वीवो में Electrophysiological में Forelimbs से यौगिक मांसपेशी कार्रवाई क्षमता की माप मोटर ंयूरॉन अध कि के मॉडल

Neuroscience
 

Summary

तंत्रिका चालन की माप neurodegeneration के माउस मॉडलों का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, लेकिन यह अक्सर ही hindlimbs में sciatic तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए लागू किया जाता है. यहां, हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए यौगिक मांसपेशी कार्रवाई क्षमता (CMAP) में vivo में माउस forelimb मांसपेशियों innervated बाहु जाल द्वारा मापने के लिए ।

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Pollari, E., Prior, R., Robberecht, W., Van Damme, P., Van Den Bosch, L. In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration. J. Vis. Exp. (136), e57741, doi:10.3791/57741 (2018).

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Abstract

तंत्रिका axon की कार्यक्षमता का आकलन neuromuscular विकारों की प्रगति के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है । Electrophysiological रिकॉर्डिंग मनुष्यों और कुतर मॉडलों में तंत्रिका चालन को मापने के लिए एक संवेदनशील दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । चूहों में electromyography के लिए तकनीकी संभावनाओं को व्यापक करने के लिए, सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग कर forelimb में बाहु जाल तंत्रिका से यौगिक मांसपेशी कार्रवाई संभावितों (CMAPs) की माप यहाँ वर्णित है. CMAP रिकॉर्डिंग उत्तेजक के बाद hindlimbs में sciatic तंत्रिका पहले वर्णित किया गया है । नव शुरू की विधि यहां एक अतिरिक्त साइट पर तंत्रिका चालकता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, और इस प्रकार neuromuscular कार्यशीलता का एक और अधिक गहन सिंहावलोकन प्रदान करता है । तकनीक दोनों कार्यात्मक axons और myelination स्तर के सापेक्ष संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करता है । जिससे, इस विधि दोनों axonal रोगों के साथ ही demyelinating शर्तों का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह न्यूनतम इनवेसिव विधि तंत्रिका के निष्कर्षण की आवश्यकता नहीं है और इसलिए यह अनुदैर्ध्य अनुवर्ती एक ही जानवर में अप के लिए दोहराया माप के लिए उपयुक्त है । इसी तरह की रिकॉर्डिंग नैदानिक setups में किया जाता है के लिए विधि की शोधों प्रासंगिकता पर जोर ।

Introduction

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मोटर ंयूरॉन विकारों, plexopathies, न्यूरोपैथी, neuromuscular जंक्शन विकारों, और myopathies जैसे neuromuscular विकारों में एक नैदानिक उपकरण के रूप में प्रयोग किया जाता है । पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) में, जिसमें मुख्य रूप से मोटर न्यूरॉन्स प्रभावित होते हैं, axonal क्षति और मांसपेशी पक्षाघात1 तंत्रिका चालन अध्ययन (CMAP) पर कम एनसीएस आयाम में परिलक्षित होते हैं. Charcot में मैरी टूथ रोग (CMT) दोनों axonal अध कि और ग्रासलेल्या एनसीएस2का उपयोग परिधीय नसों में अनुमान लगाया जा सकता है । इस तकनीक के निदान की पुष्टि के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोग प्रगति3,4का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एनसीएस axonal विकृति है, जो कार्रवाई संभावित आयाम5के परिमाण से मुजे है, और ग्रासलेल्या की हद तक-जो कम आचरण वेग में परिणाम, लंबे समय तक बाहर विलंब, या आचरण ब्लॉक के अनुमान को सक्षम 6.

CMAP माप मनुष्यों और चूहों दोनों में तंत्रिका आचरण का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से और संवेदनशील तरीका है । रोगियों में जबकि एनसीएस विभिन्न साइटों पर नियमित रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं अलग नसों और मांसपेशियों को रिकॉर्ड करने के लिए, चूहों में, CMAP माप आमतौर पर केवल sciatic तंत्रिका hindlimbs में तंत्रिका कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए किया जाता है. हालांकि, कुछ जानवरों के अध्ययन में यह CMAP रिकॉर्ड करने के लिए लाभप्रद होगा दोनों में सामने-और hindlimbs, उदाहरण के लिए, अंतर के बीच रोग प्रगति का पालन करने के लिए-और hindlimbs ALS माउस मॉडल में.

यहाँ, हम सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग चूहों के forelimbs से CMAPs रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का परिचय. इसके अतिरिक्त, हम सुई इलेक्ट्रोड के साथ इसी तरह, hindlimbs से CMAPs को मापने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । रिंग इलेक्ट्रोड्स के साथ hindlimbs से CMAPs का माप पहले7,8प्रस्तुत किया गया है. सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग कर CMAPs की रिकॉर्डिंग एक तेजी से मापने विधि है, यह फर के शेविंग की आवश्यकता नहीं है, और दोनों हिंद को मापने के लिए प्रक्रिया-और forelimbs एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए पशु प्रति केवल 10 मिनट लगते हैं. इसके अलावा, इस ंयूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण दोहराया माप के लिए संभव है अनुदैर्ध्य अनुवर्ती पशुओं में कई नसों के ऊपर की अनुमति है ।

Protocol

सभी पशु मानक शर्तों के तहत कू Leuven के दिशा निर्देशों के अनुसार स्थित थे-Leuven विश्वविद्यालय और संबद्ध यूरोपीय दिशानिर्देश (यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/ईयू पशु प्रयोगों के लिए) । सभी पशु प्रयोगों को केयू Leuven की स्थानीय एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. पशु तैयारी और संज्ञाहरण

  1. isoflurane/ऑक्सीजन साँस लेना के साथ माउस में संज्ञाहरण प्रेरित । isoflurane का 4% का उपयोग करें संज्ञाहरण के प्रेरण और 2-3% के रखरखाव के लिए २.५ एल पर/ माउस की स्थिति के अनुसार संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए isoflurane प्रतिशत समायोजित करें, यानी, छोटे और कमजोर चूहों कम निश्चेतक की आवश्यकता. एक दर्द वापसी पलटा के अभाव की जाँच करने के लिए hindlimb घूमना पैड के लिए हल्के दबाव लागू करने के द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण उदा, की पुष्टि करें ।
  2. संज्ञाहरण के दौरान शरीर के तापमान की कमी को रोकने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोस्टेट हीटिंग प्लेट का उपयोग माउस शरीर के तापमान पर नियंत्रण ।
  3. संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए nosecone के साथ माउस फिट । पशु nosecone एयरवेज ब्लॉक नहीं करता है और यह है कि पशु तेजी से सांस ले रहा है कि जाँच करके ऑक्सीजन की पर्याप्त वितरण किया है कि यह सुनिश्चित करें ।
  4. रिकॉर्डिंग के दौरान, निगरानी कि माउस पर्याप्त श्वास दर (लगभग 1 हर्ट्ज संज्ञाहरण में) और हल्के दबाव पर एक वापसी पलटा के अभाव को देख कर anesthetized है । isoflurane एकाग्रता को मैंयुअल रूप से बढ़ाएं यदि संज्ञाहरण काफी गहरा नहीं है ।
  5. माप के बाद, हीटिंग प्लेट पर या एक अवरक्त दीपक की गर्मी में ठीक करने के लिए माउस छोड़ जब तक यह पर्याप्त चेतना को फिर से प्राप्त किया है स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए, लगभग 2-5 मिनट के लिए । छोड़ माउस उपेक्षित और अंय चूहों की कंपनी में जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है मत करो ।

2. हिंद-और Forelimbs में CMAP का मापन

Figure 1
चित्र 1. CMAP माप के लिए इलेक्ट्रोड की स्थिति. के लिए इलेक्ट्रोड की स्थिति प्रस्तुत की है हिंद-(A) और forelimbs (B). इलेक्ट्रोड निम्नानुसार गिने जाते हैं: 1: anode और 2: कैथोड उत्तेजक इलेक्ट्रोड, 3: सक्रिय रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, 4: संदर्भ इलेक्ट्रोड, और 5: ग्राउंडिंग इलेक्ट्रोड. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. hindlimb और forelimb CMAP माप के लिए 27 जी सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. इलेक्ट्रोड स्थिति की सिफारिश की स्थानों के लिए चित्रा 1 देखें.
  2. इलेक्ट्रोड्स को hindlimb पर निम्नानुसार रखें.
    1. प्रवण स्थिति में हीटिंग पैड पर माउस रखें । घुटने पर hindlimb का विस्तार और चिपकने वाला टेप (आंकड़ा 1a) का उपयोग कर काम की सतह पर पंजा संलग्न ।
    2. इलेक्ट्रोड के बीच लगभग 2 सेमी (1 = anode और 2 = कैथोड) की दूरी के साथ sciatic पायदान के दोनों किनारों पर चमड़े के नीचे उत्तेजक इलेक्ट्रोड प्लेस । त्वचा के माध्यम से सीधा सुई डालने के लिए त्वचा लिफ्ट और अंतर्निहित मांसपेशियों puncturing बिना त्वचा के नीचे सुई के लगभग 5 मिमी धक्का.
    3. इसी तरह, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड जगह (3) चमड़े के नीचे gastrocnemius मांसपेशी संरेखित. संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें (4) चमड़े की एक 30 डिग्री के कोण में दुखती tendons के बगल में और त्वचा के नीचे सुई के 2-5 mm छोड़ दें । जमीन इलेक्ट्रोड (5) उत्तेजक इलेक्ट्रोड के रूप में एक समान तरीके से माउस के पक्ष में चमड़े के किनारे पर रखें, लेकिन इस इलेक्ट्रोड की स्थिति माप के लिए महत्वपूर्ण नहीं है.
  3. इलेक्ट्रोड्स को forelimbs पर निम्नानुसार रखें.
    1. लापरवाह स्थिति में हीटिंग पैड पर माउस की स्थिति और चिपकने वाला टेप का उपयोग करने के लिए शरीर के किनारों पर दोनों forelimbs का विस्तार (आंकड़ा 1b) ।
    2. उत्तेजक इलेक्ट्रोड प्लेस (1 = anode और 2 = कैथोड) forelimb के दोनों किनारों पर चमड़े के बाहु जाल तंत्रिका के साथ संरेखित करने के लिए । त्वचा के माध्यम से सीधा सुई डालने के लिए त्वचा लिफ्ट और अंतर्निहित मांसपेशियों puncturing बिना त्वचा के नीचे सुई के लगभग 5 मिमी धक्का.
    3. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (3) त्वचा को उठाने से मछलियां brachii मांसपेशी के शीर्ष पर चमड़े की जगह । संदर्भ इलेक्ट्रोड (4) घूमना पैड पर 3 मिमी गहराई में एक 30 डिग्री के कोण पर रखें । जमीन इलेक्ट्रोड (5) माउस के किनारे पर चमड़े के नीचे रखें.
      नोट: इलेक्ट्रोड इस सेटअप में एक दूसरे के करीब निकटता में हैं. एक दूसरे को छूने से इलेक्ट्रोड को रोकने के रूप में इस रिकॉर्डिंग विकृतियों ।

3. डाटा अधिग्रहण

  1. नियंत्रक इकाई में आवर्तक उत्तेजना बटन धक्का और उत्तेजना बढ़ाने के लिए तीव्रता नियंत्रक घुंडी बारी से उत्तेजना शुरू करो । उत्तेजित सभी axons का उपयोग कर 1 पल्स/०.१ ms उत्तेजना अवधि के साथ एस । सही आवृत्ति और सॉफ्टवेयर में ड्रॉपडाउन मेनू से अवधि का चयन करें ।
  2. supramaximal उत्तेजनाओं तक पहुँचने के लिए (5-20 ma demyelinating शर्तों में ६० ma करने के लिए), CMAP प्रतिक्रिया के आयाम को बढ़ाने के लिए रहता है जब तक तीव्रता नियंत्रक घुंडी मोड़ से बढ़ती उत्तेजनाओं लागू होते हैं. वहां से, आगे 20% द्वारा उत्तेजना को बढ़ाने के लिए सुनिश्चित करें कि CMAP आयाम अपनी अधिक से अधिक प्रतिक्रिया तक पहुंच गया है । आवर्तक उत्तेजना बटन फिर से धक्का द्वारा उत्तेजना समाप्त ।
  3. रिकॉर्डिंग में निम्नलिखित बिंदुओं को इंगित करने के लिए मार्कर उपकरण का उपयोग करें: उत्तेजना की दीक्षा, प्रतिक्रिया की दीक्षा, अधिकतम सकारात्मक चोटी, और अधिकतम नकारात्मक चोटी (चित्रा 2).
  4. (एम2) प्रतिक्रिया की दीक्षा के लिए उत्तेजना की दीक्षा से देरी के रूप में विलंबता (एमएस में) का निर्धारण । प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रतिक्रिया की दीक्षा को परिभाषित जहां आयाम को बढ़ाने के लिए शुरू होता है । axons में ग्रासलेल्या का मूल्यांकन करने के लिए विलंबता का उपयोग करें ।
  5. अधिकतम सकारात्मक चोटी (चित्रा 2) के लिए अधिकतम नकारात्मक से आयाम (एमवी) को मापने. कार्यात्मक axons की संख्या सहसंबंधी करने के लिए आयाम के परिमाण का उपयोग करें ।

Figure 2
चित्र 2. CMAP प्रतिक्रिया की प्रतिनिधि छवि । एक वर्णनात्मक CMAP प्रतिक्रिया आयाम और विलंबता () की गणना के लिए इस्तेमाल किया अंक का संकेत है । विलंबता उत्तेजना से CMAP प्रतिक्रिया की शुरुआत करने के लिए देरी से निर्धारित होता है । पीक करने के लिए पीक आयाम अधिकतम नकारात्मक से biphasic लहर की अधिकतम सकारात्मक चोटी के लिए मापा जाता है । एक स्वस्थ गैर ट्रांसजेनिक पशु की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग () और लंबे समय तक विलंबता और कम आयाम (सी) के साथ एक रोगग्रस्त जानवर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. इलेक्ट्रोड के सटीक स्थान के बाद से रिकॉर्डिंग के परिणाम मूल्य को प्रभावित कर सकते हैं, इलेक्ट्रोड की जगह और तीन बार supramaximal उत्तेजना का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि सबसे बड़ी प्रतिक्रिया प्राप्त की है के लिए एक ही तंत्रिका उपाय. रिकॉर्डिंग के औसत का उपयोग करें ।

Representative Results

सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग CMAPs के Electrophysiological माप समय के साथ neuromuscular समारोह का पालन करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव और बहुत संवेदनशील तरीका है. तकनीक यहां वर्णित चूहों में forelimb तंत्रिका चालन के आकलन की अनुमति देता है, और इस प्रकार, तंत्रिका की कार्यक्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

CMAP आयाम और विलंब हिंद से मापा गया-और forelimbs ALS, SOD1-G93A9 और पीआरपी-hFUS-WT310 (चित्रा 3) के दो माउस मॉडल में रोग पाठ्यक्रम के दौरान, और CMT के एक माउस मॉडल में, C61-PMP2211,12 (चित्रा 4). ALS माउस मॉडल ALS-से संबंधित मानव जीन के व्यक्त द्वारा बनाए गए थे, अर्थात् या तो SOD1 या जंगली प्रकार FUS। दोनों मॉडलों में, चूहों ALS प्रगतिशील मोटर ंयूरॉन अध कि पक्षाघात के लिए अग्रणी जैसी विकसित । गैर-ट्रांसजेनिक littermate नियंत्रण में, दोनों हिंद-और forelimbs के CMAP आयाम समय (चित्र 3ए) के साथ बदल नहीं किया । दूसरी ओर, hindlimb से sciatic तंत्रिका के CMAP आयाम SOD1-G93A चूहों में नाटकीय रूप से कमी आई थी, यहां तक कि ६० दिनों की उम्र के आसपास लक्षण शुरुआत से पहले (जबकि पहली मोटर लक्षण आमतौर पर तीन महीने की उम्र में मनाया जाता है)13 . आयाम गैर में उस उंर में ९० एमवी-ट्रांसजेनिक (गैर टीजी) littermates था, जबकि SOD1-G93A चूहों में यह केवल 30 एमवी था । रोग के रूप में १५० दिन की उम्र में देर रोगसूचक चरण के लिए प्रगति की है के रूप में आयाम में केवल न्यूनतम आगे गिरावट आई थी । CMAP आयाम में गिरावट, और इसलिए axons के अध: पतन, sciatic से hindlimbs तंत्रिका की तुलना में forelimbs के बाहु जाल तंत्रिका में देरी थी । forelimbs में, रोग प्रगति भी अधिक ध्यान देने योग्य था के रूप में CMAP आयाम से कम 30 mv जब पहले और इन चूहों में मोटर घाटे की अभिव्यक्ति के बाद मापा ७० mv.

ALS के पीआरपी-hFUS-WT3 माउस मॉडल में, मोटर घाटे की शुरुआत लगभग 28 दिन10, जो CMAP आयाम में गिरावट की दीक्षा के साथ मेल खाती है की उंर में शुरू होता है । यह एक और अधिक त्वरित रोग मॉडल के रूप में चूहों अंत स्तर तक पहुंचने लगभग ६५ दिन की उंर में है । CMAP आयाम में गिरावट forelimb में बाहु जाल तंत्रिका की तुलना में hindlimb के sciatic तंत्रिका में और अधिक तेजी से हुई है, जो axonal (चित्रा 3 डी) में एक पहले hindlimbs अध कि इंगित करता है । इस प्रेक्षण hindlimbs के रूप में इन माउस मॉडलों के दोनों में नैदानिक अवलोकन का समर्थन करता है विशेष रूप से पहले forelimbs कि रोग की प्रक्रिया की देर चरणों तक कार्यात्मक रहने से पंगु बना रहे हैं ।

सामांय में, उत्तेजना से कार्रवाई क्षमता की दीक्षा के लिए विलंबता forelimbs में कम था hindlimbs की तुलना में (चित्र बी, ई) । यह सिर्फ उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के बीच कम दूरी की वजह से है. विलंबता axons के myelination स्तर का एक संकेत प्रदान करता है । हमारा अवलोकन है कि CMAP विलंब ALS के माउस मॉडल में रोग प्रगति के दौरान लंबे समय तक रहे हैं, हालांकि ALS एक demyelinating रोग नहीं है । यह सबसे बड़ा, तेजी से मोटर axons के संचालन के नुकसान के कारण की संभावना है ।

C61-PMP22 चूहों मानव PMP22 और heterozygote चूहों की 3-4 प्रतियां व्यक्त दोहराऊंगा हल्के CMT1A और कम phenotype के साथ एक बहुत ही हल्के ग्रासलेल्या रोग CMAPs, लेकिन कोई दिखाई नहीं phenotype11,12के साथ । उम्र के 1.5-2 साल में C61-PMP22 चूहों, CMAP आयाम कम हो जाते हैं और विलंब hindlimbs और forelimbs (चित्रा 4) में लंबे समय तक दोनों. एक स्वस्थ विषय से एक रिकॉर्डिंग की तुलना में कम आयाम और विलंबित प्रतिक्रिया प्रदर्शित प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग क्रमशः चित्र 2cमें प्रस्तुत कर रहे हैं. forelimbs में CMAP विलंब के रूप में हिंद अंगों में ज्यादा प्रभावित नहीं कर रहे हैं । यह CMT1A रोगियों के साथ संगत है, के रूप में अधिक बार रोगियों को एक लंबाई निर्भर विकार के रूप में CMT के pathophysiological प्रकृति के कारण निचले अंगों में गंभीर रूप से कम या undetectable CMAPs है14. इसके अतिरिक्त, रोग गंभीरता की डिग्री CMAP आयाम, बजाय विलंबता या आचरण वेग के साथ संबंधित है, आयाम axonal अखंडता14,15की डिग्री के साथ सहसंबंधी के रूप में । फिर भी, परिणाम संकेत मिलता है कि इस विधि CMT1A में स्वीकार्य demyelinating प्रक्रिया का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है ।

आयाम और लेटेंसी में भिन्नता गैर-ट्रांसजेनिक समूहों में सबसे कम थी (भिन्नता का गुणांक 2-15% और 1-13%, क्रमशः). सभी ट्रांसजेनिक मामलों में, माप में अधिक भिन्नता (आयाम 8-51% के लिए भिन्नता का गुणांक और विलंबता के लिए 1-21%), जो सबसे अधिक संभावना जानवरों के बीच रोग प्रगति में मतभेद के कारण होता है । सभी मामलों में, भिंनता हिंद में समान था-और forelimbs । सुई और सतह इलेक्ट्रोड के उपयोग में भिन्नता16के समान होने की सूचना दी गई है.

आवश्यक उत्तेजना तीव्रता गैर के बीच बहुत भिंन नहीं-ट्रांसजेनिक और ALS मॉडल (आंकड़ा 3सी, एफ) । इसी तरह, आवश्यक उत्तेजना इन मामलों में supramaximal उत्तेजना तक पहुंचने के लिए समान था और hindlimbs और 5-12 mA के बीच विविध । CMT में, वृद्धि की उत्तेजना तीव्रता के लिए आवश्यकता17 पहचाना गया है और एक ही phenotype C61 में देखा गया था-PMP22 चूहों (चित्रा 4c). घटना hypertrophic endoneurial परिवर्तन17से बढ़ी विद्युत प्रतिबाधा द्वारा समझाया गया है.

CMAP आयाम forelimbs से दर्ज की पुष्टि करने के लिए तंत्रिका उत्तेजना और नहीं मांसपेशियों उत्तेजना के कारण था, हम बाहु जाल तंत्रिका पर एकतरफा आंशिक axotomy प्रदर्शन में 5 महीने पुराने गैर ट्रांसजेनिक C57BL/6Jax चूहों (पुरुष और महिला) ( चित्रा 5) । Axotomy 20 एमवी के लिए ९० एमवी से CMAP आयाम कम है, यह दर्शाता है कि axons के अधिकांश आपरेशन में काट दिया गया । contralateral forelimb या hindlimbs में आयाम में कोई परिवर्तन नहीं किया गया था । यह परिणाम दृढ़ता से इंगित करता है कि उत्तर मछलियां brachii में पाया तंत्रिका उत्तेजना के कारण था और मांसपेशियों की उत्तेजना से परिणाम नहीं था ।

Figure 3
चित्र 3. CMAP आयाम, विलंबता, और हिंद में रोग पाठ्यक्रम पर आवश्यक उत्तेजना-और ALS माउस मॉडल में forelimbs । SOD1-G93A (-सी) और पीआरपी-hFUS-WT3 (डीएफ) ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों और गैर ट्रांसजेनिक (गैर टीजी) littermates मोटर लक्षण की शुरुआत में, रोगसूचक अवस्था में मापा गया, और रोग की प्रक्रिया के देर-रोगसूचक चरण, ५७, ९१, और १४७ दिनों में (घ) या 29, ३८, और ५३ दिनों में SOD1-G93A और पीआरपी-hFUS-WT3 चूहों के लिए, क्रमशः । कालाधन: नॉन-ट्रांसजेनिक hindlimb, ब्लैक डैश्ड: नॉन-ट्रांसजेनिक forelimb, ग्रे: ट्रांसजेनिक hindlimb, ग्रे धराशायी: ट्रांसजेनिक forelimb । परिणाम मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । आयाम (, डी) हिंद में गैर ट्रांसजेनिक पशुओं दोनों में समय के साथ स्थिर थे और forelimbs. ट्रांसजेनिक पशुओं में, रोग की प्रक्रिया के दौरान आयाम में कमी आई है । विलंब (बी, ) रोग से कम प्रभावित थे और प्रमुख मतभेद हिंद के बीच मनाया गया-और forelimbs, जीनोटाइप की परवाह किए बिना । आवश्यक उत्तेजना (सी, एफ) में भिंनता सभी समूहों में कम था । के लिए SOD1-G93A n = 4 टीजी १४७ डी के अलावा सभी समूहों में, n = 3 । पीआरपी-hFUS-WT3 चूहों के लिए आयु समूहों में 29, ३८, और ५३, N गैर-टीजी 4, 5 और 4 के लिए है, और टीजी 7, 5, और 3 के लिए, क्रमशः । प्रतीकों समूहों के बीच अंतर के रूप में निरूपित: *: गैर टीजी hindlimb बनाम टीजी hindlimb, #: गैर टीजी forelimb बनाम टीजी forelimb, ¤: गैर टीजी hindlimb बनाम गैर टीजी forelimb, ग्रे *: टीजी hindlimb बनाम टीजी forelimb । Tukey के कई तुलना परीक्षण के साथ दो-तरफा ANOVA, *: p < ०.०५, * *: p < ०.०१, * * *: p < ०.००१, * * * *: p < 0.0001. #: p < ०.०५, # #: p < ०.०१, # # #: p < ०.००१, # # # # : p < ०.०००१. ¤: p < ०.०५, ¤ ¤: p < ०.०१, ¤ ¤ ¤: p < ०.००१, ¤ ¤ ¤ ¤: p < ०.०००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. CMAP आयाम, विलंबता, और हिंद में आवश्यक उत्तेजना-और CMT1A चूहों में forelimbs । C61-PMP22 ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों और नॉन ट्रांसजेनिक (नॉन-टीजी) littermates को 1.5-2 साल की उम्र में मापा गया । आयाम () हिंद में दोनों में कमी आई थी-और ट्रांसजेनिक चूहों में forelimbs । विलंबता () CMT चूहों में सभी अंगों में लंबे समय तक था और forelimbs में भी सूक्ष्म परिवर्तन इस माप के साथ पता चला था. उत्तेजना तीव्रता के लिए आवश्यकता () C61-PMP22 चूहों में वृद्धि की गई थी, जो CMT1A रोगियों में पता लगाया phenotype जैसा दिखता है. परिणाम गैर टीजी एन = 4 और टीजी एन = 3 के लिए, मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । Sidak की एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ दो-तरफा ANOVA, * *: p < ०.०१, * * * *: p < ०.०००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. Forelimb कार्रवाई क्षमता तंत्रिका उत्तेजना की वजह से कर रहे हैं । संभावना है कि मनाया CMAP प्रतिक्रिया मांसपेशियों उत्तेजना की वजह से था बाहर करने के लिए, (आंशिक) axotomy बाहु जाल तंत्रिका पर प्रदर्शन किया गया था । CMAP आयाम () और विलंबता (बी) पहले (पूर्व) और 4 दिन (पोस्ट) के बाद दर्ज किए गए वयस्क गैर ट्रांसजेनिक चूहों में बाहु जाल के axotomy । Axotomy CMAP आयाम का संकेत है कि प्रतिक्रिया तंत्रिका उत्तेजना के कारण था कम । काला: hindlimb, ग्रे: contralateral forelimb, ग्रे धराशायी: ipsilateral forelimb । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± एसडी, N = 2 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

संवेदनशील रिकॉर्डिंग तरीकों रोग प्रगति और विशेष रूप से ंयूरॉन विकारों के पशु मॉडल में एक चिकित्सा की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं । CMAPs का निर्धारण एक न्यूनतम इनवेसिव electrophysiological तकनीक है, जो नियमित रूप से क्लीनिक में और प्रयोगात्मक setups में neuromuscular और neuropathic विकारों3,18में तंत्रिका चालन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहाँ, हम forelimb के बाहु जाल तंत्रिका में तंत्रिका चालन को मापने के क्रम में चूहों में CMAP रिकॉर्डिंग के लिए एक उपंयास आवेदन का वर्णन । प्रस्तुत विधि की अनुमति देता है एक और अधिक बहुमुखी और neurodegeneration के माउस मॉडल में ंयूरॉन समारोह के विस्तृत अनुदैर्ध्य आकलन ।

सुई इलेक्ट्रोड थोड़ा और अधिक अंगूठी इलेक्ट्रोड से आक्रामक रहे हैं और विशेष रूप से अनुदैर्ध्य अध्ययन देखभाल में ऊतक नुकसान को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. विधि का एक संभावित दोष एक तंत्रिका या मांसपेशी भेदी से चोट के परिणामस्वरूप है । हालांकि, इलेक्ट्रोड के सावधान चमड़े के नीचे स्थान के बाद, चोट और मांसपेशियों और नसों के विघटन को रोका जा सकता है । अंगूठी इलेक्ट्रोड का उपयोग कर विधि के विपरीत, यहाँ प्रस्तुत विधि शरीर के बड़े हिस्से से फर के शेविंग की आवश्यकता नहीं है. एक परिणाम के रूप में, वहां कोई असुविधा या पशु के लिए thermoregulation पर प्रभाव है ।

इलेक्ट्रोड की स्थिति CMAP आयाम और विलंब के सही और लगातार रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है. यह इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए सलाह दी जाती है और प्रत्येक साइट पर दो से तीन माप करने के लिए पुष्टि करें कि अधिक से अधिक उत्तेजना और प्रतिक्रियाओं हासिल कर रहे हैं । सही रिकॉर्डिंग biphasic curves के रूप में चित्र 2में प्रदर्शित उत्पादन करना चाहिए । विधि का मानकीकरण करने के लिए, तंत्रिका चोट के बिना गैर ट्रांसजेनिक चूहों इष्टतम उत्तेजना के लिए उचित और लगातार इलेक्ट्रोड स्थिति स्थापित करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल हैं. पुन: प्रयोज्य सुई इलेक्ट्रोड दोहराया उपयोग के लिए उपयुक्त हैं, तो वे नियमित रूप से निष्फल रहे हैं, जैसे जानवरों के बीच 20 मिनट के लिए glutaraldehyde के साथ, और तीक्ष्णता के लिए निरीक्षण किया ।

स्वस्थ वयस्क चूहों में, CMAP प्रस्तुत विधि के साथ दर्ज आयाम आमतौर पर 80-100 एमवी sciatic तंत्रिका और बाहु जाल उत्तेजक के बाद कर रहे हैं । इस अंगूठी इलेक्ट्रोड के साथ मापा प्रतिक्रियाओं से विशेष रूप से बड़ा है, क्योंकि वहाँ एक उच्च प्रतिबाधा है कि 20-40 एमवी8,19,20के परिणाम का उत्पादन करता है कि अंगूठी इलेक्ट्रोड के लिए त्वचा की वजह से है. ALS माउस मॉडलों में, sciatic तंत्रिका उत्तेजक या झोले के अंग में बाहु जाल 10-30 एमवी को कम करने के बाद CMAP आयाम. CMAP आयाम की भयावहता21विकास के दौरान CMAP आयाम बढ़ जाती है के बाद से युवा जानवरों में छोटा है ।

विधि है कि हम यहां का वर्णन विशेष रूप से ALS के माउस मॉडलों में उपयोगी है, जिसमें वितंत्रीभवन, और बाद में मोटर घाटे, forelimbs13में से hindlimbs में पहले हो । वितंत्रीभवन के अलावा, विधि reinnervation जो CMAP आयाम में रोका या मंदबुद्धि गिरावट के रूप में निर्धारित किया जाता है पता लगा सकता है । लक्षण शुरुआत की उम्र में पहले से ही hindlimbs की मांसपेशियों में CMAP आयाम में नाटकीय कमी आगे रोग प्रगति का पालन करने में बाधा; के रूप में CMAP आयाम रोग के प्रारंभिक चरण में बहुत कम मूल्यों तक पहुँचने, वे आगे रोग प्रक्रिया के दौरान कमी नहीं है. इसके विपरीत, axonal हानि forelimbs के बाहु जाल तंत्रिका में एक धीमी गति से प्रगति और रोग की एक लंबी अवधि में रोग प्रगति को मापने के लिए एक और अधिक संवेदनशील विकल्प प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, कम पतित forelimbs चिकित्सीय दृष्टिकोण का आकलन है कि axonal समारोह को बढ़ाने पर उद्देश्य के लिए एक अधिक शक्तिशाली साइट प्रदान कर सकता है ।

यह स्पष्ट है कि प्रस्तुत तकनीक neuromuscular विकारों के माउस मॉडलों के लक्षण वर्णन के लिए उपंयास संभावनाएं प्रदान करता है । sciatic तंत्रिका और बाहु जाल से सुई इलेक्ट्रोड के साथ CMAP रिकॉर्डिंग axonal नुकसान और हिंद में ग्रासलेल्या-के रूप में अच्छी तरह के रूप में forelimbs में आकलन करने के लिए एक तेजी से और reproducible विधि है. विधि की संवेदनशीलता से पहले भी उल्लेखनीय मोटर घाटे दर्ज किया जा सकता है axonal घाटे का पता लगाने में सक्षम बनाता है, और इस तरह इन दोषों के प्रारंभिक ठहराव की अनुमति देता है । इसके अलावा, दोहराया परीक्षण की संभावना आवश्यक पशुओं की संख्या कम कर देता है और एक व्यक्तिगत जानवर में विभिंन स्थलों पर neuromuscular और neuropathic रोगों की प्रगति का एक विस्तृत सिंहावलोकन प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को कू Leuven (' फ्यूचर ओपनिंग ' और C1), साइंटिफिक रिसर्च Flanders (FWO-Vlaanderen), द थियरी Latran फाउंडेशन, द एसोसिएशन Belge contre लेस विकृतियों न्यूरो-Musculaires (ABMM), के लिए फंड का सपोर्ट दिया गया है, दमदार Dystrophy एसोसिएशन (एमडीए), द एण्ड ALS एसोसिएशन एण्ड द ALS लिगा (बेल्जियम) । PVD को FWO-Vlaanderen का एक वरिष्ठ investigatorship मानती हैं. आरपी केंद्रीय उपचारात्मक क्लिनिक (सीआरसी) आयरलैंड से अनुदान द्वारा समर्थित था और वर्तमान में आयरलैंड के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय (नुई) और FWO का समर्थन किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Resuable subdermal needle electrode, Pl/Ir Technomed TE/S61-434 The Needle is 13 mm (0.51") in length, 0.4 mm (27G) in diameter
Natus electrodiagnostic system Natus Neurology UltraPro S100 EMG device
Synergy Natus Neurology version 20.1.0.100 EMG software for UltraPro S100
Physitem Controller Rothacher-Medical GmbH TCAT-2LV Heating pad
combi-vet Base Anesthesia System Digital Flowmeter with TEC 3 Vaporize Rothacher & Partner CV 30-301-D Isoflurane Vaporizer and flowmeter
Iso-Vet 1000 mg/g  Piramal Healthcare UK Limited AP/DRUGS/220/96 Isoflurane
SOD1-G93A mice The Jackson Laboratory #002726 ALS tg and non-tg control littermates, only females
PrP-hFUS-WT3 mice The Jackson Laboratory #017916  ALS tg and non-tg control littermates, all groups balanced for males and females
C57BL/6Jax mice The Jackson Laboratory #000664 Non-tg mice for axotomy, male and female
C61-PMP22 mice Mouse line was generously donated  by Prof. M. Sereda (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, Göttingen, Germany). CMT tg and non-tg control littermates, all groups balanced for males and females

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