Kartlegging metabolisme: Overvåking laktat Dehydrogenase aktivitet direkte i vev

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en protokoll som tilordner den romlige fordelingen av enzymatisk aktivitet for enzymer som genererer nicotinatmide adenine dinucleotide fosfat (NAD(P)H) + H + direkte i vevsprøver.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kartlegging enzymatiske aktiviteten i rom og tid er avgjørende for å forstå molekylær grunnlaget for cellen atferd i normalt vev og sykdom. In situ metabolsk aktivitet analyser kan gi informasjon om den romlige fordelingen av metabolsk aktivitet innenfor en vev. Vi gir her en detaljert protokoll for å overvåke aktiviteten til enzym laktat dehydrogenase direkte i vevsprøver. Laktat dehydrogenase er en viktig determinant av om brukte glukose konverteres til energi via aerob / anaerob trening Glykolysen. En løsning som inneholder laktat og NAD gis til en frossent seksjonen. Celler med høy laktat dehydrogenase aktivitet vil konvertere den angitte laktat til pyruvate, mens samtidig konvertere gitt nikotinamid adenine dinucleotide (NAD) NADH og et proton, som kan oppdages basert på reduksjon av nitrotetrazolium blå til formazan, som er visualisert som en blå utløse. Vi beskriver en detaljert protokoll for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet i musen huden. Bruk denne protokollen, fant vi at laktat dehydrogenase aktivitet er høy i quiescent hårsekken stamceller innenfor huden. Bruke protokollen kulturperler mus embryonale stamceller viste høyere farging i kulturperler embryonale stamceller enn mus embryonale fibroblaster. Analyse av fersk isolert musen aorta avdekket farging i glatte muskelcellene vinkelrett aorta. Metodikken gitt kan brukes til romlig aktiviteten av enzymer som genererer et proton i frosne eller friske vevet.

Introduction

Forstå steder i vev som enzymer har høy eller lav aktivitet er avgjørende for forståelse utvikling og fysiologi. Avskrift eller protein brukes ofte som surrogater for enzymatisk aktivitet. Mens slike studier kan være informativ, gir de ikke informasjon som kan være kritiske for å bestemme et enzym aktivitet, som post-translasjonell modifikasjoner, protein komplekser, eller enzymets subcellular lokalisering. Når måles direkte enzymatisk aktivitet, er det ofte overvåket homogenisert protein lysates som ikke inneholder informasjon om individuelle celler i blandingen eller den romlige fordelingen av cellene med høy eller lav aktivitet innenfor en vev.

Vi gir her en detaljert protokoll for å kartlegge den romlige fordelingen av enzymatisk aktivitet innenfor en Vevsprøve. Metodene er basert på tidligere studier viser at tetrazolium salter kan brukes til å lokalisere aktiviteten til dehydrogenases, reductases og oxidases i frossent1. Disse metodene, er en vann-uløselig formazan dannet når protoner overføres til tetrazolium salt2,3. Glukose-6-fosfat dehydrogenase genererer NADPH og et proton, og har blitt oppdaget med tetrazolium aktivitet. Glukose-6-fosfat dehydrogenase har vært overvåket i skrubbe hepatocytter4alveolar type 2 cellene av lungene5 og nephrons nyre5. Tetrazolium salter har også blitt brukt til å overvåke transketolase aktivitet i frossent6. En lignende fremgangsmåte ble nylig brukt til å overvåke aktiviteten til flere dehydrogenases i samme vev på tilstøtende lysbilder7.

Her beskriver vi en metode for å bruke tetrazolium salter til å overvåke den romlige fordelingen av laktat dehydrogenase aktivitet (figur 1). Laktat dehydrogenase kan konvertere pyruvate Glykolysen til laktat, og motsatt reaksjon. Laktat dehydrogenase aktivitet er dermed en viktig determinant av pyruvate's inngangen til tricarboxylic syre syklusen versus sekresjon som laktat. Laktat nivåer i blodet brukes ofte til å diagnostisere en rekke sykdommer, inkludert kreft8,9,10, fordi det kan signalisere at sykdom eller skade har skadede celler og enzymet er frigitt.

Det er fire laktat dehydrogenase gener: LDHA, LDHB, LDHC og LDHD11. LDHA og LDHB antas å ha oppstått fra duplisering av en tidlig LDHA gene12. LDH er som en tetramer LDHA og LDHB kan danne homotetramers og heterotetramers med hverandre. LDHA er rapportert å ha høyere affinitet for pyruvate, mens LDHB er rapportert å ha høyere affinitet for laktat, og fortrinnsvis konvertere laktat til pyruvate13. LDHA selskapet inneholder bindende områder for HIF1α, cMYC og FOXM1 transkripsjon faktorer11. Dessuten, som mange andre glycolytic enzymer14,15, kan LDH endres av post-translasjonell modifikasjoner. Fibroblast vekstfaktor reseptor 1 kan phosphorylate LDHA Y10, som fremmer tetramer formasjon, eller Y83, som fremmer NADH substrat bindende16. LDHA kan også være acetylated17. For disse grunner krever en fullstendig forståelse av LDH aktivitet overvåking ikke bare LDH protein nivå, men det enzym aktivitet også.

I tillegg til metoden vi presenterer her har andre tilnærminger brukt til å overvåke laktat dehydrogenase aktivitet. Laktat dehydrogenase aktivitet kan overvåkes spektrofotometrisk homogenisert protein lysate. Generering av NADH som laktat konverteres til pyruvate kan bli målt basert på absorbans ved 340 nm, mens forsvinningen av NADH kan bli overvåket som pyruvate konverteres til laktat18. Laktat dehydrogenase aktivitet har også vært overvåket med magnetisk resonans imaging (MRI). 13 C-pyruvate kan administrere og konverteringen av pyruvate til laktat kan bli overvåket som forholdet mellom [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate. Forhøyet prosenter av [1 -13C] laktat / [1 -13C] pyruvate har blitt observert i kreft tissue19. Mens Mr tilnærminger kan gi informasjon om laktat dehydrogenase aktivitet i normal og sykdom vev, har ikke metodikkene oppløsningen måtte bestemme aktivitetsnivået i bestemte celler. Metodene som er gitt her kan gi informasjon om laktat dehydrogenase aktivitet i vev områder og selv i enkeltceller.

Bruker i situ aktivitet analyser, fant vi at aktiviteten til laktat dehydrogenase er høy i hårsekken stamceller musen hud20. Vi brukte også metoden å overvåke aktiviteten til laktat dehydrogenase i kulturperler embryonale stamceller og fant aktiviteten er høyere i stamceller enn mater laget. Endelig vi overvåket aktiviteten til laktat dehydrogenase i frisk musen aorta og observert farging i glatte muskelcellene. Her beskriver vi en detaljert protokoll for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet i frosne mus huden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter beskrevet ble godkjent av dyr omsorg komiteen ved University of California, Los Angeles.

1. Generer lysbilder frosne mus hud

  1. Euthanize mus i henhold til institusjonen personvern.
    Merk: Følg institusjonelle politikk for verneklær. Alle protokoller som involverer dyr må godkjennes av institusjonelle dyr omsorg komiteen.
  2. Fjerne musen er håret med en dyr hår trimmer.
  3. Lage snitt i huden med saks. Ved hjelp av pinsett, løft huden fra musen. Med saks, utstanset delen huden.
  4. Fyll cryomold med frysing reagens sammensatte (se Tabell for materiale).
  5. Plass huden deler i fylt cryomolds bruker p-nosed tang. Plasser huden slik at vev skiver vil generere et tverrsnitt av huden fra overhuden å dermis og epidermis muskel (figur 2).
    Merk: Hvis mulig, montere eksperimentelle og kontroll mus sammen i den samme cryomold så de kan bli delt inn i samme lysbildet og behandlet sammen. Ta vare ikke for å skape bobler.
  6. Plasser cryomold på den flate overflaten på en blokk med tørris i en isen bøtte og la fryse. Fortsette å observere retningen på huden. Juster om nødvendig.
    Merk: Bruk kryogene hansker når du håndterer tørris.
  7. Overføre cryomolds til en-80 ° C fryser for lagring. Eksempler kan vedlikeholdes i fryseren for ca 3 måneder uten betydelige tap av enzymatisk aktivitet. Ikke la frosne snitt tørke ut.
  8. Bruker en kryostaten på 20 ° C, slice vev opprette delene 7-10 µm tykke for beste huden morfologi21.

2. forberedelser lysbilder til farging

  1. Opprette en rekke lysbilder som skal testes. Inkluderer en kontroll lysbildet som NAD vil holdes og en annen kontroll Skyv som underlaget, laktat, vil trekkes. Inkluder et positivt kontroll lysbilde fra en frossent blokk tidligere undersøkt.
  2. Kort fikse lysbilder som inneholder huden inndelinger med 4% formalin i 5 minutter ved pipettering 1 mL av 4% formalin på lysbildet eller ved behandling av flere lysbilder, av dipping lysbilder i en beholder som inneholder 4% formalin.
    Merk: Fiksering sikrer huden ikke løsner fra lysbildene under følgende prosedyrer og bevare huden morfologi.
    Forsiktig: Formalin er et karsinogen og farlige; Bruk hansker, ikke la det berører huden og utføre dette trinnet i kjemisk avtrekksvifte.
  3. Vask lysbilder med minst 1 mL fosfat bufret saltvann, pH 7.4, per lysbilde pipettering eller dipping.

3. forberedelser flekker løsning

  1. Vortex sammen reagensene laktat dehydrogenase aktivitet flekker (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazine methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium blå klorid og 30 mM laktat) i en passende stor tube avhengig av mengden fargingen løsningen som kreves.
    Note 1 mL er tilstrekkelig til å dekker ett lysbilde.
  2. Forberede en andre løsning der reagenser finnes unntatt NAD. Forberede en tredje løsning der reagenser finnes unntatt laktat.

4. ruge lysbilder i flekker løsning

  1. Pipetter forsiktig flekker løsningen eller kontrolløsninger på forberedt lysbildene som dekker delen i sin helhet (1 mL er tilstrekkelig for ett lysbilde). Hvis flere lysbilder behandles sammen, dyppe alle lysbildene i flekker løsningen samtidig (Kontroller at beholderen har nok løsningen dekker delen vev).
  2. Inkuber lysbildene i en fuktet miljø på 37 ° C i mørket. Hvis flekker løsning på lysbildet, plassere lysbildet i et fuktet miljø å hindre fordampning.

5. overvåke lysbildene

  1. Overvåke konvertering av flekker løsningen fra klar til blå ved by visuell inspeksjon. Når prøvene har nådd ønsket nivået av blueness, stoppe reaksjonen ved å fjerne flekker løsningen.
    Merk: For hud, 10 min er tilstrekkelig. Tiden vil avhenge orgel og enzymatiske aktiviteten.
  2. Skyll lysbilder med fosfat bufret saltvann av pipettering (1 mL er nok for hvert lysbilde) eller dipping.
    Merk: Noen eksempler som skal sammenlignes hverandre må opprettholdes i flekker løsning for samme mengde tid.

6. counterstain og montere

  1. Pipetter en counterstain på lysbildene når lysbildene har nådd et passende nivå av blueness.
    Merk: Counterstains som slår kjerner rød eller grønn vil gi god kontrast med den blå laget av formazan precipitant.
  2. Montere med vandig eller ikke-vandig montering middels22. En til tre dråper (40-50 µL) montering medium er tilstrekkelig avhengig av cover slip.

7. image lysbilder og kvantifisere

  1. Bildet glir under lys mikroskop. Ta bilder av eksperimentelle og kontroll prøvene og alle negative kontroller på 10 X, 20 X og 40 X forstørrelse.
  2. Bestemme intensiteten av blå flekker i forskjellige regioner med analyseprogramvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere rapportert resultater for i situ aktivitet analyser i musen hud20. Som vist i Figur 3, observerte vi høye nivåer av laktat dehydrogenase aktivitet i hårsekken stamceller ved foten av hårsekken når fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble fulgt. Disse funn ble bekreftet av fluorescens aktivert cellen sortering av huden for hårsekken stamceller og bekrefter høy laktat dehydrogenase aktivitet i stamcelleforskningen rommet med aktivitet analyser på sorterte celler.

Basert på våre funn at hårsekken stamceller har høy laktat dehydrogenase aktivitet, utvidet vi våre studier av kultivert embryonale stamceller. Mus embryonale fibroblaster som et mater lag ble analysert alene eller i nærvær av embryonale stamceller. Analysere kulturperler celler, mediet ble pustende, og cellene var kort fast og inkubert med laktat dehydrogenase flekker løsning som beskrevet ovenfor. Vi observert høy laktat dehydrogenase aktivitet i embryonale stamceller mot mus embryonale fibroblaster (Figur 4).

Vi har også brukt fargeprotokoll fersk isolert vev. Mus aortas ble dissekert og skiver åpen. Fartøyene ble åpnet og immobilisert slik at innsiden lumen av aortas var tilgjengelig. Prøvene ble inkubert med Hanks balansert saltløsning som inneholder 0,5% Triton-X for 10 min, så med laktat dehydrogenase flekker løsning for 10 min. laktat dehydrogenase flekker løsning ble brukt til friskt vev. Etter inkubasjon bilder ble samlet inn, viser farging i den glatte muskelcellene (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : Kjemiske aktivitet av laktat dehydrogenase og oppdagelsen. Laktat dehydrogenase konverterer laktat + NAD pyruvate + NADH + H+. Proton som genereres vil redusere nitroblue tetrazolium til formazan, som vil danne en blå utløse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk av orientere musen huden i cryomolds. Musen hud bør være orientert i cryomolds slik at hver kuttet delen inneholder et tverrsnitt av hele huden epidermis, dermis, epidermis og muskel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Laktat dehydrogenase farging av musen huden avslører høy aktivitet i hårsekken stamceller. Musen hud var frosset i cryomolds og inkubert med laktat dehydrogenase flekker løsning inneholder laktat. Laktat dehydrogenase aktivitet var fremtredende i hårsekken stamceller. (A, B) To bilder av laktat dehydrogenase aktivitet analysen av musen huden. (C, D) To bilder av kontroll farging med underlaget laktat tilbakeholdt. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Høy laktat dehydrogenase aktivitet i kulturperler mus embryonale stamceller. Kultivert mus embryonale stamceller dyrket på et bestrålt mus embryonale fibroblast mater lag ble analysert laktat dehydrogenase aktivitet. Høy aktivitet ble observert i stamceller sammenlignet med fibroblaster. Mus embryonale fibroblaster viste lignende nivåer av flekker med og uten bestråling. Bildene ble tatt med en 20 X-målet. Skala bar = 50 µm. (A, B, D, E) mus embryonale fibroblaster og stamceller. (C, F) Mus embryonale fibroblaster alene. (A-C) Bildene ble tatt etter 7 minutter med inkubering med flekker løsning. (D-F) Bildene ble tatt etter 20 minutter med inkubering med flekker løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Høy laktat dehydrogenase aktivitet i den glatte muskelcellene rundt musen aorta. Aortas ble isolert fra euthanized mus. Fartøyene ble løst i 2 minutter i 2% paraformaldehyde og vasket 3 x 10 minutter i 1 x fosfat bufret saltvann. Fartøyene ble inkubert med Hanks balansert salt løsning med 0,5% Triton-X og vasket 3 x 5 minutter i fosfat bufret saltvann. Laktat dehydrogenase flekker løsning ble lagt og var ruges i 10 min på 37° C og vasket 3 x 5 min med 1 x fosfat-bufret saltvann. Prøvene var så fast i 1 time i 2% paraformaldehyde, vasket 3 x 5 min med 1 x fosfat-bufret saltvann og fotografert. (A) laktat dehydrogenase løsning som inneholder laktat. (B) laktat dehydrogenase løsning uten laktat som en negativ kontroll. For hver del, det er en lavere forstørrelse bilde til venstre og et angitt område vises med høyere forstørrelse til høyre. (A, B) Komplett laktat dehydrogenase løsning som inneholder laktat ble brukt til farging. B er et forstørret bilde av det angitte området i bildet A. (C, D) laktat dehydrogenase løsning uten laktat ble brukt til farging som en negativ kontroll. D er et forstørret bilde av det angitte området i C. A og C ble tatt med 20 X mål (skala bar = 50 µm) og B og D ble tatt med en 40 X mål (skala bar = 20 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her kan brukes til å overvåke aktiviteten til laktat dehydrogenase eller andre metabolsk enzymer som genererer NADH eller NADPH, i ulike celletyper i en vev eller i ulike deler av en vev over tid. Laktat dehydrogenase er et viktig enzym for å forstå biologi stamceller og svulster, og evnen å dataskjerm laktat dehydrogenase aktivitet i enkeltceller er sannsynlig å gi viktig innsikt i funksjonen av dette enzymet.

En viktig fordel av denne protokollen sammenlignet med andre metoder er at muligheten til å overvåke enzymatiske aktiviteten, i stedet for bare protein overflod, kan resultere i mer avgjørende informasjon om ikke bare hvor laktat dehydrogenase enzymer er stede, men hvor de er faktisk funksjonelle. Fremgangsmåten beskrevet her kan kombineres med immunohistochemistry slik at nivået for en valgt protein, for eksempel en celle avstamning markør, bestemmes i de samme vevsprøver som laktat dehydrogenase aktivitet. Sammenlignet med MRI-baserte tilnærminger for overvåking av laktat dehydrogenase aktivitet, har protokollen gitt fordelen at den kan gi større romlig oppløsning og hjelpe deg for å finne de bestemte cellene innenfor en vev som har høy enzymatisk aktivitet . Sammenlignet med tilnærminger til kartlegging metabolisme basert på fluorogenic underlag, er oppdage signal med protokollen beskrevet ikke begrenset av autofluorescence1. Miller og medforfattere utført en tilsvarende analyse av tid avhengighet og underlaget avhengighet av fem forskjellige enzymer ved å overvåke konvertering til formazan7. Reaksjonene ble oppdaget å følge stoichiometric prinsipper for enzym kinetics. Miller og medforfattere unike mitokondrie enzymer fra ikke-Mitokondrielt enzymer av co lokalisering med mitokondrie flekker7. De brukte 5-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium chloride (CTC) som en gjenkjenning reagens etterfulgt av AC confocal mikroskopi for subcellular co lokalisering analyse7.

Metoden beskrevet har ulemper også. Mens Mr tilnærminger kan brukes i levende organismer, krever fremgangsmåten beskrevet frosne eller friske vevet. Frosne vev er kun egnet for et par måneder fordi aktiviteten av enzymer forringes over tid, selv når frosset. Videre, fordi underlaget er gitt i overkant, tilnærmingen gir informasjon om "potensialet" forutsatt substrat finnes. Hvis nivåene av underlaget er begrensende, kan deretter aktivitet distribusjon observert med denne analysen avvike fra mengden aktivitet som oppstår fysiologisk. Metoden som presenteres her er i tillegg ikke kunne skille mellom dem hvis det finnes forskjellige isoformene av samme enzym som utfører den samme enzymatiske aktiviteten. For eksempel ikke kan metoden presentert skille mellom aktiviteten til LDHA mot LDHB. En tilnærming til adressen problemet ville være å bruke genetisk utviklet mus der en enkelt enzym isoformen er genetisk deaktivert.

Vi har eksperimentert med PMS, en photochemically stabile elektron operatør som formidler elektron overføring mellom NADH og tetrazolium fargestoffer23. Mens noen forskere har rapportert at PMS hemmer glukose-6-fosfat dehydrogenase aktivitet og funnet PMS unhelpful5, fant vi PMS verdifull for enzym lokalisering og inkludere den inne våre protokollen. Noen andre forfattere har rapportert bruk polyvinylalkohol for å begrense spredningen av glukose-6-fosfat dehydrogenase enzym1. I vårt forsøk, vi fant ikke polyvinylalkohol å være nyttig og eliminert den.

Noen skritt er avgjørende for suksess for den flekker. Ett viktig problem er å sikre at vevsprøver er plassert riktig i cyromolds. Huden delene skal legges slik at skiver skåret over huden. I tillegg hvis inndelingene være forberedt, er det ideelle hvis de er innebygd i den samme cryomold så de kan være skiver sammen i samme lysbilde. Dette vil bidra til å eliminere variant på grunn av tykkelsen av lysbildet som er kuttet med kryostaten. Det er også viktig å sikre at vevet bevart enzymatisk aktivitet.

Den beste tiden å avslutte reaksjonen bør fastsettes empirisk. Det er nødvendig å nøye kontrollere lysbildene under inkubasjonstiden og finne riktig tidspunkt for å legge til counterstain og montere lysbilder basert på intensiteten av blå flekken. Hvis utvalgene er altfor lett farget, vil det ikke være mulig å fastslå hvor aktiviteten er. Hvis utvalgene er overstained, kan formazan føre spres, gjør det vanskelig å fastslå de spesifikke områdene som var opprinnelig høy aktivitet.

Vi forventer denne protokollen vil være verdifulle for forskere med en rekke spørsmål om rollen av stoffskiftet. Programmene omfatter co flekker for metabolsk aktivitet og cellen lineage markører eller spredning markører, vurdere bidrag av ulike enzymer med genetisk modeller, vurdere subcellular lokalisering av enzymatisk aktivitet, overvåking enzymatisk aktivitet i syke vev eller under utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser å avsløre.

Acknowledgements

HAC var Milton E. Cassel forskeren Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd til HAC fra National Institute av generelle medisinske fakultet R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute of generelle medisinske fakultet R01 GM0866465, Eli og Edythe bredt Center for regenerativ medisin og stamcelleforskning ( Rose og Hal Gaba awards), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, leukemi Lymphoma Society, innvirkning priser fra Jonsson Comprehensive Cancer Center WEL og HAC. Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute av National Institutes of Health under prisen nummer P50CA092131. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. HAC er medlem av Eli & Edythe bred Center for regenerativ medisin & stamcelleforskning, UCLA Molecular Biology Institutt og UCLA bioinformatikk interdepartemental programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
  2. Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
  3. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. Bios. (1992).
  4. Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
  5. Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
  6. Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
  7. Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. (2017).
  8. Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482 (2016).
  9. Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
  10. Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
  11. Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
  12. Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
  13. Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
  14. Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
  15. Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
  16. Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
  17. Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
  18. Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
  19. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108 (2013).
  20. Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. (2017).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
  22. Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
  23. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics