Kanserle ilgili yorgunluk mitokondriyal işlev rolünün değerlendirilmesi

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Amacımız mitokondrial disfonksiyon kanser hastalarında yorgunluk ile ilişkili değerlendirmek için pratik bir protokol geliştirmekti. Bu yenilikçi protokol döneminde klinik kullanımı içeren yalnızca standart flebotomi ve Temel Laboratuvar işlemleri için optimize edilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yorgunluk bir ortak ve çoğu kanser hastaları etkileyen durum zayıflatıcı olduğunu. Bugüne kadar bu durumun şiddetini ölçmek için objektif yorgunluk kalır kötü hiçbir tanı ile karakterize sınayın. Burada PBMCs yorgun kanser hastalarına toplanan mitokondriyal işlev değerlendirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi açıklanmaktadır. Bir kompakt ekstraselüler akı sistemi ve solunum inhibitörleri sıralı enjeksiyon kullanma, biz PBMC mitokondrial fonksiyonel durum bazal mitokondrial solunum, yedek solunum kapasitesi ve açıklar enerji fenotip ölçerek muayene strese yanıt vermek için tercih edilen enerji yolu. Taze PBMCs klinik ayarı standart flebotomi kullanarak kolayca kullanılabilir. Bu protokol için açıklanan tüm tahlil karmaşık biyokimyasal tekniklerin katılımı olmadan 4 saatten az bir süre içinde tamamlanabilir. Ayrıca, tekrarlanabilir veri almak için gerekli olan bir normalleştirme yöntemi açıklanmaktadır. Sunulan basit yordamı ve normalleştirme Yöntem aynı hasta ve potansiyel tedavisinin etkileri değerlendirmek için zaman puan arasında karşılaştırılabilir tekrarlanabilir veri nesil tekrarlanan örnek toplama için izin vermek.

Introduction

Yorgunluk, kanser hastaları1yaşam kalitesi üzerinde olumsuz bir etkisi vardır yaygın ve üzücü bir durumdur. Bu tarihe kanser yorgunluk kötü tanımlanmış kalır ve sadece öznel hastalar2tarafından raporlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, yorgunluk klinik ayarı3,4objektif olarak niteleyen bir kolayca uyarlanabilir tanılama laboratuvar testi tanımlamak için acil bir ihtiyaç vardır.

Mitokondri disfonksiyon, dahil olmak üzere birden çok temel mekanizmaları yorgunluk5neden önerilen. Mitokondri hücresel enerji ihtiyacı ile Oksidatif fosforilasyon, % 95'i sağlayan elektrik santrali organelleri ve kalsiyum sinyal, apoptozis, bağışıklık sinyal ve diğer hücre içi sinyal olaylar6 düzenlenmesi önemli bir rol oynamak . Buna göre Engelli mitokondriyal bioenergetics ve enerji üretim hatalarını yorgunluk için katkıda bulunabilir. Bu hipotezi destekleyen, önceki çalışmalarda kronik yorgunluk sendromu7olan hastalarda mitokondriyal DNA'da mutasyonlar gözlemledim. Olup merkezi sinir sistemi veya iskelet kasları8,9gibi periferik doku içinde yorgunluk patofizyolojik kökeni yatıyor belirsiz kalırken işte şu anda doğru değerlendirmek için doğrudan Yöntem Mitokondrial disfonksiyon canlı, respiring hücrelerdeki yorgunluk ile ilgili.

Mitokondriyal işlev çalışmaya periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) kullanarak birçok avantaj sunar. İlk olarak, PBMCs standart flebotomi kullanarak klinik ortamda kullanılabilir ve hızlı bir şekilde temel laboratuvar teknikleri kullanarak ayrılmış olabilir. İkinci olarak, kan diğer dokulara kas biyopsisi gibi toplama daha az invaziv oluşur. Böylece, kan örnekleri aynı hastadan art arda tedavisinin etkileri boyuna değerlendirilmesi kolaylaştırır zaman içinde toplanabilir. İlginçtir, PBMCs mitokondriyal işlevde de bir hayvan modeli10böbrek mitokondrial durumu ile ilişkili olduğu ortaya çıktı. Ayrıca, bağışıklık hücre mitokondri farklı hastalık koşulları11,12altında sistemik değişiklikleri algılamak için bir proxy olarak kullanılmaya başlandı. Mitokondri bağışıklık hücreleri dolaşan içinde özellikle bağışıklık işlevlerindeki değişikliklere duyarlı ve bağışıklık sitokinler13,14,15gibi moleküller sinyal vardır. Örneğin, PBMCs hastalarda akut romatizmal inflamatuar hastalıklar ile yüksek temel oksijen tüketimi14sergi gözlenmiştir. Buna ek olarak, oksijen tüketimi sepsis16dahil olmak üzere sistemik inflamatuar koşullar ile hastalardan izole PBMCs düşürüldü. İnflamatuar koşullar altında serbest radikaller tarafından işlevsiz mitokondri üretilen daha fazla yüksek oksidatif stres ve uzun süreli iltihap17için katkıda bulunabilir. Mitokondri oksidatif stres gibi enerji üretiminde de merkezi rol yorgunluk kanser hastaların 13' te çalışmak için bir proxy olarak mitokondriyal işlev kullanarak potansiyel yardımcı programı öneriyor.

Mitokondriyal işlev inceleyerek önceki çalışmalarda kullanılan biyokimyasal teknikleri, mitokondrial membran potansiyeli ölçüm veya klinik ayarı5', kolayca adapte olmayabilir belirli hücre popülasyonlarının yalıtım 14,18. Son yıllarda, hücre dışı akı deneyleri gelişimi araştırmacılar için kolayca izin verdi ve doğru bir şekilde yanıt olarak solunum inhibitörleri19,20 otomatik enjeksiyon oksijen tüketim oranını (OCR) değişiklikleri incelemek , 21 , 22. ancak, bu çalışmaların en belirli hücre tipleri için tasarlanmıştır ve yüksek üretilen iş büyüklüğündeki bir klinik ortamda geçerli olmayabilir. Bu makale, klinik kullanım için mitokondriyal işlev incelenmesi için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çalışmada (NCT00852111) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB tarafından) ulusal kurumları, sağlık (NIH), Bethesda, Maryland kabul edildi. Bu çalışmada kayıtlı katılımcılar ötimik adamları, 18 yaş yaş ve üstü, kim sigara metastatik prostat kanseri ile veya olmadan önceki prostatektomi tanısı konuldu ve vardı dış beam radyasyon terapisi (EBRT) almak üzere zamanlanmış. Potansiyel katılımcılar hariç onlar önemli yorgunluk, neden olabilir ilerleyici bir hastalık olsaydı, psikiyatrik hastalık son beş yıl içinde vardı düzeltilmeyen hipotiroidizm veya anemi, ya da ikinci bir malignite vardı. Sakinleştirici, steroidler veya non-steroid anti-enflamatuar ajanlar kullanılan bireyler de dışlandı. Sağlıklı kontrol kan örnekleri, NIH nakli bölümü tıp bir IRB tarafından onaylanan Protokolü (NCT00001846) altında sağlıklı bağışçılardan elde edilmiştir. Tüm katılımcılar NIH Magnuson klinik araştırma Merkezi'nde yaşında işe alınmış. İmzalı yazılı bilgilendirilmiş izinlerin çalışma katılım önce elde edilmiştir.

1. mitokondriyal işlev ölçüm hazırlık (1. gün deneme)

  1. Sensör kartuş hidrat (süresi yaklaşık Malzemeler tablo; görmek: 5 dk).
    1. Sensör kartuşu paketinden çıkarın. Yardımcı program plaka her kuyuya 200 μL Calibrant çözüm ekleyin, sonra her hendek 400 μL Calibrant çözüm ile doldurun.
    2. Şimdi Calibrant çözüm var yardımcı programı plaka sensörü plaka dönün. Kartuş sigara-CO2 37 ° C kuluçka gecede hidrat.
      Not: Sensör kartuş 4 h en az ve en fazla 72 h için nemli gerekiyor.

2. Klinik numune hazırlama (2. gün deneme)

  1. Yorgunluk 13 maddelik işlevsel değerlendirme, kronik hastalık tedavisi - temel (önce EBRT başlatma), orta nokta ve tamamlanması EBRT ve 1 yıl sonrası-EBRT, yorgunluk (FACIT-K)2,23,24 kullanarak ölçmek.
    1. Kullanım a 0 - 4 ölçek nerede bir 0 "hiç de" temsil eder ve bir 4 davalı için karşılık gelen deyimi "çok fazla" ilgilidir her madde yanıt için Toplam puanları ile daha düşük Skorlar yüksek yorgunluk şiddeti yansıtan 16-53, mesafe.
    2. Yorgunluk bir FACIT-F 43 düşük puan ≥43 yokluğu veya klinik-rağmen anlamlı olmayan yorgunluk2gösteren FACIT-F puanı olarak tanımlayın.
      Not: 43 en iyi FACIT-F puan yorgunluk puanları kanser hastaları ve genel nüfus2böler.
    3. FACIT yorgunluk ölçeğinde aşağıdaki 13 bileşen içerir: 1) yorgun; hissediyorum 2) her yerde güçsüz hissediyorum; 3) Ben bitkin hissediyorum ("yıkanmış"); 4) kendimi yorgun hissediyorum; 5) ben yorgun olduğum için işler başladı sorun var; 6) ben yorgun olduğum için şeyler bitirme sorun var; 7) ben enerji var; 8) Ben her zamanki benim faaliyetleri yapmak am güçlü; 9) gündüz uyumak istiyorum; 10) yemek için çok yorgunum; 11) benim her zamanki faaliyetleri yaparken yardıma ihtiyacım var; 12) ben çok yapmak istediğim şeyleri yapmak için yorgun tarafından hayal kırıklığına; ve 13) yorgun olduğum için benim sosyal etkinlik sınırlamak zorunda.
  2. PBMC taze toplanan kan örneklerinden izole (yaklaşık süre: 1 h).
    1. 8 mL kan mononükleer hücreler hazırlık tüp içine toplamak ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Kan örnekleri içinde 2 h koleksiyonunun işlenmesi gerektiğini. Kan örnekleri daha 2 h örnek toplandıktan sonra işlenirse PBMCs kalitesini tehlikeye olabilir.
    2. 1750 x g (18-25 ° C) Oda sıcaklığında 30 dakika, santrifüj kapasitesi. Bulutlu katman 15 mL konik tüp aktarın. PBS ilâ 15 mL ekleyin ve 5 kez tersine çevirin.
    3. 300 x g de 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatle kaldırmak ve süpernatant rahatsız edici Pelet olmadan. Pelet ilâ 10 mL PBS ekleyerek yeniden askıya alma ve 5 kez tersine çevirin.
    4. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g, santrifüj Süpernatant sıvı atın ve 1 mL PBS hücrelerde yeniden askıya alma. PBMCs 1.5 mL microfuge tüp aktarın.
    5. 610 x g de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve Pelet tam RPMI-1640 yılında resuspend (RPMI-%1640 10 ile desteklenmiş FBS, 10 mM penisilin/streptomisin).
  3. Kat hücre plakaları yapışık olmayan hücreler için (yaklaşık süresi: 30 dk).
    1. Hücre ve doku yapıştırıcı çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 0.1 M sodyum bikarbonat pH 8.0 hisse senedi çözümde sulandrarak tarafından. Çalışma çözüm 3,5 μg/cm2 yüzey alanının adlı olmalıdır.
      Not: Bu çözüm deniz midyesi, Mytilus mantarı--dan hulâsa polifenolik proteinleri içerir. Bu proteinler kendisi yüzeylere tutturmak midye tarafından salgılanan tutkal anahtar bileşenleridir. Biz hücre-Tak PBMCs ile en uygun bulmak.
    2. Her şey için yapıştırıcı seyreltilmiş çözeltinin 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında en az 20 dk için kuluçkaya. Üç kez DI su ve hava ile kuru yıkayın.

3. mitokondriyal işlev ölçüm

  1. Tahlil medya hazırlanması (yaklaşık süre: 10 dk.).
    Not: Tahlil medya denemenin gün taze hazırlanmalıdır.
    1. L-glutamine, pyruvate ve glikoz medya (aynı bileşenlerin Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) olarak, ama sodyum bikarbonat, glikoz, glutamin veya sodyum pyruvate olmadan) üsse tahlil medya yapmak için ekleyin. Medya ısınmak için 37 ° C, sonra pH 7.4 için ayarlayın.
      Not: L-glutamine, pyruvate ve şekeri konsantrasyonları normal büyüme medya konsantrasyonlarda genellikle aynıdır, ancak üzerinde tahlil göre ayarlanabilir.
  2. PBMCs Mito stres test için hazırlamak (yaklaşık süre: 2 h).
    1. Adım 2 yeterli PBMCs % 80-90 confluency ulaşmak için her kuyuya plaka. Deneyim, 1.5 x 105 hücreleri/iyi en tutarlı sonuçlar vermiştir.
      Not: Kuyu A ve H arka plan kuyu vardır ve yalnızca tahlil medya ile hiçbir hücre içermelidir. Wells B G için en az 3-6 kuyu hasta örnek başına outliers için hesap için kaplama öneririz.
    2. Tabak iyi spin aşağı 200 x g hücreleri kuyu dibine bağlı kalmak izin vermek 2 min için de. Hücreleri bir kez tahlil medya ile yıkayın. Bu adımı serum ve sodyum bikarbonat büyüme medyasından kaldırır.
      Not: deneyim, çamaşır adım genellikle 20-%30 hücre kaldırır.
    3. Bir sigara-CO2 37 ° C kuluçka 45-60 dk için arka plan kuyu A ve H. Incubate dahil olmak üzere her kuyuya 180 μL tahlil medya ekleyin.
  3. Mito stres testi çalıştırma
    1. Uyuşturucu Mito stres seti tahlil medya ile aşağıdaki gibi yeniden oluşturma:
      1. Oligomycin: 252 μL tahlil medya 50 mikron hisse senedi bir çözüm üretmek için şişe içine ekleyin.
      2. FCCP: 288 μL tahlil medya 50 mikron hisse senedi bir çözüm üretmek için şişe içine ekleyin.
      3. Antimycin A / Rotenon: 216 eklemek μL tahlil medya 25 mikron hisse senedi bir çözüm üretmek için şişe içine.
    2. Girdap uyuşturucu yaklaşık 1 dakika için yeniden düzenlendi. Çalışma çözümlerinizle sulandırmak.
      Not: Çalışma çözümleri konsantrasyonları titre ve önceden belirlenen hücre türüne bağlı olarak deney öncesinde gerekir. PBMCs için biz Oligomycin bu 1 mikron, 1 mikron FCCP ve 0.5 mikron antimycin A bulmak / Rotenon en iyi iş.
    3. Uyuşturucu her bağlantı noktasına sensör kartuşundaki pipette sırayla:
      1. Bağlantı noktası A: Pipet 20 μL 10 mikron, Oligomycin, 1 mikron her iyi son bir konsantrasyon için.
      2. Bağlantı noktası B: 10 mikron FCCP, 1 mikron her iyi son bir konsantrasyon pipet 22 μL.
      3. Bağlantı noktası C: Pipet 25 μL 5 mikron antimycin A, / Rotenon 0.5 mikron her iyi son bir konsantrasyon için.
  4. "Mito stres testi" hücre dışı akı enstrüman üzerinde seçin. Enstrüman istemi izleyin ve sensör kartuşu takın. Araç kalibrasyon etiket sensörü otomatik olarak gerçekleştirir. Kalibrasyon etiket sensörü ve enstrüman tahlil kalan bitirdikten sonra hücre montaj levhası. Oksijen dynamics 530 ölçülen nm (uyarma) / 650nm (emisyon), ve proton konsantrasyon 470 ölçülen nm (uyarma) / 530 nm (emisyon).

4. mitokondriyal işlev veri normalleştirme

  1. Hücre çoğalması tahlil çözüm hazırlamak (yaklaşık süresi: 5 dk).
    1. 48 μL nükleik asit leke (500 x) ve 240 μL arka plan bastırıcı 11.7 mL PBS ekleyin (2 x). Nükleik asit leke bir hücre permeant DNA'ya bağlanıcı boya ve arka plan bastırıcı ölü hücreleri veya hücre lekeli üzerinden güvenliği aşılan hücre zarının bütünlüğü ile bloklar maskeleme boya. DNA'ya bağlanıcı boya ve arka plan bastırıcı yalnızca canlı hücreleri lekeli sağlar.
    2. Mito stres testi tamamlandıktan sonra her şey ortamda doğrudan çalışma çözüm (180 μL) x 2 eşit miktarda ekleyin.
  2. Hücreleri hücre proliferasyonu tahlil çözümü için 45-60 dk. miktarını canlı hücre (floresan) 508, plaka okuyucu sayısı 37 ° C kuluçka huzurunda kuluçkaya nm (uyarma) / 527 nm (emisyon) ve OCR verileri normalleştirmek (yaklaşık süre: 10 dk.) .
    Not: numara canlı hücreleri ek olarak, kullanıcılar aynı zamanda onların veri hücreleri toplam sayısı, nükleik asit, protein konsantrasyonları, vbmiktarı ile normalize etmek seçebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mito stres testi oksijen tüketim oranını (OCR) ölçme üzerinde tam bir mitokondri profil eşleştirmek için çeşitli solunum inhibitörleri sıralı enjeksiyon sonra dayanır. Her uyuşturucu enjekte aşağıdaki parametreleri hesaplamakta kullanılan sonra OCR ölçümleri ile ilgili mitokondrial sağlığına: Bazal OCR ilk düzey ATP talep dinlenme karşılamak için gerekli oksijen tüketimi değerlendirmek için herhangi bir uyuşturucu enjekte önce ölçülen. Bazal Solunum Sigara mitokondrial Solunum oranı oligomycin iğne önce OCR taban çizgisinden çıkarılarak hesaplanır. Daha sonra oligomycin ATP sentaz (karmaşık V) proton kanalını inhibe enjekte edilir. OCR sonraki düşüş oligomycin enjeksiyon sonra ATP üretimi ile ilgili oksijen tüketimigösterir. FCCP (karbonil siyanür 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), proton degrade ve mitokondri zar potansiyeli, bozmaya kullanılan bir ionophore sonra maksimal oksijen tüketimi çıkarmak için kullanılır. Maksimal solunum mitokondrial maksimum OCR FCCP enjeksiyon sonra solunum çıkarılarak hesaplanır. Yedek solunum kapasitesi maksimal ve bazal solunum arasındaki farktır. Son olarak, antimycin bir (karmaşık III önleyici) ve Rotenon (karmaşık ben inhibitörü) elektron taşıma zinciri kapatmak için aynı anda enjekte edilir. Tanımı gereği, sigara mitokondrial solunum elektron taşıma zinciri (Örneğin, mitokondrial sigara NADPH oksidaz makrofajlar, vb.) üzerinden bağımsızdır ve OCR değerleri olarak antimycin sonra A temsil edilir / Rotenon enjeksiyon. Verimlilik kaplin ATP sentezi için kullanılan bazal mitokondrial oksijen tüketimi kısmını tanımlar ve (ATP üretimi ile ilgili OCR) x % 100 olarak hesaplanan /(basal respiration rate).

Mito stres testi gerçekleştirmeden önce hücre yoğunluğu kodlamayla her koşul için optimize edilmelidir. Deneyim, % 80-90 confluency 1.5 x 105 hücreleri/kuyu insan kanı (Şekil 1A) üzerinden taze izole PBMCs kaplama elde edilir. Bu kaplama yoğunluğu 3.2.3. adımda anlatılan çamaşır adım hesapları. En uygun kaplama yoğunluğu belirleyen ek olarak, FCCP titrasyon maksimal OCR görüntüyü artırmak için gerekli konsantrasyonu belirlemek için gerçekleştirilmelidir. FCCP konsantrasyonları test - 0,125 mikron, 0,25 mikron, 0.5 mikron, 1 mikron ve 2 mikron - 1 mikron bir plato ulaşan FCCP konsantrasyon ile artmış ama 2 mikron (Şekil 1B) azalma OCR. Bu o 1 mikron PBMC mitokondriyal işlev incelenmesi için kullanılması gereken en uygun FCCP konsantrasyonu olduğunu gösterir.

Aynı kan örneği çeşitli zaman noktalarda sağlıklı bir donörden toplanan hücre aynı toplu mitokondriyal işlev PBMC yalıtım sonra test ettik. Bazal oksijen tüketimi hem de maksimal OCR gibi erken olarak 3 h ve 5 ve 8 h PBMC yalıtım (Şekil 2A) sonra azaltmak için devam eden azalmıştır. 3 saat sonra maksimal solunum FCCP enjeksiyonu (zaman puan 7-9) ile elde edildi bile canlı hücrelerde mitokondri zaman içinde hızla solunum kapasitesi azalır yedek düşündüren bazal OCR fazla olamaz. Ekstrasellüler asitleştirme oranı (D.H.T.) aynı anda bir hücre dışı akı araç üzerinde ölçüldü. Oligomycin mitokondriyal ATP sentaz engeller beri glikoliz enerji talebi karşılamak için ve ATP üretimi ile Oksidatif fosforilasyon, eksikliği telafi etmek için dakika içinde oligomycin sonra D.H.T. hızlı artış gösterdiği gibi işe bir enjeksiyon. PBMC yalıtım sonra 3 h gibi erken OCR (Şekil 2B) yanı sıra D.H.T. bir azalma oldu. Her ne kadar biz herhangi bir önemli değişiklik 1, 3, 5 ve 8 h hücre canlılığı içinde PBMC yalıtım sonra gözlemleme, mitokondriyal işlev hızla, zamanlama canlı, respiring PBMCs mitokondriyal profili yakalamak için anahtar olduğunu düşündüren azalmıştır.

Hasta örnek koleksiyon çeşitli zamanlarda ayrı günlerde meydana eğilimindedir; Böylece, farklı örnekleri ve zaman puan karşılaştırmak için verileri normalleştirmek çok önemlidir. Ise protein gibi diğer normalleştirme yöntemleri tahlil ve nükleik asit miktar kullanılabilir, canlı hücreleri DNA'ya bağlanıcı boya ve miktar her şey yeşil floresan hücreleri boyama en verimli ve güvenilir normalleştirme olduğunu bulmak yöntemi. İki farklı sağlıklı bağışçılardan iki ayrı günlerde toplanan PBMCs temsilcisi veri Şekil 3' te gösterilmektedir. İç metin de toplam hücreleri (faz kontrast) ve canlı hücreleri gösteren bir hücre tabak temsilcisi bir görüntüsünü DNA'ya bağlanıcı boya (yeşil flüoresan) ile mito stres testinden sonra lekeli. Bazal oksijen tüketim oranı yanı sıra her uyuşturucu enjekte hücreleri yaşamak için normalleştirilmiş sonra oksijen tüketimi iki farklı sağlıklı olmayan yorgun bağış içinde (Şekil 3) benzerdi.

Yorgun bir konunun temsilcisi mitokondriyal işlev veri (FACIT-F puanı < 43) prostat kanseri (kırmızı) ve bir yaş/cinsiyet/yarış-uyumlu olmayan yorgun sağlıklı donör (mavi) ile Şekil 4' te gösterilmiştir. Her ne kadar biz bazal OCR (Şekil 4B) herhangi bir farklılık gözlemlemek değil, sergilenen yorgun konu yanı sıra kontrolü (Şekil 4C, D) göre yedek solunum kapasitesi maksimal oksijen tüketimi azalmıştır. Yorgunluk olduğu ortaya çıktı ve azaltılması için yedek solunum kapasitesi, ilgili olabilir mitokondrial Sigara oksijen tüketimi (Şekil 4E), ATP ile ilgili oksijen tüketimi (Şekil 4F), bulunan hiçbir farkı olmadığı veya Verimlilik (Şekil 4G) kaplin. Temel veri (önce herhangi bir uyuşturucu enjekte etme) ve FCCP enjeksiyon varlığı tercih edilen yolu (OCR Oksidatif fosforilasyon karşı D.H.T. glikoliz) ortaya çıkarır bir enerji fenotip arsa kullanarak görüntülenir sonra maksimal solunum arttı enerji talebi (Şekil 4H). Boş kareleri bazal enerji fenotip belirtmek ve katı kareler enerji fenotip yanıt maksimal ATP isteğe bağlı olarak gösterir. Oksidatif fosforilasyon glikoliz karşı doğru hücresel tercihini yamaç gösterir, ancak yedek kapasite, bazal (boş kare) ve maksimal (düz kare) arasındaki uzaklığı gösterir. Sigara yorgun sağlıklı denetime göre Şekil 4H, yedek kapasite azalır yorgunluk konu gösterildiği gibi. Buna ek olarak, yanıt olarak enerji fenotip glikoliz sağlıklı kontrol (Şekil 4H) karşılaştırıldığında yorgun konu doğru eğilmiş ATP talep arttı.

Figure 1
Resim 1 : Yoğunluk ve FCCP doz-yanıt eğrisi kaplama PBMC. (A) taze izole PBMCs 1,5 x 105 hücreleri/iyi CellTak kaplı hücre kültür miniplates kaplama. Yıkama sonrası ve medya değiştirmek, hücreler eşit olarak % 80-90 confluency dağıtıldı. Ölçek çubuğu 100 mikron =. (B) giderek artan bir FCCP konsantrasyonları 0,125 mikron, 0,25 mikron, 0.5 mikron, 1 mikron, ulaşan en yüksek OCR OCR arttı. OCR 2 mikron, maksimal solunum PBMCs.Error barlarda temin için en uygun doz göstermek 3 sıralı ölçümleri standart sapması ilk uyuşturucu enjekte sonra o 1 mikron olduğunu belirten düştü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 2
Resim 2 : Mitokondrial solunum taze izole PBMCs zamanla azalır. OCR (A) hem de D.H.T. (B) PBMC yalıtım sonra zaman içinde hızla azaldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 3
Şekil 3 : Temsilcisi mitokondrial solunum veri normalleştirme ile. Mito stres testi farklı günlerde iki farklı sağlıklı gönüllülerden izole ve floresan plaka okuyucu üzerinde sayısal bir floresan nükleik asit leke kullanarak normalleştirilmiş taze PBMCs kullanılarak gerçekleştirildi. İç metin: canlı hücreleri (yeşil) bir temsili resim ve toplam hücreleri (faz kontrast) bir kuyuda. Ölçek çubuğu = 1000 mikron Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 4
Şekil 4 : Yorgun bir konu sağlıklı denetime göre temsilcisi Analizi. (A) temsilcisi Mito stres testi OCR grafiği bir yaş/cinsiyet/yarış-uyumlu olmayan yorgun sağlıklı kontrol için karşılaştırıldığında yorgun bir konu. Çubuk grafikler bazal OCR (B), (C), maksimal solunum solunum kapasitesi (D)yedek, mitokondrial Sigara oksijen tüketimi (E), ATP üretimi (F)ve kaplin verimlilik (G) gösterilir. Enerji fenotip Arsa yorgun konu ve sağlıklı kontrol (H)gösterilir. Temel enerji fenotip boş kareleri belirtmek, katı kareler FCCP enjeksiyon sonra ölçülen stresli enerji fenotip temsil eder. Hata çubukları için her çalışma katılımcı 3 farklı Wells standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yorgunluk kanser hastalarında iyi tanımlanmış değil veya1ile karakterize zayıflatıcı bir durumdur. Yorgunluk tanısında tamamen öznel raporlama kullanır ve hiçbir geçerli tanılama standart ya da tedavi için bu durum, büyük ölçüde onun pathobiology2anlayış eksikliği nedeniyle. Kanser hastalarında yorgunluk temel önerilen mekanizmaları, mitokondriyal işlev bozukluğu en tedavi amaçlı targetable yollar biridir. Bu nedenle, biz proaktif hasta yorgunluk, o kadar erken de dahil olmak üzere kanser tedavisi ile ilgili toksisitesine geliştirmek için risk altındaki tanımlamak için kullanılan klinik örneklerinde mitokondriyal işlev ölçmek için hızlı ve pratik bir yöntem geliştirdi Yönetim uyguladı.

Sıralı enjeksiyon solunum inhibitörleri ile birlikte hücre dışı akı teknoloji mitokondrial fonksiyonel durum değerlendirmesi için izin ve her iki vitro için kullanılan ve in vivo modelleri19, 20,21. Biz mevcut vücut çalışma genişletilmiş ve klinik örneklerinde mitokondrial disfonksiyon muayene için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem geliştirdi. Kompakt ekstraselüler akı analyzer kullanımı çalışmanın bir avantajdır. Biz gösterildiği zaman deneme taze PBMCs yalıtım sonra kan grubundan çok önemlidir. Daha büyük biçimi (96-şey ya da 24-şey biçimi) yüksek üretilen iş deneme için ideal bir seçimdir olmakla birlikte, 8 wells içerir, kompakt ekstraselüler akı sistem her hasta örnek19bireysel değerlendirmesi için sağlar. Bu yöntem daha pratik ve düşük maliyetli (hem araç kendisi açısından ve tahlil gerçekleştirmek için kullanılan reaktifler), çünkü örnek koleksiyon farklı hastalarda çeşitli zamanlarda farklı günlerde oluşacak şekilde.

Yorgun kanser hastalarında mitokondriyal işlev değerlendirmek için PBMCs kullanımı birçok avantajı vardır: 1) biyopsi iskelet kasları gibi dokuların pratik olabilir zaman zaman; 2) PBMCs kullanılabilir ve kolayca bir klinik ortamda pratik bir avantaj sunan hücre hazırlık tüpler, kullanarak ayrılmış olabilir; ve 3) mitokondriyal işlev taze izole hücre kültüründe 3 saatten fazla olmuştur ve belirli hücre tipleri genellikle izole alır birkaç saat (3 saatten fazla) sonra azalır göstermiştir. PBMCs bir saat içinde böylece gerçek zamanlı mitokondriyal işlev ölçüm doğruluğunu sağlamak hazır olun. Daha önce uncharacterized hasta nüfus ilk klinik araştırmaları için PBMCs kullanmanızı öneririz, T lenfositler, trombosit, nötrofil ve monosit gibi diğer hücre tipleri de geçerli protokolle optimizasyon sonra kullanılabilir yoğunluk ve solunum inhibitör konsantrasyonlarının15,25,26kaplama ile.

Mitokondriyal işlev içinde yeni bir sistem test önce ilk optimum hücre yoğunluğu ve FCCP konsantrasyonu belirlemek önemlidir. Deneyim, 1.5 x iyi başına 105 hücre kaplama hücre yoğunluğu kaplama ve çamaşır adım kalır % 80-90 birleşmesi sonrası sağlar. Buna ek olarak, her hücre tipi için en uygun FCCP konsantrasyonu belirlemek çok önemlidir. FCCP aralığı konsantrasyonları sınanacağı ve maksimal OCR bir hücre sağlık ödün vermeden üreten FCCP konsantrasyonu kullanılmalıdır. Test konsantrasyonları maksimal solunum PBMCs FCCP, 1 mikron sonuçlandı. Diğer kritik adım deneme, zamanlaması mitokondrial solunum damla olarak precipitously 3 saat sonra PBMC yalıtım olduğunu. Böylelikle mito stres test doğru klinik örnek mitokondriyal işlevde yakalamak için örnek toplama sonra 3 saat içinde yapılmalıdır. Pek çok araştırmacı sadece Donmuş numuneler erişim yok işaret değer. Daha önce dondurma ve çözme sonra PBMCs test ettik ve bu hücrelerin mitokondrial işlevlerini büyük ölçüde tehlikeye. Bu nedenle, taze kullanarak PBMCs mümkün olduğunda klinik çalışmalarda, izole önerilir.

Tekrarlanabilir verileri oluşturan başka bir önemli veri normalleştirme yöntemidir. Bazı laboratuvarlar mitokondrial solunum veri normalize etmek BCA protein miktar kullanarak bir başarı olmuştur iken, bu her zaman özellikle düşük hücre yoğunluğu mümkün değil bulmak. Bu protokol için açıklanan normalleştirme Yöntem hücre sayıları ve boya nükleik asit kompleksleri floresans emisyon arasında doğrusal ilişki dayanır ve doğru bir şekilde 10-50.000 hücreleri27ölçmek. Buna ek olarak, normalleştirme floresan nükleik asit leke ve floresan plaka okuyucu bir arada kullanarak canlı hücreleri hızlı miktar deneme tamamlanmasından sonra sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem trypsinization yapışık hücreleri veya hücre kazıyıcı kullanarak gerektirmez.

Bir uyarı iletişim kuralı biz PBMCs belirli hücre türleri mitokondrial fonksiyonel analiz yapmadan önce ayrı değil var. Biz gösterildiği mitokondrial solunum hızla PBMC yalıtım sonra zamanla azalır. Bu hangi genellikle birkaç saat sürer hastalar arasındaki farklar, farklı hücre popülasyonlarının, izole sonra deneme gerçekleştirildi yanlış olabileceğini düşündürmektedir. PBMCs gibi karışık nüfus eğitim önemli hücre türüne özgü bilgileri bildirmez olsa bile, PBMCs kullanarak deneylerden elde edilen bilgiler Kılavuzu gelecekteki Mekanik araştırmalar belirli hücre türleri üzerinde duruldu yardımcı olabilir. PBMCs sistemik mitokondrial disfonksiyon, proxy olarak hangi kanser yorgunluk10,28gibi sistemik hastalıkları ile ilgili hizmet vermektedir. Geçerli el yazması açıklanan protokolü sadece gözlem nedenlerini saptayarak olmadan mitokondrial disfonksiyon ham bir ölçüm sağlar. Bu nedenle, bu teknoloji ve yordamı kullanarak bulguları dikkatli yorumlanmalıdır ve yorgunluk gibi diğer davranışlar (Örneğin, depresyon, uyku, kognitif bozukluk) ile birlikte onun olay multifaktöriyel doğası göz önüne almalıyız ve koşulları (Örneğin, kardiyopulmoner durumu, flizofreni). Gelecekteki çalışmaları belirli hücre türleri (Örneğin, doğal katil hücreler, T lenfositler ve monosit) ve çeşitli klinik nüfus mitokondrial işlevlerindeki değişiklikler incelemek (Örneğin, yorgun/sigara-yorgun kanser hastaları ve sağlıklı kontrol). O geçerli yazının kapsamı dışındadır olmakla birlikte, kanser yorgunluk önem ve mitokondrial disfonksiyon yanı sıra mitokondriyal işlev ölçümleri ve yorgunluk gibi fiziksel testler arasındaki korelasyon arasındaki ilişkileri belirler 6 dakika yürüme testi, gelecekte araştırmalar. Ayrıca, gelecekteki çalışmaları da yorgunluk çeşitli kanser türleri arasında mitokondrial disfonksiyon ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için diğer kanser türlerinde mitokondrial disfonksiyon inceleyeceğiz. Sonuç olarak, klinik numuneleri kullanılarak genel mitokondriyal işlev bozuklukları hızlı bir değerlendirmesi için en iyi duruma getirilmiş bir protokol geliştirdik. Daha fazla mekanik araştırmalar bu zayıflatıcı durum belirli yollar katılımı kesin olarak belirlemek için gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada bölme, Intramural araştırmaya, Ulusal Enstitüsü Hemşirelik araştırma NIH, Bethesda, Maryland, tam olarak desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13, (8), 1012-1039 (2015).
  2. Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52, (6), 832-840 (2016).
  3. Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19, (6), 744-750 (2015).
  4. Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40, (3), 184-193 (2017).
  5. Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2, (1), 1-16 (2009).
  6. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, (1), 505-531 (2016).
  7. Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208, (2), 117-120 (1996).
  8. Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267, (4), 394-401 (2010).
  9. Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
  10. Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40, (6), (2013).
  11. Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
  12. Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21, (4), 315-319 (2004).
  13. Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
  14. Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62, (2), 133-139 (2003).
  15. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
  16. Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205, (3), 392-400 (2012).
  17. Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20, (7), 1126-1167 (2014).
  18. Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (3), 389-395 (2001).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  20. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
  23. Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13, (2), 63-74 (1997).
  24. Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64, (5), 507-516 (2011).
  25. Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
  26. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93, (6), 690-700 (2013).
  27. Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254, (1), 85-98 (2001).
  28. Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19, (1), London, England. 67-74 (2014).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics