Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo práctico para evaluar la disfunción mitocondrial asociada a fatiga en pacientes con cáncer. Este innovador protocolo está optimizado para uso clínico que implica flebotomía estándar y procedimientos básicos de laboratorio.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La fatiga es común y debilitante condición que afecta a la mayoría de los pacientes cáncer. Hasta la fecha, restos de fatiga mal caracterizados con ningún diagnóstico prueba para medir objetivamente la severidad de esta condición. Aquí describimos un método optimizado para la evaluación de la función mitocondrial de PBMCs recogidos de pacientes fatigados. Usando un sistema compacto de flujo extracelular y secuencial inyección de inhibidores respiratorios, examinamos estado funcional mitocondrial PBMC midiendo el básica respiración mitocondrial, capacidad respiratoria y fenotipo de energía, que describe la vía preferida de energía para responder al estrés. PBMCs frescos están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar. El ensayo completo que se describe en este protocolo se puede completar en menos de 4 horas sin la participación de técnicas bioquímicas complejas. Además, se describe un método de normalización que es necesario para obtener datos reproducibles. Los métodos de procedimiento y normalización simple presentados permiten para recolección de muestras repetidas del mismo paciente y generación de datos reproducibles que pueden compararse entre puntos de tiempo para evaluar los efectos potenciales del tratamiento.

Introduction

La fatiga es una condición frecuente y angustiante que tiene un impacto negativo en la calidad de vida de pacientes de cáncer1. Hasta la fecha, fatiga del cáncer sigue siendo mal definida y se basa sólo en información subjetiva de pacientes2. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar una prueba de laboratorio de diagnóstico fácilmente adaptable para caracterizar objetivamente la fatiga en el ajuste clínico3,4.

Se han propuesto múltiples mecanismos subyacentes, incluyendo la disfunción de las mitocondrias, que causan fatiga5. Las mitocondrias son los orgánulos de potencia, ofreciendo el 95% de las necesidades de energía celular por fosforilación oxidativa y juegan un papel importante en la señalización de calcio, apoptosis, señalización inmune y regulación de otros de eventos de señalización intracelular6 . Por consiguiente, alteración bioenergética mitocondrial y defectos en la producción de energía pueden contribuir a la fatiga. Apoyando esta hipótesis, estudios anteriores han observado mutaciones en el ADN mitocondrial en pacientes con síndrome de fatiga crónica7. Aunque no está claro si el origen fisiopatológico de la fatiga se encuentra dentro del sistema nervioso central o periférico tejidos, como músculos esqueléticos8,9, no existe ningún método directo para valorar con precisión disfunción mitocondrial se relaciona con fatiga en células vivas, respiran.

Utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para el estudio de la función mitocondrial ofrece varias ventajas. En primer lugar, PBMCs están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar y pueden ser aislados rápidamente utilizando técnicas de laboratorio básicas. En segundo lugar, la recogida de sangre es menos invasiva que recoger otros tejidos tales como una biopsia del músculo. Así, recogieron muestras de sangre pueden ser del mismo paciente repetidamente en el tiempo, que facilita la evaluación longitudinal de los efectos del tratamiento. Curiosamente, la función mitocondrial en PBMCs parece correlacionarse bien con estado mitocondrial renal en un modelo animal10. Además, las mitocondrias de la célula inmune se han utilizado como un proxy para la detección de cambios sistémicos en enfermedad diferentes condiciones11,12. Las mitocondrias en las células inmunes circulantes son particularmente sensibles a los cambios en las funciones inmunológicas e inmune señalización moléculas como citoquinas13,14,15. Por ejemplo, se ha observado que PBMCs de pacientes con enfermedades inflamatorias reumáticas agudas exhiben alta base oxígeno consumo14. En contraste, el consumo de oxígeno se redujo en PBMCs aisladas de pacientes con condiciones inflamatorias sistémicas incluyendo sepsis16. En condiciones inflamatorias, radicales libres producidos por las mitocondrias disfuncionales pueden contribuir al elevado estrés oxidativo y la inflamación prolongada17. El papel central de las mitocondrias en la producción de energía, así como en el estrés oxidativo sugiere la posible utilidad del uso de la función mitocondrial como un proxy para el estudio de la fatiga en pacientes de cáncer 13.

Estudios anteriores que examinan la función mitocondrial utilizan técnicas bioquímicas, medición de potencial de membrana mitocondrial o aislamiento de poblaciones celulares específicas que no pueden ser fácilmente adaptables en el ajuste clínico5, 14,18. En los últimos años, el desarrollo de ensayos de flujo extracelular ha permitido a los investigadores a fácilmente y con precisión examinar los cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en respuesta a las inyecciones automatizadas de inhibidores respiratorios19,20 , 21 , 22. sin embargo, la mayoría de estos estudios está diseñada para tipos específicos de la célula y el gran formato de alto rendimiento puede no ser aplicable en un ajuste clínico. En este manuscrito, se describe un protocolo optimizado para examinar la función mitocondrial para uso clínico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

El presente estudio (NCT00852111) fue aprobado por la Junta de revisión institucional (IRB) de los institutos nacionales de salud (NIH), Bethesda, Maryland. Los participantes inscritos en este estudio eran eutímicos, 18 años de edad o más, que fueron diagnosticados con cáncer de próstata no metastásico con o sin previa prostatectomía y fueron programados para recibir radioterapia de haz externo (EBRT). Los participantes potenciales fueron excluidos si tenían una enfermedad progresiva que puede causar fatiga significativa, tenían enfermedad psiquiátrica dentro de los últimos cinco años, tenía sin corregir el hipotiroidismo o anemia, o tenía una segunda malignidad. También se excluyeron los individuos que usaron sedantes, esteroides o agentes antiinflamatorios no esteroides. Se obtuvieron muestras de sangre de control sano en la medicina de los NIH Departamento de transfusión de donantes sanos bajo un protocolo aprobado por el IRB (NCT00001846). Todos los participantes son reclutados en el Magnuson Clinical Research Center en el NIH. Firmado Consentimientos informados escritos se obtuvieron antes de la participación en el estudio.

1. preparación de la medición de la función mitocondrial (día 1 del experimento)

  1. Cartucho Sensor del hidrato (véase Tabla de materiales; duración aproximada: 5 minutos).
    1. Retire el cartucho de Sensor de paquete. Añadir 200 μL Calibrant solución en cada pocillo de la placa de la utilidad, luego llenar cada foso con 400 μL Calibrant solución.
    2. Devuelva el Sensor de la placa a la placa de la utilidad, que ahora tiene solución Calibrant. Hidratar el cartucho en un incubador de 37 º C sin CO2 durante la noche.
      Nota: Cartucho Sensor necesita estar hidratado para un mínimo de 4 h y un máximo de 72 h.

2. preparación de la muestra clínicos (día 2 del experimento)

  1. Medir la fatiga mediante el artículo 13 funcional evaluación de enfermedad la terapia crónica - fatiga (FACIT-F)2,23,24 al inicio (antes de la iniciación de la EBRT), punto medio y completar EBRT y 1 año post-TRHE.
    1. Utilice un 0 - 4 escala de respuesta de cada elemento, donde 0 representa "nada" y 4 indica que el demandado refiere a la instrucción correspondiente "mucho." Puntaje total debe estar comprendida desde 16-53, con puntuaciones más bajas que reflejan la intensidad alta fatiga.
    2. Definir la fatiga como una puntuación de FACIT-F inferior a 43, con una puntuación de FACIT-F de ≥43 indicando ausencia de o no significativo clínicamente fatiga2.
      Nota: Una puntuación de FACIT-F 43 mejor divide puntuaciones de fatiga de pacientes con cáncer y la población general2.
    3. Incluyen los siguientes 13 artículos en la escala de fatiga de FACIT: 1) me siento fatigado; 2) me siento débil todo más; 3) me siento apático ("lavado hacia fuera"); 4) me siento cansado; 5) tengo problemas para iniciar cosas porque estoy cansado; 6) tengo problemas para terminar las cosas porque estoy cansado; 7) tengo energía; 8) soy capaz de hacer mis actividades habituales; 9) es necesario dormir durante el día; 10) estoy demasiado cansado para comer; 11) necesito ayuda para hacer mis actividades habituales; 12) me siento frustrado por estar demasiado cansado para hacer las cosas que quiero hacer; y 13) tengo que limitar mi actividad social porque estoy cansado.
  2. Aislar PBMC de muestras de sangre recién recogidas (duración aproximada: 1 h).
    1. Recoger 8 mL de sangre en un tubo de preparación de células mononucleares (véase Tabla de materiales).
      Nota: Las muestras de sangre deben procesarse dentro de las 2 h de colección. La calidad de PBMCs puede verse comprometida si las muestras de sangre se procesan más de 2 h después de la recogida de muestras.
    2. Centrifugue a 1.750 x g durante 30 min a temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferir la capa turbia en un tubo cónico de 15 mL. Añadir hasta 15 mL de PBS e invertir 5 veces.
    3. Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante sin pellets inquietante. Resuspender el pellet agregando a 10 mL de PBS e invierta 5 veces.
    4. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Descarte el líquido sobrenadante y Resuspenda las células en 1 mL de PBS. Transferir las PBMCs de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    5. Centrifugue a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en completo RPMI-1640 (RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 10 mM penicilina/estreptomicina).
  3. Capa de placas de células para que las células no adherentes (duración aproximada: 30 min).
    1. Preparar la solución adhesiva de células y tejidos (véase Tabla de materiales) diluyendo la solución madre en bicarbonato de sodio, 0.1 M pH 8.0. La solución de trabajo deben de 3.5 μg/cm2 de superficie.
      Nota: Esta solución contiene proteínas polifenólicos extraídas de lo marino mejillón, Mytilus edulis. Estas proteínas son componentes clave del pegamento secretada por el mejillón para anclarse a las superficies. Nos encontramos con que Cell-Tak funciona mejor con PBMCs.
    2. Añadir 100 μL de la solución de pegamento diluida en cada pocillo e incubar durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Lavar tres veces con agua desionizada y aire seco.

3. medición de la función mitocondrial

  1. Preparación de medios de ensayo (duración aproximada: 10 minutos).
    Nota: Los medios de ensayo deben ser recién preparados en el día del experimento.
    1. Añadir L-glutamina piruvato y glucosa a la base de los medios de comunicación (los mismo componentes como el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM), sin bicarbonato de sodio, glucosa, glutamina o piruvato de sodio) para hacer los medios de ensayo. Calentar el medio a 37 ° C, luego ajustar el pH a 7,4.
      Nota: Las concentraciones de L-glutamina, piruvato y glucosa son generalmente las mismas concentraciones en medios de crecimiento normal, pero pueden ser ajustadas en base a lo análisis.
  2. Preparar la prueba de estrés de Mito PBMCs (duración aproximada: 2 h).
    1. Placa suficiente PBMCs del paso 2 en cada pozo para llegar a 80-90% de confluencia. En nuestra experiencia, 1,5 x 105 células/pozo produjo los resultados más consistentes.
      Nota: Pozos A y H son los pozos de fondo y sólo deben contener los medios de análisis sin las células. En pozos B a G, se recomienda al menos 3-6 pocillos por muestra del paciente de la galjanoplastia para explicar afloramientos.
    2. Girar las placas de abajo a 200 x g durante 2 minutos permitir que las células se adhieran al fondo de los pozos. Lavar las células una vez con los medios de ensayo. Este paso quita suero y bicarbonato de sodio desde el medio de crecimiento.
      Nota: En nuestra experiencia, el paso de lavado quita típicamente 20-30% de las células.
    3. Añadir 180 medios de ensayo μL en cada pocillo, incluyendo pozos de fondo A y H. Incubar en una incubadora de 37 ° C no CO2 durante 45-60 minutos.
  3. Realizar la prueba de estrés de Mito
    1. Reconstituir los fármacos en el Kit de estrés de Mito con los medios de ensayo como sigue:
      1. Oligomycin: Agregar medios de ensayo μL 252 en el frasco para generar una solución de reserva a 50 μM.
      2. FCCP: Añadir 288 μL del medio de ensayo en el frasco para generar una solución de reserva a 50 μM.
      3. Antimycin A / rotenona: 216 añadir μL de medios de ensayo en el vial para generar una solución stock a 25 μM.
    2. Drogas de vórtice reconstituido durante aproximadamente 1 minuto. Diluir en soluciones de trabajo.
      Nota: Las concentraciones de las soluciones de trabajo deben ser graduadas y predeterminadas antes del experimento según el tipo de célula. Para PBMCs, encontramos que 1 μM de Oligomycin, 1 μM FCCP y 0.5 μM antimycin A / rotenona funcionan mejor.
    3. Pipetear las drogas en cada puerto en el cartucho de sensor secuencialmente:
      1. Puerto A: Pipeta de 20 μL de 10 μM Oligomycin, para una concentración final en cada pozo de 1 μM.
      2. Puerto B: pipeta 22 μL de 10 μM FCCP, para una concentración final en cada pozo de 1 μM.
      3. Puerto C: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para una concentración final en cada pozo de 0.5 μM.
  4. Seleccione "Test de estrés de Mito" en un instrumento de flujo extracelular. Siga sistema de instrumento e inserte el cartucho de sensor. El instrumento realizará automáticamente la calibración del sensor. Inserte la placa de la célula después de calibración del sensor y el instrumento terminará el resto del ensayo. Dinámica de oxígeno se mide a 530 nm (excitación) / 650nm (emisión), y concentración de protón se mide a 470 nm (excitación) / 530 nm (emisión).

4. normalización de los datos de la función mitocondrial

  1. Preparar la solución de ensayo de proliferación celular (duración aproximada: 5 minutos).
    1. Añadir 48 μL de ácido nucleico mancha (x 500) y supresor de fondo 240 μL a 11,7 mL PBS (x 2). La mancha de ácido nucleico es un colorante florescente de la célula de ADN, y el supresor de fondo es un tinte de enmascaramiento que bloquea las células muertas o células con integridad de la membrana de la célula comprometida de ser manchado. La combinación del tinte de unión al ADN y el supresor de fondo asegura que se tiñen las células sólo vivas.
    2. Añadir un volumen igual de 2 x solución de trabajo (180 μL) directamente en el medio en cada pozo ha finalizado la prueba de estrés de Mito.
  2. Incubar las células en presencia de solución de ensayo de proliferación celular en una incubadora de 37 ° C durante 45-60 minutos cuantificar el número de células vivas (fluorescente) en un lector de placas a 508 nm (excitación) / 527 nm (emisión) y normalizar datos OCR (duración aproximada: 10 minutos) .
    Nota: además de las células energizadas número, los usuarios pueden elegir también a normalizar sus datos con el número total de células, cantidad de ácido nucleico, las concentraciones de proteína, etcetera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Los Test de estrés del Mito se basa en medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) después de la inyección secuencial de varios inhibidores respiratorios para asignar un perfil mitocondrial completo. Mediciones de OCR después de cada inyección de la droga puede utilizarse para calcular los siguientes parámetros relacionados con la salud mitocondrial: OCR Basal se mide primero antes de cualquier inyección de la droga para evaluar el consumo de oxígeno necesario para cubrir reposo nivel demanda de ATP. Respiración basal se calcula restando la tasa de respiración no mitocondrial desde el inicio OCR antes de la inyección de oligomycin. A continuación, se inyecta oligomycin para inhibir el canal de protones de la ATP sintasa (complejo V). La gota subsecuente en OCR después de la inyección de oligomycin representa consumo de oxígeno relacionadas con la producción de ATP. FCCP (cianuro de carbonilo 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), un ionóforo utilizado para alterar el gradiente de protones y el potencial de membrana mitocondrial, entonces se utiliza para obtener el consumo máximo de oxígeno. Respiración máxima se calcula restando la respiración no mitocondrial de la OCR máxima después de la inyección del FCCP. Capacidad respiratoria es la diferencia entre respiración basal y máxima. Por último, antimicina un (complejo inhibidor III) y rotenona (complejo I inhibidor) se inyectan al mismo tiempo para cerrar la cadena de transporte de electrones. Por definición, la respiración no mitocondrial es independiente de la cadena de transporte de electrones (por ejemplo, no mitocondrial NADPH oxidasa en los macrófagos, etcetera.) y se representa como valores de OCR después antimycin A / inyección de rotenona. Eficiencia de acoplamiento describe la fracción de consumo de oxígeno mitocondrial básico utilizado para la síntesis de ATP y se calcula como 100% x (OCR relacionadas con la producción de ATP) /(basal respiration rate).

Densidad celular para cada condición de cultivo debe optimizarse antes de realizar una prueba de esfuerzo de mito. En nuestra experiencia, 80-90% de confluencia se logra mediante placas de 1.5 x 105 células/pozo de PBMCs recién aisladas de sangre humana (figura 1A). Esta densidad de placas explica el paso de lavado que se describen en el paso 3.2.3. Además de determinar la densidad óptima de la galjanoplastia, titulación FCCP debe realizarse para determinar la concentración necesaria para generar máxima OCR. En el FCCP concentraciones probadas - 0,125 μM, 0.25 μM, 0,5 μM, 1 μM y 2 μM - OCR aumentó con la concentración de la FCCP alcanzar un plateau en 1 μM, pero se redujo a 2 μM (figura 1B). Esto indica que 1 μM es la concentración óptima de FCCP que puede usarse para examinar la función mitocondrial de PBMC.

Probamos la función mitocondrial de un mismo lote de las células de la misma muestra de sangre de un donante sano en varios puntos del tiempo después de aislamiento de PBMC. Consumo de oxígeno basal así como OCR máxima disminuyó tan temprano como 3 h y continuo a la disminución en 5 y 8 h después del aislamiento de PBMC (figura 2A). Después de 3 horas, máxima respiración inducida por inyección de FCCP (momentos 7-9) no excediera OCR basal, sugiriendo que incluso en células vivas, las mitocondrias repuesto capacidad respiratoria disminuye rápidamente con el tiempo. Simultáneamente se midió la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en un instrumento de flujo extracelular. Desde oligomycin inhibe synthase mitocondrial de ATP, glucólisis es reclutado dentro de minutos para satisfacer la demanda de energía y compensar la falta de producción de ATP mediante fosforilación oxidativa, según lo demostrado por el rápido aumento de ECAR después oligomycin inyección. Tan pronto como 3 h después de aislamiento de PBMC, hubo una disminución en ECAR como OCR (figura 2B). Aunque no observamos ningún cambio notable en la viabilidad celular en 1, 3, 5 y 8 h después de aislamiento de PBMC, función mitocondrial disminuyó rápidamente, lo que sugiere que la sincronización es clave para capturar el perfil mitocondrial de PBMCs vivo, respirando.

Colecciones de muestra del paciente tienden a ocurrir en varias ocasiones en diferentes días; por lo tanto, es crucial para normalizar los datos para comparar diversas muestras y puntos de tiempo. Mientras que otros métodos de normalización tales como proteína análisis y cuantificación de ácidos nucleicos puede ser utilizada, encontramos que la tinción de células vivas con un tinte de unión al ADN y cuantificación de células verdes fluorescentes en cada pozo es la normalización más eficiente y confiable método. Datos representativos de PBMCs recolectados de dos diferentes donantes sanos en dos días separados se muestran en la figura 3. La inserción es una imagen representativa de una placa celular bien mostrando células totales (contraste de fases) y células vivas teñida con el tinte de unión al ADN (verde fluorescente) después de la prueba de tensión del mito. Tasa de consumo de oxígeno basal, así como el consumo de oxígeno después de cada inyección de la droga normalizado para vivir las células fueron similares en dos diferentes no fatigados donantes sanos (figura 3).

Datos representativos de la función mitocondrial de un sujeto fatigado (puntuación FACIT-F < 43) con cáncer de próstata (rojo) y una edad/género/raza-emparejado no fatigados donante sano (azul) se muestran en la figura 4. Aunque no observamos ninguna diferencia en el OCR basal (figura 4B), el sujeto fatigado exhibió disminución de consumo máximo de oxígeno, así como capacidad respiratoria en comparación con el control (figura 4C, D). Fatiga parece estar relacionada con la reducción en la capacidad respiratoria, ya que no hubo diferencias encontradas el consumo de oxígeno no mitocondrial (figura 4E), consumo de oxígeno relacionados con el ATP (figura 4F), o acoplamiento de eficiencia (figura 4G). Datos iniciales (antes de cualquier inyección de la droga) y la máxima respiración después de inyección FCCP puede visualizarse utilizando una trama de fenotipo de energía, que revela el camino preferido (fosforilación oxidativa de OCR versus glucólisis ECAR) en presencia de mayor demanda de energía (figura 4H). Plazas vacías indican fenotipo basal energía y sólidos cuadrados indican el fenotipo de la energía en respuesta a la máxima demanda de ATP. La distancia entre basal (casilla vacía) y máxima (macizo cuadrado) indica capacidad de repuesto, mientras que la pendiente indica preferencia celular hacia la fosforilación oxidativa frente a glucólisis. Como se muestra en la figura 4H, capacidad en el tema de la fatiga disminuyó en comparación con el control sano no está fatigado. Además, el fenotipo de la energía en respuesta a la mayor demanda de ATP sesgada hacia glucólisis en el fatigado tema comparado con control sano (figura 4H).

Figure 1
Figura 1 : PBMC galjanoplastia densidad y curva de dosis-respuesta FCCP. (A) recién aislado PBMCs fueron plateadas en 1.5 x 105 células/pozo cubierto de CellTak de la célula cultura miniplacas. Después de lavar y cambian los medios de comunicación, las células fueron distribuidas uniformemente en el 80-90% de confluencia. Barra de escala = 100 μm. (B) OCR aumenta con el aumento de las concentraciones de FCCP en μM 0.125, 0.25 μM, 0,5 μM, alcanzando picos OCR en 1 μM. OCR cayó en 2 μM, lo que indica que 1 μM es la dosis óptima para obtener la máxima respiración en PBMCs.Error barras indican la desviación estándar de las mediciones secuenciales 3 después de la inyección de la droga inicial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Respiración mitocondrial disminuye con el tiempo en PBMCs recién aislados. OCR (A) así como ECAR (B) disminuyó rápidamente con el tiempo después de aislamiento de PBMC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Datos del representante de la respiración mitocondrial con la normalización. Prueba de tensión del mito fue realizada usando PBMCs frescos aislado de dos voluntarios sanos diferentes en días diferentes y normalizado mediante una tinción fluorescente de ácidos nucleicos cuantificada en un lector de placas de fluorescentes. Recuadro: una imagen representativa de células vivas (verde) y un total de células (contraste de fases) en un pozo. Barra de escala = 1.000 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 4
Figura 4 : Análisis representativo de un sujeto fatigado frente a un control sano. Gráfico (A) representante Mito estrés prueba OCR de un sujeto fatigado en comparación con un/género/raza no fatigados saludable control de edad comparable. Repuesto de gráficos de barras de basal OCR (B), (C), de la respiración máxima capacidad respiratoria (D), consumo de oxígeno no mitocondrial (E), producción de ATP (F)y la eficiencia de acoplamiento (G) se muestran. La trama de fenotipo la energía del sujeto fatigado y el control sano se muestra (H). Plazas vacías indican fenotipo de energía basal, cuadrados sólidos representan fenotipo energía estrés medido después de la inyección del FCCP. Barras de error indican la desviación estándar de 3 diferentes pozos para cada participante del estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La fatiga en pacientes con cáncer es una condición debilitante que no está bien definido o caracterizado1. Diagnóstico de fatiga se basa enteramente en informes subjetivos y no hay estándar actual de diagnóstico o tratamiento para esta condición, en gran parte debido a la falta de entendimiento en el pathobiology2. De los mecanismos propuestos que fatiga en pacientes con cáncer, deterioro de la función mitocondrial es uno de los caminos más terapéutico targetable. Por lo tanto, hemos desarrollado un método rápido y práctico para la medición de la función mitocondrial en muestras clínicas que pueden utilizarse para identificar a pacientes en riesgo de desarrollar cáncer relacionados con el tratamiento efectos secundarios incluyendo fatiga, así que temprano de forma proactiva gestión puede ser instituida.

La tecnología de flujo extracelular, en combinación con inyección secuencial de inhibidores respiratorios permitir la evaluación del estado funcional mitocondrial y se ha utilizado para ambos en vitro y en vivo modelos19, 20,21. Hemos ampliado el cuerpo existente de la obra y desarrolló un método optimizado para la examinación de la disfunción mitocondrial en muestras clínicas. Una ventaja del estudio es la utilización del analizador compacto de flujo extracelular. Como hemos demostrado, el tiempo del experimento es crucial después de aislamiento de PBMCs frescas de sangre humana. Mientras que el formato más grande (formato de 96 pocillos o 24 pocillos) es la elección ideal para un experimento de alto rendimiento, el sistema compacto de flujo extracelular, que contiene 8 pocillos, permite la evaluación individual de cada muestra de paciente19. Este método es más práctico y rentable (en relación con el propio instrumento y a los reactivos utilizados para realizar el ensayo), porque la recolección de muestras de pacientes diferentes tienden a ocurrir en varias veces en días distintos.

La utilización de PBMCs para evaluar la función mitocondrial en pacientes con cáncer fatigado tiene varias ventajas: 1) biopsia de tejidos como los músculos esqueléticos puede ser poco práctica a veces; 2) PBMCs son fácilmente disponibles y fácilmente se puede aisladas usando tubos de preparación de la célula, que ofrece una ventaja práctica en un entorno clínico; y 3) hemos demostrado que la función mitocondrial disminuye después de que las células recién aisladas han sido en la cultura por más de 3 horas y aislamiento de tipos celulares específicos generalmente tarda varias horas (más de 3 horas). PBMCs se pueden preparar en menos de una hora, garantizando así la exactitud de la medición de la función mitocondrial en tiempo real. Aunque es aconsejable usar PBMCs para la investigación clínica inicial en poblaciones de pacientes no previamente caracterizadas, otros tipos de células como los linfocitos T, plaquetas, neutrófilos y monocitos pueden emplearse con el protocolo actual después de la optimización de la galjanoplastia densidad y respiratorio inhibidor concentraciones15,25,26.

Antes de probar la función mitocondrial en un nuevo sistema, es importante primero determinar la densidad celular óptima y las concentraciones del FCCP. En nuestra experiencia, 1,5 x 105 células por pocillo de la galjanoplastia asegura de que la densidad celular después de la galjanoplastia y la confluencia de 80-90% restos de lava paso. Además, es crucial determinar las concentraciones óptimas de FCCP para cada tipo de célula. Deben analizarse las concentraciones de una gama de FCCP y debe utilizarse la concentración FCCP que produce OCR máxima sin comprometer la salud de una célula. En las concentraciones probadas, 1 μM de FCCP dio lugar a la respiración máxima en PBMCs. Otro paso fundamental es el tiempo del experimento, como gotas de respiración mitocondrial empinado 3 horas después de aislamiento de PBMC. Esto significa que se debe realizar la prueba de estrés de mito dentro de 3 horas después de la recolección de muestra para capturar con precisión la función mitocondrial en una muestra clínica. Cabe señalar que muchos investigadores sólo tienen acceso a las muestras congeladas. Previamente hemos probado PBMCs después de congelación y descongelación, y las funciones mitocondriales de estas células son enormemente comprometidas. Por lo tanto, se recomienda uso recién aislado PBMCs en estudios clínicos, cuando sea posible.

Otro aspecto importante de generación de datos reproducibles es el método de normalización de datos. Mientras que algunos laboratorios han tenido éxito utilizando cuantificación de proteína BCA para normalizar la respiración mitocondrial datos, encontramos que no siempre es factible especialmente en una densidad baja de la célula. El método de normalización que se describe en este protocolo se basa en la correlación lineal entre el número de células y la emisión de fluorescencia de los complejos de ácido nucleico de tinte y puede cuantificar exactamente 10 a 50.000 células27. Además, normalización utilizando una combinación de la tinción fluorescente de ácidos nucleicos y un lector de placas fluorescentes permite la cuantificación rápida de células vivas después de la terminación del experimento. Además, este método no requiere tripsinización de células adherentes o con un raspador celular.

Una advertencia del protocolo es que no separamos PBMCs en tipos de células específicas antes de realizar el análisis funcional mitocondrial. Como hemos demostrado, la respiración mitocondrial disminuye rápidamente con el tiempo después de aislamiento de PBMC. Esto sugiere que las diferencias entre pacientes pueden ser inexactas si el experimento se realizó después de aislar diferentes poblaciones celulares, que generalmente toma un par de horas. A pesar de estudiar poblaciones mixtas como PBMCs no reveló información específica del tipo de célula importante, información obtenida de experimentos usando PBMCs puede ayudar a futuras investigaciones mecánicas guía centradas en tipos celulares específicos. PBMCs sirven como un proxy para la sistémica disfunción mitocondrial, que es relevante en enfermedades sistémicas como cáncer fatiga10,28. El protocolo descrito en el manuscrito actual sólo proporciona una medición cruda de la disfunción mitocondrial sin indicar la causa de la observación. Por lo tanto, utilizando esta tecnología y procedimiento de resultados deben ser interpretados con precaución y debe tener en cuenta la naturaleza multifactorial de la fatiga, tales como su co-ocurrencia con otros comportamientos (p. ej., depresión, sueño, deterioro cognitivo) y condiciones (por ejemplo, el estado cardiopulmonar, polifarmacia). Los estudios futuros deben examinar alteraciones en funciones mitocondriales en tipos de células específicas (por ejemplo, las células natural killer, linfocitos T y monocitos) y en varias poblaciones clínicas (p. ej., pacientes con cáncer está fatigado/no-fatigados y controles sanos). Mientras que es más allá del alcance del manuscrito actual, determinamos las asociaciones entre severidad de fatiga del cáncer y la disfunción mitocondrial, así como la correlación entre las mediciones de la función mitocondrial y pruebas físicas de la fatiga como una prueba de 6 minutos a pie, en el futuro de las investigaciones. Además, los estudios futuros también examinarán la disfunción mitocondrial en otros tipos de cáncer con el fin de determinar si la fatiga a través de varios tipos de cáncer está asociado con la disfunción mitocondrial. En conclusión, hemos desarrollado un protocolo optimizado para una rápida evaluación general disfunciones mitocondriales utilizando muestras clínicas. Más investigaciones mecanicistas pueden realizarse para detectar la implicación de vías específicas de esta condición debilitante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio es apoyado completamente por la división de investigación intramuros del Instituto Nacional de enfermería investigación de los NIH, Bethesda, Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13, (8), 1012-1039 (2015).
  2. Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52, (6), 832-840 (2016).
  3. Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19, (6), 744-750 (2015).
  4. Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40, (3), 184-193 (2017).
  5. Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2, (1), 1-16 (2009).
  6. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, (1), 505-531 (2016).
  7. Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208, (2), 117-120 (1996).
  8. Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267, (4), 394-401 (2010).
  9. Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
  10. Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40, (6), (2013).
  11. Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
  12. Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21, (4), 315-319 (2004).
  13. Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
  14. Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62, (2), 133-139 (2003).
  15. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
  16. Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205, (3), 392-400 (2012).
  17. Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20, (7), 1126-1167 (2014).
  18. Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (3), 389-395 (2001).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  20. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
  23. Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13, (2), 63-74 (1997).
  24. Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64, (5), 507-516 (2011).
  25. Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
  26. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93, (6), 690-700 (2013).
  27. Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254, (1), 85-98 (2001).
  28. Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19, (1), London, England. 67-74 (2014).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics