הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עייפות היא משותפת, מתישה מצב זה משפיע על חולי סרטן. עד כה, עייפות נשאר גרוע מאופיין עם אבחון לא מבחן אובייקטיבי מודדים את חומרת המצב הזה. כאן נתאר שיטת אופטימיזציה להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי של PBMCs שנאסף חולי סרטן עייף. באמצעות מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית הזרקה רציפים של מעכבי נשימה, נבחנו המצב התפקודי מיטוכונדריאלי PBMC על ידי מדידת נשימה מיטוכונדריאלי הבזליים לקיבולת בדרכי הנשימה, אנרגיה פנוטיפ, המתאר מסלול אנרגיה מועדף להגיב על הלחץ. PBMCs טריים זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל. וזמינותו כולו שמתואר פרוטוקול זה יכולה להסתיים תוך פחות מ 4 שעות ללא המעורבות של טכניקות הביוכימי מורכבים. בנוסף, אנו מתארים שיטה לנרמול הדרוש להשגת לשחזור נתונים. השיטות הליך ונורמליזציה פשוטה הציג מאפשרים איסוף הדגימה חוזרות ונשנות מן החולה באותו הדור לשחזור נתונים ניתן להשוואה בין נקודות זמן כדי להעריך את תופעות הטיפול האפשריות.

Introduction

עייפות היא מצב נפוץ ומצערת זה יש השפעה שלילית על איכות החיים של חולי סרטן1. מועד זה, סרטן נשאר גרוע מוגדר ועייפות מסתמך רק על דיווח סובייקטיבי על-ידי חולים2. לכן, יש צורך דחוף לזהות ניסוי מעבדה אבחון להתאמה בקלות לאפיין באופן אובייקטיבי עייפות3,בקביעת קליני4.

מנגנונים כבסיס מרובות, כולל תפקוד המיטוכונדריה, הוצעו כדי לגרום לעייפות5. המיטוכונדריה הם organelles תחנת כוח, מתן 95% צרכי האנרגיה התאית באמצעות זרחון חמצוני, ולשחק תפקיד חשוב סידן איתות אפופטוזיס, המערכת החיסונית איתות, ויסות תאיים אחרים איתות האירועים6 . בהתאם לכך, ביואנרגיה מיטוכונדריאלי לקוי, פגמים בייצור אנרגיה עשויים לתרום עייפות. תמיכה השערה זו, מחקרים קודמים מקיימות מוטציות ב- DNA מיטוכונדריאלי בחולים עם תסמונת התשישות הכרונית7. אמנם עדיין לא ברור אם מקור pathophysiological עייפות טמון בתוך מערכת העצבים המרכזית או רקמות היקפיים, כגון שרירי השלד8,9, יש כיום אין שיטה ישירה להעריך במדויק תפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורים עייפות בתאים חיים, respiring.

באמצעות תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) ללמוד פונקציה מיטוכונדריאלי מציע מספר יתרונות. ראשית, PBMCs זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל, ניתן לבודד במהירות באמצעות טכניקות מעבדה בסיסית. שנית, איסוף דם הוא פחות פולשניים איסוף לרקמות אחרות כגון ביופסיה של השריר. לפיכך, דגימות דם ניתן לאסוף מן המטופל אותו שוב ושוב לאורך זמן, אשר מקלה על הערכת האורך של השפעות הטיפול. מעניין, פונקציית מיטוכונדריאלי PBMCs הופיע טוב בקורלציה עם כליות מצב מיטוכונדריאלי במודל חיה10. יתר על כן, תא החיסון המיטוכונדריה שימשו כמדד לזיהוי שינויים מערכתית תחת מחלות שונות בתנאים11,12. המיטוכונדריה במחזור תאים חיסוניים הם רגישים לשינויי פונקציות החיסונית במיוחד ואת המערכת החיסונית איתות מולקולות כגון ציטוקינים13,14,15. לדוגמה, זה נצפתה PBMCs של חולים עם מחלות דלקתיות פרקים חריפה התערוכה צריכת חמצן בסיסית גבוהה14. לעומת זאת, צריכת חמצן צומצם ב PBMCs מבודדים מחולים עם התנאים דלקתית מערכתית כולל אלח דם16. תחת תנאים דלקתיים, רדיקלים חופשיים המיוצר על ידי המיטוכונדריה לקוי עשוי נוספת לתרום סטרס חמצוני גבוהות ו דלקת ממושכת17. התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בהפקת אנרגיה, כמו גם כמו סטרס חמצוני מציע השירות פוטנציאל של שימוש ב- function מיטוכונדריאלי כמדד ללמוד עייפות חולי סרטן 13.

מחקרים קודמים בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי מנוצל טכניקות הביוכימי, מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי או בידוד של אוכלוסיות תאים מסוים עשוי להיות לא ברצון וישימה בקביעת קליני5, 14,18. בשנים האחרונות, ההתפתחות של מבחני חוץ-תאית השטף איפשר לחוקרים בקלות ולבחון באופן מדויק שינויי קצב צריכת החמצן (OCR) בתגובה זריקות אוטומטיות של מעכבי נשימה19,20 , 21 , 22. עם זאת, רוב המחקרים הללו תוכננו עבור סוגי תאים ספציפיים ולא בפורמט גדול תפוקה גבוהה ניתן החלים בסביבה קלינית. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטבת לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי לשימוש קליני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר הנוכחי (NCT00852111) אושרה על-ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של במכון הלאומי של בריאות (NIH), בת'סדה, מרילנד. המשתתפים שהשתתפו במחקר זה היו גברים euthymic, 18 שנה ומעלה, אשר אובחנו עם סרטן הערמונית-גרורתי עם או בלי prostatectomy מוקדמת, היו אמורים לקבל טיפול קרינתי חיצוני קרן (EBRT). המשתתפים הפוטנציאליים שוחררנו אם היה להם מחלה פרוגרסיבית אשר עלול לגרום עייפות משמעותית, היה מחלה פסיכיאטרית מתוך חמש השנים האחרונות, היו שלא תוקנו בלוטת התריס או אנמיה, או היה גידול ממאיר השני. יחידים אשר השתמשו בכדורי שינה, סטרואידים או סוכנים אנטי דלקתיות לא סטרואידיות היו גם לא נכלל. דגימות דם בקרה בריאים התקבלו לרפואה NIH המחלקה של עירוי דם מתורמים בריאים תחת פרוטוקול שאושרו על-ידי IRB (NCT00001846). כל המשתתפים הם גייסו מגנוסון קלינית במרכז המחקר ב- NIH. ההסכמות מידיעה בכתב חתום התקבלו לפני ההשתתפות במחקר.

1. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה הכנה (יום 1 של הניסוי)

  1. מימה חיישן מחסנית (ראה טבלה של חומרים; משך משוער: 5 דקות).
    1. הסר את חיישן מחסנית של החבילה. להוסיף 200 μL Calibrant פתרון לבאר כל צלחת השירות ולאחר מכן למלא כל חפיר עם פתרון Calibrant μL 400.
    2. לחזור חיישן צלחת הצלחת השירות, עכשיו שיש פתרון Calibrant בו. מימה את המחסנית חממה 37 ° C-CO2 בן לילה.
      הערה: חיישן מחסנית צריך להיות להתייבש מינימום של 4 שעות, לכל היותר 72 h.

2. הכנת הדוגמא קלינית (יום 2 של הניסוי)

  1. למדוד עייפות בעזרת 13-פריט פונקציונאלי הערכה של כרונית מחלות הטיפול - עייפות (FACIT-F)2,23,24 -בסיסית (לפני EBRT חניכה), נקודת האמצע והשלמה של EBRT ולאחר שנה אחת פוסט-EBRT.
    1. להשתמש 0 - מידה 4 עבור כל פריט תגובה, כאשר 0 מייצג "". בכלל לא- ו 4 מציין כי המשיב מתייחס המשפט המתאים "תודה רבה" הציונים הכלליים צריך לנוע בין 16-53, עם ציונים נמוכים המשקף בעוצמה גבוהה עייפות.
    2. להגדיר עייפות כמו ציון FACIT-F נמוך יותר 43, עם ציון FACIT-F של ≥43 המציין היעדר או עייפות לא-משמעותיים קלינית2.
      הערה: ציון FACIT-F של 43 הטוב ביותר מחלק ציונים עייפות של חולי סרטן, את האוכלוסייה הכללית2.
    3. כוללים את הפריטים הבאים 13 בסולם עייפות FACIT: 1) אני מרגיש עייף; 2). אני מרגישה חלשה בכל מקום; 3) אני מרגישה תשושה ("נשטף החוצה"); 4) אני מרגיש עייף; 5) אני מתקשה מתחיל דברים כי אני עייפה; 6) אני מתקשה לסיים דברים כי אני עייפה; 7) יש לי אנרגיה; 8). אני מסוגל לעשות פעילויות הרגיל שלי; 9) אני צריכה לישון במהלך היום; 10). אני עייפה מדי לאכול; 11) אני צריך עזרה עושה פעילויות הרגיל שלי; 12) אני אני מתוסכל בגלל היותו עייף מדי כדי לעשות את הדברים שאני רוצה לעשות; ו 13) אני צריך להגביל את פעילות חברתית כי אני עייפה.
  2. לבודד PBMC של דגימות דם טרי שנאספו (משך משוער: 1 h).
    1. לאסוף 8 מ של דם לתוך צינור הכנה תאי תאי (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: דגימות דם צריך להיות מעובד בתוך שעתיים של אוסף. עלולה לסכן את איכות PBMCs אם דגימות דם מעובדים יותר מ 2 h לאחר איסוף הדגימה.
    2. צנטריפוגה ב g x 1,750 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (18-25 ° C). להעביר את השכבה מעונן צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף עד 15 מ"ל ל- PBS, היפוך 5 פעמים.
    3. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 15 דקות ב 4 º C. בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות את צניפה על-ידי הוספת עד 10 מ"ל PBS, היפוך 5 פעמים.
    4. צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את הנוזל supernatant והשהה מחדש תאים 1 מ"ל PBS. להעביר את PBMCs צינור microfuge 1.5 mL.
    5. צנטריפוגה ב 610 x g במשך 10 דקות. להסיר את תגובת שיקוע ובזהירות resuspend צנפה ב RPMI מלאה-1640 (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10 מ מ פניצילין/סטרפטומיצין).
  3. מעיל תא לוחות עבור תאים שאינם מחסידי (משך משוער: 30 דקות).
    1. להכין פתרון דבק תאים ורקמות (ראה טבלה של חומרים) על ידי דילול הפתרון מניות ב- 0.1 M סודיום ביקרבונט pH 8.0. הפתרון עובד צריך להיות μg/cm 3.52 של פני השטח.
      הערה: פתרון זה מכיל חלבונים polyphenolic מופק גברת ימיים, Mytilus אדאליס. חלבונים אלה הם רכיבי מפתח של הדבק מופרש על ידי גברת לעגן את עצמה משטחים. אנו מוצאים כי התא-טאק עובד הכי טוב עם PBMCs.
    2. להוסיף 100 μL של הפתרון מדולל דבק מכל קידוח, תקופת דגירה של פחות 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שלוש פעמים עם די מים ואוויר יבש.

3. מיטוכונדריאלי פונקציה מדידה

  1. הכנת Assay מדיה (משך משוער: 10 דקות).
    הערה: המדיה Assay צריך להיות טרי מוכן ביום של הניסוי.
    1. הוסף-גלוטמין פירובט, גלוקוז לבסיס המדיה (באותו המרכיבים כמו בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco), אך ללא כל סודיום ביקרבונט, גלוקוז, גלוטמין או נתרן פירובט) כדי להפוך assay מדיה. לחמם מדיה 37 מעלות, ואז להתאים את ה-pH ל 7.4.
      הערה: ריכוזי-גלוטמין פירובט, גלוקוז בדרך כלל זהה ריכוזים בתקשורת הצמיחה רגילה, אך ניתן להתאים בהתאם וזמינותו.
  2. היכונו PBMCs במבחן Mito הלחץ (משך משוער: 2 h).
    1. צלחת מספיק PBMCs משלב 2 כל טוב להגיע confluency 80-90%. מניסיוננו, 1.5 x 105 תאים/טוב הניבו את התוצאות הכי עקבי.
      הערה: בארות A ו- H רקע בארות, צריך להכיל רק assay מדיה עם אין תאים. בבארות B ל גרם, אנו ממליצים על ציפוי לפחות 3-6 בארות לאדם החולה מדגם כהתאמה ליניאריים.
    2. מסובבת צלחות למטה ב g x 200 למשך 2 דקות לאפשר תאים לדבוק בתחתית הבארות. לשטוף את התאים פעם אחת עם התקשורת וזמינותו. שלב זה מסיר סרום, סודיום ביקרבונט מהתקשורת צמיחה.
      הערה: מניסיוננו, הצעד כביסה בדרך כלל מסירה 20-30% של תאים.
    3. להוסיף 180 μL Assay מדיה לתוך כל טוב, כולל רקע בארות א' וה' Incubate חממה 37 ° C-CO2 למשך 45-60 דקות.
  3. הבדיקה מתח Mito
    1. לשקם סמים בערכה מתח Mito עם מדיה assay כדלקמן:
      1. Oligomycin: להוסיף 252 μL assay מדיה לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.
      2. FCCP: להוסיף 288 μL assay מדיה לתוך הבקבוקון כדי ליצור פתרון מניות ב- 50 μM.
      3. Antimycin A / Rotenone: להוסיף 216 μL של המדיה assay לתוך המבחנה כדי ליצור פתרון מניות ב 25 μM.
    2. מערבולת מחדש סמים כדקה בערך. לדלל לתוך העבודה פתרונות.
      הערה: ריכוזים של פתרונות עבודה צריך להיות טיטרציה וקבעה מראש לפני הניסוי בהתאם לסוג התא. עבור PBMCs, אנו מוצאים את μM 1 של Oligomycin 1 μM FCCP, 0.5 μM antimycin A / Rotenone פועלות באופן הטוב ביותר.
    3. Pipette הסמים ליציאת כל במחסנית חיישן ברצף:
      1. ת: יציאה μL 20 פיפטה של 10 μM Oligomycin, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.
      2. יציאה b: μL 22 פיפטה של 10 μM FCCP, עבור ריכוז סופי כל היטב של 1 μM.
      3. C: יציאה μL 25 פיפטה של μM 5 antimycin A / rotenone עבור ריכוז סופי כל היטב של 0.5 μM.
  4. בחר "בדיקת המאמץ Mito" על כלי שטף חוץ-תאית. בצע כלי שורת, הכנס את מיכל הדיו חיישן. הכלי יבצע באופן אוטומטי חיישן כיול. הוסף תאים בצלחת לאחר כיול חיישן, לבין הכלי יסיים את שאר וזמינותו. דינמיקה חמצן נמדד ב- 530 ננומטר (עירור) / 650nm (פליטת), פרוטון הריכוז נמדדת ב- 470 nm (עירור) / 530 ננומטר (פליטה).

4. נרמול נתונים פונקציה מיטוכונדריאלי

  1. להכין פתרון תא התפשטות Assay (משך משוער: 5 דקות).
    1. להוסיף 48 μL חומצת גרעין הכתם (500 x) משתיק קול רקע 240 μL מ"ל 11.7 PBS (2x). חומצת גרעין הכתם הוא צבע DNA מחייב תא-permeant, משתיק קול רקע צבע המסיכה אשר חוסם תאים מתים או תאים עם קרום התא פרוץ שלמות של להיות מוכתם. שילוב לצבוע דנ א מחייב עם משתיק קול על רקע מבטיחה כי תאים חיים רק מוכתמים.
    2. להוסיף נפח שווה 2 x הפתרון עובד (180 μL) ישירות לתוך המדיום היטב כל לאחר השלמת במבחן הלחץ Mito.
  2. דגירה התאים בנוכחות תא התפשטות assay פתרון חממה 37 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דק Quantify מספר תאים חיים (פלורסנט) על קורא צלחת-508 nm (עירור) / 527 nm (פליטת), באופן שיטתי נתונים OCR (משך משוער: 10 דקות) .
    הערה: בנוסף תאים חיים, מספר המשתמשים לבחור גם לנרמל את הנתונים שלהם עם המספר הכולל של תאים, כמות חומצת גרעין, ריכוז חלבון, וכו '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במבחן הלחץ Mito מסתמך על מדידת קצב צריכת החמצן (OCR) לאחר ההזרקה רציפים של מעכבי נשימה שונים כדי למפות פרופיל מיטוכונדריאלי שלם. מדידות OCR לאחר הזרקת סמים כל יכול לשמש כדי לחשב את הפרמטרים הבאים הקשורים לבריאות מיטוכונדריאלי: OCR הבזליים נמדד לראשונה לפני כל זריקה סמים כדי להעריך את צריכת החמצן. צריך לפגוש נח רמת הביקוש ATP. נשימה הבזליים מחושבת על-ידי חיסור קצב הנשימה הלא-מיטוכונדריאלי מקו OCR לפני הזרקת oligomycin. בשלב הבא, oligomycin מוזרק לעכב ערוץ פרוטון של ATP סינתאז (V מורכבים). הירידה OCR עוקבות אחרי הזרקת oligomycin מייצג את צריכת החמצן הקשורות לייצור ATP. FCCP (קרבוניל ציאניד 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), ionophore נהגה לשבש את מעבר פרוטון ואת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי, משמש לאחר מכן שמעודדים צריכת חמצן מירבית. נשימה מקסימלי מחושבת על-ידי חיסור נשימה מיטוכונדריאלי מ OCR המרבי לאחר ההזרקה FCCP. יכולת הנשימה חילוף ההבדל בין נשימה מקסימלית וללא הבזליים. לבסוף, antimycin (מתחם השלישי מעכב) ו rotenone (מתחם אני מעכב) מוזרקים באותו הזמן לנתק את השרשרת אלקטרון תחבורה. לפי ההגדרה, נשימה מיטוכונדריאלי עצמאי בשרשרת האלקטרונים תחבורה (למשל, שאינם מיטוכונדריאלי nadph ל אוקסידאז מקרופאגים, וכו '.), מיוצג כערכים OCR לאחר antimycin A / rotenone הזרקה. צימוד יעילות מתאר את השבר של צריכת חמצן הבזליים מיטוכונדריאלי משמש סינתזת ATP, מחושב כ- 100% x (OCR הקשורות לייצור ATP) /(basal respiration rate).

צריך להיות מוטבת תא צפיפות עבור כל תנאי culturing לפני ביצוע בדיקת מאמץ mito. מניסיוננו, 80-90% confluency מושגת על ידי ציפוי 1.5 x 105 תאים/טוב של PBMCs טרי מבודד של דם אנושי (איור 1א'). זו צפיפות ציפוי חשבונות עבור השלב כביסה שמתואר בשלב 3.2.3. בנוסף לקביעת צפיפות ציפוי אופטימלית, FCCP טיטור יש לבצע כדי לקבוע את הריכוז הדרוש כדי ליצור OCR מקסימלי. ב FCCP ריכוזי נבדק - 0.125 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM ו- 2 μM - OCR גדל עם ריכוז FCCP להגיע מישור ב 1 μM, אך ירד ב 2 μM (איור 1B). זה מציין כי μM 1 ריכוז FCCP אופטימלית צריך לשמש לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי PBMC.

בדקנו מיטוכונדריאלי פונקציה מאותה אצווה של תאי דם באותו מדגם שנאספו מתורם בריא בנקודות זמן שונות לאחר בידוד PBMC. צריכת החמצן הבזליים, כמו גם OCR מקסימלי ירד כמו מוקדם ככל 3 והמשיך כדי להקטין ב- h 5 ו 8 לאחר בידוד PBMC (איור 2א). לאחר 3 שעות, מקסימלי נשימה שהפיק הזרקת FCCP (נקודות זמן 7-9) לא יעלה על OCR הבזליים, רומז כי אפילו בתאים חיים, המיטוכונדריה לוותר על יכולת הנשימה יורדת במהירות לאורך זמן. קצב חוץ-תאית acidification (ECAR) נמדדה בו זמנית על כלי שטף חוץ-תאית. מאז oligomycin מעכב מיטוכונדריאלי ATP סינתאז, גליקוליזה הוא גויס בתוך דקות כדי לענות על הדרישה אנרגיה וכדי לפצות על העדר ATP ייצור באמצעות זרחון חמצוני, כפי שמתואר על ידי העלייה המהירה ברמת ECAR לאחר oligomycin זריקה. מוקדם ככל h 3 לאחר בידוד PBMC, חלה ירידה ECAR, כמו גם OCR (איור 2B). למרות שאנו לא צופים כל שינוי הבולטים ב תא הכדאיות ב 1, 3, 5 ו- 8 שעות לאחר בידוד PBMC, הפונקציה מיטוכונדריאלי ירד במהירות, רומז. התזמון הוא המפתח כדי ללכוד את הפרופיל מיטוכונדריאלי של חיים, respiring PBMCs.

החולה מדגם אוספים נוטים להתרחש במועדים שונים בימים נפרדים; לכן, זה הכרחי לנרמל את הנתונים כדי להשוות בין נקודות זמן ודוגמאות שונות. בעוד שיטות נרמול אחרות כגון חלבון assay כימות חומצת גרעין עשוי לשמש, אנו מוצאים כי צביעת תאים חיים עם דנ א מחייב לצבוע, כימות של תאים ניאון ירוק היטב כל הוא הכי יעיל ואמין נירמול השיטה. נציג נתונים של PBMCs אסף מתורמים בריאים שונים שני על יומיים נפרדים מוצגים באיור3. הזחה הוא דמות ייצוגית של צלחת תא מציג היטב הכולל תאים (שלב חדות) ותאים חיים מוכתם לצבוע דנ א מחייב (ירוק ניאון) לאחר בדיקת המאמץ mito. קצב צריכת החמצן הבזליים, כמו גם צריכת חמצן לאחר הזרקת סמים כל מנורמל לחיות תאים היו דומים שונה בריאים שאינם עייף בגיטרה (איור 3).

הפונקציה מיטוכונדריאלי נציג נתונים של נושא עייף (ציון FACIT-F < 43) עם סרטן הערמונית (אדום), גיל/מין/גזע-מתאימים עייף שאינו בריא תורמת (כחול) מוצגים באיור4. למרות שלא נתבונן כל הבדל OCR הבזליים (איור 4B), הנושא עייף הציג ירד צריכת חמצן מירבית, כמו גם יכולת הנשימה חילוף בהשוואה הפקד (איור 4C, D). עייפות הופיע להיות קשורה להפחתת מתוקף הנשימה חילוף, כי היו שם אין הבדלים שנמצאו צריכת חמצן מיטוכונדריאלי (איור 4E), צריכת חמצן הקשורים ל- ATP (איור 4F), או צימוד יעילות (איור 4G). נתוני התוכנית הבסיסית (לפני כל זריקה סמים) וגברה מקסימלי נשימה לאחר הזרקת FCCP ניתן לאבחן באמצעות עלילה פנוטיפ של אנרגיה, אשר חושף את מסלול מועדף (OCR זרחון חמצוני לעומת ECAR גליקוליזה) רכוש האנרגיה הביקוש (איור 4H). משבצות ריקות מציינות אנרגיה הבזליים פנוטיפ ולציין ריבועי מוצק של פנוטיפ אנרגיה בתגובה מקסימליים הביקושים ATP. המרחק בין הבסיס (ריבוע ריק) מקסימלי (ריבוע מוצק) מציין קיבולת רזרבית, בעוד המדרון מצביע על העדפה הסלולר כלפי זרחון חמצוני לעומת גליקוליזה. כפי שמוצג באיור 4H, יכולת חילוף בנושא עייפות ירד לעומת הפקד בריאים שאינם עייף. בנוסף, פנוטיפ אנרגיה בתגובה הביקוש ATP מוטה כלפי גליקוליזה בנושא עייף בהשוואה הפקד בריא (איור 4H).

Figure 1
איור 1 : PBMC יופיצ צפיפות, עקומת מנה-תגובה FCCP. (א) טרי מבודד PBMCs מצופים ב- 1.5 x 105 תאים/באר תא מצופה CellTak התרבות miniplates. לאחר הרחצה, מדיה לשנות, תאים חולקו באופן שווה על 80-90% confluency. סרגל קנה מידה = 100 μm. (B) OCR גדלה עם הגדלת ריכוזי FCCP 0.125 μM, 0.25 μM, μM 0.5, OCR להשיג שיא ב 1 μM. OCR תועיגמ 2 μM, המציין שאת μM 1 הוא המינון האופטימלי שמעודדים נשימה מקסימלי בברים PBMCs.Error מציינות סטיית התקן של 3 מדידות רציפות אחרי הזריקה סמים הראשונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 2
איור 2 : נשימה מיטוכונדריאלי יורד במשך הזמן ב- PBMCs טרי מבודד. OCR (א) , כמו גם ECAR (B) ירד במהירות לאורך זמן לאחר בידוד PBMC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 3
איור 3 : הנשימה מיטוכונדריאלי נציג נתונים עם נורמליזציה. בדיקת המאמץ Mito בוצעה באמצעות PBMCs טריים מבודד שני מתנדבים בריאים שונה בימים שונים, מנורמל בעזרת כתם חומצת גרעין פלורסנט לכמת על קורא צלחת פלורסנט. שיבוץ: תמונת הנציגה של תאים חיים (ירוק), סה כ תאים (שלב חדות) בבאר. סרגל קנה מידה = 1,000 μm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 4
איור 4 : ניתוח ייצוגית של נושא עייף בהשוואה פקד בריא. (א) נציג Mito מתח הבדיקה OCR גרף של נושא עייף לעומת גיל/מין/גזע-מתאימים עייף שאינו בריא פקד. גרפים המתארים הבזליים OCR (B), נשימה מקסימלי (C), לוותר על יכולת הנשימה (D), צריכת חמצן מיטוכונדריאלי (E), ייצור ATP (נ)ויעילות צימוד (G) מוצגים. העלילה פנוטיפ אנרגיה של הנושא עייף, בקרה בריאים מוצג (H). משבצות ריקות מציינות פנוטיפ אנרגיה בסיסית, מוצק וריבועים מייצגים אנרגיה לחוץ פנוטיפ נמדד לאחר ההזרקה FCCP. קווי שגיאה מציינות סטיית תקן של 3 בארות שונות לכל משתתף במחקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עייפות אצל חולי סרטן היא מחלה מתישה אינה מוגדרת היטב או מאופיין1. אבחון של עייפות כולו מתבסס על דיווח סובייקטיבי, אין תקן הנוכחי אבחון או טיפול עבור תנאי זה, בעיקר בשל חוסר ההבנה שלו pathobiology2. מנגנוני המוצעת שבבסיס עייפות אצל חולי סרטן, ליקוי בתפקוד מיטוכונדריאלי הוא אחד המסלולים הכי רפואית targetable. לכן, פיתחנו שיטה מעשית ומהירה למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי בדגימות קליניות יכול לשמש באופן יזום לזהות חולים בסיכון לפתח סרטן הקשורות לטיפול רעילות כולל עייפות, זה כל-כך מוקדם ניהול יכול תיערך.

השטף חוץ-תאית הטכנולוגיה בשילוב עם הזרקת רציפים של מעכבי נשימה לאפשר הערכה של המצב התפקודי מיטוכונדריאלי, שימש במשך שני במבחנה , ויוו מודלים19, 20,21. אנו מורחב בגוף העבודה הקיימת, פיתח שיטת אופטימיזציה עבור בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי בדגימות קליניות. יתרון של המחקר הוא הניצול של מנתח קומפקטי השטף חוץ-תאית. כפי הראו, העיתוי של הניסוי הוא קריטי לאחר ניתוקה של PBMCs טריים של דם אנושי. בעוד בתבנית גדולה יותר (96-ובכן או 24-ובכן תבנית) היא הבחירה האידיאלית עבור ניסוי תפוקה גבוהה, מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית, אשר מכיל 8 בארות, מאפשר הערכה אישית של כל החולה מדגם19. שיטה זו היא מעשית יותר וחסכונית (הן לגבי המכשיר עצמו והן של ריאגנטים המשמש לביצוע וזמינותו), כי דוגמה מהאוסף לחולים שונים נוטים להתרחש במועדים שונים בימים שונים.

הניצול של PBMCs כדי להעריך את הפונקציה מיטוכונדריאלי בחולי סרטן עייף יש כמה יתרונות: 1) ביופסיה של רקמות כגון שרירי השלד עשוי להיות מעשי לפעמים; 2) PBMCs הינם זמינים בקלות, בקלות ניתן לבודד באמצעות צינורות הכנה תא, אשר מציע יתרון מעשי בסביבה קלינית; ו 3) הראו כי הפונקציה מיטוכונדריאלי פוחתת לאחר תאים מבודדים טרי בתרבות כבר יותר משלוש שעות, לבודד את סוגי תאים ספציפיים בדרך כלל לוקח כמה שעות (יותר מ- 3 שעות). PBMCs ניתן להכין תוך שעה, ובכך להבטיח את הדיוק של מדידת תפקוד מיטוכונדריאלי בזמן אמת. בעוד אנו ממליצים להשתמש PBMCs עבור החקירה קליני ראשוני באוכלוסיות החולה בעבר uncharacterized, סוגי תאים אחרים כגון T לימפוציטים, טסיות, נויטרופילים ומונוציטים יכול לשמש גם עם פרוטוקול הנוכחי לאחר אופטימיזציה של ציפוי צפיפות, מעכבי נשימה ריכוזים15,25,26.

לפני בדיקות תפקוד מיטוכונדריאלי מערכת חדשה, חשוב תחילה לקבוע את צפיפות תא אופטימלית וריכוזי FCCP. מניסיוננו, ציפוי 1.5 x 105 תאים לכל טוב מבטיחה את צפיפות התאים ואחרי ציפוי confluent 80-90% את הכביסה שלב שרידים. בנוסף, חשוב לקבוע ריכוז FCCP האופטימלי עבור כל סוג התא. ריכוזים טווח של FCCP צריך להיבדק, ריכוז FCCP שמייצר OCR מקסימלי מבלי להתפשר על הבריאות של תא אמור לשמש. בריכוזים שנבדקו, 1 μM של FCCP כתוצאה בנשימה מקסימלי ב- PBMCs. עוד צעד קריטי הוא התזמון של הניסוי, כמו נשימה מיטוכונדריאלי טיפות בתלילות 3 שעות לאחר בידוד PBMC. משמעות הדבר היא כי במבחן הלחץ mito צריכה להתבצע בתוך 3 שעות לאחר המדגם אוסף ללכוד במדויק את הפונקציה מיטוכונדריאלי במדגם קליניים. זה שווה מדגישה כי חוקרים רבים יש גישה רק דוגמאות קפוא. בדקנו בעבר PBMCs לאחר הקפאה והפשרה של, הפונקציות מיטוכונדריאלי של תאים אלה נחשפים במידה רבה. לכן, מומלץ שימוש טרי מבודד PBMCs במחקרים קליניים, כאשר זה ריאלי.

היבט חשוב נוסף של יצירת לשחזור נתונים היא השיטה של נרמול נתונים. בעוד כמה מעבדות היו הצלחה באמצעות כימות חלבון BCA לנרמל את הנשימה מיטוכונדריאלי נתונים, אנו מוצאים שזה לא תמיד ריאלי במיוחד על צפיפות נמוכה התא. השיטה נורמליזציה שמתואר פרוטוקול זה מסתמך על המתאם ליניארי בין מספרי הטלפון הנייד את פליטת קרינה פלואורסצנטית צבען-nucleic מתחמי חומצה, יכולים לכמת במדויק 10 עד 50 אלף תאים27. בנוסף, נורמליזציה באמצעות שילוב של חומצות גרעין פלורסנט הכתם, קורא צלחת פלורסנט מאפשר כימות מהירה של תאים חיים לאחר סיום הניסוי. בנוסף, שיטה זו אינה דורשת trypsinization של תאים חסיד או באמצעות המגרד של התא.

אזהרה של הפרוטוקול זה כי אנחנו לא נפרד PBMCs תא ספציפי סוגים לפני ביצוע אנליזה פונקציונלית מיטוכונדריאלי. כמו, הראו נשימה מיטוכונדריאלי יורדת במהירות לאורך זמן לאחר בידוד PBMC. זה מרמז כי ההבדלים בין חולים עשוי להיות לא מדויק אם הניסוי בוצע לאחר בידוד אוכלוסיות תאים שונים, אשר בדרך כלל לוקח כמה שעות. אף-על-פי לומד אוכלוסיות מעורבות כגון PBMCs אינו חושף מידע ספציפי סוג התא חשוב, מהמידע המתקבל ניסויים באמצעות PBMCs יכול לעזור מדריך חקירות מכניסטית העתיד התמקדו סוגי תאים ספציפיים. PBMCs לשמש proxy עבור לקוי של מיטוכונדריאלי, אשר רלוונטית הפרעות מערכתיות כגון סרטן עייפות10,28. פרוטוקול המתואר בכתב היד הנוכחי מספק רק מדידה גסה של תפקוד מיטוכונדריאלי מבלי לאתר את הגורם התצפית. לכן, ממצאים באמצעות הליך וטכנולוגיה זו יש לפרש בזהירות, יש לקחת בחשבון את אופי multifactorial עייפות, כגון התרחשותו שיתוף עם התנהגויות אחרות (למשל, דיכאון, שינה, פגיעה קוגניטיבית), תנאים (למשל, ריאות מצב, polypharmacy). מחקרים עתידיים יש לבחון שינויים בפונקציות מיטוכונדריאלי סוגי תאים ספציפיים (למשל, תאים רוצח טבעי, T לימפוציטים ומונוציטים), אוכלוסיות קליניות שונות (למשל, חולי סרטן עייף/הלא-עייף, פקדי בריא). אמנם זה מעבר להיקף של כתב היד הנוכחי, נקבע את השיוכים בין חומרת עייפות סרטן בתפקוד מיטוכונדריאלי, כמו גם המתאם בין פונקציה מיטוכונדריאלי מדידות ובדיקות גופניות עייפות כגון מבחן 6 דקות הליכה, חקירות בעתיד. יתר על כן, מחקרים עתידיים יבחנו גם בתפקוד מיטוכונדריאלי בסוגי סרטן אחרים על מנת לקבוע אם עייפות על פני סוגי סרטן שונים קשורה בתפקוד מיטוכונדריאלי. לסיכום, פיתחנו פרוטוקול אופטימיזציה עבור הערכה מהירה של כללית בתפקוד מיטוכונדריאלי באמצעות דגימות קליניות. בהמשך ניתן לבצע חקירות מכניסטית כדי להצביע על המעורבות של מסלולים ספציפיים ב המתיש הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי חלוקה של מגזר המחקר של במכון הלאומי סיעוד למחקר של NIH, בת'סדה, מרילנד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13, (8), 1012-1039 (2015).
  2. Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52, (6), 832-840 (2016).
  3. Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19, (6), 744-750 (2015).
  4. Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40, (3), 184-193 (2017).
  5. Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2, (1), 1-16 (2009).
  6. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, (1), 505-531 (2016).
  7. Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208, (2), 117-120 (1996).
  8. Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267, (4), 394-401 (2010).
  9. Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
  10. Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40, (6), (2013).
  11. Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
  12. Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21, (4), 315-319 (2004).
  13. Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
  14. Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62, (2), 133-139 (2003).
  15. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
  16. Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205, (3), 392-400 (2012).
  17. Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20, (7), 1126-1167 (2014).
  18. Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (3), 389-395 (2001).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  20. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
  23. Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13, (2), 63-74 (1997).
  24. Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64, (5), 507-516 (2011).
  25. Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
  26. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93, (6), 690-700 (2013).
  27. Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254, (1), 85-98 (2001).
  28. Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19, (1), London, England. 67-74 (2014).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics