线粒体功能在癌症相关疲劳中的作用评价

Cancer Research

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Summary

我们的目标是制定一个实用的协议, 以评估线粒体功能障碍与疲劳相关的癌症患者。这种创新的协议是优化的临床使用只涉及标准放血和基本的实验室程序。

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Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

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Abstract

疲劳是影响大多数癌症患者的常见和衰弱的条件。到目前为止, 疲劳仍然很低的特点, 没有诊断测试, 客观地测量这种情况的严重性。在这里, 我们描述了一个最优化的方法来评估 PBMCs 的线粒体功能收集从疲劳的癌症患者。利用紧凑的胞外通量系统和顺序注射呼吸抑制剂, 我们通过测量基底线粒体呼吸、剩余呼吸能力和能量表型来检查 PBMC 线粒体功能状态, 描述应对压力的首选能量通路。新鲜 PBMCs 是现成的临床设置使用标准放血。本议定书所描述的整个化验方法在不到4小时内就可以完成, 而不需要复杂的生化技术。此外, 我们还描述了获取可重现数据所需的规范化方法。所提出的简单程序和规范化方法允许重复样本收集从同一病人和生成可重复的数据, 可以比较时间点, 以评估潜在的治疗效果。

Introduction

疲劳是一种普遍和令人痛心的情况, 对癌症患者的生活质量有负面影响1。到目前为止, 癌症疲劳的定义仍然很差, 仅依靠患者的主观报告2。因此, 迫切需要确定一个易于适应的诊断实验室测试, 客观地描述疲劳的临床设置3,4

许多潜在的机制, 包括线粒体功能障碍, 已被建议导致疲劳的5。线粒体是发电站的细胞器, 通过氧化磷酸化提供95% 的蜂窝能量需求, 并在钙信号、凋亡、免疫信号和调节其他细胞内信号事件中发挥重要作用6.因此, 线粒体生物能学受损和能源生产缺陷可能导致疲劳。支持这个假说, 以前的研究观察了线粒体 DNA 在慢性疲劳综合征患者中的突变7。尽管目前尚不清楚疲劳的病理生理学起源是否存在于中枢神经系统或周边组织中, 例如骨骼肌8,9, 当前还没有直接的方法来准确评估线粒体功能障碍与活着的 respiring 细胞的疲劳有关。

利用外周血单个核细胞 (PBMCs) 研究线粒体功能提供了一些优势。首先, PBMCs 是现成的在临床设置使用标准的放血, 可以快速隔离使用基本的实验室技术。其次, 血液收集比收集其他组织如肌肉活检更少侵入。因此, 血液样本可以收集从同一病人反复一段时间, 这有助于纵向评估治疗效果。有趣的是, PBMCs 的线粒体功能在动物模型10中似乎与肾脏线粒体状态有很好的相关性。此外, 免疫细胞线粒体已被用于检测不同疾病条件下的系统性变化11,12。循环免疫细胞中的线粒体对免疫功能和免疫信号分子的变化特别敏感, 如细胞因子13,14,15。例如, 有人观察到, 急性风湿性炎症疾病患者的 PBMCs 表现为高基线耗氧量14。相比之下, PBMCs 与全身炎症性疾病 (包括脓毒症16) 隔离的患者的氧耗减少。在炎症条件下, 功能失调的线粒体产生的自由基可能进一步促进氧化应激和长时间炎症17。线粒体在能源生产和氧化应激中的中心作用表明, 利用线粒体功能作为研究癌症患者疲劳的一个重要因素, 可能是13

以前的研究检测线粒体功能使用生物化学技术, 线粒体膜电位测量, 或隔离特定的细胞群体, 可能不容易适应在临床设置5, 14,18。近年来, 细胞外通量检测的发展使研究人员能够轻松准确地检查氧气消耗率 (OCR) 对呼吸抑制剂自动注射的影响19,20,21,22. 然而, 大多数这些研究都是针对特定的细胞类型而设计的, 而大容量的高通量格式可能不适用于临床设置。在这篇手稿中, 我们描述了一个优化的协议, 以检查线粒体功能的临床使用。

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Protocol

目前的研究 (NCT00852111) 得到了马里兰国家卫生研究院 (NIH) 机构审查委员会的批准。参加这项研究的参与者为18岁或以上的 euthymic 男性, 他们被诊断为无转移性前列腺癌, 有或没有事先前列腺切除术, 并计划接受外照射治疗 (外照射)。潜在的参与者被排除, 如果他们有一个渐进性疾病, 可能导致严重的疲劳, 在过去五年的精神疾病, 有未矫正甲状腺功能减退或贫血, 或有第二次恶性肿瘤。使用镇静剂、类固醇或非甾体抗炎药物的个体也被排除在外。健康的对照血液样本是在 NIH 批准的协议 (NCT00001846) 下由健康的捐赠者在国立卫生研究院输血医学部门获得的。所有参与者都在 NIH 的马格努森临床研究中心招聘。在学习参与之前获得了书面知情同意书。

1. 线粒体功能测量准备 (实验1天)

  1. 水合物传感器墨盒 (请参阅材料表; 大约持续时间: 5 分钟)。
    1. 从包中卸下传感器墨盒。添加 200 ul Calibrant 解决方案的每个井的公用事业板块, 然后填补每个护城河与 400 ul Calibrant 解决方案。
    2. 将传感器板返回到实用新型板上, 现在有 Calibrant 解决方案。将墨盒在非 CO2 37 °c 孵化器过夜。
      注: 传感器墨盒需水合至少4小时, 最大可达72小时。

2. 临床样品准备 (实验2天)

  1. 使用慢性病治疗的13项功能评估-疲劳 (FACIT)2,23,24在基线 (外照射启动之前), 中点和完成外照射, 1 年外照射后, 测量疲劳。
    1. 对每个项目的响应使用 0-4 刻度, 其中0代表 "不完全", 4 表示答辩人与相应的声明 "非常" 相关。总分应从 16-53 不等, 低分数反映高疲劳强度。
    2. 将疲劳定义为 FACIT 分数低于 43, FACIT 评分≥43表示没有或没有临床意义的疲劳2
      注: FACIT 评分为 43, 最佳划分癌症患者和一般人群的疲劳评分为2
    3. 包括以下13项 FACIT 疲劳等级: 1) 我感到疲倦;2) 我感到身体虚弱;3) 我感到无精打采 ("冲出");4) 我感到疲倦;5) 我有困难开始的事情, 因为我累了;6) 因为我累了, 所以我很难完成事情;7) 我有活力;8) 我能做我平时的活动;9) 白天我要睡觉。10) 我太累了, 不能吃;11) 我需要帮助做我通常的活动;12) 我因太累而无法做我想做的事而感到沮丧;13) 我必须限制我的社交活动, 因为我累了。
  2. 从新鲜收集的血液样本中分离 PBMC (大约持续时间: 1 小时)。
    1. 收集8毫升血液进入单个核细胞制备管 (见材料表)。
      注: 血液样本应在收集2小时内处理。如果样品收集后的血液样品处理超过2小时, PBMCs 的质量可能会受到损害。
    2. 离心机在 1750 x g 在室温下30分钟 (18-25 °c)。将混浊层转移到15毫升锥形管上。加15毫升 PBS, 反转5次。
    3. 离心机在 300 x g 15 分钟在4摄氏度。小心地除去和丢弃上清, 不干扰颗粒。通过添加多达10毫升 PBS, 并反转5次, 重新悬浮颗粒。
    4. 离心机在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。在1毫升 PBS 中丢弃液体上清和重新悬浮细胞。将 PBMCs 转移到1.5 毫升离心管。
    5. 离心机在 610 x g 10 分钟。小心地移除上清和并用重悬丸在完全 RPMI-1640 (RPMI-1640 补充10% 血清, 10 毫米青霉素/链霉素)。
  3. 非黏附细胞的涂层细胞板 (大约持续时间:30 分钟)。
    1. 通过稀释0.1 米碳酸氢钠 pH 值8.0 中的库存溶液, 制备细胞和组织粘合剂溶液 (参见材料表)。工作解决方案应位于表面积的3.5 微克/厘米2处。
      注意: 此解决方案包含从海洋贻贝中提取的多酚类蛋白,贻。这些蛋白质是由贻贝分泌的胶水的关键成分, 以锚定自己的表面。我们发现, 细胞-德的工作与 PBMCs 最好的。
    2. 添加 100 ul 稀释胶粘剂溶液的每一个井和孵化至少20分钟室温。洗三次, 用 DI 水和空气干燥。

3. 线粒体功能测量

  1. 测定培养基的制备 (大约持续时间:10 分钟)。
    注意: 化验介质必须在实验当天进行新的准备。
    1. 将 l-谷氨酰胺、丙酮酸和葡萄糖添加到基介质中 (与 Dulbecco 的修饰鹰的培养基 (DMEM) 相同, 但不含碳酸氢钠、葡萄糖、谷氨酰胺或丙酮酸钠) 来制作化验介质。暖媒体高达37摄氏度, 然后调整 pH 值为7.4。
      注: l-谷氨酰胺、丙酮酸和葡萄糖的浓度通常与正常生长培养基中的浓度相同, 但可根据该检测进行调整。
  2. 为图美的应力测试准备 PBMCs (大约持续时间: 2 小时)。
    1. 板材足够 PBMCs 从步2入每个井到达 80-90% 融合。根据我们的经验, 1.5 x 105单元格/很好地产生了最一致的结果。
      注: 井 A 和 H 为背景井, 只应包含无细胞的化验介质。在井 B 到 G, 我们建议电镀至少 3-6 井每个患者样品为了考虑异常点。
    2. 旋转板以 200 x g 为2分钟, 允许细胞粘在井底。用化验介质清洗细胞。这一步从生长培养基中去除血清和碳酸氢钠。
      注意: 按照我们的经验, 洗涤步骤通常会去除 20-30% 的细胞。
    3. 在每个井中添加 180 ul 化验介质, 包括背景井 a 和 h. 在非 CO2 37 °c 孵化器中孵化 45-60 分钟。
  3. 运行户内应力测试
    1. 用化验介质在图美的应力试剂盒中重建药物, 如下所示:
      1. 寡霉素: 添加 252 ul 化验介质到瓶子, 以产生一个股票溶液在50微米。
      2. FCCP: 在小瓶中加入 288 ul 的化验介质, 生成50微米的库存溶液。
      3. Antimycin/鱼藤酮: 添加 216 ul 的化验介质到瓶子, 以产生一个股票溶液在25微米。
    2. 漩涡重组药物约1分钟。稀释成工作解决方案。
      注意: 工作溶液的浓度应在实验前根据细胞类型滴定和预先确定。对于 PBMCs, 我们发现1微米的寡霉素, 1 微米 FCCP, 0.5 微米 antimycin A/鱼藤酮的工作最好。
    3. 按顺序将药物吸管插入传感器墨盒中的每个端口:
      1. 端口 A: 吸管 20 ul 10 微米寡霉素, 为最终浓度在每井1微米。
      2. 端口 B: 吸管 22 ul 10 微米 FCCP, 为最终浓度在每井1微米。
      3. C 港: 吸管 25 ul 5 微米 antimycin/鱼藤酮为最终浓度在每井0.5 微米。
  4. 在胞外通量仪上选择 "图美应力测试"。按照仪表提示插入传感器墨盒。该仪器将自动执行传感器校准。在传感器校准后插入细胞板, 仪器将完成其余的化验。氧气动力学被测量在530毫微米 (励磁)/650 毫微米 (发射), 并且质子浓度被测量在470毫微米 (励磁)/530 毫微米 (放射)。

4. 线粒体功能数据的规范化

  1. 准备细胞增殖测定溶液 (大约持续时间: 5 分钟)。
    1. 添加 48 ul 核酸染色 (500x) 和 240 ul 背景抑制器11.7 毫升 PBS (2x)。核酸染色是一种细胞 permeant DNA 结合染料, 背景抑制剂是一种掩蔽染料, 它阻止死细胞或细胞受损细胞膜完整性的染色。DNA 结合染料和背景抑制剂的结合确保只有活细胞被染色。
    2. 在图中应力测试完成后, 将2x 工作溶液 (180 ul) 的相等容积直接添加到每个井中的介质中。
  2. 在37摄氏度孵化器的细胞增殖试验溶液中孵化细胞, 用于 45-60 分钟. 用 508 nm (励磁)/527 nm (发射) 和规范化 OCR 数据 (近似持续时间:10 分钟) 量化板读器上活细胞 (荧光) 的数量。.
    注意: 除了数字活细胞外, 用户还可以选择使用细胞总数、核酸量、蛋白质浓度、来规范化数据。

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Representative Results

在对不同的呼吸抑制剂进行序贯注射后, 图面应力测试依赖于测量氧气消耗率 (OCR) 来映射一个完整的线粒体剖面。每种药物注射后的 OCR 测量可用于计算以下与线粒体健康相关的参数:基底 OCR首先在任何药物注射前测量, 以评估满足静止水平 ATP 需求所需的氧气消耗。基础呼吸是通过在寡霉素注射液前减去基线 OCR 的非线粒体呼吸率来计算的。其次, 寡霉素被注射来抑制 ATP 合成酶 (复杂 V) 的质子通道。寡霉素注射后的 OCR 随后下降表示与 ATP 生产相关的氧气消耗量。FCCP (羰基氰化物 4-[三氟甲氧基] 苯腙), 一个载体用来扰乱质子梯度和线粒体膜电位, 然后被用来引出最大的氧气消耗。最大呼吸的计算方法是从 FCCP 注射后的最大 OCR 中减去非线粒体呼吸。备用呼吸容量是最大和基本呼吸的区别。最后, antimycin A (复合 III 抑制剂) 和鱼藤酮 (复合 I 抑制剂) 被注射在同一时间关闭电子传输链。根据定义,非线粒体呼吸独立于电子传输链 (巨噬细胞、中的非线粒体 antimycin 氧化酶), 并在/鱼藤酮注射液后表示为 OCR 值。耦合效率描述用于 ATP 合成的基底线粒体氧消耗的分数, 并计算为 100% x (atp 生产相关的 OCR)/(基本呼吸速率)。

每种培养条件的细胞密度应在进行图中应力测试前进行优化。根据我们的经验, 80-90% 融合是通过电镀 1.5 x 105细胞/良好的新鲜隔离 PBMCs 从人的血液 (图 1A)。此电镀密度占步骤3.2.3 中描述的洗涤步骤。除了确定最佳的电镀密度, FCCP 滴定必须执行, 以确定所需的浓度, 以产生最大的 OCR。在 FCCP 浓度测试-0.125 微米, 0.25 微米, 0.5 微米, 1 微米, 2 微米-OCR 增加, FCCP 浓度达到高原在1微米, 但减少2微米 (图 1B)。这表明, 1 微米是最好的 FCCP 浓度, 应用于检查 PBMC 线粒体功能。

我们在 PBMC 隔离后, 从一个健康的捐献者在不同时间点采集的同一血样中检测出同一批细胞的线粒体功能。基底耗氧量以及最大 OCR 早在3小时后就下降, 并在 PBMC 隔离后继续下降5和 8 h (图 2A)。3小时后, FCCP 注射液引起的最大呼吸 (时间点 7-9) 不超过基底 OCR, 表明即使在活细胞中, 线粒体备用呼吸能力随着时间的推移迅速减少。细胞外酸化率 (ECAR) 同时测量的细胞外通量仪。由于寡霉素抑制线粒体 ATP 合酶, 在几分钟内就可以吸收糖酵解, 以满足能量需求, 并通过氧化磷酸化来弥补 ATP 生产的不足, ECAR 后寡霉素的快速增加证明了这一点。注射。早在 PBMC 隔离后的3小时内, ECAR 和 OCR 的减少 (图 2B)。虽然在 PBMC 隔离后, 我们没有观察到1、3、5和8小时细胞存活的显著变化, 但线粒体功能迅速下降, 提示时间是捕捉活体、respiring PBMCs 线粒体剖面的关键。

患者标本收集往往发生在不同的时间, 在不同的日子;因此, 对数据进行规范化以比较不同的采样和时间点是至关重要的。虽然可以使用其他规范化方法, 如蛋白质检测和核酸定量, 我们发现染色活细胞与 DNA 结合染料和量化的绿色荧光细胞在每个井是最有效和可靠的规范化方法。在两个单独的日子里, 从两个不同的健康捐助者收集的 PBMCs 的代表性数据显示在图 3中。嵌入是一个代表性的图像的细胞板显示总细胞 (相对照) 和活细胞染色的 DNA 结合染料 (绿色荧光) 后, 美因试验。两种不同健康的非疲劳捐献者的基本耗氧率, 以及每次药物注射规范化到活细胞后的耗氧量 (图 3) 是相似的。

(FACIT 评分 < 43) 与前列腺癌 (红色) 和年龄/性别/种族配对的非疲劳健康捐献者 (蓝色) 的代表性线粒体功能数据显示在图 4中。尽管我们没有观察到基底 OCR 的任何差异 (图 4B), 但与控制相比, 疲劳主体显示的最大耗氧量和备用呼吸容量都降低了 (图 4C, D)。疲劳似乎与多余呼吸能力的减少有关, 因为在非线粒体氧消耗方面没有发现差异 (图 4E), ATP 相关的耗氧量 (图 4F), 或耦合效率 (图 4G)。基线数据 (在任何药物注射之前) 和最大呼吸后 FCCP 注射可以可视化的能量表型图, 揭示了首选的途径 (OCR 氧化磷酸化与 ECAR 糖酵解) 在存在增加能源需求 (图 4H)。空方块表示基底能量表型和实心正方形表示的能量表型响应最大 ATP 需求。基底 (空方) 与最大 (实心正方形) 之间的距离表示备用容量, 而斜率表示细胞对氧化磷酸化和糖酵解的偏爱。如图 4H所示, 疲劳主体中的剩余容量与非疲劳健康控制相比下降。此外, 相对于健康控制 (图 4H), 由于 ATP 需求的增加, 能量表型在疲劳主体中的糖酵解偏倚。

Figure 1
图 1: PBMC 电镀密度和 FCCP 剂量响应曲线(A)新隔离的 PBMCs 被镀在 1.5 x 105细胞/以及 CellTak 涂层细胞培养 miniplates 中。在洗涤和媒介变化以后, 细胞均匀地分布在 80-90% 融合。刻度条 = 100 微米。(B) ocr 随着 FCCP 浓度的增加而增加0.125 微米, 0.25 微米, 0.5 微米, 达到峰值 OCR 1 微米。OCR 下降2微米, 表明1微米是最好的剂量, 以获得最大的呼吸在 PBMCs. 误差条表示初始药物注射后3次顺序测量的标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 线粒体呼吸随着时间的推移在新鲜隔离的 PBMCs 中减少。OCR (A)以及 ECAR (B)在 PBMC 隔离后的时间内迅速减少。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 具有规范化的线粒体呼吸数据.在不同的日子里, 用两个不同健康的志愿者分离出的新鲜 PBMCs 进行了图美的应力测试, 并在荧光板阅读器上量化了荧光核酸染色的规范化。插图: 一个在井中的活细胞 (绿色) 和总细胞 (相对比) 的代表性图像。缩放条 = 1000 微米请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 与健康控制相比, 对疲劳主体的代表性分析(A)代表性的图户应力测试一个疲惫的主题与年龄/性别/种族匹配的非疲劳健康控制的 OCR 图表。基 OCR 的条形图(B), 最大呼吸性(C), 备用呼吸容量(D), 非线粒体氧消耗(E), ATP 生产(F), 和耦合效率(G)显示。疲劳主体和健康控制的能量表型图显示为(H)。空方块表示基线能量表型, 实方代表 FCCP 注射液后测量的压力能量表型。误差条表示每个研究参与者的标准偏差为3个不同的井。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

癌症患者的疲劳是一个虚弱的状况, 没有很好的定义或特征1。疲劳诊断完全依赖于主观报告, 目前还没有诊断标准或治疗, 这主要是由于在其病理2中缺乏了解。在癌症患者所提出的疲劳机制中, 线粒体功能受损是治疗多弹头的最主要途径之一。因此, 我们开发了一种快速实用的方法来测量临床样品中的线粒体功能, 可用于主动识别患癌症治疗相关毒性包括疲劳的患者, 使早期可以建立管理。

细胞外通量技术结合序贯注射呼吸抑制剂, 可以评估线粒体功能状态, 并已用于体外体内模型19, 20,21。我们扩大了现有的工作机构, 并制定了一个方法, 以检查线粒体功能障碍的临床标本。本研究的优点是利用了紧凑的胞外通量分析仪。正如我们已经表明, 实验的时间是关键后, 从人类血液中分离新鲜 PBMCs。虽然较大的格式 (96 井或24井格式) 是高通量实验的理想选择, 但包含8个水井的紧凑胞外流量系统允许对每个病人样本19进行单独评估。这种方法更实用, 更符合成本效益 (无论是仪器本身, 还是用于执行化验的试剂), 因为不同病人的样本收集往往发生在不同的日子。

PBMCs 在疲劳性肿瘤患者线粒体功能评估中的应用有以下几个优点: 1) 组织如骨骼肌的活检有时可能不切实际;2) PBMCs 是现成的, 可以很容易地隔离使用细胞制剂管, 这在临床设置提供了实际的优势;和 3) 我们已经证明, 线粒体功能下降后, 新鲜隔离细胞已经在文化超过3小时, 隔离特定的细胞类型通常需要几个小时 (超过3小时)。PBMCs 可以在一个小时内准备, 从而确保测量实时线粒体功能的准确性。虽然我们建议使用 PBMCs 的初步临床调查早期 uncharacterized 病人的人群, 其他细胞类型, 如 T 淋巴细胞, 血小板, 中性粒细胞, 和单核, 也可以使用目前的协议后, 优化电镀密度和呼吸抑制剂浓度15,25,26

在检测新系统线粒体功能之前, 首先确定最佳细胞密度和 FCCP 浓度是很重要的。根据我们的经验, 电镀 1.5 x 105细胞每井确保电镀后的细胞密度和洗涤步骤保持 80-90% 汇合。此外, 确定每个细胞类型的最佳 FCCP 浓度是至关重要的。应该对 FCCP 浓度的范围进行测试, 并在不损害细胞健康的情况下, 使用 FCCP 浓度来产生最大的 OCR。在测试的浓度, 1 微米的 FCCP 导致最大的呼吸 PBMCs。另一个关键步骤是实验的时间, 因为线粒体呼吸在 PBMC 隔离后3小时急剧下降。这意味着, 在样品收集后3小时内, 应进行户内应力测试, 以准确地捕获临床样品中的线粒体功能。值得指出的是, 许多研究人员只能使用冷冻样品。我们以前在冷冻和解冻后测试过 PBMCs, 这些细胞的线粒体功能受到很大的损害。因此, 我们建议在临床研究中使用新鲜的孤立 PBMCs, 当它是可行的。

生成可重现数据的另一个重要方面是数据规范化方法。虽然一些实验室已经成功地使用了可鉴定蛋白量化来规范化线粒体呼吸数据, 但我们发现它并不总是可行的, 特别是在低细胞密度。本协议中描述的规范化方法依赖于细胞数与染料核酸复合物的荧光发射之间的线性相关性, 并能准确量化10到5万细胞27。此外, 利用荧光核酸染色和荧光板读取器的规范化, 可以在实验完成后对活细胞进行快速量化。此外, 这种方法不需要 trypsinization 的黏附细胞或使用细胞刮刀。

该协议的一个警告是, 我们不分离 PBMCs 到特定的细胞类型, 然后进行线粒体功能分析。正如我们已经证明的, 线粒体呼吸随着时间的推移在 PBMC 隔离后迅速减少。这表明患者之间的差异可能是不准确的, 如果实验是在隔离不同的细胞群体后进行的, 这通常需要几个小时。尽管研究 PBMCs 等混合种群并没有揭示重要的细胞类型特定信息, 但使用 PBMCs 的实验获得的信息可以帮助指导未来的机械研究, 重点放在特定的细胞类型上。PBMCs 作为系统性线粒体功能障碍的代表, 这与全身性疾病如癌症疲劳10,28有关。目前手稿中描述的协议只提供了一个粗略的测量线粒体功能障碍, 而没有查明原因的观察。因此, 使用这一技术和程序的结果应谨慎解释, 必须考虑到疲劳的多因素性质, 例如与其他行为 (例如,抑郁症、睡眠、认知障碍) 的共同发生, 以及条件 (例如,心肺状态, 多重用药)。未来的研究应该检查特定细胞类型 (例如,自然杀伤细胞, T 淋巴细胞, 单核) 和不同临床人群中线粒体功能的变化 (例如,疲劳/非疲劳的癌症患者和健康的控制)。虽然它超出了当前手稿的范围, 我们将确定癌症疲劳严重程度和线粒体功能障碍之间的关联, 以及线粒体功能测量与疲劳物理试验的相关性, 如6分钟的步行测试, 在未来的调查。此外, 未来的研究还将检查其他癌症类型的线粒体功能障碍, 以确定是否在各种癌症类型的疲劳与线粒体功能障碍有关。最后, 我们开发了一项优化的协议, 用于快速评估使用临床样本的一般线粒体功能障碍。可以进行进一步的机械性调查, 以查明特定通路在这种衰弱状态下的参与情况。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了马里兰国家卫生研究院国立护理研究所内部研究司的充分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

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References

  1. Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13, (8), 1012-1039 (2015).
  2. Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52, (6), 832-840 (2016).
  3. Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19, (6), 744-750 (2015).
  4. Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40, (3), 184-193 (2017).
  5. Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2, (1), 1-16 (2009).
  6. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, (1), 505-531 (2016).
  7. Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208, (2), 117-120 (1996).
  8. Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267, (4), 394-401 (2010).
  9. Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
  10. Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40, (6), (2013).
  11. Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
  12. Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21, (4), 315-319 (2004).
  13. Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
  14. Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62, (2), 133-139 (2003).
  15. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
  16. Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205, (3), 392-400 (2012).
  17. Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20, (7), 1126-1167 (2014).
  18. Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (3), 389-395 (2001).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  20. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
  23. Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13, (2), 63-74 (1997).
  24. Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64, (5), 507-516 (2011).
  25. Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
  26. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93, (6), 690-700 (2013).
  27. Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254, (1), 85-98 (2001).
  28. Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19, (1), London, England. 67-74 (2014).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

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