Сопоставление метаболизма: Мониторинг активности лактатдегидрогеназы непосредственно в ткани

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем протокол для карт пространственного распределения ферментативной активности ферментов, которые генерируют nicotinatmide аденин динуклеотид фосфат (NAD(P)H) + H + непосредственно в образцах тканей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Картирование ферментативную активность в пространстве и времени имеет решающее значение для понимания молекулярные основы поведения клеток в нормальной ткани и болезней. В situ метаболической активности анализов может предоставить информацию о пространственного распределения метаболической активности в ткани. Здесь мы предоставляем подробный протокол для наблюдения за активностью фермента лактатдегидрогеназы непосредственно в образцах тканей. Лактатдегидрогеназа является важным фактором, определяющим ли потребления глюкозы будут преобразованы в энергии через аэробного и анаэробного гликолиза. Раствор, содержащий лактат и NAD предоставляется замороженные ткани секции. Клетки с высоким лактатдегидрогеназа активности будет конвертировать предоставленного лактат пируват, хотя одновременно преобразования при условии, что Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) NADH и протона, которые могут быть обнаружены на основе сокращения nitrotetrazolium синий Формазаны, который визуализируется как синий осадок. Мы описываем подробный протокол для мониторинга активности лактатдегидрогеназы в мыши кожи. Применяя этот протокол, мы обнаружили, что активность лактатдегидрогеназы высок в неработающем волосяного фолликула стволовых клеток в коже. Применение протокола к искусственный мышиных эмбриональных стволовых клеток показали выше окрашивание в культивированный эмбриональных стволовых клеток, чем мыши эмбриональных фибробластов. Анализ свежевыделенных мыши аорты показал, пятнать в клетках гладких мышц перпендикулярно аорты. Представлена методология может использоваться для пространственно карта активность ферментов, которые генерируют протона в замороженные или свежие ткани.

Introduction

Понимание места внутри тканей, в которых ферменты обладают высокой или низкой активности имеет важное значение для понимания развития и физиологии. Транскрипт или белка уровнях часто используются в качестве суррогатов для ферментативной активности. Хотя такие исследования могут быть информативным, они не предоставляют информацию, которая может иметь решающее значение для определения активности ферментов, как столб-поступательные изменения, наличие белковых комплексов, или локализации внутриклеточных ферментов. Когда измеряется прямо энзимную активность, он часто контролируется в лизатов гомогенизированные белка, что больше не содержат информацию об отдельных ячеек в смеси или пространственное распределение ячеек с высокой или низкой активности в ткани.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для картирования пространственного распределения ферментативной активности в образец ткани. Методология основана на более ранних исследований, демонстрируя, что tetrazolium соли может использоваться для локализации деятельности дегидрогеназ, reductases и оксидазы замороженные ткани1. С помощью этих методов нерастворимого в воде Формазаны образуется, когда протонов передаются в tetrazolium соли2,3. Глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа генерирует NADPH и протона и был обнаружен с tetrazolium активностью. Глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа осуществлялся в европейской камбалы гепатоцитов4, в альвеолярной типа 2 клетки легких5 и нефронов почек5. Tetrazolium соли также используются для мониторинга активности транскетолазы в замороженные ткани6. Аналогичный подход был недавно использован для наблюдения за активностью нескольких дегидрогеназ же ткани на прилегающих слайды7.

Здесь мы описываем метод использовать tetrazolium соли для мониторинга пространственного распределения активности лактатдегидрогеназы (рис. 1). Лактатдегидрогеназа можно преобразовать пируват, порожденных гликолиза в лактат и обратная реакция. Лактатдегидрогеназа деятельность следовательно является важным фактором, определяющим пирувата в вход в цикл трикарбоновых кислот против его секреции как лактат. Уровень лактата в крови часто используются для диагностики ряда заболеваний, включая рак8,9,10, потому что это может означать, что болезни или травмы поврежденные клетки и фермента был освобожден.

Есть четыре лактатдегидрогеназа генов: LDHA, LDHB, LDHC и LDHD11. Подуманы, что возникли от дублирования раннего гена LDHA12LDHA и LDHB. LDH активен как Тетрамер и LDHA и LDHB могут образовывать homotetramers и heterotetramers друг с другом. LDHA, как сообщается, имеют более высокие сродство для пируват, в то время как LDHB сообщается выше сродство для молочной кислоты и преобразуемый преференциально лактат пируват13. Промоутер LDHA содержит привязки сайтов для факторов11транскрипции HIF1α, cMYC и FOXM1. Кроме того как многие другие гликолитических ферментов14,15, ЛДГ может быть изменен на столб-поступательные изменения. Фактор роста фибробластов рецептор 1 можно фосфорилировать LDHA на Y10, который способствует формированию Тетрамер, или Y83, который способствует NADH субстрата привязки16. LDHA также может быть ацетилированный17. По этим причинам полное понимание активности ЛДГ требует мониторинга не только уровня ЛДГ белка, но также активность фермента.

В дополнение к метод, который мы представляем здесь другие подходы используются для мониторинга активности лактатдегидрогеназы. Лактатдегидрогеназа активность может контролироваться спектрофотометрически гомогенизированные белка lysate. Поколение NADH как лактат преобразуется пируват может быть измерена по оптической плотности на 340 Нм, в то время как исчезновение НАДН может контролироваться как пируват превращается в лактат18. Лактатдегидрогеназа деятельности также ведется с магнитно-резонансная томография (МРТ). 13 C-пируват может управляться и преобразование пируват лактата может контролироваться как отношение [1 -13C] лактата / [1 -13C] пируват. Повышенные показатели [1 -13C] лактата / [1 -13C] пируват наблюдаются в раковых тканей19. Хотя подходы, основанные на МРТ может предоставить информацию о активности лактатдегидрогеназы в нормальных и болезней тканей, методологии не имеют резолюции, необходимые для определения уровня активности в определенных ячейках. Методологии, здесь может предоставить информацию о лактатдегидрогеназа деятельности в областях, ткани и даже в одиночных клетках.

Использование в situ анализов деятельности, мы обнаружили, что активность лактатдегидрогеназы высока в волосяной фолликул стволовых клеток мыши кожи20. Мы также использовали этот метод для отслеживания активности лактатдегидрогеназы в культивированный эмбриональных стволовых клеток и обнаружил, что активность в стволовых клеток выше, чем уровень подачи. Наконец мы мониторинг активности лактатдегидрогеназы в свежих мыши аорты и наблюдается окрашивание в клетках гладких мышц. Здесь мы описываем подробный протокол для мониторинга активности лактатдегидрогеназы в замороженных мыши кожи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты описал были утверждены Комитетом животное уход в Калифорнийском университете, Лос-Анджелес.

1. создать слайды замороженных мыши кожи

  1. Усыпить мышей в соответствии с политикой Организации.
    Примечание: Следуйте институциональной политики для защитной одежды. Все протоколы с участием животных должны быть одобрены организационного комитета уход животных.
  2. Удаление волос мыши Триммер волос животных.
  3. Сделайте разрезы в коже с помощью ножниц. С помощью щипцов, снять кожу от мыши. С помощью ножниц, срезаем кожу секции.
  4. Заполнить cryomold с замораживанием реагент соединения (см. Таблицу материалы).
  5. Место разделы кожи в заполненных cryomolds с помощью иглы носом щипцами. Ориент кожи, таким образом, чтобы кусочки ткани будет генерировать сечения кожи от эпидермиса дермы и гиподермы мышцы (рис. 2).
    Примечание: если возможно, подключить экспериментальные и контроль мышей вместе в том же cryomold, поэтому они могут быть секционного на тот же слайд и обрабатываются вместе. Будьте осторожны, чтобы не создавать пузыри.
  6. Место cryomold на плоской поверхности блока сухого льда в ведёрке со льдом и пусть заморозить. Продолжать соблюдать ориентации кожи. При необходимости отрегулируйте.
    Примечание: Перчатках криогенной обработки сухим льдом.
  7. Передача cryomolds в морозильной камере-80 ° C для хранения. Образцы можно сохранить в холодильнике около 3 месяцев без значительной потери ферментативной активности. Не позволяйте Замороженные разделы высохнуть.
  8. С помощью криостата при-20 ° C, кусочек ткани для создания секций толщиной для лучших кожи морфология217-10 мкм.

2. Подготовка слайды для окрашивания

  1. Создать набор слайдов для проверки. Включить контроль слайд, на котором будут удержаны NAD и другого элемента управления слайд на котором субстрата, лактат, будет отказано. Включать положительный контроль слайд из блока замороженные ткани ранее расследование.
  2. Кратко исправьте слайды, содержащий разделы кожи с формалином 4% за 5 мин либо дозирования 1 мл 4% формалина на слайд, или при обработке нескольких слайдов, окунания слайды в контейнер, содержащие формалин 4%.
    Примечание: Фиксация обеспечит, что кожа не отслаиваются от слайды во время следующих процедур и заповедник морфологию кожи.
    Предупреждение: Формалин является канцерогеном и опасных; Надевайте перчатки, не позволяйте ему прикоснуться к вашей коже и выполнить этот шаг в химической зонта.
  3. Мыть слайды с по крайней мере 1 мл фосфат буфер солевой раствор, рН 7,4, каждого слайда закупорить или погружением.

3. Подготовка окрашивание раствора

  1. Вихревой вместе реагенты для окрашивания активности лактатдегидрогеназы (50 мм трис рН 7,4, 750 мкм NADP, 80 мкм мембранотропного порфириновых (PMS), 600 мкм nitrotetrazolium синий хлорида и лактат 30 мм) в соответствующего размера трубки в зависимости от количества пятнать требуется решение.
    Примечание: 1 мл достаточно, чтобы полностью покрыть один слайд.
  2. Подготовьте второе решение, в котором присутствуют все реагенты за исключением NAD. Подготовьте третье решение, в котором присутствуют все реагенты за исключением лактата.

4. Инкубируйте слайды в окрашивание раствора

  1. Аккуратно накапайте окрашивание решения или решения управления на подготовленные слайды, охватывающих секции в полном объеме (1 мл достаточно для одного слайда). Если несколько слайдов обрабатываются вместе, окунуть все слайды в окрашивание раствора в то же время (убедитесь, что контейнер имеет достаточно решение полностью покрыть в разделе ткани).
  2. Инкубируйте слайды в увлажненной среде при 37 ° C в темноте. Если окрашивание раствора поверх слайда, место слайда в увлажненной среде для предотвращения испарения.

5. монитор слайды

  1. Мониторинг преобразования окрашивание раствора от прозрачного голубого путем визуального осмотра. Когда образцы достигли желаемого уровня голубизны, остановите реакции, удалив окрашивание раствора.
    Примечание: Для кожи, 10 минут вполне достаточно. Время будет зависеть от органа и ферментативную активность.
  2. Промойте слайды с фосфатный буфер, дозирование (1 мл достаточно для каждого слайда) или погружением.
    Примечание: Любые образцы, которые будут сравниваться друг с другом должны поддерживаться в окрашивание раствора для одинаковое количество времени.

6. изображение и смонтировать

  1. Накапайте изображение на слайды когда слайды достигли соответствующего уровня голубизны.
    Примечание: Counterstains, которые превращают ядер красных или зеленых обеспечит хороший контраст с синим, созданные Формазаны осадителя.
  2. Крепление с водных и неводных монтажа средних22. Один-три капли (40-50 мкл) монтажа среды достаточно в зависимости от размера крышки выскальзования.

7. изображения слайдов и количественно

  1. Слайды изображений под микроскопом света. Возьмите фотографии экспериментальных и контрольных образцов и все отрицательные элементы управления в 10 X 20 X и 40 кратном.
  2. Определите интенсивность синего пятна в различных регионах с программного обеспечения для анализа изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы уже ранее сообщали результаты в situ анализов деятельности в мыши кожи20. Как показано на рисунке 3, мы наблюдали, что высокий уровень активности лактатдегидрогеназы в волосяной фолликул стволовых клеток на базе волосяного фолликула, когда вышеописанные процедуры были соблюдены. Эти выводы были подтверждены клеток активированных флуоресцированием сортировки кожи для волосяного фолликула стволовых клеток и подтверждающий высокий лактатдегидрогеназа активности в отсеке стволовых клеток с анализов деятельности на сортированном клетки.

Основываясь на наших выводов, что волосяного фолликула стволовые клетки имеют высокие лактатдегидрогеназа активности, мы расширили наши исследования культивировали эмбриональных стволовых клеток. Мышь эмбриональных фибробластов, выступающей в качестве слоя фидер были проанализированы отдельно или в присутствии эмбриональных стволовых клеток. Для анализа культивируемых клеток, носитель был придыханием, и клетки были кратко фиксированной и инкубированы с лактатдегидрогеназа окрашивание раствора, как описано выше. Мы наблюдали лактатдегидрогеназа высокой активности в эмбриональных стволовых клеток по сравнению с мыши эмбриональных фибробластов (рис. 4).

Мы также применили окрашивание протокол свежевыделенных ткани. Аорты мыши были расчленены и нарезанный открытым. Эти суда были открыты и иммобилизованные так что внутри просвета аорты была доступна. Образцы инкубировали с Хэнка сбалансированный солевой раствор, содержащий 0,5%, применяемые Тритон-X 10 мин, затем с лактатдегидрогеназа, окрашивание раствора для 10 мин лактатдегидрогеназа окрашивание раствора в свежие ткани. После инкубации были собраны изображения, показаны пятнать в клетках гладких мышц (рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1 : Химическая активность лактатдегидрогеназы и его обнаружения. Лактатдегидрогеназа преобразует лактат + NAD пируват, НАДН + H+. Протон, создаваемый снижают nitroblue tetrazolium Формазаны, которая сформирует синий осадок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Схема ориентации мыши кожи в cryomolds. Мыши кожи должна быть ориентирована в cryomolds, чтобы вырезать каждый раздел будет содержать сечения всей кожи от эпидермиса, дермы, подкожную клетчатку и мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Лактатдегидрогеназа окрашивание кожи мыши показывает высокую активность в волосяной фолликул стволовых клеток. Мыши кожи был заморожен в cryomolds и инкубировали с лактатдегидрогеназа окрашивание раствора содержат лактата. Лактатдегидрогеназа активности был видно в волосяной фолликул стволовых клеток. (A, B) Два изображения лактатдегидрогеназа деятельности пробирного мыши кожи. (C, D) Два изображения управления окрашивание с субстрата лактат отказано. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Высокая лактатдегидрогеназа активность в культивированный мышиных эмбриональных стволовых клеток. Культивированный мышиных эмбриональных стволовых клеток вырос на слое фидер эмбриональных фибробластов облученного мыши были проанализированы для активности лактатдегидрогеназы. Высокая активность наблюдалась в стволовых клеток, по сравнению с фибробластов. Мышь, эмбриональных фибробластов показали аналогичные уровни окрашивание с и без облучения. Изображения были взяты с 20 X цели. Шкалы бар = 50 µm. (A, B, D, E) мыши эмбриональных фибробластов и стволовых клеток. (C, F) Мышь эмбриональных фибробластов в одиночку. (A-C) Снимки были сделаны после 7 минут инкубации с окрашивание раствора. (D-F) Снимки были сделаны после 20 минут инкубации с окрашивание раствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Высокая лактатдегидрогеназа активность в клетках гладких мышц, окружающих мыши аорты. Аорты были изолированы от Усыпленных мышей. Суда были исправлены в течение 2 минут в 2% параформальдегида и промывают 3 x 10 минут в 1 x фосфат буфер солевой. Суда были инкубировали с Хэнка сбалансированного солевого раствора с 0,5% Тритон-X и промывают 3 x 5 минут в фосфатный буфер. Лактатдегидрогеназа окрашивание раствора была добавлена и образцы инкубировали в течение 10 минут при 37° C и промывают 3 x 5 мин с 1 x фосфат амортизированное saline. Образцы были затем фиксированной на 1 час в 2% параформальдегида, промывают 3 x 5 мин с 1 x фосфат амортизированное saline и образы. (A) лактатдегидрогеназа раствор, содержащий лактата. (B) лактатдегидрогеназа решение без лактат как отрицательный контроль. Для каждого раздела существует меньше масштаб изображения слева и участком показано увеличение справа. (A, B) Полный лактатдегидрогеназа раствор, содержащий лактат был использован для окрашивания. B это увеличенное изображение области указано в решении лактатдегидрогеназа A. (C, D) изображения без лактат использовался для окрашивания как отрицательный контроль. D это увеличенное изображение области указано в C. A и C были взяты с 20 X целей (шкала бар = 50 мкм) и B и D были приняты с целью 40 X (шкала бар = 20 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, описанный здесь может использоваться для мониторинга активности лактатдегидрогеназы и другие метаболические ферменты, которые генерируют NADH или NADPH, в различных типов клеток внутри ткани или внутри различных частей ткани с течением времени. Лактатдегидрогеназа является ферментом, важным для понимания биологии стволовых клеток и опухоли, и способность контролировать активность лактатдегидрогеназы в отдельных клетках, вероятно, предоставить важную информацию в функцию этого фермента.

Одно важное преимущество этого протокола по сравнению с другими методологиями, что способность монитора ферментативной активности, а не просто белка изобилия, может привести к более исчерпывающей информации о не только где лактатдегидрогеназа ферменты присутствует, но где они на самом деле работоспособны. Подход, описанный здесь может сочетаться с иммуногистохимии, так что уровень выделенного белка, например, клеток линии маркера, определяется в том же образцах тканей как лактатдегидрогеназа деятельность. По сравнению с МРТ-подходы на основе для мониторинга активности лактатдегидрогеназы протокол имеет то преимущество, что она может обеспечить большую пространственное разрешение и помочь определить конкретные клетки внутри ткани, которые имеют высокой ферментативной активностью . По сравнению с подходы к метаболизм сопоставления, основанные на fluorogenic субстратов обнаружения сигнала с протоколом описал не ограничивается аутофлюоресценция1. Миллер и соавторы производится мониторинг преобразования в Формазаны7аналогичный анализ зависимости от времени и субстрат зависимость от пяти различных ферментов. Реакции были обнаружены следовать стехиометрическим принципам Ферментативная кинетика. Миллер и соавторы уважаемого митохондриальных ферментов из не митохондриальных ферментов, Сопредседатель локализации с митохондриальных окрашивание7. Они использовали 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium хлорид (КТК) как обнаружения реагента, следуют confocal микроскопии для локализация внутриклеточных совместного анализа7.

Метод, описанный имеет недостатки также. Хотя подходы, основанные на МРТ может быть использован в живых организмах, описанный подход требует замороженные или свежие ткани. Замороженные ткани пригодны только за несколько месяцев, потому что активность ферментов деградирует со временем, даже когда заморожены. Кроме того поскольку субстрат в избытке, подход обеспечивает информацию о «деятельности потенциал», предполагая, что субстрат присутствует. Если ограничения уровней субстрата, распределение деятельности наблюдается с этот assay может отклоняться от активности, которое происходит физиологически. Кроме того если есть разные изоформы же фермент, которые выполняют же ферментативной активности, метод, представленные здесь не способен различать между ними. Например метод представлен не может различать деятельность LDHA против LDHB. Один из подходов к адресу, что этот вопрос будет использовать генетически инженерии мышей, в которых один фермента изоформы генетически инактивированной.

Мы экспериментировали с PMS, воздухе стабильных электронов перевозчик, который является посредником при передаче электрона между NADH и tetrazolium красителей23. Хотя некоторые ученые сообщили, что PMS препятствует глюкозы 6-фосфатдегидрогеназа активность и нашли бесполезным PMS5, мы нашли PMS ценным для локализации фермента и включить его в наш протокол. Некоторые другие авторы сообщили об использовании поливинилового спирта для ограничения распространения глюкозы 6-фосфатдегидрогеназа фермента1. В наших экспериментах мы не нашли поливинилового спирта, чтобы быть полезным и ликвидировать его.

Несколько шагов являются критическими для успеха окрашивания. Одной из важных проблем является обеспечение того, что образцы тканей помещены правильно в cyromolds. Кожи разделы должны быть уложены, плоский, так что ломтики сократить через кожу. Кроме того если несколько секций должны быть подготовлены, это идеальное место, если они встроены в том же cryomold, поэтому они могут быть нарезанный вместе на тот же слайд. Это поможет устранить различия за счет толщины слайд, режется с криостата. Важно также обеспечить, что ткани по-прежнему сохраняет ферментативную активность.

Лучшее время, чтобы положить конец реакции следует определить эмпирически. Необходимо тщательно контролировать слайды во время инкубационного периода и определить подходящее время для добавить изображение и смонтировать слайды, основанные на интенсивность синего пятна. Если образцы слишком легкомысленно витражи, не удастся определить, где деятельность. Если образцы overstained, Формазаны осадок может распространяться, что делает его трудно определить конкретные области, которые были первоначально высокой активности.

Мы ожидаем, что этот протокол будет ценным для ученых с широким кругом вопросов о роли метаболизма. Приложения включают в себя совместное пятная для метаболической активности и клеток линии маркеры или маркеры распространения, оценки вклада различных ферментов с генетической модели, оценки субцеллюлярные локализация ферментативной активности, мониторинг Ферментативная активность в пораженной ткани или во время разработки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.

Acknowledgements

HAC был Милтон E. Cassel ученый Аллен фонда Рита (http://www.ritaallenfoundation.org). Эта работа финансировалась грантов для HAC от национальных общих медицинских наук R01 GM081686, R01 AR070245, Национальный институт общих медицинских наук R01 GM0866465 Эли Edythe Широкое центр восстановительной медицины &, исследования стволовых клеток ( Роуз холмы и Hal ГАМК награды), центр здоровья/UCLA CTSI низ Грант UL1TR000124, лейкемии лимфомы общества, влияния женщин Iris Кантор награды от Йонссон всеобъемлющем онкологический центр WEL и ВАК. Исследования в этой публикации было поддержано национального института рака национальных институтов здоровья под награду номер P50CA092131. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. ВАК является членом Эли Edythe Широкое центр восстановительной медицины и исследования стволовых клеток, Институт молекулярной биологии Калифорнийского университета, и UCLA биоинформатики межведомственной программы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. Bios. (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics