Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Biochemistry

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Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatische Aktivität von Enzymen, die generieren Nicotinatmide Adenin Dinucleotide Phosphat (NAD(P)H) + H + direkt in Gewebeproben.

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Jelinek, D., Flores, A., Uebelhoer, M., Pasque, V., Plath, K., Iruela-Arispe, M. L., Christofk, H. R., Lowry, W. E., Coller, H. A. Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue. J. Vis. Exp. (136), e57760, doi:10.3791/57760 (2018).

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Abstract

Mapping enzymatische Aktivität in Raum und Zeit ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Zelle Verhalten im normalgewebe und Krankheit. In Situ Stoffwechselaktivität Tests liefern Informationen über die räumliche Verteilung der metabolischen Aktivität innerhalb eines Gewebes. Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Aktivität des Enzyms Lactat Dehydrogenase direkt in Gewebeproben. Laktat-Dehydrogenase ist eine wichtige Determinante für ob konsumierten Glukose in Energie durch aerobe oder anaerobe Glykolyse umgewandelt wird. Eine Lösung mit Laktat und NAD ist ein gefrorenes Gewebe Abschnitt zur Verfügung gestellt. Zellen mit hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität konvertiert die bereitgestellten Laktat in Pyruvat, während gleichzeitig konvertieren, vorausgesetzt, Nicotinamid-adenin-Dinucleotide (NAD), NADH und ein Proton, die erkannt werden können auf die Reduzierung der Basis Nitrotetrazolium blau, Formazan, die als ein blauer Niederschlag visualisiert wird. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Maus Haut. Die Anwendung dieses Protokolls, fanden wir, dass Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den ruhenden Haarfollikel Stammzellen in der Haut ist. Umsetzung des Protokolls zu embryonalen Stammzellen gezüchteten Maus zeigte höhere Färbung in kultivierten Stammzellen als Maus embryonalen Fibroblasten. Analyse der frisch isolierte Maus Aorta ergab Färbung in glatten Muskelzellen senkrecht zu der Aorta. Die Methodik zur Verfügung gestellt lässt sich räumlich zugeordnet werden die Aktivität von Enzymen, die ein Proton im gefrorenen oder frischen Gewebe erzeugen.

Introduction

Die Standorte in den Geweben, in denen Enzyme hohe oder Niedrige Aktivität haben, zu verstehen ist wichtig für Verständnis Entwicklung und Physiologie. Abschrift oder Protein Ebenen dienen oft als Surrogate für enzymatische Aktivität. Während solche Studien informativ sein können, bieten sie keine Informationen, die entscheidend für die Bestimmung einer Enzym-Aktivität, wie Post-translationalen Modifikationen, die Anwesenheit von Protein-komplexe oder das Enzym subzelluläre Lokalisation sein können. Wenn die enzymatische Aktivität direkt gemessen wird, wird es oft in homogenisierte Protein Lysates überwacht, die nicht mehr Informationen über einzelne Zellen innerhalb der Mischung oder die räumliche Verteilung der Zellen mit hoher oder niedriger Aktivität innerhalb eines Gewebes enthalten.

Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatischen Aktivität innerhalb einer Gewebeprobe. Die Methodik basiert auf früheren Studien, die zeigen, dass tetrazoliumsalz Salze verwendet werden können, um die Aktivität der Dehydrogenases, Reduktasen und oxidasen in tiefgefrorenem Gewebe1zu lokalisieren. Mit diesen Methoden wird ein wasserunlösliches Formazan gebildet, wenn eine Tetrazolium Salz2,3Protonen übertragen werden. Glukose-6-phosphat Dehydrogenase NADPH und ein Proton generiert und mit tetrazoliumsalz Aktivität erkannt wurde. Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase ist in Flunder Hepatozyten4, im alveolären Typ-2-Zellen der Lunge5 und Nephrone der Niere5überwacht worden. Tetrazoliumsalz Salze wurden auch zur Transketolase-Aktivität in tiefgefrorenem Gewebe6zu überwachen. Ein ähnlicher Ansatz wurde kürzlich verwendet, um die Aktivität von mehreren Dehydrogenases im gleichen Gewebe auf angrenzenden Folien7überwachen.

Wir beschreiben hier eine Methode um tetrazoliumsalz Salze verwenden, um die räumliche Verteilung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität (Abbildung 1) zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase wandelt Pyruvat durch Glykolyse, Laktat und die umgekehrte Reaktion erzeugt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist daher eine wichtige Determinante der Pyruvat Eingang in der Tricarboxylic Säure Zyklus gegen seine Sekretion wie Laktat. Laktat-Spiegel im Blut werden oft zur diagnose einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs8,9,10, denn es signalisieren kann, dass Krankheit oder Verletzung Zellen beschädigte hat und das Enzym freigegeben wurde.

Es gibt vier Laktat-Dehydrogenase Gene: LDHA, LDHB, LDHC und LDHD11. LDHA und LDHB werden gedacht, um aus der Duplizierung von einer frühen LDHA Gen12entstanden sind. LDH ist als ein Tetramer aktiv und LDHA und LDHB bilden Homotetramers und Heterotetramers mit einander. LDHA wird berichtet, haben höheren Affinität für Pyruvat, während LDHB haben höheren Affinität für Laktat und bevorzugt Laktat in Pyruvat13konvertieren berichtet wird. Der Projektträger LDHA enthält verbindliche Aufstellungsorte für die HIF1α, cMYC FOXM1 Transkription Faktoren11. Darüber hinaus kann wie viele andere glykolytischen Enzyme14,15, LDH durch Post-translationalen Modifikationen verändert werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 phosphorylieren kann LDHA Y10, das Tetramer Bildung fördert, oder Y83, die NADH Substrat Bindung16fördert. LDHA kann auch schimmelpilzschäden17. Aus diesen Gründen erfordert ein umfassendes Verständnis der LDH-Aktivität nicht nur LDH-Protein-Ebene, sondern auch die Enzym-Aktivität sowie Überwachung.

Neben der Methode, die wir hier präsentieren, wurden andere Ansätze zur Laktat-Dehydrogenase-Aktivität zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität kann spektralphotometrisch lysate homogenisierte Protein überwacht werden. Die Erzeugung von NADH wie Laktat in Pyruvat umgewandelt gemessen werden basierend auf Absorption bei 340 nm, während das Verschwinden von NADH überwacht werden kann, wie Pyruvat in Laktat18umgewandelt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist auch mit Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) überwacht worden. 13 C-Pyruvat kann verabreicht werden, und die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat kann überwacht werden, als das Verhältnis von [1 -13C] Laktat / [1 -13C] Pyruvat. Erhöhte Verhältnisse von [1 -13C] Laktat / [1 -13C] Pyruvat in Krebs Gewebe19eingehalten worden. Während MRT-basierte Ansätze über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in Normal und Krankheit Gewebe informieren können, haben die Methoden nicht die Auflösung benötigt, um die Aktivität in bestimmten Zellen zu bestimmen. Die Methodik, die hier zur Verfügung gestellten kann Informationen über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Bereichen Gewebe und sogar in einzelnen Zellen.

Verwendung von in Situ Aktivität Assays, fanden wir, dass die Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den Haarfollikel Stammzellen der Maus Haut20ist. Wir nutzten auch die Methode zu überwachen die Aktivitäten der Laktat-Dehydrogenase in kultivierten Stammzellen und fand, dass die Aktivität in den Stammzellen über die Feeder-Schicht liegt. Schließlich überwacht die Tätigkeit der Laktat-Dehydrogenase in frischen Maus Aorta und Färbung in glatten Muskelzellen beobachtet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in gefrorenen Maus Haut.

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Protocol

Alle beschriebenen Experimente stimmten die Animal Care Committee an der University of California, Los Angeles.

1. erzeugen Sie Dias von gefrorenen Maus Haut

  1. Mäuse im Einklang mit Institution Politik einschläfern.
    Hinweis: Führen Sie institutionelle Politik für Schutzkleidung. Alle Protokolle, bei denen Tiere müssen durch die institutionelle Animal Care Committee genehmigt werden.
  2. Entfernen Sie die Maus Haare mit einem Tier Haarschneider.
  3. Stellen Sie Einschnitte in der Haut mit einer Schere. Mit Pinzette, heben Sie die Haut von der Maus. Mit Schere, Abschnitt Haut wegschneiden.
  4. Füllen Sie die Cryomold mit dem Reagenz zusammengesetzte Einfrieren (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Ort Hautpartien in gefüllten Cryomolds mit Nadelzange Pinzette. Haut zu orientieren, so dass Gewebe Scheiben werden einen Querschnitt durch die Haut aus der Epidermis, Lederhaut, Unterhaut und Muskulatur (Abbildung 2) zu generieren.
    Hinweis: Wenn möglich, montieren Sie experimentell zu und Steuern Sie Mäuse zusammen in der gleichen Cryomold, so dass sie auf derselben Folie geschnitten und zusammen verarbeitet werden können. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen zu erstellen.
  6. Legen Sie Cryomold auf die flache Oberfläche aus einem Block von Trockeneis in einem Eiskübel und Einfrieren zu lassen. Weiterhin die Ausrichtung der Haut zu beobachten. Passen Sie bei Bedarf.
    Hinweis: Kryogene Handschuhe beim Umgang mit Trockeneis.
  7. Cryomolds in einem-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung zu übertragen. Proben können in den Gefrierschrank für ca. 3 Monate ohne erheblichen Verlust der Enzymaktivität gepflegt werden. Lassen Sie sich nicht Gefrierschnitte austrocknen.
  8. Verwenden einen Kryostaten bei-20 ° C, Stück Gewebe Abschnitte 7 bis 10 µm Dicke für die beste Haut Morphologie21erstellen.

2. Vorbereitung Folien zum Beizen

  1. Den Satz von Folien zu prüfenden zu etablieren. Gehören ein Steuerschieber auf dem NAD einbehalten und schieben Sie ein anderes Steuerelement auf dem Substrat, Laktat, einbehalten. Gehören Sie einer Positivkontrolle Folie aus einem gefrorenen Gewebe vorher untersucht.
  2. Kurz fix Folien mit Hautpartien mit 4 % Formalin für 5 min entweder durch pipettieren 1 mL 4 % Formalin auf der Folie oder, wenn mehrere Folien Verarbeitung durch Eintauchen in ein Behälter, 4 % Formalin schiebt.
    Hinweis: Die Fixierung wird sichergestellt, dass die Haut nicht von den Folien während der folgenden Verfahren und bewahren die Haut Morphologie abziehen.
    Achtung: Formalin ist ein Karzinogen und gefährlich; tragen Sie Handschuhe, lassen Sie es Ihre Haut berühren und führen Sie diesen Schritt in einem chemischen Abzug nicht.
  3. Waschen Folien mit mindestens 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, pro Folie entweder durch pipettieren oder eintauchen.

3. Vorbereitung der Färbelösung

  1. Wirbel zusammen Reagenzien für Laktat-Dehydrogenase Aktivität Färbung (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazinderivat Methosulfate (PMS), 600 µM Nitrotetrazolium blaue Chlorid und 30 mM Laktat) in einem entsprechend großen Rohr abhängig von der Menge der Färbung Lösung benötigt.
    Hinweis: 1 mL ist ausreichend um eine Folie vollständig zu bedecken.
  2. Bereiten Sie eine zweite Lösung, in der alle Reagenzien außer NAD vorhanden sind. Bereiten Sie eine dritte Lösung, in der alle Reagenzien außer Laktat vorhanden sind.

(4) inkubieren Sie Folien in Färbelösung

  1. Sanft die Färbelösung pipettieren oder Control-Lösungen auf die vorbereiteten Folien, die im Abschnitt in seiner Gesamtheit (1 mL ist ausreichend für eine Folie). Wenn mehrere Folien zusammen verarbeitet werden, Tauchen alle Folien in der Färbelösung gleichzeitig (stellen Sie sicher, der Container hat genug Lösung Abschnitt Gewebe vollständig bedecken).
  2. Inkubieren Sie die Folien in eine feuchte Umgebung bei 37 ° C im Dunkeln. Wenn Färbelösung oben auf der Folie ist, legen Sie die Folie in eine feuchte Umgebung, um Verdunstung zu verhindern.

5. Monitor Folien

  1. Die Umwandlung von der Färbelösung von klar bis blau durch Sichtkontrolle zu überwachen. Wenn die Proben das gewünschte Maß an Bläue erreicht haben, stoppen Sie die Reaktion durch das Entfernen der Färbelösung.
    Hinweis: Für die Haut ist 10 Minuten ausreichend. Die Zeit hängt von der Orgel und die enzymatische Aktivität.
  2. Spülen Sie Folien mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung durch pipettieren (1 mL ist ausreichend für jede Folie) oder Tauchen.
    Hinweis: Alle Beispiele, die mit einander verglichen werden in Färbelösung für die gleiche Menge an Zeit einzuhalten.

6. gegenfärbung und montieren

  1. Pipettieren eine gegenfärbung auf den Objektträger, wenn die Folien ein angemessenes Maß an Bläue erreicht haben.
    Hinweis: Counterstains, die die Kerne rot oder Grün verwandeln bieten guten Kontrast mit dem Blau durch die Formazan Fällungsmittel erstellt.
  2. Mit wässrigen und nichtwässrigen Montage mittlerer22montieren. Ein bis drei Tropfen (40-50 µL) Eindeckmedium reicht je nach Größe des Deckglases.

7. Bild Folien und quantifizieren

  1. Bildfolien unter einem Lichtmikroskop. Nehmen Sie Fotos von experimentellen und Kontrollproben und alle negativen Kontrollen an 10 X, 20 X und 40 X Vergrößerung.
  2. Bestimmen Sie die Intensität der Bläue in verschiedenen Regionen mit Bildanalyse-Software.

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Representative Results

Wir haben bereits Ergebnisse für in Situ Aktivität Assays in Maus Haut20berichtet. Wie in Abbildung 3dargestellt, haben wir beobachtet, dass hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Haarfollikel Stammzellen an der Basis des Haarfollikels, wenn die Verfahren oben beschrieben befolgt wurden. Diese Ergebnisse wurden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortierung der Haut für Stammzellen Haarfollikel und bestätigt hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Stammzell-Fach mit Aktivität Assays auf sortierten Zellen bestätigt.

Basierend auf unseren Erkenntnissen, dass die Haarfollikel Stammzellen hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität haben, erweitern wir unsere Studien kultivierten embryonaler Stammzellen. Maus embryonale Fibroblasten dient als Zubringer Schicht wurden alleine oder im Beisein von embryonalen Stammzellen analysiert. Kultivierte Zellen zu analysieren, wurde das Medium angesaugt, und die Zellen wurden kurz fixiert und inkubiert mit Laktat-Dehydrogenase Färbelösung wie oben beschrieben. Wir beobachteten hohen Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den embryonalen Stammzellen im Vergleich zu der Maus embryonalen Fibroblasten (Abbildung 4).

Wir haben auch die Färbung Protokoll an frisch isolierte Gewebe angewendet. Maus Hauptschlagadern wurden seziert und offen geschnitten. Die Schiffe wurden geöffnet und immobilisiert damit innen Lumen der Hauptschlagadern zugänglich war. Proben wurden inkubiert, mit Hank es ausgewogen Salzlösung mit 0,5 % Triton-X für 10 min, dann mit dem Laktat-Dehydrogenase Färbelösung für 10 min. Laktat-Dehydrogenase Färbelösung an das frische Gewebe angewendet wurde. Nach der Inkubation wurden Bilder gesammelt, zeigt Färbung in der glatten Muskelzellen (Abbildung 5).

Figure 1
Abbildung 1 : Chemische Aktivität von Laktat-Dehydrogenase und seine Entdeckung. Laktat-Dehydrogenase konvertiert Lactat + NAD in Pyruvat + NADH + H+. Das Proton, das generiert wird verringert Nitroblue tetrazoliumsalz zu Formazan, die einen blauen Niederschlag bilden wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Schaltplan der Orientierung Maus Haut in Cryomolds. Maus Haut sollte innerhalb von Cryomolds ausgerichtet werden, so dass jede Schnittfläche einen Querschnitt der gesamten Haut aus Oberhaut, Lederhaut, Unterhaut und Muskulatur enthalten wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Laktat-Dehydrogenase Färbung der Maus Haut zeigt hohen Aktivität im Haarfollikel Stammzellen. Maus Haut war in Cryomolds eingefroren und inkubiert mit Laktat-Dehydrogenase Färbelösung Laktat enthalten. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität war prominent in Stammzellen Haarfollikel. (A, B) Zwei Bilder von Laktat-Dehydrogenase-Aktivität-Assay Maus Haut. (C, D) Zwei Bilder der Kontrolle Färbung mit Substrat Laktat einbehalten. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in kultivierten Maus embryonale Stammzellen. Kultivierte Maus embryonale Stammzellen auf eine bestrahlte Maus embryonalen Fibroblasten Feeder Schicht angebaut wurden für Laktat-Dehydrogenase-Aktivität analysiert. Hoher Aktivität wurde in den Stammzellen im Vergleich zu den Fibroblasten beobachtet. Maus embryonale Fibroblasten zeigten ähnliche Färbung mit und ohne Bestrahlung. Bilder wurden mit einem 20 X Objektiv. Maßstabsleiste = 50 µm. (A, B, D, E) Maus embryonalen Fibroblasten und Stammzellen. (C, F) Maus embryonalen Fibroblasten allein. (A-C) Bilder wurden nach 7 Minuten Inkubation mit Färbelösung. (D-F) Bilder wurden nach 20 Minuten Inkubation mit Färbelösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den glatten Muskelzellen, die rund um die Maus Aorta. Hauptschlagadern waren von euthanasierten Mäusen isoliert. Schiffe wurden für 2 Minuten in 2 % Paraformaldehyd und 3 x 10 Minuten in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gewaschen. Schiffe wurden mit Hank es ausgeglichene Salzlösung mit 0,5 % Triton-X und Phosphat gepufferte Kochsalzlösung gewaschen 3 x 5 Minuten inkubiert. Laktat-Dehydrogenase Färbelösung wurde hinzugefügt und Proben wurden für 10 min bei 37° C inkubiert und 3 x 5 min mit 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung gewaschen. Proben wurden dann für 1 Stunde in 2 % Paraformaldehyd fixiert, 3 x 5 min mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung gewaschen und abgebildet. (A) Laktat-Dehydrogenase Lösung mit Laktat. (B) Laktat-Dehydrogenase Lösung ohne Laktat als Negativkontrolle. Für jeden Bereich gibt es ein niedrigeres Vergrößerung Bild auf der linken Seite und ein bestimmten Bereich wird mit höherer Vergrößerung auf der rechten Seite angezeigt. (A, B) Komplette Laktat-Dehydrogenase Lösung mit Laktat wurde zum Färben verwendet. B ist ein vergrößertes Bild des angegebenen Bereichs im Bild A. (C, D) Laktat-Dehydrogenase Lösung ohne Laktat für Färbung als Negativkontrolle verwendet wurde. D ist ein vergrößertes Bild des angegebenen Bereichs in C. A und C wurden mit 20 X Ziele (Maßstabsleiste = 50 µm) und B und D wurden mit einem 40 X Objektiv (Maßstabsleiste = 20 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, zur Überwachung der Tätigkeit des Laktat-Dehydrogenase oder andere metabolische Enzyme, die NADH oder NADPH, in verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder verschiedene Teile eines Gewebes im Laufe der Zeit zu generieren. Laktat-Dehydrogenase ist ein wichtiges Enzym für das Verständnis der Biologie der Stammzellen und Tumoren, und die Fähigkeit, Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in einzelnen Zellen überwachen wird voraussichtlich wichtige Einblicke in die Funktion dieses Enzyms.

Ein wichtiger Vorteil dieses Protokolls im Vergleich mit anderen Methoden ist, dass die Fähigkeit, Monitor enzymatische Aktivität, anstatt nur Protein Fülle, kann dazu führen, dass mehr aussagekräftige Informationen über nicht nur wo Laktat-Dehydrogenase Enzyme sind vorhanden, aber wo sind sie tatsächlich funktionsfähig. Der hier beschriebene Ansatz kann mit Immunohistochemistry kombiniert werden, so dass das Niveau eines ausgewählten Proteins, zum Beispiel eine Zelle Abstammung Marker, in der gleichen Gewebeproben als Laktat-Dehydrogenase-Aktivität bestimmt wird. Im Vergleich mit MRT-basierte Ansätze für die Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hat das Protokoll zur Verfügung gestellt den Vorteil, dass es höhere räumliche Auflösung liefern und helfen, um die entsprechenden Zellen innerhalb eines Gewebes zu bestimmen, die hohen enzymatischen Aktivität haben können . Im Vergleich zu Ansätze zur Zuordnung Stoffwechsel basierend auf Fluorogenic Substrate ist Erkennung Signal mit dem beschriebenen Protokoll nicht durch Autofluoreszenz1beschränkt. Miller und Co-Autoren durchgeführt eine ähnliche Analyse der Zeitabhängigkeit und Substrat Abhängigkeit von fünf verschiedenen Enzymen durch Umstellung auf Formazan7Überwachung. Die Reaktionen wurden entdeckt, stöchiometrische Prinzipien der Enzym-Kinetik zu folgen. Miller und Co-Autoren unterschieden mitochondrialen Enzyme nicht mitochondrialen Enzyme durch Co Lokalisierung mit mitochondrialen Färbung7. Sie verwendet als Erkennung Reagens gefolgt von konfokalen Mikroskopie für subzelluläre Lokalisation Co Analyse75-Cyano-2,3-di-(p-tolyl)tetrazolium Chlorid (CTC).

Die beschriebene Methode hat auch Nachteile. Während MRT-basierte Ansätze in lebenden Organismen verwendet werden können, erfordert die beschriebene Ansatz gefrorenen oder frischen Gewebe. Gefrorene Gewebe eignen sich nur für ein paar Monate, da die Aktivität der Enzyme zersetzen im Laufe der Zeit wenn auch eingefroren. Da das Substrat im Überschuss bereitgestellt wird, bietet der Ansatz weiter, Informationen auf "Aktivität Potenzial" vorausgesetzt, dass Substrat vorhanden ist. Wenn die Ebenen des Substrates begrenzt sind, kann der Aktivitätsverteilung mit dieser Assay beobachtet aus der Menge an Aktivität abweichen, die physiologisch auftritt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Isoformen des gleichen Enzyms, die die gleichen enzymatische Aktivität ausführen, ist die hier vorgestellte Methode nicht in der Lage, zwischen ihnen zu unterscheiden. Beispielsweise kann nicht die vorgestellte Methode unterscheiden, die Aktivität der LDHA im Vergleich zu LDHB. Ein Ansatz zur Adresse dieses Problem wäre um gentechnisch engineered Mäuse, in denen ein einziges Enzym-Isoform genetisch inaktiviert ist.

Wir haben experimentiert mit PMS, photochemisch stabilen Elektron Träger, der Elektronentransfer zwischen NADH und tetrazoliumsalz vermittelt Farbstoffe23. Während einige Wissenschaftler berichtet haben, dass das PMS Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität hemmt und PMS nicht hilfreich5gefunden, fanden wir das PMS zu wertvoll für die Enzym-Lokalisierung und in unserem Protokoll aufzunehmen. Einige andere Autoren berichteten mit Polyvinylalkohol, um Diffusion von Glukose-6-phosphat Dehydrogenase Enzym1zu begrenzen. In unseren Experimenten wir fanden nicht die Polyvinylalkohol, hilfsbereit zu sein und beseitigt.

Ein paar Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Färbung. Ein wichtiges Thema ist sicherzustellen, dass die Gewebeproben in der Cyromolds richtig platziert sind. Hautpartien sollten festgelegt werden, flach, so dass Scheiben über die Haut geschnitten. Darüber hinaus Wenn mehrere Abschnitte sind, vorbereitet zu sein, ist es ideal, wenn sie innerhalb der gleichen Cryomold eingebettet sind, so dass sie zusammen auf derselben Folie geschnitten werden können. Dies wird helfen, um Variation aufgrund der Dicke der Folie zu beseitigen, die mit der Kryostat geschnitten ist. Es ist auch wichtig, damit das Gewebe enzymatische Aktivität bewahrt.

Die beste Zeit, um die Reaktion zu beenden sollte empirisch ermittelt werden. Es ist notwendig, die Folien während der Inkubationszeit überwachen und bestimmen Sie die geeignete Zeit hinzufügen gegenfärbung und montieren Sie die Folien anhand der Intensität von den blauen Fleck. Wenn Sie die Proben zu leicht gefärbt sind, wird es nicht möglich festzustellen, wo die Tätigkeit ist. Wenn die Proben overstained sind, kann der Formazan Niederschlag verteilt, macht es schwierig, bestimmte Bereiche zu ermitteln, die ursprünglich hohe Aktivität waren.

Wir erwarten, dass dieses Protokoll Wissenschaftler mit einer breiten Palette von Fragen über die Rolle des Stoffwechsels nützlich sein werden. Anwendungen umfassen Co Färbung für metabolische Aktivität und Zelle Abstammung Marker oder Proliferationsmarker, bewertet die Beiträge verschiedener Enzyme mit genetischen Modellen, Bewertung subzelluläre Lokalisation der Enzymaktivität, Überwachung enzymatische Aktivität in erkranktes Gewebe oder während der Entwicklung.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse zu HAC vom nationalen Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research (finanziert. Rose Hügel und Hal Gaba awards), die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft Auswirkungen vergibt aus dem Jonsson Comprehensive Cancer Center an WEL und HAC. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical instruments For collecting skin from euthanized mice
Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm Fisher Scientific NC9511236 For freezing mouse skin
Tissue-Tek O.C.T. compound Fisher Scientific NC9638938 For mounting cryomolds
Ice bucket Fisher Scientific 07-210-106
Dry Ice
Polysine Adhesion Slide Fisher Scientific 12-545-78
4% formalin Fisher Scientific 23-245-684 Dilluted in water
phosphate buffered saline, pH 7.4
vortex
Tris base Fisher Scientific 23-245-684
NAD Sigma-Aldrich N7004
Phenazine methosulfate Sigma-Aldrich P9625
Nitrotetrazolium blue chloride Sigma-Aldrich N6876
Lithium L-lactate Sigma-Aldrich L2250 Substrate
37°C incubator (or tissue culture incubator)
Braziliant! Counter stain Anatech 861 Counter stain
Mounting medium Vector Laboratories H-5000 
Cover slips for slides Fisher Scientific 12-544D
Light microscope

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References

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