자료를 수정 하기 위한 손쉬운 방법을 보여줍니다.

템플릿 다공성 실리 카 지원 (예:실리 카 재료 MCM-41 또는 SBA-15 같은 supramolecular 계면 활성 어셈블리를 통해 템플릿)12 이 방법은 훨씬 빠르고 더 온화한, 사용의 전통적인 합성에 비해 맞게, 수많은 immobilization 단계와 힘 드는 정화에 대 한 필요 없이 현장에서 캡슐화. 또한, calcination 보다 산 차입의 사용 유기 표면 기능화의 가능성을 엽니다.

이 방법은 매우 physisorption 발견 누가 활성 종 동원 정지 또는 효과적 이도록 화학식 동원 정지에서 이러한 작업에 적용 됩니다. Bioinspired 합성은 유일 하 게 기존의 템플릿 실리 카 재료에 비해 산업화에 대 한 배치 프로세스 스케일-업 연구 들도 유용 합니다. 13 , 14 이 방법은 포토닉스, 자료 구조에 대 한 내는 소재 예:숨 구멍의 정렬 된 배열이 필요로 하는 응용 프로그램을 권장 하지 않습니다 대량 속성에 어떤 유사성에도 불구 하 고 무질서 이다.

Protocol

1. 전조 솔루션 (및 선택적 모듈 솔루션)의 준비

  1. 180 mL 플라스틱 용기에 규 산 나트륨 pentahydrate (318.2 mg)의 1.5 m m o l을 측정 하 고 이온된 물 20 mL에 용 해.
  2. 마찬가지로, 두 번째 컨테이너에서 pentaethylene hexamine (PEHA, 58.1 mg)의 0.25 mmol을 측정 하 고 이온을 제거 된 물 20 mL에 용 해 키를 누릅니다.
    1. 다른 포함 하는 아민 화합물 예를 들어,diethylenetriamine (만) 또는 triethylenetetraamine (TETA)를 사용할 경우 되도록 총 Si:N 몰 비율 일정 1 (즉, 해당만의 0.5 m m o l 또는 0.375 mmol TETA에의 하 설명한 절차)15.
    2. 고분자 아민 첨가제 예를 들어,poly(ethyleneimine) (페이) 또는 poly(allylamine hydrochloride) (PAH)을 사용 하 여, 1 mg/mL (최종 반응 볼륨)15의 농도 유지 합니다.
      주의: 그들은 부식성 또는 독성 (특히 증기)로 그들의 순수한 형태에서이 아민 증기 두건 안쪽만 처리 합니다.
  3. 합성 하는 동안 제자리에서 캡슐화를 수행 하려면 미리 결정 된 대량의 단백질 분해 (본 50 mg의 소 혈 청 알 부 민, BSA) 이온된 물 5 mL에. 이 양의 규 산 나트륨 pentahydrate의 해산에 사용할 이온된 수의 볼륨에서 물 빼기.
    1. 일단 이온된 수 혼합의 구조를 변경 하지 않고 단백질 해체를 쉽게 하기 위해 컨테이너를 뚜껑과 4 ° c.에 저장 때때로 교 반 없이 선호 해체 진행 상황을 확인 합니다.

2. 실리 카 합성

  1. 규 산 나트륨 pentahydrate와 180 mL 컨테이너 중 하나에 대 한 PEHA 솔루션을 결합 하 고 최종 수 있도록 충분 한 이온된 수 추가 솔루션 볼륨 41 mL (또는 46 제자리에서 캡슐화를 생략 하는 경우).
  2. 갓의 혼합물 규 산 나트륨과 PEHA 솔루션 일관 된 혼합을 제공 하는 활동가 바 추가 활동가 접시 위에 놓습니다.
  3. 이 혈관으로 pH 프로브를 일시 중지 하 고 초기 pH를 기록 합니다.
    1. 이 단계에서 필요에 따라 단계 8.1에에서 설명 된 대로 몰 리브 덴 블루 spectrophotometric 분석 결과 사용 하 여 초기 [시] 농도의 나중에 결정에 대 한 시작의 750 µ L 약 수를 제거 합니다.
  4. 그림 1에서 계산한 1 M HCl의 정해진된 수량을 추가 하 여 합성을 시작 하 고 탁도의 즉각적인 진화를 관찰 ( 그림 2참조)
  5. 최대한 빨리 산 추가에, 추가 모듈 솔루션 (있는 경우) 가능한 한 빨리.
    참고: 이러한 수량 주어진 마지막 볼륨 30 m m의 Si와 N 농도 선도 총 반응 혼합물의 50 mL입니다. 이 조정 될 수 있다 일정 금액 수량 보다 곱하여 원하는.
  6. 반응 완료; 확인 하려면 5 분 후 pH를 기록 pH 7 ± 0.05 인지 확인 합니다.

3. 산 차입 자료의

  1. 반응 더 산의 추가 의해 (또는으로 만든 coagulum 실리 카의 이전 합성된 샘플을 resuspending 하 여) 완성에 도달 했습니다 후 생산된 실리 카의 구성을 수정 합니다.
  2. 실리 카 resuspending, 180 mL 플라스틱 용기에 이온된 물 100 mL를 약 150 mg으로 준비 bioinspired 실리 카를 혼합 하 고 활동가 접시 위에 놓습니다.
  3. 일단 정지 잘 혼합 하 고, 선박에서 pH 프로브를 일시 중단 합니다.
  4. (7과 2) 사이 원하는 pH에 도달할 때까지 더 HCl에 적정 하 고 ca. 안정화 될 수 있도록 1 분.
  5. 시스템은 완전히 equilibrated 하 고 고체 실리 카 분리 진행 추가 5 분을 기다립니다.

4. 실리 카 분리 및 건조

  1. 50 mL 원심 분리기 튜브 bioinspired 실리 카 현 탁 액을 가만히 따르다.
  2. 15 분 동안 5000 g에서 정지 원심
  3. 원심 분리 후에 추가 분석 (예를 들면, Bradford 분석 실험, 아래 참조)에 대 한 저장소는 상쾌한을 제거 합니다. 이온된 수, 원심 분리기 튜브를 리필 하 고 다시 실리 카와 동 믹서를 사용 하 여 일시 중단.
  4. 원심 분리, 표면에 뜨는 저장 및 다시 중지를 두 번 반복 합니다.
  5. 최종 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 하 고 세라믹 도가니에 실리 카를 다쳤어요.
  6. 밤새 85 ° c.에 오븐에 건조
    1. 경우 캡슐화 자리를 차지 하 고, 단백질 변성을 피하기 위해 동결 시설 또는 진공에서 운영 하는 오븐을 사용 합니다.

5. 몰 리브 덴 생산 [Si] 측정 시 약 (MBR) 블루

  1. 플라스틱 1l 부피 플라스 크, 8 mmol (10 g) 황화 몰 리브 덴 tetrahydrate 증기 찬에 추가 합니다.
  2. 500 mL 이온된 물 교 반 아래에 이것을 분해.
  3. 신중 하 게 10 M HCl 해결책의 60 mL을 추가 하 여 솔루션을 시 어 지 다.
  4. 1 나에 마지막 볼륨 조정

6. 파라 aminophenol 황산 염 감소 시키는 대리인 (RA) [시] 결정의 생산

  1. 연기 찬에 활동가 접시에 주위 온도에 물 욕조에 500 mL 유리 부피 플라스 크를 배치 합니다.
  2. 파라-aminophenol 황산 염 및 아 황산 나트륨의 16 mmol (2 세대)의 무수 산의 111 mmol (10 g), 19.5 m m o l (3.35 g)를 추가 하 고 250 mL 물에 용 해.
  3. 신중 하 고 천천히 교 하면서 포화 황산의 92 g (50 mL)을 추가 하 고 냉각 솔루션에 대 한 기다립니다.
  4. 마지막으로, 이온 물 500 mL를 희석.

7. Silicomolybdic 산 분석 결과 단위체 실리 카 종에

  1. 5 mL 플라스틱 병에서 MBR의 희석 300 µ L 단계 5.4 이온된 물 3 mL에서에서 생산.
  2. 10 µ L silicic acid 테스트 솔루션 및 쉐이크 믹스를 추가 합니다.
    참고:이 솔루션 천천히 노란색 돌 것 이다.
  3. 정확히 15 분 후의 블루 이성질체에 복잡 한 노란색 silicomolybdate를 줄이기 위해 섹션 6에서에서 준비 하는 원제의 1.6 mL를 추가 합니다.
  4. 적어도 2만 24 시간 이상 개발에 파란색을 수 있습니다.
  5. 810에서 샘플의 흡 광도 측정 대 일 분 광 광도 계에 nm 교정 곡선에 대 한 [시]를 계산 하 고.

8. 실리콘 폴리머 실리 카 종에 Molybdic 산 성 시험

  1. Microcentrifuge 튜브, 몰 리브 덴 블루 메서드를 사용 하는 polysilicate 종의 농도 측정 하기 위해 2 M 수산화 나트륨 용액의 750 µ L 750 µ L 실리 카 서 스 펜 션 결합 되어 있습니다.
  2. 인감과 microcentrifuge 부유물에서 장소입니다.
    1. 충분 한 headspace 압력 구축으로 인해 파열을 방지 하기 위해 튜브에 남아 확인 합니다.
      참고: 500 µ L의 headspace 이것을 피하기 위하여 일반적으로 충분 하다. 또는, 절차 수 실시 오픈 튜브에서 너무 오랫동안 증발으로 인해 액체 손실 비율인.
  3. Microcentrifuge 튜브 80 ° C에가 열 물 욕조에 플 로트 그리고 1 시간에 대 한 해산을 두고.
  4. 1 시간 경과 후 microcentrifuge 튜브를 제거 하 고 외부 건조를 닦아냅니다.
  5. 일단 냉각, [Si] 위에서 설명한 단계 7.2 7.5에서에서 설명한 대로 확인할 수 있습니다.

9. 브래드 퍼 드 실리 카에서 단백질 농도의 결정에 대 한 분석 결과 절차

  1. 각 할당 된 베트에 (실 온) Bradford 시 약 및 샘플의 미리 정해진된 금액을 삽입 (특정 볼륨에 대 한 표 1표 2 참조). 모든 베트에 대 한 일회용 피 펫 팁을 사용 하 여 시의 특성상 볼륨 변경 방지 하 고 3 중에 각 포인트를 반복.
  2. 3 번 반전 하 여 각 베트를 혼합 하 고 10 분에 대 한 개발을 두고.
  3. 595에서 흡 광도 측정 순수한 상쾌한을 사용 하 여 빈으로 nm.
  4. 각 측정에서 흡 광도 컨트롤 샘플 (모두 분석에 베트 번호 0)에 대 한 발견을 빼서 각 베트의 원래 흡 광도 계산 합니다.
  5. 보정 곡선 (그림 3)를 사용 하 여 알 수 없는 샘플의 단백질 농도 계산 합니다. 원래 샘플의 희석 시 희석 요인 설명 될 필요가 있다.
    1. 분석 결과 감도 영향을 줄 수 임의의 변동 피하기 위해 BSA의 농도 대 한 플로팅 측정 된 흡 광도 의해 실험의 각 세트에 대 한 교정 곡선을 만듭니다.
    2. 비록이 단백질 분석 결과를 사용 하 여 BSA는 표준으로 모든 종류의 단백질을 정량 의미 된다, 향상 된 정확도 대 한 관심의 각 특정 단백질에 대 한 교정 곡선을 만듭니다.
    3. 알 수 없는 샘플의 단백질 콘텐츠 교정 곡선의 적용된 범위 보다 높을 것으로 예상 된다, 하는 경우 필요에 따라 그것을 희석.
  6. 다시-서 스 펜 션 가능한 단백질 손실 모니터링 하는 동안 각 샘플에 대 한 단백질 함량을 결정 합니다.

Representative Results

위에서 설명한 기술을 지속적으로 그리고 reproducibly 침전 실리 카 수 있습니다. 이것은 반응 배는 동요의 정지시 자발적으로 침전 된 실리 카 (그림 2)의 두꺼운 coagulum 정착 내 탁도의 급속 한 개시에 의해 결정 하는 가장 쉬운. 반응의 범위 그리고 그러므로 항복 분리 후이 coagulum의 질량을 측정 하 여 확인할 수 있습니다 일반적으로 58 ± 6.5% (그림 4, 황색).

반응 진행에 더 통찰력 적응 반응이 있어야 그 종 unreacted 단위체 규 산 염 종의 양을 감지 하 몰 리브 덴 블루 분 광 방법에 의해 생성 될 수 있습니다 polysilicates 또는 '올리고' 형성 하지만 응고에 충분 한 크기를 도달 하는 관리 하지 않은 (그림 4, 빨간색과 파란색 각각).

강 수 반응에 대 한 다른 적정 효율을 비교할 때 특히 특정 실리 카 speciation 데이터는-에 단위체 실리 카의 중 합에 영향을 미치는 방법 즉, 최종 반응 pH와이에 속도 도달할 경우는 '올리고 머'와 그 후속 응고 고체 실리 카를. 산 단계 2.4에에서 약간 추가의 금액을 수정 하 여 아래-또는 오버-titration 반응 혼합물의 수 있습니다 (그림 5)를 수행. 이 두 경우에 다시 실리 카 종 형성을 측정 하 여 명확한 차이 볼 수 있습니다 반응 완료 (그림 4)에 반응 (그림 5)의 적정 프로필에만 사소한 변화에도 불구 하 고.

차이가 (29-33% 사이 남아 있는) 3 개의 반응 경우 단위체 종의 소비 사이 존재 이지만, 각 케이스에서 침전 oligomeric 실리 카 종의 분명 한 차이가 있다. 이것은 전통적인 이론 솔-젤 침-'언더' 경우에 pH 개최에 대 한 더 높은 이상, 개별 입자 성장을 허용 하 고 따라서 효율적인 응고; 방 조 동의 응고를 훨씬 더 빨리 유도 하 여 신속한 적정 때문 '슛' 경우에 따라서 적은 실리 카 종족의 응고 및 콜 로이드 단계에 갇혀 유지 하는 충분 한 크기를 성장 했다. 16

적정 시 실리 카 형성의 중요성을 감안할 때, 적절 한 적정 볼륨의 선험적 지식이 필수적 이다. 비록 하지 아민 첨가제와 응고에 실리 카 표면 산 성도, 신뢰할 수 있는 경험적 관계 시스템 내용, 농도 사이 변화의 복잡 한 protonation 동작으로 인해 반응 산출할에서 추출 물 및 titer 볼륨은 쉽게 생성 (그림 1).

응고 완료 되 면 소재 표면 수정할 수 있습니다 쉽게 산 차입을 통해 최근 다른 저자에 의해 보고 되었습니다. 13 소재 속성 구성, 다공성, 첨가제 (그림 6a , b)의 화학 활동 등의 미세 조정 가능 합니다.

그러나이 연구에서는 BSA 견본 모듈 효소로 사용 되었다,, 여기에 설명 된 기술을 사용할 수 있습니다 여러 효소17,18. 단백질 검출에 대 한 다음 프로시저 Bradford 분석 실험 프로토콜,19 supernatants 각 원심 사이클에서 저장 된를 사용 하 여 이다. 상쾌한에 단백질의 양은 0 단백질 콘텐츠 (컨트롤 샘플) 샘플의 상쾌한에 용 해 하는 BSA의 알려진된 금액에서 만든 보정 곡선을 사용 하 여 계산 됩니다. 실리 카에 캡슐화 하는 단백질의 양은 단백질 추가의 초기 금액에서 supernatants에 감지 된 단백질의 빼기로 계산 됩니다. 분석 결과에 필요한 유일한 시는 Bradford 시 약 (조달 또는 표준 조리법에 따라).

샘플 볼륨, 감지 단백질의 예상된 금액 및 사용 되는 측정 방법에 따라 분석 결과 형식의 세 가지 유형이 있다. 여기, 뒤 포맷은 분 광 광도 계에 대 한 지정, 매크로 마이크로 크기의 일회용 큐 벳 필요 하며 1.4 mg/ml 단백질의 10 µ g/mL에서 검색할 수 있습니다.

그림 7 에서 각 세척 (4.3 단계) 후 감지 하는 단백질의 양은 (이 50mg) 초기 단백질 금액의 %로 표시 됩니다. 약 BSA의 50% ~ 50% 동원 정지 효율에 관한 첫 번째 원심 분리 후에 상쾌한에 검색 되었습니다. 아무 BSA 감지, 다음 세척, BSA (또는 다른 효소) 안전 하 게 거르는-와 실리 카 합성 중 캡슐화 될 수 있었다 이것은이 방법의 중요 한 이점은 이다. 생산 하는 실리 카에 BSA의 존재를 확인, 푸리에 변환 적외선 분광학 (FTIR) 분석 수행 되었다. 아 미드의 특성 밴드의 존재 I 및 II 1500/cm와 샘플에서 1650/cm (그림 8)의 영역에 존재 BSA, 준비 하지만 하지 컨트롤 샘플 (BSA)는 고체에 BSA의 존재를 확인.

효소 추가 (BSA 중화 반응 혼합물의 중 추가) 위에서 설명한 방법 이외에 다른 가능한 변화 예를 들어,BSA 추가 규 산 염 및 첨가제 솔루션, 중화 전에 혼합 하는 동안 또는 효소 그들의 혼합 하 고 중화 하기 전에 규 산 염 또는 첨가제 솔루션에 추가 합니다. 일부 이러한 가능성의 더 탐험 했다 그리고 동원 정지 효율성 (BSA 움직일 Bradford 분석 실험을 기준으로 계산 반응 시스템에 추가 하는 효소의 비율의 질량) 및 최종 실리 카에 BSA의 양이 측정된 ( 농도 BSA의 실리 카 생산, 총 복합 무게의 그림 9참조). 그것은 분명 BSA는 unreacted 시 약 ( 그림 9에 A-C의 경우)에 추가 될 때 거기 동원 정지 효율 또는 결과 합성에서 BSA의 금액에 상당한 차이가 있었다. 그러나, BSA는 실리 카 형성 ( 그림 9의 경우 D) 동안 추가 되, immobilization 효율 및 최종 제품에 BSA의 금액 했다 둘 다 크게 낮은. 이러한 차이도 불구 하 고 생산 하는 실리 카의 평균 금액 (85-90 mg) 사이 그대로 남아 있었다. 이 관측은 BSA, 규 산/실리 카 및 첨가제의 이온화 (또는 전자 포인트)에 근거 하 여 설명할 수 있다. 추가의 다른 방법 효소 및 실리 카 전 사이 다른 상호 작용에 대 한 수 있습니다. 효소 변경의 추가 시 pH로 각 종족의 이온화 차례로 immobilization 효율 제어 intermolecular 상호 작용을 결정 합니다.

멧 없음 BSA (mg/mL)의 농도 브래드 퍼 드 시 약 (mL) 샘플 (mL)
0 0 (제어) 1.5 0.05
1 0.1 1.5 0.05
2 0.25 1.5 0.05
3 0.5 1.5 0.05
4 0.75 1.5 0.05
5 1 1.5 0.05
6 1.25 1.5 0.05
7 알 수 없는 샘플 (X) 1.5 0.05

표 1: 매크로 Bradford 분석 결과 및 계산된 구성 요소 볼륨. 유효 측정 범위 0.1-1.4mg/mL (볼륨 1 복제에 대 한)

멧 없음 BSA (ug/mL)의 농도 브래드 퍼 드 시 약 (mL) 샘플 (mL)
0 0 (제어) 1 1
1 1 1 1
2 2.5 1 1
3 5 1 1
4 7.5 1 1
5 10 1 1
6 알 수 없는 샘플 (X) 1 1

표 2: 마이크로 Bradford 분석 결과 및 계산된 구성 요소 볼륨. 결정에 대 한 유효 범위는 1-10 µ g/mL (1 복제 볼륨)

Figure 1
그림 1 : Titer 볼륨만 또는 PEHA는 첨가제로 사용 하 여 반응 시스템에 대 한 실리 카 농도 대 한 필요합니다. 실리 카는 [N]을 유지 하면서 다양 한 농도에서 합성 되었다: 2 개의 다른 첨가제 화학 물질에 대 한 1의 [시] 비율. 오차 막대는 1 표준 편차 평균 주위. 

Figure 2
그림 2 : 솔루션 탁도 보여주는 최적의 반응의 지표로 침전 반응 용기 중 (a) 및 (b) 동요, 후에 실리 카 coagulum의 사진.  

Figure 3
그림 3 : 브래드 매크로 분석 결과 대 한 표본 보정 곡선. Bioinspired 실리 카 합성에 BSA의 부재에서 상쾌한 후 Bradford 분석 수행 단계 9.1에서에서 설명 된 대로 단백질의 알려진된 양을 혼합입니다.

Figure 4
그림 4 : 다른 반응 조건에 대 한 실리 카의 최종 중 합 상태. 최적의 (기준선) 조건을 사용 하 여 실리 카 합성 이상-또는-적정, 후 상대 실리 카 농도 단위체 또는 dimeric 규 (빨간색), polysilicate '올리고' (파란색)에 대 한 계량은와 마찬가지로, 불안정 한 응고 실리 카 (노란색)입니다.

Figure 5
그림 5 : 초기 titer 볼륨의 기능으로 반응 시스템을 통해 pH의 진행. 산은 즉시 약을 복용 후 ca. 정의 혼합 하 고, 빠르게 8 아래 드롭 pH을 일으키는. 그 후, 추가 산 양의 자동으로 약을 복용 같은 그 pH 7.0 ± 0.05 300s 초기 추가 후. 지나치게 넣는 경우이 아니었다 달성, 초기 복용량 7, 300 후 pH 6.65 도달 pH를 삭제 하기에 충분 했다. 초기 HCl 볼륨 '언더', '기준'에 대 한 추가 하 고 '슛' 되었고 6.90, 7.05, 7.20 mL 각각.

Figure 6
그림 6 : 대표 속성 변경 coagulated 실리 카 물질의 산성화에. (pH, 관련 첨가제 농도의 변화 a) 및 (b) 실리 카 다공성 pH 기준의 변화 매닝 에서 재현 13 크리에이 티브 Commons 라이센스입니다. 

Figure 7
그림 7 : Bioinspired 실리 카 합성 supernatants BSA 농도. Bradford 분석 실험 후 원심 분리에서 결정 되었다 (따라서 합성된 실리 카에서 가려진) 상대적인 양을 남은 반응 supernatants에 실행 되었다.

Figure 8
그림 8 : Bioinspired 실리 카와 활성 종 캡슐화 없이 FTIR 분석. 스펙트럼을 보여주었다: 블랙 라인: bioinspired 실리 카, 회색 선: 순수 BSA, 블루 라인: bioinspired 실리 카 BSA와 함께 로드 된. 수직 점선된 라인 특성 아 미드 밴드를 나타냅니다. 

Figure 9
그림 9 : 동원 정지 효율성 및 BSA의 실리 카에 대 한 합성 PEHA를 사용 하 여 생산. BSA와 규 산 염, 혼합 하기 전에 (A) PEHA 솔루션에 추가 되었습니다 (B) PEHA, PEHA 및 규 산 염 혼합 후 PEHA 규 산 염 솔루션 및 (D) 의 초기 혼합 후 (C) 와 혼합 하기 전에 규 산 염 솔루션에서 솔루션 및 중화 합니다. 효율성은 추가, 실리 카에 BSA 질량 % 농도 BSA의 최종 실리 카 합성에서을 의미 하는 동안 총 BSA의 비율로 반응 혼합물에서 캡슐화 %BSA 측정 됩니다. 오차 막대는 1 표준 편차 평균 주위.

Discussion

현재 작업에서 우리는 빠르게 계기 bioinspired 실리 카 재료 및 생체의 캡슐화 거기에 하는 방법 제시. 절차, 즉 반응 시작 산을 추가할 수 및 biomolecule 모듈의 추가의 타이밍의 금액 내에서 중요 한 단계를 설명 합니다. 우리 모두 반응 진행 및 수율에 산 추가 금액의 효과 보여 (그림 4그림 5, 각각), 합성 조건,이 감도도 불구 하 고 일관성 있게 꽉 제어 하는 방법을 시연 했다. 그러나 활성 종 캡슐화에 관한 절차의 측면에서 간단 하지만 캡슐화 표시 됩니다 (또한, 또한, 환경 조건 pH의 순서), 실험 조건에 민감한, 자료의 일관성 속성은 다시 달성 이다.

합성 조건15 형태학 및 porosities의 범위를 제공 하는 많은 출판 되었습니다 다른 곳, 다른 첨가제를 사용 하 여 수정할 수 있습니다. 온화한 정화13 및 표면 아민 장식 등 추가, 이후 합성 기술은 수정 하 고 bioinspired 실리 카 재료를 화학적으로 맞게 보고 되었습니다. 20 마지막으로, 온화 하 고, 수성의 특성상 합성, 제자리에서 캡슐화 가능 하다 그 효소17,18 에서21 , 전체 세포에 이르기까지 여기, 시연 보다는 기판의 광범위에 대 한 금속 염,22 활성 제약 성분,23 및 양자 점. 24

(같은 자료의 MCM-41 또는 SBA 15 가족) 다른 중재 유기 실리 카 종합, 달리 첨가제 생산 수 없습니다 bioinspired의 polyfunctional 자연 주문 기 공 구조도 높은 단 분산 입자 크기 분포 Stöber-타입 실리 카의 특성입니다. 25 이 bioinspired (특별 한 경우) 이외의 첨가물26 의 잘 정의 된 micellization 동작의 부족와 결합의 증가 촉매 활동 monofunctional 포함 하는 아민 첨가제를 통해. 26

다른 한편으로,이 polyfunctional 첨가제 자연 짧은 반응 시간 및 더 온화한 온도 및 다른 중재 유기 실리 카 종합에 비해 압력의 사용을 수 있습니다. 이것 또한 리드 룸 온도 첨가제 차입의 가능성에, 위에서 설명한 대로 아직이 다른 실리 카 가족 때문에 구체적인 그들의 표면 화학에 대 한 달성 될 수 있다. 27 , 28 , 29 따라서, bioinspired 실리 카 재료 표시 되었습니다 모두 더 경제적이 고 실용적인 쉽게 상용화 및 개발으로 이어지는 큰 규모에서 생산 될. 14

요약 하자면, bioinspired 실리 카 합성 활성 종 지원 또는 가스 매 미디어 생산에 대 한 신속 하 고 손쉬운 방법을 나타냅니다. 중 고 반응 후 pH의 꽉 컨트롤을 통해 다양 한 실리 카 아민 합성 종합 될 수 다양 한 속성, 제자리에서 캡슐화의 다른 유기의 가능성에 의해 보완 추가, 무기, 또는 바이오-유기 재료. 비록 bioinspired 첨가제 및 모듈 농도의 독립 후 합성 수정 아직 달성 될, 이러한 방법은 환경 양성 화학 공정으로 유망한 단계를 나타냅니다.

Disclosures

저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 화학의 부 및 생물 공학 (셰필드의 대학), EPSRC (EP/L017059/1 및 EP/P006892/1)에서 금융 지원을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silica synthesis
Sodium silicate pentahydrate Fisher scientific 10070470
Pentaethylene hexamine (PEHA) Sigma-Aldrich 292753
Diethylenetriamine (DETA) Sigma-Aldrich D93856 Toxic
Triethylenetetraamine (TETA) Sigma-Aldrich 90460
Poly(ethyleneimine) (PEI) Polysciences 6088 1.2K MW
Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) Sigma-Aldrich 283215 17.5k MW
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Hydrochloric acid (HCl) 1M Fisher Scientific 10487830
Silicomolybdic acid assay
Ammonium molybdate tetrahydrate Sigma-Aldrich A7302 Product replaced by M1019
Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt Fluka Analytical 84436
Anhydrous oxalic acid Sigma-Aldrich 75688
Para-aminophenol sulphate Fisher Scientific 10446880
Sodium sulphite Fisher Scientific 10234400
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 84727
Bradford assay
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916
Equipment
Autotitrator Titrando 902 Metrohm 2.902.0010
801 magnetic stirrer plate Metrohm 2.801.0040 For use with above
800 Dosino Metrohm 2.800.0010 For use with above
Aquatrode Plus Metrohm 6.0253.100 For use with above
Centrifuge Sorvall ST16 Thermo Scientific 11814243 Code is for Fisher scientific
UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A Thermo scientific 12104972 Code is for Fisher scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. 607-630 (2004).
  2. Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas - benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42, (15), 6277 (2013).
  3. Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47, (45), 8582-8594 (2008).
  4. Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38, (2), 453-468 (2009).
  5. Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42, (15), 6213-6222 (2013).
  6. Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, Á, Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42, (15), 6290-6307 (2013).
  7. Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, Springer Netherlands. Dordrecht. (2014).
  8. Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22, (2), 211-213 (2004).
  9. Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26, (10), 566-572 (2008).
  10. Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13, (33), R673-R691 (2001).
  11. Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20, (5), 844 (2010).
  12. Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
  13. Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10, (8), 1683-1691 (2017).
  14. Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
  15. Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47, (27), 7567-7582 (2011).
  16. Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. Wiley. http://books.google.co.uk/books?id=Dc0RAQAAIAAJ (1979).
  17. Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49, (31), 3191-3193 (2013).
  18. Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1, (8), 1164 (2013).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, (1-2), 248-254 (1976).
  20. Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
  21. Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50, (27), 6239-6242 (2011).
  22. Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8, (1), 567-576 (2017).
  23. Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2, (9), 1493-1503 (2016).
  24. Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2, (1), 33-39 (2010).
  25. Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21, (4), 1516-1523 (2005).
  26. Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (16), 5963-5968 (2008).
  27. de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
  28. Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
  29. Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8, (8), 2068-2079 (1996).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics