Vurdere rollen mitokondrie funksjon i kreft relatert tretthet

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Målet var å utvikle en praktisk protokoll for å evaluere mitokondrie dysfunksjon knyttet til trøtthet i kreftpasienter. Denne nyskapende protokollen er optimalisert for klinisk bruk involverer kun phlebotomy og grunnleggende laboratorium prosedyrer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Trøtthet er en felles og ødeleggende tilstand som påvirker de fleste kreftpasienter. Hittil test tretthet fortsatt dårlig preget med ingen diagnostisk å objektivt måle alvorlighetsgraden av denne tilstanden. Her beskriver vi en optimalisert metode for å vurdere mitokondrie funksjon av PBMCs fra trøtt kreftpasienter. Bruker en kompakt ekstracellulære forandring system og sekvensiell injeksjon av respiratoriske hemmere, undersøkte vi PBMC mitokondrie funksjonell status ved å måle basal mitokondrie respirasjon reservedeler åndedretts kapasitet og energi fenotype, som beskriver foretrukket energi veien svare på stress. Ferske PBMCs er lett tilgjengelig i klinisk setting med standard phlebotomy. Hele analysen beskrevet i denne protokollen kan gjennomføres på mindre enn 4 timer uten involvering av komplekse biokjemiske teknikker. I tillegg beskriver vi en normalisering metode som er nødvendig for å få reproduserbar data. De enkle prosedyren og normalisering metodene presentert tillater gjentatte prøvetaking fra samme pasient og generasjon av reproduserbar data som kan sammenlignes med mellom tidspunkt å vurdere potensielle behandling effekter.

Introduction

Trøtthet er en utbredt og sørgelig tilstand som har en negativ innvirkning på livskvaliteten kreft pasienter1. Til denne datoen, kreft trøtthet er fortsatt dårlig definert og bare avhengig av subjektive rapportering av pasienter2. Derfor er det et presserende behov for å identifisere en enkelt tilpasses diagnostisk laboratorietest objektivt betegner tretthet i klinisk setting3,4.

Flere underliggende mekanismer, inkludert mitokondriene dysfunksjon, foreslått å forårsake tretthet5. Mitokondrier er drivkraft organeller, gir 95% av mobilnettet energibehov via oxidative fosforylering, og spiller en viktig rolle i kalsium signalering, apoptose, immun signalering og regulering av andre intracellulær signalnettverk hendelser6 . Følgelig kan svekket mitokondrie bioenergi og defekter i energiproduksjon bidra til trøtthet. Støtter denne hypotesen, har tidligere studier observert mutasjoner i Mitokondrielt DNA hos pasienter med kronisk fatigue syndrome7. Mens det er uklart om patofysiologiske opprinnelsen til trøtthet ligger i sentralnervesystemet eller perifere vev, for eksempel skjelettmuskulatur8,9, finnes det for øyeblikket ingen direkte måte å vurdere nøyaktig Mitokondrielt dysfunksjon knyttet til trøtthet i live, respiring celler.

Hvis du bruker perifert blod mononukleære celler (PBMCs) for å studere mitokondrie funksjonen har flere fordeler. Først PBMCs er lett tilgjengelig i klinisk setting med standard phlebotomy og kan isoleres raskt ved hjelp av grunnleggende laboratorium teknikker. Andre er blod samling mindre invasiv enn å samle andre vev som en muskel biopsi. Dermed kan blodprøver hentes fra samme pasient gjentatte ganger over tid, som muliggjør langsgående vurdering av behandling effekter. Interessant, syntes mitokondrie funksjon i PBMCs å være godt korrelert med nyre mitokondrie status i en dyremodell10. Videre har immun cellen mitokondrier blitt brukt som en proxy for å oppdage systemisk endringer under forskjellige sykdom forhold11,12. Mitokondrier i sirkulerende immunceller er spesielt følsomme for endringer i immunforsvaret funksjoner og immun signalnettverk molekyler som cytokiner13,14,15. Det er for eksempel observert at PBMCs fra pasienter med akutt revmatiske inflammatoriske sykdommer ha høy planlagte oksygen forbruk14. Derimot ble oksygenforbruk redusert i PBMCs isolert fra pasienter med systemiske opphissende vilkårene inkluderer sepsis16. Under inflammatoriske tilstander, kan frie radikaler produseres av dysfunksjonelle mitokondriene ytterligere bidra til forhøyet oksidativt stress og langvarig betennelse17. Sentral rolle i mitokondrier i energiproduksjon og som oksidativt stress foreslår mulige nytten av funksjonen mitokondrie som en proxy for å studere tretthet i kreft pasienter 13.

Tidligere studier undersøke mitokondrie funksjonen benyttes biokjemiske teknikker, mitokondrie membran potensielle mål eller isolering av bestemt celle populasjoner som ikke kan være lett tilpasses i klinisk setting5, 14,18. De siste årene, utviklingen av ekstracellulære flux analyser har tillatt forskere til å enkelt og undersøke nøyaktig endringer i oksygen forbruksraten (OCR) svar på automatiserte injeksjoner av respiratoriske hemmere19,20 , 21 , 22. men de fleste av disse studiene er utformet for bestemte celletyper og store høy gjennomstrømming format kanskje ikke være tilgjengelig i en klinisk setting. I dette manuskriptet beskrive vi en optimalisert protokoll for å undersøke mitokondrie funksjon for klinisk bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien (NCT00852111) ble godkjent av de institusjonelle Review Board (IRB) av den National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Deltakere i denne studien var euthymic menn, 18 år eller eldre, som ble diagnostisert med ikke-metastatisk prostatakreft med eller uten forutgående prostatektomi og var planlagt for å få ekstern stråle strålebehandling (EBRT). Potensielle deltakere ble utelukket hvis de hadde en progressiv sykdom som kan forårsake betydelig tretthet, hadde psykiatrisk sykdom i de siste fem årene, hadde uncorrected hypothyroidism eller anemi, eller hadde en andre kreft. Personer som brukte beroligende midler, steroider eller ikke-steroide anti-inflammatoriske midler ble også utelatt. Sunn kontroll blodprøver ble oppnådd ved NIH avdeling av transfusjon medicine fra friske blodgivere under en IRB-godkjent protokollen (NCT00001846). Alle deltakere er rekruttert på Magnuson klinisk forskningssenter ved NIH. Signert skriftlig informert samtykker ble innhentet før studie deltakelse.

1. mitokondrie funksjonen måling forberedelse (dag 1 av eksperimentet)

  1. Hydrat Sensor patron (se Tabell av materialer, forventet varighet: 5 min).
    1. Fjern Sensor patron fra pakken. Legge til 200 μL Calibrant løsning i hver brønn av verktøyet plate, og deretter fylle hver vollgrav med 400 μL Calibrant løsning.
    2. Returnere bildesensoren plate av verktøyet-platen, som nå har Calibrant løsning i den. Hydrat kassetten i en ikke-CO2 37 ° C inkubator over natten.
      Merk: Sensor patronen må være hydrert for minst 4 h og opptil 72 h.

2. klinisk prøve forberedelse (dag 2 av eksperimentet)

  1. Måler tretthet ved hjelp av 13-element funksjonelle vurdering av kronisk sykdom terapi - tretthet (FACIT-F)2,23,24 planlagte (før EBRT innvielsen), midtpunktet og EBRT, og 1 års post-EBRT.
    1. Bruk en 0 - 4 skala for hver vare svar, der 0 representerer "ikke alle" og en 4 angir at respondenten gjelder tilsvarende setningen "veldig mye." Total score bør variere fra 16-53, med lavere score reflekterer høy tretthet intensitet.
    2. Definere tretthet som en FACIT-F score lavere enn 43, med FACIT-F score på ≥43 som viser fravær av eller ikke klinisk meningsfull tretthet2.
      Merk: Deler FACIT-F poengsummen 43 beste tretthet scorene til pasienter og befolkningen2.
    3. Inkluderer 13 følgende i FACIT tretthet skala: 1) jeg føler deg trett; 2) jeg føler svak over; 3) jeg føler sløv ("vasket"); 4) jeg føler Lei; 5) Jeg har problemer med å starte ting fordi jeg er lei; 6) Jeg har problemer med etterbehandling ting fordi jeg er lei; 7) Jeg har energi; 8) Jeg er i stand til å gjøre min vanlige aktiviteter. 9) jeg trenger å sove i løpet av dagen; 10) Jeg er for sliten til å spise; 11) jeg trenger hjelp gjør min vanlige aktiviteter; 12) Jeg er frustrert av er for trøtt til å gjøre tingene jeg ønsker å gjøre; og 13) jeg har til å begrense mine sosial aktivitet fordi jeg er trøtt.
  2. Isolere PBMC fra ferske samlet blodprøver (forventet varighet: 1t).
    1. Samle 8 mL blod i en mononukleære celler forberedelse Tube (se Tabell for materiale).
      Merk: Blodprøver bør behandles innen 2 timer med samling. Kvaliteten på PBMCs kan kompromitteres hvis blodprøver blir behandlet mer enn 2t etter prøvetakingen.
    2. Sentrifuge 1.750 x g i 30 min ved romtemperatur (18-25 ° C). Overføre skyet laget til en 15 mL konisk rør. Legg opptil 15 mL PBS og invertere 5 ganger.
    3. Sentrifuge 300 x g i 15 minutter på 4 ° C. Nøye fjerne og slette nedbryting uten forstyrrende pellets. Nytt suspendere pellet ved å legge til opptil 10 mL PBS, og Inverter 5 ganger.
    4. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C. Forkast flytende supernatant og å suspendere celler i 1 mL PBS. Overføring av PBMCs til en 1,5 mL microfuge tube.
    5. Sentrifuge 610 x g i 10 minutter. Nøye fjerne nedbryting og resuspend pellets i fullstendig RPMI-1640 (RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 10 mM Penicillin/Streptomycin).
  3. Pels celle plater for ikke-tilhenger celler (forventet varighet: 30 min).
    1. Forberede celler og vev selvklebende løsning (se Tabell for materiale) fortynne lager løsningen i 0.1 M natriumbikarbonat pH 8.0. Fungerende løsning bør være på 3,5 μg/cm2 av areal.
      Merk: Denne løsningen inneholder polyfenoliske proteiner Hentet fra den marine mussel, Mytilus steinsopp. Disse proteinene er sentrale komponenter av limet utskilles av blåskjell å feste seg til overflater. Vi finner at celle-så fungerer best med PBMCs.
    2. Tilsett 100 μL av utvannet selvklebende løsningen hver brønn og ruge i minst 20 min ved romtemperatur. Vask tre ganger med DI vann og luft tørr.

3. mitokondrie funksjonen måling

  1. Utarbeidelse av analysen Media (forventet varighet: 10 min).
    Merk: Analysen media må være nylaget på dagen for eksperimentet.
    1. Legge til L-glutamin, pyruvate og glukose grunnleggende media (samme bestanddeler som Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM), men uten natriumbikarbonat, glukose, glutamin eller natrium pyruvate) for å gjøre analysen media. Varme media opp 37 ° C, deretter justere pH 7,4.
      Merk: Konsentrasjoner av L-glutamin, pyruvate og glukose er vanligvis det samme som konsentrasjoner i normal vekst medier, men kan bli justert basert på analysen.
  2. Forberede PBMCs Mito Stress test (forventet varighet: 2 timer).
    1. Plate nok PBMCs fra trinn 2 i hver brønn til 80-90% confluency. I vår erfaring gitt 1,5 x 105 celler/Vel de mest konsekvente resultatene.
      Merk: A- og H er bakgrunnen brønner og bare inneholde analysen medier med ingen celler. I brønner B til G anbefaler vi plating minst 3-6 brønner per pasient prøve for outliers å kunne.
    2. Nedspinning plater på 200 x g i 2 minutter slik at cellene å forholde seg til bunnen av brønnene. Vask cellene gang med analysen media. Dette trinnet fjerner serum og natriumbikarbonat fra vekst media.
      Merk: I vår erfaring, vask trinnet vanligvis fjerner 20-30% av celler.
    3. Legge til 180 μL analysen medier i hver brønn, inkludert bakgrunn brønner A og H. Incubate i en ikke-CO2 37 ° C inkubator i 45-60 minutter.
  3. Kjører Mito stresstest
    1. Rekonstituer narkotika i Mito Stress Kit med analysen medier som følger:
      1. Oligomycin: Legge til 252 μL analysen medier i ampullen generere en lagerløsning på 50 μM.
      2. FCCP: Legge til 288 μL analysen media i ampullen generere en lagerløsning på 50 μM.
      3. Antimycin A / rotenon: legge til 216 μL analysen media ampullen generere en lagerløsning på 25 μM.
    2. Vortex rekonstituert narkotika i ca 1 minutt. Fortynne til arbeider løsninger.
      Merk: Konsentrasjoner av arbeider løsninger skal være titreres og forhåndsbestemt før eksperimentet avhengig celle. For PBMCs, finner vi at 1 μM av Oligomycin og 1 μM FCCP 0,5 μM antimycin A / rotenon som fungerer best.
    3. Pipetter narkotika i hver port i sensor kassetten fortløpende:
      1. Port A: Pipetter 20 μL 10 μM Oligomycin, for en siste konsentrasjon i hver brønn på 1 μM.
      2. Port B: Pipette 22 μL 10 μM FCCP, for en siste konsentrasjon i hver brønn på 1 μM.
      3. Port C: Pipette 25 μL 5 μM antimycin A / rotenon for en siste konsentrasjon i hver brønn på 0,5 μM.
  4. Velg "Mito Stress Test" virkemiddel ekstracellulære flux. Følg instrument spørsmål og sett sensor kassetten. Apparatet utfører automatisk sensor kalibrering. Sett inn celle plate når sensor kalibrering og instrumentet vil fullføre resten av analysen. Oksygen dynamics måles i 530 nm (eksitasjon) / 650nm (utslipp), og proton konsentrasjon måles i 470 nm (eksitasjon) / 530 nm (utslipp).

4. normalisering av mitokondrie funksjonen Data

  1. Forberede celle spredning analysen løsning (forventet varighet: 5 min).
    1. Legge til 48 μL nukleinsyre flekken (500 x) og 240 μL bakgrunn suppressor 11,7 mL PBS (2 x). Nukleinsyre flekken er en celle-permeant DNA-bindende fargestoff bakgrunn suppressor er en maskering fargestoff som blokkerer døde celler eller celler med kompromittert cellemembranen integritet fra å være farget. Kombinasjonen av DNA-bindende fargestoff og bakgrunn suppressor sikrer at bare lever celler er farget.
    2. Legge like volum av 2 x fungerende løsning (180 μL) direkte inn mediet i hver brønn etter Mito Stress Test er fullført.
  2. Inkuber cellene i nærvær av celle spredning analysen løsning i en 37 ° C inkubator for 45-60 min. kvantifisere antallet lever celler (fluorescerende) på en plate leser på 508 nm (eksitasjon) / 527 nm (utslipp) og normalisere OCR-data (forventet varighet: 10 min) .
    Merk: i tillegg til antallet lever celler, brukere kan også velge å normalisere data med antall celler, mengden av nukleinsyre, protein konsentrasjoner, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mito Stress Test avhengig måle oksygen forbruksraten (OCR) etter sekvensiell injeksjon av ulike åndedretts hemmere tilordne en fullstendig mitokondrie profil. OCR mål etter hver injeksjonsbruk kan brukes til å beregne følgende parametere knyttet til mitokondrie helse: Basal OCR måles først før noen sprøytebruk å vurdere oksygenforbruk måtte møte hviler nivå ATP etterspørsel. Basal åndedrett beregnes ved å trekke fra ikke-Mitokondrielt pustefrekvens fra grunnlinjen OCR før oligomycin injeksjon. Deretter injiseres oligomycin for å hemme proton kanalen av ATP syntase (komplekse V). Påfølgende fall i OCR etter oligomycin injeksjon representerer ATP produksjonsrelaterte oksygenforbruk. FCCP (karbonyl cyanid 4-[trifluoromethoxy] phenylhydrazone), en ionophore som brukes til å avbryte proton gradient og mitokondrie membran potensial, brukes deretter til å lokke fram maksimalt oksygenopptak. Maksimal åndedrett beregnes ved å trekke fra ikke-Mitokondrielt åndedrett fra det maksimale OCR etter FCCP injeksjon. Ledig åndedretts kapasitet er forskjellen mellom maksimal og basal åndedrett. Til slutt, antimycin en (komplekse III hemmer) og rotenon (komplekse jeg hemmer) er injisert samtidig å stenge elektronet transportkjeden. Per definisjon, ikke-Mitokondrielt åndedrett er uavhengig elektronet transportkjeden (f.eks ikke-Mitokondrielt NADPH oksidase i makrofager, osv.) og vises som OCR verdier etter antimycin A / rotenon injeksjon. Kopling effektivitet beskriver brøkdel av basale mitokondrie oksygenforbruk brukes for ATP syntese, og beregnes som 100% x (ATP produksjonsrelaterte OCR) /(basal respiration rate).

Cellen tetthet for hvert culturing vilkår skal være optimalisert før du utfører en mito test. I vår erfaring oppnås 80-90% confluency ved plating 1,5 x 105 celler/godt av fersk isolert PBMCs fra menneskelig blod (figur 1A). Denne plating tetthet står for vask trinn beskrevet i trinn 3.2.3. I tillegg til å bestemme den optimale plating tettheten, må FCCP titrering utføres for å bestemme konsentrasjonen trengs for å generere maksimal OCR. På FCCP testet konsentrasjoner - 0.125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, 1 μM og 2 μM - OCR økte med FCCP konsentrasjon nådd et platå på 1 μM, men redusert til 2 μM (figur 1B). Dette indikerer at 1 μM er den optimale FCCP konsentrasjonen som skal brukes for å undersøke PBMC mitokondrie funksjon.

Vi testet mitokondrie funksjon av den samme gruppen av celler fra av samme Blodprøven samlet fra en frisk donor på ulike tidspunkt etter PBMC isolasjon. Basal oksygenforbruk samt maksimal OCR redusert så tidlig som 3t og fortsatte å redusere på 5 og 8 h etter PBMC isolasjon (figur 2A). Etter 3 h overstige maksimal åndedrett elicited ved FCCP injeksjon (tidspunkt 7-9) ikke basale OCR, antyder at selv i levende celler, mitokondrier spare åndedretts kapasitet minsker raskt over tid. Ekstracellulære forsuring rate (ECAR) ble samtidig målt på en ekstracellulære flux instrument. Siden oligomycin hemmer mitokondrie ATP syntase, rekruttert Glykolysen minutter å møte etterspørselen etter energi og kompensere for mangel på ATP produksjon via oxidative fosforylering, som demonstrert av den raske økningen i ECAR etter oligomycin injeksjon. Så tidlig som 3t etter PBMC isolasjon, var det en nedgang i ECAR samt OCR (figur 2B). Selv om vi ikke observerer en merkbar endring i cellen levedyktighet på 1, 3, 5 og 8 timer etter PBMC isolasjon, mitokondrie funksjonen sank raskt, noe som tyder på at timingen er nøkkelen til fange mitokondrie profilen til live, respiring PBMCs.

Pasienten prøvekolleksjoner tendens til å skje på ulike tidspunkter på forskjellige dager; Dermed er det viktig å normalisere data for å sammenligne forskjellige prøver og tidspunkt. Mens andre normalisering metoder som protein analysen og nukleinsyre kvantifisering kan brukes, finner vi at flekker lever celler med DNA-bindende fargestoff og kvantifisering av grønne fluorescerende celler i hver brønn er den mest effektive og pålitelige normalisering metode. Representant data av PBMCs samlet fra to forskjellige friske blodgivere på to forskjellige dager er vist i Figur 3. Innfelt er et representativt bilde av en celle plate også viser totalt cellene (kontrast) og levende farget med DNA-bindende fargestoff (grønn fluorescerende) etter mito stress test. Basal oksygen forbruksraten, samt oksygenforbruk etter hver injeksjonsbruk normalisert leve celler var lik i to forskjellige friske ikke-utmattet givere (Figur 3).

Representant mitokondrie funksjonen data av en trett emne (FACIT-F score < 43) med prostatakreft (rød) og en alder/kjønn/rase-matchet ikke utmattet frisk donor (blå) er vist i Figur 4. Selv om vi ikke observerer noen forskjell i det basale OCR (Figur 4B), redusert trøtt emnet utstilt maksimalt oksygenopptak samt ekstra åndedretts kapasitet sammenlignet med kontrollen (Figur 4C, D). Trøtthet syntes å være relatert til reduksjon i ekstra åndedretts kapasitet, fordi det var ingen forskjeller i ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk (Figur 4E), ATP-relaterte oksygenforbruk (Figur 4-F), eller kopling effektivitet (Figur 4G). Baseline data (før noen sprøytebruk) og maksimal åndedrett etter FCCP injeksjon kan visualiseres ved hjelp av en energi fenotypen plot, som avslører den foretrukne sti (OCR oxidative fosforylering versus ECAR Glykolysen) i nærvær av økt energibehovet (Figur 4H). Tomme rutene angir basale energi fenotypen og solid firkanter angir energi fenotypen svar på maksimal ATP behov. Avstanden mellom basale (tom rute) og maksimal (fylte firkanten) angir ledig kapasitet, mens hellingen angir mobilnettet preferanse mot oxidative fosforylering versus Glykolysen. Som vist i Figur 4H, sammenlignet ledig kapasitet i tretthet faget redusert med ikke-utmattet sunn kontrollen. I tillegg økte energi fenotypen svar på ATP etterspørsel forvrenges mot Glykolysen trøtt emnet i forhold til sunn kontrollen (Figur 4H).

Figure 1
Figur 1 : PBMC plating tetthet og FCCP dose-respons kurve. (A) ferske isolert var PBMCs belagt 1,5 x 105 celler/godt inn CellTak-belagt celle kultur miniplates. Etter vask og media endre, celler var jevnt fordelt på 80-90% confluency. Skala bar = 100 μm. (B) OCR økt med økende konsentrasjoner av FCCP på 0.125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, nådde toppen OCR på 1 μM. OCR falt på 2 μM, indikerer at 1 μM er optimale dosen å lokke fram maksimal åndedrett i PBMCs.Error barer indikere standardavviket for 3 sammenhengende mål etter den første sprøytebruk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Mitokondrielt åndedrett reduseres over tid i fersk isolert PBMCs. OCR (A) samt ECAR (B) sank raskt over tid etter PBMC isolasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Representant mitokondrie åndedrett data med normalisering. Mito stresstest ble utført med fersk PBMCs isolert fra to forskjellige friske frivillige på ulike dager og normalisert bruker en fluorescerende nukleinsyre flekk kvantifisert på en fluorescerende plate leser. Innfelt: et representativt bilde av lever celler (grønn) og total celler (kontrast) i en brønn. Skala bar = 1000 μm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Representant analyse av en trett sammenlignet med en sunn kontroll. (A) representant Mito Stress test OCR graf en trett emnet sammenlignet med en alder/kjønn/rase-matchet ikke utmattet sunn kontroll. Søylediagrammer av basale OCR (B), maksimal åndedrett (C), spare åndedretts kapasitet (D), ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk (E), ATP produksjon (F)og kopling effektivitet (G) vises. Energi fenotypen plottet av trøtt emnet og sunn kontroll vises (H). Tomme rutene angir grunnlinjen energi fenotype, solid rutene representerer stresset energi fenotypen målt etter FCCP injeksjon. Feilfelt viser standardavviket for 3 forskjellige brønner for hver studie deltaker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trøtthet i kreftpasienter er en ødeleggende tilstand som ikke godt definert eller preget1. Diagnostisering av trøtthet er helt avhengig av subjektive rapportering og det er ingen gjeldende diagnostiske standarden eller behandling for denne tilstanden, hovedsakelig på grunn av mangel på forståelse i det pathobiology2. Av foreslåtte mekanismene bak trøtthet i kreftpasienter, er verdifall i mitokondrie funksjon en av de mest terapeutisk targetable. Derfor utviklet vi en rask og praktisk metode for å måle mitokondrie funksjon i klinisk prøver som kan brukes til å proaktivt identifisere pasienter risiko for å utvikle kreft behandling-relaterte toksisitet inkludert trøtthet, så det tidlig ledelse kan bli reist.

Den ekstracellulære flux teknologien i kombinasjon med sekvensiell injeksjon av respiratoriske hemmere tillater vurdering av mitokondrie funksjonell status og har vært brukt i både i vitro og i vivo modeller19, 20,21. Vi utvidet den eksisterende kroppen arbeid og utviklet en metode som er optimalisert for undersøkelse av mitokondrie dysfunksjon i klinisk prøver. En fordel av studien er bruken av kompakt ekstracellulære flux analysator. Som vi har vist, er tidspunktet for eksperimentet avgjørende etter isolering av ferske PBMCs fra menneskeblod. Mens større format (96-brønnen eller 24-vel format) er det ideelle valget for en høy gjennomstrømning eksperiment, gir kompakt ekstracellulære flux systemet, som inneholder 8 brønner, individuell vurdering hver pasient eksempel19. Denne metoden er mer praktisk og kostnadseffektiv (både i forhold til selve instrumentet og reagensene som utfører analysen), fordi prøvetaking fra pasienter har en tendens til å skje på ulike tider på ulike dager.

Utnyttelse av PBMCs å vurdere mitokondrie funksjon i trøtt pasienter har flere fordeler: 1) biopsy av vev som muskler kan være upraktisk tider; 2) PBMCs er lett tilgjengelig og kan lett isolere benytter celle forberedelse rør, som tilbyr en praktisk fordel i en klinisk setting; og 3) vi har vist at mitokondrie funksjonen reduserer etter fersk isolert celler har vært i kultur mer enn 3 timer og isolere spesifikke celletyper vanligvis tar flere timer (mer enn 3 timer). PBMCs kan tilberedes innen en time, dermed sikre nøyaktigheten av måle sanntid mitokondrie funksjon. Mens vi anbefaler at du bruker PBMCs for den første kliniske undersøkelsen i tidligere uncharacterized pasientgrupper, kan andre celletyper som T-lymfocytter, blodplater, nøytrofile og monocytter også brukes med gjeldende protokollen etter optimalisering for plating tetthet og respiratoriske hemmer konsentrasjoner15,25,26.

Før testing mitokondrie funksjon i et nytt system, er det viktig å først finne optimale celle tetthet og FCCP konsentrasjoner. I vår erfaring sikrer plating 1,5 x 105 celler per brønn at cellen tetthet etter plating og vask trinn restene 80-90% confluent. I tillegg er det viktig å fastslå de optimale FCCP konsentrasjonene for hver celle. Et utvalg av FCCP konsentrasjoner bør testes og FCCP konsentrasjonen som produserer maksimal OCR uten at helsen til en celle som skal brukes. I konsentrasjonene testet resulterte 1 μM av FCCP i maksimal åndedrett i PBMCs. Et annet viktig skritt er en eksperimentet som mitokondrie åndedrett drops precipitously 3 timer etter PBMC isolasjon. Dette betyr at mito stresstest skal utføres innen 3 timer etter prøvetaking fange nøyaktig mitokondrie funksjon i en klinisk prøve. Det er verdt å peke på at mange forskere har bare tilgang til frosne prøvene. Vi har tidligere testet PBMCs etter fryses og mitokondrie funksjonene til disse cellene er sterkt svekket. Vi anbefaler derfor nymalt isolert PBMCs i kliniske studier, når det er mulig.

En annen viktig aspekt ved generering av reproduserbar data er metoden for data normalisering. Mens noen laboratorier har hatt suksess med BCA protein kvantifisering normalisere mitokondrie åndedrett data, finner vi at det ikke er alltid mulig spesielt på en lav celle tetthet. Normalisering metoden beskrevet i denne protokollen bruker lineær sammenhengen mellom cellen tallene og fluorescens utslipp av de dye-nukleinsyre kompleksene, og nøyaktig kan kvantifisere 10 til 50 000 celler27. I tillegg tillater normalisering bruke en kombinasjon av fluorescerende nukleinsyre flekken og en fluorescerende plate leseren rask kvantifisering av levende celler etter ferdigstillelse av eksperimentet. Denne metoden krever i tillegg ikke trypsinization tilhenger celleområde eller bruke en celle skraper.

En påminnelse av protokollen er at vi ikke skille PBMCs i spesifikke celletyper før du utfører mitokondrie funksjonsanalyse. Som vi har vist, avtar mitokondrie åndedrett raskt over tid etter PBMC isolasjon. Dette tyder på at forskjellene mellom pasienter kan være unøyaktig hvis eksperimentet ble utført etter isolere ulike celle populasjoner, som vanligvis tar noen timer. Selv om studere blandet bestander som PBMCs ikke avslører viktig celle type-spesifikk informasjon, kan informasjon innhentet fra eksperimenter ved hjelp av PBMCs hjelpe guide fremtidige mekanistisk undersøkelser fokusert på spesifikke celletyper. PBMCs tjene som en proxy for systemisk mitokondrie dysfunksjon, som er relevant for systemiske sykdommer som kreft tretthet10,28. Protokollen beskrevet i gjeldende manuskriptet gir bare en grov måling av mitokondrie dysfunksjon uten pinpointing årsaken til observasjon. Derfor funn ved hjelp av denne teknologien og prosedyren må tolkes med forsiktighet og må vurdere multifaktoriell natur trøtthet, som co forekomst med andre atferd (f.eks, depresjon, søvn, kognitiv svekkelse) og betingelser (f.eks hjerte status, polypharmacy). Fremtidige studier bør undersøke endringer i mitokondrie funksjoner i spesifikke celletyper (f.eks naturlige drepe celler, T-lymfocytter og monocytter) og forskjellige kliniske bestander (f.eks utmattet/ikke-utmattet kreftpasienter og sunn kontroller). Mens det er utenfor omfanget av gjeldende manuskriptet, vil vi finne ut tilknytningene mellom kreft tretthet alvorlighetsgrad og mitokondrie dysfunksjon, samt sammenhengen mellom mitokondrie funksjonen målinger og fysiske tester av tretthet som en 6-minutters spasertur test, i fremtidige undersøkelser. Videre vil framtidige studier også undersøke mitokondrie dysfunksjon i andre typer kreft for å fastslå om tretthet over ulike typer kreft er knyttet til mitokondrie dysfunksjon. I konklusjonen, har vi utviklet en protokollen optimert for en rask vurdering av generelle mitokondrie dysfunksjoner klinisk utvalg. Videre kan mekanistisk undersøkelser utføres for å finne involvering av bestemte stier i denne ødeleggende tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien er fullt støttet av delingen av Intramural forskning av National Institute for sykepleie forskning NIH, Bethesda, Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13, (8), 1012-1039 (2015).
  2. Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52, (6), 832-840 (2016).
  3. Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19, (6), 744-750 (2015).
  4. Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40, (3), 184-193 (2017).
  5. Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2, (1), 1-16 (2009).
  6. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, (1), 505-531 (2016).
  7. Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208, (2), 117-120 (1996).
  8. Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267, (4), 394-401 (2010).
  9. Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
  10. Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40, (6), (2013).
  11. Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
  12. Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21, (4), 315-319 (2004).
  13. Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
  14. Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62, (2), 133-139 (2003).
  15. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
  16. Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205, (3), 392-400 (2012).
  17. Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20, (7), 1126-1167 (2014).
  18. Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (3), 389-395 (2001).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  20. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
  23. Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13, (2), 63-74 (1997).
  24. Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64, (5), 507-516 (2011).
  25. Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
  26. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93, (6), 690-700 (2013).
  27. Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254, (1), 85-98 (2001).
  28. Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19, (1), London, England. 67-74 (2014).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics