Stentor 에 중생의 연구 방법

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Summary

거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

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Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the Study of Regeneration in Stentor. J. Vis. Exp. (136), e57759, doi:10.3791/57759 (2018).

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Abstract

셀은 외부 섭에서 회복 하기 위해 그들의 부분을 다시 생성할 수 있이 필요가 있다. 단 세포 ciliate Stentor coeruleus 는 상처 치유 공부에 우수한 모델 유기 체 및 후속 세포 재생입니다. Stentor 게놈 최근, RNAi 등 현대 분자 생물학 방법을 함께 제공 되었다. 이러한 도구는 단일 세포 재생 분자 수준에서 연구를 가능 하 게. 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 단일 셀 또는 셀 조각 Stentor 문화를 유지 하는 것에 대 한 일반 지침과 함께 수립 Stentor 셀 문화를 다루고 있습니다. 생화학, 시퀀싱, 그리고 질량 분석 같은 유용한 도구를 사용 하 여 대량에서 Stentor 경작 할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 섹션 커버 Stentor재생을 유도 하는 다른 접근 방식. 수동으로 유리 바늘으로 세포를 절단 셀의 앞쪽 끝에 있는 특정 구조의 재생을 공부 하 고 수 자당 또는 요소 셀 치료 큰 셀 부품의 재생을 공부 수 있습니다. 이미징 개별 재생 셀에 대 한 방법은 준비 하 고 중생의 역학 분석 표제와 함께 제공 됩니다. 중생의 전체 과정은 3 단계로 분할 된다. 시각화의 진행 단계를 통해 세포의 인구 역학, 여 재생 타이밍에이 증명 됩니다.

Introduction

세포의 효소, 하지만 그 구성 요소는 신중 하 게 정확한 크기로 조정 하 고 잘 정의 된 위치에서 배열 오히려 매우 복잡 한 기계 간단한 가방 않습니다. 개별 셀의 morphogenesis 셀과 발달 생물학, 핵심 프로세스를 나타내지만 그것의 분자 메커니즘은 알 수 없는1,2. 동안 일부 교양된 셀 모양을 닮은, 단 세포 유기 체 수는 매우 복잡 한 아키텍처, ciliates3,4복잡 한 대뇌 피 질의 패턴에 의해 exemplified.

아마도 가장 극단적인 예를 고도로 구조화 된 셀의 거 대 한 heterotrichous ciliate Tetrahymena Paramecium 하 먼 관련 Stentor coeruleus, 이다. Stentor 길이 1 m m 이며 속눈썹 microtubule 리본 전체 셀의 길이 실행 하는 병렬 스택 주최의 행으로 교체 하는 블루 안료의 이상의 100 세로 줄무늬를 덮여 있다. 셀은 트럼펫-모양 (그림 1), membranellar 밴드와 그것의 앞쪽 끝과 후부 끝 기판에 셀 연결 holdfast 구강 장치 (OA). 분명 이전 후부 극성 외 셀 또한 보여줍니다 독특한 랄 패턴화 속눈썹 행 사이의 간격 점차적으로 시계 방향으로 증가 되도록. 불연속 좁은 행 만나는 넓은 행 및 셀 표면에의이 지역에서에서이 결과 스트라이프 대비의 소재 시로 알려진, 앞쪽 끝 구조에 다른 셀5, 융합 때의 두 번째 세트의 형성을 일으킬 수 있다 공식적으로 Spemann의 조직자에 해당 하 고 있습니다. 따라서, 개발 생물학의 모든 주요 프로세스에 있는 그들의 아날로그 Stentor: axiation, 패턴 형성, 그리고 유도. 배아, Stentor다른 세포 사이 에서도 이러한 프로세스 운명 차이 의해 구동 됩니다, 그리고 그들은 운명 단일 셀 내의 다른 지역 간의 차이 의해 구동 되어야 합니다. 무슨 Stentor 내에서 지역 간의 차이점을 정의 신비 이다.

Stentor 의 일부 차단 하는 경우 셀의 푸는 시간에 정상적인 세포를 재생할 수 있습니다. 셀 경우 절반, 또는 훨씬 더 작은 조각으로 심지어 각 조각 정상 찾고 하지만 작은 셀으로 재구성 하 여 잘라내어 셀 부품6,7사이의 적절 한 비례를 복구. 심지어 작은 조각, 1/64번째 원래 셀의 크기는 작지만 일반적으로 잡힌 셀으로 다시 생성 하 고 다음 전체 크기6성장 수 있습니다. Stentor 따라서 세포 기관이 크기 스케일링 및 세포 성장 규제의 조직 또는 전체 유기 체 수준에 일반적으로 적용 되는 수술 방법을 사용 하 여 기계 장치를 공부 하는 독특한 기회를 제공 합니다.

Stentor 수술 작업의 넓은 범위에서 재생성 하 수의 속성 중 하나는 단일 nodulated macronucleus (그림 1)8전체 게놈 약 50000 사본을 포함입니다. 셀 조각 macronuclear 노드를 하나 이상 포함, 그것은 완벽 하 게 다시 생성 하는 기능. Stentor의 재생 능력을 기본 또 다른 재산의 막대 한 상처 치유 능력 이다. 많은 세포 유형9그들의 상처 치유 할 수 있다, 비록 Stentor 물리적 섭의 특별 한 범위에서 복구할 수 있다. Stentor10 세포질 흐름을 시각화 하는 방법 함께 과감 한 섭 동에서 Stentor 복구의 예로 이전 보고 되었다. 이러한 메서드는 세포질의 물리적 상태 어떻게 부상 하 고 이후 재생 영향의 연구를 수 있습니다.

Stentor의 거 대 한 크기, 특별 한 재생 능력, 그리고 사실 (예: 조직, axiation, 및 패턴화) 다세포 배아에서 발달 현상의 많은 명단 매력 중 많은 발달 생물학 토머스 헌트 모건7을 포함 하 여 지난 세기의 켜십시오. 50 년대와 60 년대 동안 microsurgical 접근 입증이 단 세포 유기 체11에서 재생 및 전체적 프로세스의 놀라운 배열. 그러나, Stentor 개발 되었습니다 분자 생물학 모델 시스템으로 최근에. 지난 몇 년 동안 Stentor 의 게놈 시퀀싱은8, 조립 하 고 먹이로 RNAi를 사용 하 여 유전자 발현을 교란 하는 방법은 개발된12살.

Stentor 현대 분자 생물학만을 위한 모형 유기 체에 개발 되었다 이유 중 하나는 최근 성장 때문에 그것의 긴 세포 주기 (3 ~ 5 일) 큰 문화의 어려움 이었다. 그러나 현대 genomic와 proteomic 방법 그들은, 사용 하 고 단일 Stentor 셀의 볼륨은 단일의 분석을 위해 개발 된 磁 방법에의 지 없이 이러한 방법에 대 한 충분 한 보다 더 적은 물자를 요구 하는, 셀 Stentor보다 훨씬 작은. 프로토콜의 섹션 1 단일 Stentor 셀에서 큰 문화를 설정 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 동일한 접근 셀 절단에 의해 얻은 세포 조각에서 큰 문화 확립을 사용할 수 있습니다. 섹션 1은 또한 시간의 오랜 기간 동안 건강 한 Stentor 문화를 유지 하기 위한 지침을 제공 합니다. 프로토콜의 섹션 2 유리 바늘으로 셀을 수동으로 절단 하 여 세포 재생을 유도 대 한 방법론을 제공 합니다. 특정 셀 구조 (membranellar 밴드와 구강 장치)의 재생을 유도 하는 두 가지 방법에 전념 하는 프로토콜의 제 3: 다음 이러한 구조를 흘리기 이끌어 자당 또는 요소 셀 치료 그들의 재생입니다. 프로토콜의 제 4 시간의 오랜 기간 동안 개별 재생 세포의 영상에 대 한 방법을 자세히 설명합니다. 제 4 단계의 중생과 중생 역학의 분석에 대 한 도움말의 설명으로 끝납니다.

Protocol

1. 배양 Stentor 와 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 문화

  1. Chlamydomonas reinhardtii 문화 Stentor위한 음식으로 사용할 준비.
    1. 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 Chlamydomonas reinhardtii 셀을 가져옵니다.
    2. 메 마른 기술13를 사용 하 여 상업적으로 이용 가능한 탭 미디어에 Chlamydomonas reinhardtii 의 500 mL 액체 문화를 설정 합니다.
    3. 일주일에 두 번 탭 미디어와 그것을 diluting 하 여 램프 아래 Chlamydomonas 문화 (약 1의 마약)에서 채도 근처 농도 유지.
      참고: Chlamydomonas 문화 통에 성장 될 수 있다.
    4. 정기적으로 문화의 한 방울 슬라이드에,는 coverslip로 덮고 놓고 40 X 확대 현미경 검사 Chlamydomonas 문화 건강 인지 확인 하십시오.
      참고: Stentor 먹이 세균으로 오염 되 또는 Chlamydomonas 셀 클러스터로 집계 하는 경우에 대 한 문화를 사용 하지 마십시오. 이러한 문제 중 하나가 발생 하면, 새로운 Chlamydomonas 문화 시작.
  2. 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 Stentor coeruleus 셀을 가져옵니다.
  3. Stentor 세포는 필요한 경우 그들의 자연 서식 지에서 연못, 호수 또는 강11에서 그들을 수집 합니다.
    1. 수집 Stentor 연못, 호수 또는 강, 물이 상대적으로 그늘, 조용 하 고 분명 일부 식물 지역 찾아.
      참고: 찾는 Stentor 내려면 성장 위치에서의 더 높은 확율이 있다.
    2. 부 어 쉽게 용기에 물 2 리터 이상 수집 합니다.
    3. 암 및 미 립 자 물질 컨테이너의 하단에 정착, 한 후 부드럽게 Stentor, 대형 컨테이너에 정착 암 설에 대 한 각 컬렉션 후 몇 초 동안 대기에 대 한 검사를 몇 가지 작은 컨테이너를 입력 합니다.
    4. 샘플의 수집 위치에 완료 되 면 적어도 10 m 거리는 새 위치로 이동 하 고 거기 샘플의 컬렉션을 반복.
      참고: 모든 연못 인구가 Stentor , 그래서 여러 연못 수 샘플링을 할 수 있습니다.
    5. 실험실 샘플으로 돌아갑니다 하 고 개별 접시에 물 컨테이너에서 전송.
    6. 각 페 트리 접시에 5 배 확대에 비스듬한 빛 stereomicroscope Stentor 에 대 한 검색. 저온 살 균된 상용 샘물 (PSW)의 적어도 100 µ L를 포함 하는 유리 자리 접시의 우물에 1 mL 피 펫을 사용 하 여 개별 Stentor 셀을 전송 합니다.
      참고: Stentor 세포 기판 (그림 1)에 연결 하는 경우 나 팔 모양에 있다. 수영 Stentor 세포는 기질 (비디오 1)에 연결 된 셀 보다 덜 확장.
    7. PSW 적어도 3 Stentor 워시 x. 세척 Stentor 셀에 잘 유지 하면서 우물에서 물의 약 90%를 제거 하 여 수행 우물에 PSW의 500 µ L을 추가 하 여 다음.
      참고: Stentor 펫 피 펫 팁 10 µ L의 또는 더 작은 사용 하 여 처리 하기 전에 잘라 큰 셀 흐르는 생성 되는 전단 세력으로 인해 셀 부상 방지를 위로 피 펫 팁의 끝에서 약 0.5 m m 팁 op의 너무 작은 ening입니다.
  4. Stentor의 먹이 기 전에 Chlamydomonas 를 준비 합니다.
    1. Chlamydomonas 문화 단계 1.1에서 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 준비의 1 mL를 전송 합니다. 3 분 2,095 x g에서 원심.
    2. 제거는 상쾌한 고 PSW의 1 mL에 펠 릿을 resuspended. 2,095 x g 3 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 PSW의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.
      참고: 따라서, 세척 하 고 집중된 Chlamydomonas 참조 됩니다 "Chlamydomonas"준비로 다음 단계에서. 탭 미디어 Stentor, 따라서 Stentor 먹이 것이 중요 하기 전에 Chlamydomonas 를 세척에 유해 하다.입니다.
  5. 클론 Stentor 문화, 필요한 경우 개별 Stentor 셀 또는 셀 조각에서 문화를 시작 합니다.
    1. 때문에 단일 Stentor 셀 PSW에서 잘 성장 하지 않는다, 필터 미디어는 기존, 건강 Stentor 문화에서의 500 µ L를 살 균 하 여 바른된 미디어를 준비 합니다.
    2. 유리 자리 접시의 우물 중 하나에 500 µ L의 조건된 미디어를 전송 합니다.
    3. Stentor 조건된 미디어를 포함 하는 유리 자리 접시의 우물에 전송 합니다. 사용 가능한 작은 매체로 전송.
    4. 모든 48 h 준비 Chlamydomonas 의 각 Stentor 5 µ L를 피드. 때 Stentor 분할, 우물에 있는 셀의 수를 계산 하 고 셀 당 준비 된 Chlamydomonas 의 5 µ L를 추가 합니다.
    5. 그늘진된 장소에서 계속 Stentor 이후 셀 (예를 들어 투명 한 플라스틱 상자 종이 타 올으로 덮여)에 빛에 민감합니다.
    6. 신선한 조절된 매체 모든 96 h와 잘에서 Stentor 매체를 교환 합니다.
      1. 1.5.1 단계에서 신선한 조건된 미디어를 준비 합니다.
      2. 부드럽게 잘에서 아래로 액체 pipetting 우물의 바닥에서 분리 모든 Stentor 셀을 확인 합니다.
      3. 신중 하 게 잘 사용 하는 모든 셀에는 잘 남아 있는지 1 mL 피 펫에서 액체 발음. 우물에 신선한 바른된 미디어의 500 µ L를 추가 합니다.
    7. 잘 셀 수 20을 초과 하면 더 큰 컨테이너, 예를 들어 넓은 입 유리 항아리에 셀을 이동 합니다.
      1. 압력가 넓은 입 유리 항아리에 PSW의 20 mL를 추가 합니다.
        참고: Stentor 에 대 한 유리의 압력가 마로 소독 세척을 조심 하 고 rinsing 교체할 수 있습니다.
      2. 조심 스럽게 미디어를 위쪽 및 아래쪽 플라스틱에 우물의 바닥에서 모든 셀을 분리를 잘. 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 모든 Stentor 셀을 수집 하 고 부드럽게 유리 항아리에 그들을 전송.
    8. Stentor 문화, 공기에 대 한 충분 한 액세스를 허용 하도록 함께 항아리에 뚜껑을 조여 하지 마십시오.
    9. 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지를 항아리 마다 48 h에 PSW를 추가 합니다. 눈으로 셀의 밀도 견적 한다.
      참고: 또는, 문화의 1 mL를 피펫으로 벽에서 분리 하 고 피 펫 팁에 있는 셀의 개수를 셀 수 있도록 항아리에 거품 공기 1 mL 피 펫을 사용 합니다.
    10. 모든 48 h Stentor 문화 단지 (단계 1.4 참조)에 대 한 피드 Chlamydomonas 준비. 준비 된 Chlamydomonas의 200 µ L로 문화를 먹이 함께 시작 합니다. 문화의 볼륨 증가, 점차 준비 Chlamydomonas 먹이 1 mL에 대 한 사용의 양을 증가 합니다.
    11. 문화 볼륨 항아리의 능력의 약 90%를 도달 하는 때, 더 큰 컨테이너에는 문화를 전송 합니다.
      1. 유리에서 Stentor 분리를 1 mL 피 펫과 항아리, 내부 문화를 아래로, 플라스틱.
      2. 2 컵 유리 용기에 병의 전체 내용을 부 어.
      3. PSW의 나머지 Stentor수집 2 컵 유리 용기에 약 25 mL와 함께 항아리를 씻어.
  6. 2 컵 유리 용기에 건강 한 문화를 유지 합니다.
    1. 4-5 일 마다 Stentor 문화 문화의 100 mL 당 준비 된 Chlamydomonas 의 2 개 mL를 피드. 추가 PSW 유리 컨테이너에 4-5 일 마다 약 20 셀/mL에서 Stentor 밀도 유지 합니다.
      참고: 450 mL 2 컵 컨테이너를 보유 하 고 최대 볼륨입니다.
    2. 일주일에 한 번 검사 해 부 현미경 rotifers, 곰 팡이, 그리고 다른 성장에 대 한 X 5에서 문화. 문화의 건강, 연장 1 mL 피 펫을 사용 하 여 비정상적으로 모양 하 고 무색 Stentor 셀 함께 오염 미생물을 제거 합니다.
    3. 유리 컨테이너는 전체 약 90% 때 분할 문화.
      1. 유리 컨테이너에 PSW 25 mL를 추가 합니다. Stentor 유리에서 분리 하려면 아래로 25 mL 피 펫 피 펫을 사용 합니다. 문화의 약 50%는 새로운 2 컵 유리 컨테이너에 이동 합니다.
      2. 두 문화에 PSW 25 mL를 추가 하 고 프로토콜의이 섹션에 설명 된 대로 두 개의 문화를 유지 하는 계속.
        참고: Stentor 세포 높은 온도에 민감한 때문에, 문화 유지 됩니다 방에 온도 25 ° c 이하로 유지 합니다. 또는, 문화 인큐베이터에 보관 될 수 있습니다. Stentor 경작의 문제 해결 표 1 을 참조 하십시오.

2. 절단 Stentor 세포 재생을 유도

  1. 다음과 같이 프로그램을 사용 하는 모 세관 튜브에서 여러 바늘을 바늘 끌어당기는 사람을 사용 하 여: 열-735, 풀-100, 110, 시간-속도 150, 압력-400.
  2. PSW 50 mL에 4% 스 솔루션을 준비 합니다.
    1. 스의 1 g 추가 (점도: 1500 cP) PSW의 50 ml.
    2. 스의 해체를 촉진 하기 위하여 적어도 8 h 4 ° C에서 품 어.
    3. 실 온에서 4% 스 솔루션을 유지.
  3. 인하를 수행한 후 셀 파편을 저장 하기 위한 자리 유리 접시를 준비 합니다.
    1. 필터 미디어는 건강 한 문화, 잘 필요한 자리 유리판 당 500 mL를에서 소독.
    2. 필요한 우물의 각 소독된 미디어의 500 mL를 전송 합니다.
  4. 2 µ L 방울에 한 건강 한 Stentor (정의 된 트럼펫 모양, 선명한 블루-그린 색상, 그리고 더 큰 그들 데)를 수집 하 고 coverslip 또는 슬라이드에 배치. 4% 스 (그림 2)의 2 µ L를 추가 합니다. Stentor (동영상 2) 절단 하기 전에 천천히 하자.
  5. 바늘을 침입을 방지 하기 위해 가능한 절단 표면에 평행으로 유리 바늘을 잡으십시오.
  6. 해 부 현미경 스테레오를 사용 하 여 유리 바늘의 팁 찾아서 셀 (그림 3A)에 가까이 이동 합니다. 바늘 (그림 3B와 C)과 접촉 시 Stentor 계약을 관찰 합니다.
    참고: 셀이 어려운 후부 끝에서 앞쪽 끝을 분리 하는 방향으로, 회전 그것은 매우 부드럽게 바늘의 측면.
  7. 조심 스럽게 두 셀을 잘라 유리 바늘의 측면과 Stentor 계약된 누릅니다(그림 3D 및 E, 비디오 3). 2 개의 파편 떨어져 그들을 피하기 위해 조각 퓨전 사이 세포질 연결 되도록 이동 (그림 3 층).
  8. 두 조각 간접 조명 해 현미경 파편을 검사 하 여 각 하나 이상의 macronuclear 노드를가지고 여부를 확인 합니다.
    참고: macronuclear 노드를 하나 이상 갖는 세포 생존을 위해 필수적입니다. 셀 수 있습니다 동안 이나 컷 청록색 안료와 함께 자사의 박막 (투명 셸) 창. 대부분의 경우에서이 셀의 장기적인 생존 능력 영향을 주지 것입니다.
  9. 준비 단계 2.3에서 유리 자리 접시의 우물에 조각을 이동 합니다.
  10. 잘라 셀의 일부분을 다시 생성 하지 것입니다 때문에 여러 셀을 잘라.
  11. 한 세션에서 여러 컷을 수행 하는 경우 대체 유리 바늘 Stentor 잔류물 또는 팁 깨졌습니다 코팅 무 겁 게 된다 때. 또는 부드럽게 실리콘 스페이서의 조각에 그것을 닦아 하 여 바늘을 청소.
    참고: 유리 바늘 여러 셀 절단 세션 사용할 수 있습니다.
  12. 습도 챔버에 세포 파편 자리 유리판을 유지.
  13. 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 결과의 해석을 진행 합니다.

3. Membranellar 밴드 및 자당 또는 요소 치료 구강 장치의 재생을 유도

  1. 자당을 사용 하 여 Membranellar 밴드와 구강 장치 제거
    1. PSW에 자당의 25% 솔루션을 준비 합니다.
    2. PSW에 스냅 캡 microcentrifuge 튜브 25% 자당의 500 µ L를 추가 합니다.
    3. 자당 치료 후 셀을 세척을 위한 3 microcentrifuge 튜브 각 튜브에 PSW의 1 mL와 스냅 모자를 준비 합니다.
    4. 1 mL 피 펫 (그림 4, 화살표 A)를 사용 하 여 별도 microcentrifuge 관으로 그들의 문화 미디어의 1 mL에 30-60 Stentor 세포를 수집 합니다.
    5. 125 µ L 최종 볼륨 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 단일 무승부에에 튜브에서 모든 세포를 수집 합니다. 20% 자당 솔루션 (그림 4, 화살표 B)의 625 µ L를 25% 자당 (단계 3.1.2에서에서 준비)의 500 µ L로 튜브를 그들을 전송. 스톱 워치를 시작 합니다.
    6. 이 20% 자당 해결책에 톡-스핀 1 분 동안 랙에서 microcentrifuge 튜브 Stentor 를 품 어.
    7. 하나의 무승부에 있는 모든 셀을 수집 (쉽게 컬렉션에 대 한 200 µ L 최대 용량 피펫으로 조정).
    8. 초시계 자당 치료의 2 분 표시 될 때까지 피 펫 팁에 셀을 계속.
    9. Microcentrifuge 튜브 3.1.3 (그림 4, 화살표 C) 단계에서 준비의 하나로 Stentor 를 꺼냅니다. 영화-스핀 랙에서 튜브입니다.
    10. 두 번 더, 한 번 PSW를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 남은 두의 각 준비 단계 3.1.3 (그림 4, 화살표 D와 E)에서 세포를 씻어.
      참고: 단일 그리기 셀 컬렉션 기술은 세척 사이 중요 하지 않습니다.
    11. 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 역학 (그림 4, F와 G 화살표)의 해석을 진행 합니다.
  2. 요소를 사용 하 여 Membranellar 밴드와 구강 장치 제거
    1. PSW에 4% 우 레 아의 솔루션을 준비 합니다.
    2. PSW에 스냅 캡 microcentrifuge 튜브 4% 우 레 아의 300 µ L를 추가 합니다.
    3. 셀 요소 처리 후 세척을 위한 각 관에서 PSW의 1 mL를 포함 하는 스냅인 모자 3 microcentrifuge 튜브를 준비 합니다.
    4. 1 mL 피 펫 (그림 4, 화살표 A)를 사용 하 여 별도 microcentrifuge 관으로 그들의 문화 미디어의 1 mL에 30-60 Stentor 세포를 수집 합니다.
    5. 300 µ L 최종 볼륨 1 mL 피 펫을 사용 하 여 단일 무승부에에 튜브에서 모든 세포를 수집 합니다. 2% 요소 솔루션 (그림 4, 화살표 B)의 600 µ L를 그들 4% 우 레 아 (단계 3.2.2에서에서 준비)의 300 µ L와 튜브 전송. 스톱 워치를 시작 합니다.
    6. 이 2% 우 레 아 해결책에 톡-스핀 1 분 동안 랙에서 microcentrifuge 튜브 Stentor 를 품 어.
    7. 하나의 무승부에 있는 모든 셀을 수집 합니다.
    8. 초시계 요소 치료의 2 분 표시 될 때까지 피 펫 팁에 셀을 계속.
    9. 3.2.3 (그림 4, 화살표 C) 단계에서 준비 microcentrifuge 튜브의 하나로 Stentor 를 꺼냅니다. 영화-스핀 랙에서 튜브입니다.
    10. 두 번 더, 한 번 PSW를 포함 하는 microcentrifuge 튜브 남은 두의 각 준비 단계 3.2.3 (그림 4, 화살표 D와 E)에서 세포를 씻어.
      참고: 단일 그리기 셀 컬렉션 기술은 세척 사이 중요 하지 않습니다.
    11. 이미징에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 4와 Stentor 재생 역학 (그림 4, F와 G 화살표)의 해석을 진행 합니다.

4. 이미징 및 세포 재생 분석

  1. 교수형을 사용 똑바로 현미경을 사용 하 여 개별 셀의 이미지 재생 방울 방법.
    1. 유리 자리 접시의 우물에 PSW의 100 µ L를 넣어.
    2. 문화 미디어 (그들은 미디어)의 4 µ L에 1 Stentor 셀을 분리, 플라스틱 10 또는 20 µ L를 사용 하 여. 22 x 22 m m2 coverslip (그림 5)의 한가운데에 작은 물방울을 예금 한다.
      참고: 경우 셀에는 1) 건강에 해로운 (비정상적으로 모양 또는 무 겁 게 vacuolated) 또는 2) 아직도 membranellar 밴드 또는 구강 기관 (대 한 화학 치료 실험), 이미징에 사용 하지 마십시오.
    3. 작은 물방울 사이 충분 한 공간을 떠나 하는 동안 이전 방울 주위 문화 미디어에서 Stentor 4 더 많은 방울을 정렬 합니다.
    4. 방울과 coverslip 반전 하 고 부드럽게 된 PSW 단계 4.1에서 추가 된 유리 자리 접시의 잘 위에 그것을 배치.
    5. 참고: PSW 우물에서 물방울 (그림 5)의 증발을 최소화 합니다.
    6. 4.1.4 4.1.1-단계에 따라 영상에 대 한 나머지 셀을 준비 합니다.
    7. 재생 셀 원하는 시간 분해능으로 현미경 이미지. 또는 재생 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 관찰 합니다.
      참고: 재생 셀 절단 또는 자당 또는 요소와 치료 후 즉시 시작 됩니다. 그러나, 보이는 새로운 구강 구조는 중생의 시작 후 약 3 h를 형성할 것 이다.
  2. 각 시간 지점에 대 한 각 셀의 3 개의 재생 단계 중을 할당 합니다. 이렇게 하려면 (그림 4그림 6) 단계를 설명 하는 대표 이미지를 각 셀을 비교 합니다.
    1. 1 단계는 membranellar 밴드 아직 (그림 6A)가 없는 셀에 할당 합니다.
    2. 2 단계 membranellar 밴드와 셀에 할당 합니다.
      참고: membranellar 밴드 (그림 4, 그림 6B) 치료 후 3-6 h에 나타납니다. 이 단계의 끝부분에 membranellar 밴드의 후부 끝의 추가 곡률 구두 primordium 나타납니다 하기 바로 전에 표시 됩니다.
    3. 3 단계 구강 primordium 셀에 할당 합니다.
      참고: 구두 primordium membranellar 밴드 (그림 4, 그림 6 c 6 d)의 후부 끝에 치료 후 6-8 h를 표시 하는 invagination입니다. 재생 세포는 그들의 앞쪽 끝과 특성 트럼펫 셀 모양 (그림 4, 그림 6E) membranellar 밴드 때 완료 됩니다. 대부분 Stentor 세포 재생의 시작부터 8-9 h 이내 완전히 재생성 됩니다.
  3. 각 스택된 상자 그림 (그림 7)의 형태로 각 시간 지점에 대 한 재생 단계에 있는 세포의 백분율을 플롯 합니다.
    참고:이 유형의 플롯 셀의 인구에서 재생 역학의 시각화 수 있습니다.

Representative Results

Stentor 문화를 안정적으로 설립 하 고 개별 셀 또는 셀 조각을 사용 하는 프로토콜의 섹션 1에서 유지 되었습니다 있다. 큰 건강 한 문화에 대 한 대표적인 예제 비디오 1에 표시 됩니다.

중생의 시간 과정 Stentor 시작 단계 3.1, 이미징 및 제 4 (그림 7)에서 설명 하는 분석 방법에서에서 설명 하는 재생에 대 한 자당 치료 방법을 사용 하 여 측정 했다. 이 음모는 어떤 특정 단계에 도달 하 셀의 인구에 의해 걸린 시간에서 한 시간 동안 확산 임을 나타냅니다. 이러한 유형의 분석 셀 회생의 인구에서 재생성 과정에서 시간적이의 연구를 수 있습니다.

다음은 지금까지 수십 자당 치료 (그림 4그림 6) 후 관찰 되었습니다 재생 타이밍의 요약 이다. (이 단계는 자당 희미하게 직후 시작) 어떤 membranellar 밴드 없이 눈물 처럼 Stentor 셀 1 단계 때. 이 단계는 3-6 h. 단계 2는 membranellar 밴드 나타나고 (자당 치료 후 3-6 h) 성장 하는 때 지속 된다. 이 단계는 3-4 h. 3 단계 구강 primordium membranellar 밴드 (자당 치료 후 6-8 h), 후부 끝에 나타나고 두 구조는 셀의 앞쪽 끝으로 이동 하는 경우에 대 한 지속. 이 단계는 1-2 시간 지속 된다. Membranellar 밴드와 구강 장치 셀의 앞쪽 끝에 도달 하면,이 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 특성 Stentor 트럼펫 모양을 채택 했다. 셀 자당 치료 후 완전히 거듭난된 8-9 h를 했다.

Figure 1
그림 1입니다. 스냅숏 Stentor의. Membranellar 밴드와 구강 장치는 세포의 앞쪽 끝에 표시 됩니다. holdfast 셀의 후부 끝 이다. Stentor macronucleus nodulated입니다. 잘 먹이 Stentor 녹색 식품 그들 주로 Chlamydomonas를 포함 하는. 눈금 막대는 0.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. Stentor 절단 설정. 셀 절단 수동으로 상용 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 셀을 보는 동안 유리 바늘을 조작 하 여 수행 됩니다. 티슈 페이퍼의 목적은 흰색 배경에 더 나은 셀 참조를 제공 하는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 비디오 3 유리 바늘 Stentor 를 잘라 하는 방법을 보여주는 스냅샷. (A) A Stentor 직전 바늘 접촉 그것. (B) A Stentor 바늘과 유리 슬라이드 사이 부드럽게 압착. (C) A 계약 Stentor 바늘의 힘에 반응. (D) A Stentor 눌러 부드럽게 셀에 바늘의 측면으로 절단 되 고 (E) A Stentor 하지만 지금 두 잘라 분리 되지 않는다. (F) 두 개의 Stentor 파편. 눈금 막대는 0.25 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 제 3과 제 4 프로토콜의 구조 시각화. 이것은 자당 또는 요소 치료 및 세포 재생의 관찰을 수행 하기 위한 그림된 프로토콜 이다. 하단 패널에 표시 된 시간 세척 1의 시작에서 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. 똑바로 현미경으로 중생의 이미징 및 직접 관찰에 대 한 설정. 각 4 µ L 드롭릿은 coverslip에서 매달려, 한 세포 재생을 겪고 있다. 유리 자리 접시의 우물에 물 방울의 증발을 제한합니다. 이 설정을 동시에 여러 세포의 재생에 따라 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6입니다. Membranellar 밴드와 구강 장치 재생의 각 단계에서 Stentor 의 스냅샷. 1 단계 (A) 눈물 모양의 셀 모양 및 membranellar 밴드의 부재에 의해 특징입니다. (B) 단계 2 속눈썹 기반 구조를 지속적으로 뛰는 membranellar 밴드의 외관 특징 이다. Membranellar 밴드 패널 B에에서 흰색 파선으로 표시 됩니다-디 (C, D) 3 단계 구강 primordium (화살표 표시)의 외관에 의해 특징입니다. 구두 primordium membranellar 밴드의 뒤 끝에는 invagination 처럼 보인다. 구두 primordium 됩니다 다음 구강 장치 될 셀의 앞쪽을 향해 이동 합니다. (E) 재생 셀 Stentor 트럼펫 모양, 특성을 채택 했다 하 고 구강 장치 (화살표 표시) 셀의 앞쪽 끝에서 확대가 완료 됩니다. 눈금 막대는 0.25 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7입니다. 스택 상자 플롯 표시 어떻게 자당 치료 후 재생의 모든 단계에서 세포의 비율 시간이 지남에 변경. 음모 재생 세포의 인구 내의 재생 단계의 타이밍에서이 보여 줍니다. "최종 등록" 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 개수: 28. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Movie 1
비디오 1입니다. 건강 한 Stentor 문화의 예. 일반적으로, 문화는 집중, 문화를 나누는 것이 좋습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

Movie 2
비디오 2입니다. 스와 Stentor 늦추고. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

Movie 3
비디오 3입니다. 절단 Stentor. 개별 셀 수동으로 스테레오 현미경 셀 통해 유리 바늘을 눌러 해 부 아래 여러 조각으로 잘릴 수 있다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)

문화에 대 한 문제 가능한 치료 가능한 예방
문화는 rotifers 또는 다른 큰 유기 체에 의해 압도 됩니다. 새로운 문화 접시에 가능한 많은 Stentor 를 제거 합니다. 다음 셀 세 번 세척. 상용 공급 업체에서 구입 하는 경우에, 그들을 받을 때 Stentor 를 철저히 씻으십시오.
문화는 곰 팡이 또는 다른 작은 유기 체에 의해 압도 됩니다. 식별 코너는 최소한 Stentor. 그 지역에서 많은 Stentor 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW에 추가 합니다. 섞어 부드럽게 하지만 완전히 distrubute에 침입 유기 체. 다음 먹이 생략 하 고 Stentor 그들을 먹을 것 이다. 문화를 정기적으로 관찰 하 고 신선한 PSW에 대 한 미디어를 교환 하 여 작은 오염 물질을 제거.
Stentor 서로 위에 누워 있다. 농도 20 셀/mL 문화를 분할. 더 자주 문화를 분할.
Stentor 셀 결합 됩니다. 5 일 마다 대신 4 일 마다 피드.
문화는 어두운 폐기물의 많은 있다. 어두운 소재, 셀을 제거 하지 않고 가능한 Stentor 폐기물의 제거. Stentor 어두운 소재에 장착 하는 경우 위쪽 및 아래쪽으로 그들의 낭비에서 Stentor 세포를 다음 셀을 제거 하지 않고는 쓰레기와 함께 미디어를 제거 플라스틱. 또는, 그 Stentor 제거 하 고 그에 따라 피드 덜. 피드 Stentor 음식 문화의 100 mL 당 적은 1 mL.
유해한 수준의 vacuolated/비 대 한 (둥근) Stentor. 많은 Stentor 세포를 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW를 추가 합니다. 미디어를 정기적으로 교환 합니다.

표 1입니다. Stentor경작에 대 한 문제 해결 가이드입니다.

Discussion

경작 Stentor 다양을 한 도전 선물 한다. 첫째, 세포의 많은 수를 필요로 하는 실험을 수행 하기 위해 하나 Stentor 농도 20 셀/mL을 초과 하면 건강에 해로운 될 문화로 Stentor 문화의 많은 수를 유지 해야 합니다. 둘째, 자주 Stentor 문화를 오염 수 생물 Stentor 보다 빠르게 분할 하 고 (일반적인 오염 물질은 rotifers) 문화를 압도. 따라서, 그것은 현미경으로 문화를 주기적으로 검사 하 고 오염 물질을 제거 하는 데 필요한입니다. 때때로, 새로운 문화는 오염 된 문화에서 수동으로 구출 하는 세포의 작은 숫자에서 시작 될 필요가 있다. 이 건강 한 Stentor 문화를 유지 하는 데 필요한 시간이 증가 합니다. 셋째, 단일 셀 400 mL 문화 확대 필요 합니다 적어도 한 달 Stentor 세포 주기는 3-5 일 때문에. 넷째, 다른 모델과 달리 ciliates Stentor 드물게 낭종에가 하 고 그들은 동결 수 없습니다 키를 누릅니다.

Stentor 경작의 중요 한 측면의 적절 한 음식 유 기체의 선택 이다. Stentor 경작을 위한 다양 한 방법은 설명 이전 했다. 그들 중 하나를 사용 하 여 탈지 우유 Stentor피드 박테리아 문화 제안 합니다. 이러한 기술은 Stentor; 경작에 효과적입니다. 그러나, 게놈 기술 응용 프로그램에서 정의 되지 않은 식품 생물 게놈 읽기에서 발생 하는 혼동을 피하기 위해 순수 샘플을 요구 한다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, Stentor 질량에서 성장 될 수 있다 고, 그들의 음식, Chlamydomonas, 시퀀싱 되었습니다 때문에 genomic 오염 식품 유기 체에서 존재 수 수 감지 제어. 알 수 없는 이유로 타르 타르 어디 그가 발견 하기 전에 Stentor 반환 하 여 그의 주식을 보충 했다. 현재 프로토콜 우리 Stentor 수년간 계속 할 수 있게 되었습니다.

Stentor 재생 실험은 일반적으로 간단 하지만 마음에 계속 몇 가지 중요 한 세부 사항. 섹션 2에 관한 Stentor 절단 절반 세포 분에 마스터 수 있습니다. 마스터링 Stentor 의 고급 미세 절차 연습 주가 필요할 수 있습니다. 동안 때 자당 치료 다음 수행 됩니다에 대 한 10-30에 의해 부 화 시간을 증가 (제 3), 영상 시작 되는 시점에 대부분 셀 아직도 있다면 그들의 membranellar 밴드 자당 또는 요소 처리를 수행. 3 분 보육 넘어 자당 치료의 시간 그것은 세포 죽음 귀 착될 것 이다 때문에 늘리지 마십시오.

Stentor 의 영상 재생 시간의 오랜 기간 동안 이미지 큰 셀에 방법을 필요 합니다. 섹션 4에 이미징 방법만 똑바로 현미경으로 사용할 수 있습니다. 거꾸로 현미경 대신 사용할 수 있는 경우, 셀 슬라이드 또는 작은 챔버에 coverslip에 배치할 수 있습니다. 한 가지 방법은 증발을 방지 하기 위해 다른 coverslip와 석유 젤리와 커버 챔버를 만드는 것입니다. 또는 개별 셀에 대 한 챔버 1 x 1 cm2 실리콘 스페이서의 평방에 원하는 크기의 구멍 펀치 구멍을 만들어 할 수 있다 (테이블의 재료)는 coverslip에는 스페이서를 배치, 셀 챔버 그리고 다른 coverslip와 챔버. 이미징, Stentor 중생의 각 단계의 특성을 관찰 하는 올바른 방향에 있지 않은 경우 때 셀 계약을 확고 하 게 접시를 누릅니다. 중생의 단계를 식별 하는 확장 셀 보고 (전체 확장 소요 약 45 s). 셀이 잘못 된 방향에 있는 아직도, 두드리는 반복 합니다. 그림 1그림 6 에 표시 된 이미지는 스테레오 줌 현미경;로 찍은 그러나, 모든 실험 상세한 해 부 실체 현미경 X 5를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

경작 및 이미징 Stentor 외 또 다른 도전을 재생, 특히 단계를 식별 하는 데 필요한 시간의 양의 추적 이다. 완벽 하 게 명확 하 게 보이는 구두 primordium의 지역 중심 재생 셀 이면 무대의 몇 초 걸립니다. 그러나 가끔은,, Stentor 셀 재생 단계, 따라서 식별 하기 위해 더 많은 시간을 복용의 명확한 임무를 방지 하는 방향에서입니다. 상당한 양의 무대 개별 재생 셀 모든 재생 세포, 따라서 감소 하는 준비 하 고 기다려야 관찰자 요구의 시간 정밀도의 정량화를 지연 시킬 수 및 다시 후 셀 이동 이미지 하는 데 필요한 시간 새로운 방향입니다. 따라서,이 실험은 모두 시간과 노동 집약. 이러한 이유로, 그것은 매우 바람직한 Stentor 세포를 감지 하 고 비디오 현미경 데이터에는 중생의 단계 할당에 대 한 자동화 된 방법을 개발 하는 것입니다. 이들은 또한 더 재현 실험에 대 한 허용 샘플 크기와 인간의 편견의 제거에서 증가 한다.

매우 민감한 genomic와 proteomic 방법의 출현은 단일 세포의 연구 범위에 넣어 하기 시작 했다. 이러한 단일 세포 분석 Stentor 셀의 거 대 한 크기 네요 개념 증명 실험에 대 한 바람직한 테스트 주제. 가능, 같은 실험에 대 한 기본적, 이다 Stentor 경작 하 고 그래서 여기에 설명 된 방법을 더 고급 단일 셀 기술의 추가 개발 역할을 담당할 해야.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH R01 GM113602 (WFM) 보조금과 NSF 1144247 (알)에 의해 지원 되었다. 우리 인정 마크 Slabodnick 나탈리 커 클 랜드 이러한 프로토콜 중 일부의 초기 버전을 개발 하 고 유익한 토론 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 카 리 나 Perlaza 및 Greyson 루이스 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stentor coeruleus live culture Carolina Biological Supply 131598
Chlamydomonas reinhardtii on agar Carolina Biological Supply 152040
Pasteurized springwater, 1-quart bottle Carolina Biological Supply 132458
Methyl cellulose, 1500 cP Millipore Sigma M0387
Pyrex glass spot plate Fisher Scientific 13748B
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL Carolina Biological Supply 715740
2-cup glass container with glass lid Pyrex 1095600
CultureWell silicone sheet material Grace Bio Labs 664475
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube Denville C2170
Cover Glass Fisher finest 12-548-B
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture ThermoFisher A1379801
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm Grace Bio Labs 664475
Petrolatum, Petroleum Jelly, White Spectrum P1037
Borosilicate glass capillary tubes.
OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.
Sutter Instrument B120-90-10
Needle puller P-87 Sutter Instrument
Stemi 2000 stereo microscope Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscope Zeiss

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References

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