매핑 대사: 조직에서 직접 젖 산 효소 활동 모니터링

Biochemistry

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Summary

우리 nicotinatmide 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NAD(P)H) + H + 조직 샘플에서 직접 생성 하는 효소 효소 활동의 공간적 분포를 매핑하기 위한 프로토콜 설명.

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Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

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Abstract

공간과 시간에 효소 활동을 매핑 하는 것이 정상 조직과 질병에서 셀 동작의 분자 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다. 신진 대사 활동 분석 실험 현장에 는 조직 내에서 신진 대사 활동의 공간적 분포에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기 조직 샘플에서 직접 효소 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 젖 산 효소 포도 당 소비 호 기성 또는 혐 기성 해당 분해를 통해 에너지로 변환 하는 것입니다 여부의 중요 한 결정 이다. 젖 고 나드를 포함 하는 솔루션은 냉동된 조직 섹션에 제공 됩니다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) NADH를 검출 될 수 있다 양성자의 감소에 따라 제공 하는 동시에 변환 하는 동안 높은 젖 산 효소 활동에 포함 된 셀 pyruvate에 제공 된 젖 산을 변환 됩니다. nitrotetrazolium 블루 침전으로 시각화 formazan 블루. 우리는 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜을 적용, 우리는 젖 산 효소 활동은 높은 무부하 머리 여 포 줄기 세포는 피부 내에 발견. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 보다 배양된 미 발달 줄기 세포에서 높은 얼룩 공개 교양된 마우스 배아 줄기 세포를 적용 하는 프로토콜. 갓 절연된 마우스 대동맥의 분석 계시 수직 대동맥 평활 근 세포에 얼룩. 제공 하는 방법론 공간적으로 냉동 또는 신선한 조직에 양성자를 생성 하는 효소의 활동을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

있는 효소는 높은 또는 낮은 활동 조직 내의 위치를 이해 하는 것은 이해 개발 및 생리학에 대 한 필수적입니다. 사본 또는 단백질 레벨은 효소 활동에 대 한 대리 모 알선으로 자주 사용 된다. 이러한 연구는 유익 수 있습니다, 그들은 포스트 번역 상 수정, 단백질 복합물, 또는 효소의 subcellular 지 방화의 존재 하는 효소의 활동을 결정 하기 위한 중요 한 수 있는 정보를 제공 하지 않습니다. 효소 활동은 직접 측정 하는 경우 더 이상 높은 또는 낮은 활동은 조직 내에서 혼합물 또는 셀의 공간 분포 내에서 개별 셀에 대 한 정보를 포함 하는 무 균된 단백질 lysates에 자주 모니터링 합니다.

여기는 조직 샘플 내에서 효소 활동의 공간 배급을 매핑하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 방법론은 tetrazolium 염 dehydrogenases, reductases, 및 냉동된 조직1에서 oxidases의 활동을 지역화를 사용할 수 있습니다 설명 하는 이전 연구를 기반으로 합니다. 이러한 방법으로, 물 불용 성 formazan 형성 때 양성자 tetrazolium 소금2,3에 전송 됩니다. 포도 당-6-인산 효소는 NADPH와 양성자, 생성 하 고 tetrazolium 활동 감지 되었습니다. 포도 당-6-인산 효소는 유럽 넙치 hepatocytes4, 폐5 의 2 형 폐 포 세포와 신장5nephrons에서에서 모니터링 되었습니다. Tetrazolium 소금 또한 냉동된 조직6transketolase 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 비슷한 접근 방식은 최근 인접 한 슬라이드7에 동일한 조직에 여러 개의 dehydrogenases의 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었다.

여기 tetrazolium 염을 사용 하 여 (그림 1) 젖 산 효소 활동의 공간적 분포를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 젖 산 효소 분해 젖이 나올, 하 고 역 반응에 의해 생성 된 pyruvate를 변환할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 결과적으로 그것의 분 비로 젖이 나올 대 tricarboxylic 산 주기로 pyruvate의 입구를 결정 하는 중요 한 이다. 젖 산 수치 종종 다양 한 질병 이나 상해는 손상 된 세포와 효소가 릴리스 되었습니다 나타낼 수 있기 때문에 암8,,910를 포함 하 여 질병을 진단 하는 데 사용 됩니다.

4 젖 산 효소 유전자를 있다: LDHA, LDHB, LDHC, 및 LDHD11. LDHA와 LDHB는 초기 LDHA 유전자12의 중복에서 발현 생각 된다. LDH는 tetramer로 활성 이며 LDHA 및 LDHB homotetramers와 함께 heterotetramers를 형성할 수 있다. LDHA LDHB는 젖 산에 대 한 높은 선호도를 보고 pyruvate13우선적으로 젖 산을 변환 하는 동안 pyruvate에 대 한 높은 선호도가지고 보고 있다. LDHA 발기인 HIF1α, cMYC 및 FOXM1 녹음 방송 요인11에 대 한 바인딩 사이트를 포함 되어 있습니다. 또한, 같은 많은 다른 glycolytic 효소14,15, LDH 포스트 번역 상 수정에 의해 수정할 수 있습니다. 섬유 아 세포 성장 인자 수용 체 1 Y10 tetramer 형성을 촉진, 또는 NADH 기질 바인딩16촉진 Y83 LDHA phosphorylate 수 있습니다. LDHA acetylated17수도 있습니다. 이러한 이유로, LDH 활동의 완전 한 이해 LDH 단백질 수준, 하지만 효소의 활동 뿐만 아니라 모니터링 해야 합니다.

우리가 여기에 제시 하는 메서드와 다른 접근 젖 산 효소 활동을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 무 균 단백질 lysate spectrophotometrically 젖 산 효소 활동을 모니터링할 수 있습니다. NADH 생성 젖 산 pyruvate 변환으로 측정 될 수 있다 340 흡 광도에 따라 nm, 동안 pyruvate는 젖 산18변환으로 NADH의 실종을 모니터링할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동은 또한 자기 공명 영상 (MRI)와 모니터링 되었습니다. 13 C-pyruvate를 관리할 수 있습니다 하 고 젖이 나올에 pyruvate의 변환의 비율으로 감시 될 수 있다 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate. 상승의 비율 [1-13C] 젖이 나올 / [1-13C] pyruvate 암 조직19에서 관찰 되었습니다. MRI-기반 접근 정상에 젖 산 효소 활동과 질병 조직에 정보를 제공할 수 있습니다, 하는 동안 방법론 특정 셀에 활동 수준을 결정 하는 데 필요한 해상도 있지 않습니다. 여기에 제공 된 방법론은 조직 영역에서 단일 셀에도 젖 산 효소 활동에 정보를 제공할 수 있습니다.

현장에서 활동 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 젖 산 효소의 활동은 마우스 피부20의 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 높은 발견. 우리 또한 사용 방법이 경작된 한 배아 줄기 세포에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 활동은 피더 계층 보다는 줄기 세포에서 발견. 마지막으로, 우리는 신선한 마우스 대동맥에서 젖 산 효소의 활동을 모니터링 하 고 부드러운 근육 세포에 얼룩이 관찰. 우리 여기 냉동된 마우스 피부에서 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

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Protocol

설명 하는 모든 실험 동물 관리 위원회, 로스 앤젤레스가 주 대학에 의해 승인 되었다.

1. 냉동된 마우스 스킨의 슬라이드 생성

  1. 기관 정책에 따라 마우스를 안락사
    참고: 보호에 대 한 제도적 정책을 따릅니다. 동물 관련 된 모든 프로토콜 기관 동물 관리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다.
  2. 동물 털 트리머 사용 마우스의 머리를 제거 합니다.
  3. 가 위를 사용 하 여 피부에 절 개를 확인 합니다. 집게를 사용 하 여 마우스에서 피부를 들어올립니다. 멀리 피부 섹션을 잘라가 위를 사용 하 여.
  4. cryomold 복합 시 약 동결을 채우십시오 ( 재료의 표참조).
  5. 바늘 코 집게를 사용 하 여 채워진된 cryomolds에 장소 피부 섹션입니다. 동양 피부 있도록 조직 조각 표 피에서 진 피, hypodermis와 근육 (그림 2)에 피부의 횡단면을 생성 합니다.
    참고: 가능 하면 실험 탑재 하 고 동일한 슬라이드에 구분 하 고 함께 처리 수 있도록 동일한 cryomold에서 함께 마우스 제어. 거품을 만드는 것이 아니라는 것을 주의.
  6. 드라이 아이스는 얼음 양동이에 블록의 평평한 표면에 cryomold를 배치 하 고 고정 하자. 스킨의 방향을 관찰을 계속 합니다. 필요한 경우 조정 합니다.
    참고: 드라이 아이스를 처리할 때 극저온 장갑 착용.
  7. Cryomolds 스토리지-80 ° C 냉동 고로 전송 합니다. 샘플 효소 활동의 상당한 손실 없이 약 3 달 동안 냉장고에서 유지할 수 있습니다. 냉동된 섹션을을 건조 하지 마십시오.
  8. -20 ° C, 7-10 µ m 두께 최고의 피부 형태학21에 대 한 섹션을 만들을 슬라이스 조직 한 cryostat 사용 하.

2. 얼룩에 대 한 슬라이드 준비

  1. 시험 될 슬라이드 집합을 설정 합니다. 나드 보류 될 것입니다 어떤 컨트롤 슬라이드를 포함 하 고 다른 컨트롤에 슬라이드 기판, 젖이 나올, 보류 될 것 이다. 냉동된 조직 블록 이전 조사에서 긍정적인 제어 슬라이드를 포함 합니다.
  2. 짧게 수정 피부 4% 포 르 말린 5 분에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드 슬라이드, 또는 4% 포 르 말린의 pipetting 1 mL로 슬라이드 4% 포 르 말린을 포함 하는 컨테이너를 찍기 하 여 여러 슬라이드를 처리할 때.
    참고: 고정 피부 않습니다 하지 껍질을 슬라이드에서 다음 절차와 보존 피부 형태학 동안 지킬 것 이다.
    주의: 포 르 말린은 발암 물질과 유해; 장갑을 착용, 그것은 당신의 피부 및 화학 증기 두건에서이 단계를 수행 하지 마십시오.
  3. 적어도 1 mL의 인산 염으로 세척 슬라이드 버퍼링 염 분, pH 7.4, 슬라이드 당 pipetting 또는 수영.

3. 준비 솔루션 얼룩

  1. 젖 산 효소 활동 얼룩에 대 한 소용돌이 함께 시 약 (50 mM Tris pH 7.4, 750 µ M NADP, 80 µ M phenazine methosulfate (PMS), 600 µ M 블루 nitrotetrazolium 염화 물, 그리고 30mm 젖) 얼룩의 크기에 따라 적절 한 크기의 튜브에 필요한 솔루션입니다.
    참고: 1 mL는 완전히 하나의 슬라이드를 커버 하기에 충분.
  2. 있는 모든 시 약은 나드 제외 하 고 존재 하는 두 번째 솔루션을 준비 합니다. 모든 시 약은 젖 산을 제외 하 고 존재 하는 세 번째 솔루션을 준비 합니다.

4. 슬라이드 솔루션 얼룩에 알을 품으십시오

  1. 부드럽게 피펫으로 얼룩 솔루션 또는 전체에서 섹션을 다루는 준비 슬라이드에 제어 솔루션 (1 mL입니다 한 슬라이드에 대 한 충분 한). 여러 슬라이드를 함께 처리 되는 경우 동시에 얼룩 솔루션으로 모든 슬라이드를 찍어 (컨테이너는 완전히 조직 단면도 커버에 충분 한 해결책 확인).
  2. 어둠 속에서 37 ° C에서 습도 환경에서 슬라이드를 품 어. 슬라이드 위에 솔루션 얼룩 경우 증발을 방지 하기 위해 습도 환경에서 슬라이드를 놓습니다.

5입니다. 모니터 슬라이드

  1. 모니터링 검사에 의해 파랑 클리어에서 얼룩 솔루션의 변환 합니다. 샘플 blueness의 원하는 수준에 도달, 얼룩 솔루션을 제거 하 여 반응을 중지 합니다.
    참고: 피부를 위한 10 분은 충분 합니다. 에 오르간과 효소 활동에 따라 달라 집니다.
  2. Pipetting으로 인산 염 버퍼 식 염 수와 슬라이드를 린스 (1 mL는 각 슬라이드에 대 한 충분 한) 또는 찍기.
    참고: 서로 게 비교 될 것입니다 모든 샘플 유지 되어야 합니다 얼룩 솔루션에서 동일한 양의 시간에 대 한.

6. counterstain 및 마운트

  1. 피펫으로 슬라이드 슬라이드 blueness의 적절 한 수준에 도달 하는 때에 counterstain.
    참고: 빨간색 또는 녹색 핵을 설정 하는 Counterstains precipitant는 formazan에 의해 만들어진 블루와 좋은 대조를 제공 합니다.
  2. 수성 또는 비-수성 매체22장착 탑재. 설치 매체의 1 ~ 3 방울 (40-50 µ L)은 커버 슬립의 크기에 따라 충분 합니다.

7. 이미지 슬라이드 및 계량

  1. 가벼운 현미경 슬라이드 이미지. 실험의 사진 및 제어 샘플 및 10 배, 20 X 40 X 확대에 부정적인 모든 컨트롤을 가져가 라.
  2. 이미지 분석 소프트웨어는 서로 다른 영역에서 푸른 얼룩의 강도 결정 합니다.

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Representative Results

우리는 이전 제자리에 활동 분석 실험 마우스 피부20에 대 한 결과 보고 있다. 그림 3에서 같이, 우리는 절차는 위에서 설명한 때 머리 여 포의 기지에서 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 젖 산 효소 활동의 높은 수준을 다음 관찰. 이러한 결과 형광 활성화 된 세포 피부의 머리 여 포 줄기 세포에 대 한 정렬 및 정렬된 셀에 활동 분석 실험과 줄기 세포 구획에 높은 젖 산 효소 활동을 확인에 의해 뒷받침 했다.

머리 여 포 줄기 세포는 높은 젖 산 효소 활동 우리의 연구 결과 바탕으로, 우리 교양된 미 발달 줄기 세포의 연구를 확장. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 급지대 계층으로 혼자 또는 배아 줄기 세포의 존재를 분석 했다. 배양된 세포를 분석 하려면 매체 발음 했다, 그리고 셀 고정 짧게 되었고 위에서 설명한 솔루션 얼룩 젖 산 효소와 알을 품을. 우리 미 발달 섬유 아 세포 (그림 4) 마우스에 비해 배아 줄기 세포에 높은 젖 산 효소 활동을 관찰 했다.

우리 또한 갓 절연 조직 얼룩 프로토콜을 적용 했습니다. 마우스 aortas 해 부 되었고 오픈 슬라이스. 혈관이 개설 되었고 움직일 수 있도록 내부는 aortas의 루멘 접근 가능 했다. 샘플 행 크의 균형 소금 솔루션 트리톤-X 10 분, 10 분 젖 산 효소 솔루션 얼룩에 대 한 솔루션 얼룩 젖 산 효소와 다음에 대 한 신선한 조직에 적용 된 0.5% 포함 된 알을 품을 했다. 부 화, 후 이미지 부드러운 근육 세포 (그림 5)에서 얼룩 보여주는 수집 했다.

Figure 1
그림 1 : 젖 산 효소와 그것의 탐지의 화학 활동. 젖 산 효소는 pyruvate + NADH + H+NAD + 젖 산을 변환합니다. 생성 된 양성자 푸른 침전을 형성할 것 이다 formazan에 nitroblue tetrazolium을 줄어 듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Cryomolds에 마우스 피부 방향을의 도식. 각 컷된 섹션 전체 피부는 표 피, 진 피, hypodermis, 및 근육에서의 크로스 섹션을 포함 합니다 마우스 피부 cryomolds에서 동쪽으로 향하게 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 높은 활동을 계시 한다 젖 산 효소 마우스 피부 얼룩. 마우스 피부 cryomolds에서 냉동 고 incubated 젖 산 효소와 젖 산을 포함 솔루션 얼룩. 젖 산 효소 활동 머리카락 뿌리 줄기 세포에서 저명 했다. (A, B) 마우스 피부 젖 산 효소 활동 분석 결과의 두 가지 이미지. (C, D) 두 이미지 컨트롤 보류 기판 젖과 얼룩의. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 교양된 마우스 배아 줄기 세포에 높은 젖 산 효소 활동. 비친된 마우스 미 발달 섬유 아 세포 급지대 레이어에 성장 경작된 마우스 배아 줄기 세포는 젖 산 효소 활동에 대 한 분석 했다. 높은 활동 줄기 세포는 섬유 아 세포와 비교에서 관찰 되었다. 마우스 미 발달 섬유 아 세포와 조사 없이 얼룩의 유사한 수준을 보였다. 이미지는 20 X 목표와 함께 찍은. 눈금 막대 = 50 µ m. (A, B, D, E) 마우스 미 발달 섬유 아 세포 및 줄기 세포. (C, F) 마우스 미 발달 섬유 아 세포 혼자입니다. (A-C) 이미지는 솔루션 얼룩과 보육의 7 분 후 촬영 했다. (D-F) 이미지는 솔루션 얼룩과 보육의 20 분 후 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 주변 마우스 대동맥 평활 근 세포에 높은 젖 산 효소 활동. Aortas 안락사 쥐에서 분리 했다입니다. 배는 2 %paraformaldehyde 2 분 동안 고정 하 고 버퍼링 1 x 인산 염 분 3 x 10 분을 씻어. 배는 0.5% 트리톤 X와 인산 염 버퍼 식 염 수에 씻어 3 × 5 분 행 크의 균형 소금 솔루션 incubated 했다. 젖 산 효소 솔루션 얼룩 추가 되었습니다 고 샘플 37 ° C에서 10 분 동안 incubated 했다 3 x 5 분 x 1 인산 염 버퍼 식 염 수로 세척. 샘플 2 %paraformaldehyde 1 시간 동안 다음 고정 했다, 인산 염 버퍼 염 분 x 1 3 x 5 분 세차 및 몇 군데. (젖 산을 포함 하는 A) 젖 산 효소 솔루션. (B) 젖 산 효소 솔루션 없이 부정적인 제어로 젖 산. 각 섹션에 대 한 낮은 확대 이미지는 왼쪽에 있다 하 고 지정된 된 지역 오른쪽에 더 높은 확대와 함께 표시 됩니다. (A, B) 젖 산을 포함 하는 완전 한 젖 산 효소 솔루션 얼룩을 위해 사용 되었다. B는 젖 없이 이미지 A. (C, D) 젖 산 효소 솔루션에 지정 된 영역의 확대 이미지 부정적인 통제로 얼룩을 위해 사용 되었다. D는 C에 표시 된 영역의 이미지를 확대 A와 C는 20 X 목표와 함께 찍은 (눈금 막대 = 50 µ m) B와 D 40 X 목적으로 찍은 (눈금 막대 = 20 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기 설명 하는 방법은 젖 산 효소 또는 다른 세포 유형 조직 내에서 또는 시간이 지남에 따라 조직의 다른 부분에서에서 NADH 또는 NADPH를 생성 하는 다른 대사 효소의 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 젖 산 효소, 종양 줄기 세포의 생물학을 이해 하기 위한 중요 한 효소 이며 개별 셀에서 젖 산 효소 활동을 모니터 하는 능력이이 효소의 기능에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

이 프로토콜의 중요 한 장점은 다른 방법론에 비해 하나는 모니터 효소 활동, 보다는 그냥 단백질 풍부 하, 더 결정적인에 대 한 정보 뿐 아니라 어디 젖 산 효소 효소에에서 발생할 수 있습니다. 현재, 하지만 어디 그들은 실제로 기능. 여기에 설명 된 방법은 선택 된 단백질, 예를 들어, 셀 혈통 마커 수준은 젖 산 효소 활동으로 같은 조직 샘플에서 결정 되도록 immunohistochemistry와 결합할 수 있습니다. 젖 산 효소 활동을 모니터링 하기 위한 MRI-기반 접근, 비교 제공 하는 프로토콜은 큰 공간 해상도 제공 하 고 높은 효소 활동을 조직 내에서 특정 셀을 확인 하는 데 도움이 수 있는 이점이 있다 . Fluorogenic 기판에 따라 매핑 대사에 접근, 비교 설명 프로토콜 신호를 감지 하지 autofluorescence1에 의해 제한 됩니다. 밀러와 공동 저자 모니터링 formazan7로 변환 하 여 시간 의존 및 5 개의 다른 효소의 기질 의존의 유사한 분석을 수행. 반응 효소 반응의 화학 량 론 원리를 따라 발견 되었다. 밀러와 공동 저자 고유 미토 콘 드리 아 효소 미토 콘 드 리아 얼룩7공동 지역화 하 여 비-미토 콘 드리 아 효소에서. 그들은 subcellular 공동 지역화 분석7confocal 현미경 검사 법에 의해 따라 탐지 시 약 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium 염화 (CTC) 이용.

설명 하는 방법을 단점 또한 있다. MRI-기반 접근은 살아있는 유기 체에 사용할 수 있습니다, 설명 하는 방법은 냉동 또는 신선한 조직을 합니다. 냉동된 조직입니다만 적당 한 몇 개월 시간이 지남에 저하 효소의 활동 때문에 경우에 동결. 또한, 기판 초과에서 제공 하기 때문에 접근 제공 정보를 "활동 잠재력" 기판은 현재 가정. 기판의 수준을 제한 하는 경우이 분석 결과와 관찰 활동 배포 생리 적으로 발생 하는 활동의 금액에서 이탈 될 수 있습니다. 또한, 동일한 효소 활동을 수행 하는 동일한 효소의 다른 isoforms 경우 여기에서 설명한 메서드는 그들 사이 구별 하 수 없습니다. 예를 들어, 제시 하는 메서드는 LDHB 대 LDHA의 활동을 구분할 수 없습니다. 유전자를 사용 하는 것이이 문제 해결 방법 중 하나는 단일 효소 isoform는 유전자 활성화 마우스 설계.

우리는 PMS 실험, 전자 전송 NADH와 tetrazolium 사이 중재 하는 photochemically 안정 전자 캐리어23염료. 일부 과학자 들은 보고 있지만 PMS 포도 당 6 인산 염 효소 활동을 억제 하 고 PMS 인정5을 발견, 우리는 PMS 하 효소 지역화에 대 한 귀중 한 우리의 프로토콜에 포함 발견. 다른 저자는 폴 리 비닐 알코올을 사용 하 여 포도 당 6 인산 염 효소 효소1의 확산을 제한 보고 있다. 우리의 실험에서 우리는 도움이 될 폴 리 비닐 알코올을 찾지 못 했 하 고 그것을 제거.

몇 가지 단계는 얼룩이 지는의 성공을 위해 중요 합니다. 한 가지 중요 한 문제는 조직 샘플에서 cyromolds에 제대로 배치 됩니다 보장 합니다. 피부 섹션 평면을 조각 잘라 피부에 걸쳐 계획 되어야 한다. 또한, 여러 섹션 준비 될 경우, 이상적 이다 그래서 그들은 함께 같은 슬라이드에 슬라이스 수 같은 cryomold 내에서 포함 하는 경우. 이 cryostat 컷은 슬라이드의 두께 때문에 변이 제거 하는 데 도움이 됩니다. 그것은 또한 조직을 여전히 효소 활동을 유지 보장 하는 것이 중요입니다.

최고의 시간 반응 끝을 실험적으로 결정 되어야 합니다. 그것은 잠복기 동안 슬라이드를 밀접 하 게 모니터링 하 고 counterstain를 추가 하 고 푸른 얼룩의 강도에 따라 슬라이드 마운트를 적절 한 시기를 결정 해야 합니다. 샘플은 너무 가볍게 스테인드 하는 경우 활동의 위치를 확인할 수 되지 않습니다. 샘플 overstained는 원래 활동에 높은 특정 영역을 확인 하 고 어려운 formazan 침전 퍼질 수 있다.

우리는이 프로토콜을 광범위 한 대사의 역할에 대 한 질문 과학자에 대 한 가치가 있을 것입니다 예상. 애플리케이션으로 신진 대사 활동 및 세포 계보 마커 또는 확산 마커, 유전자 모델, 효소 활동의 subcellular 지 방화를 평가 다른 효소의 기여를 평가 대 한 얼룩 공동 모니터링 병에 걸리는 직물 또는 개발 하는 동안 효소 활동.

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Disclosures

저자는 공개 없습니다 경쟁 관심사 있다.

Acknowledgements

HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품에서 국립 연구소의 일반 의료 과학 R01 GM081686, R01 AR070245, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli와 Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구 (HAC에 교부 금에 의해 투자 되었다 로즈 언덕 및 Hal Gaba 상), 아와 HAC Jonsson 종합 암 센터에서 상을 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 백혈병 림프 종 사회 영향. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli & Edythe 넓은 센터의 재생 의학 및 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소, UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램의 회원입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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