تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

نقدم هنا، بروتوكولين لدراسة التفاعلات بلعمية-بكتريا أبسسيسوس : فحص مكتبة ينقول متحولة لعوز داخل الخلايا البكتيرية وتصميم الترنسكربيتوم داخل الخلايا البكتيرية من الحمض النووي الريبي التسلسل. كلا النهجين التبصير مزايا الجينوم والتكيفات ترانسكريبتوميك تعزيز اللياقة البدنية البكتيريا داخل الخلايا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ما يميز بكتريا أبسسيسوس من المتفطرة saprophytic الأخرى هو القدرة على مقاومة البلعمه بالضامة البشرية والقدرة على ضرب داخل هذه الخلايا. تجعل هذه الصفات الفوعة م. أبسسيسوس المسببة للأمراض، لا سيما في المضيفين الضعيفة مع أمراض الرئة الهيكلية الأساسية، مثل التليف الكيسي أو القصبات أو السل. كيف يصاب المرضى مع أبسسيسوس م. لا تزال غير واضحة. خلافا للعديد من البكتيريا، أبسسيسوس م. لم يتم العثور على في البيئة لكن قد تتواجد داخل الزحارية، البالعات البيئية التي تمثل خزان محتملة أبسسيسوس م. وفي الواقع، أبسسيسوس م. مقاومة البلعمه أمويبال والحياة داخل-أميبا ويبدو أن زيادة ضراوة م. أبسسيسوس في نموذج تجريبي للعدوى. ومع ذلك، يعرف الكثير عن ضراوة م. أبسسيسوس في حد ذاته. فك جينات تمنح ميزة للحياة داخل الخلايا أبسسيسوس م. ، وضعت عرض مكتبة متحولة ينقول م. أبسسيسوس . في موازاة ذلك، تم تطوير طريقة لاستخراج الحمض النووي الريبي من البكتيريا داخل الخلايا بعد ثقافة المشارك مع الزحارية. هذا الأسلوب تم التحقق من صحتها ويسمح تسلسل كله أبسسيسوس م. ترانسكريبتوميس داخل الخلايا؛ تقدم، لأول مرة، نظرة عالمية على أبسسيسوس م. التكيف مع الحياة داخل الخلايا. كلا النهجين تعطينا نظرة ثاقبة في عوامل الفوعة أبسسيسوس م. تمكن م. أبسسيسوس لاستعمار الشعب الهوائية في البشر.

Introduction

جنس متفطره يشمل الأنواع تتراوح بين الكائنات saprophytic غير مؤذية لمسببات الأمراض البشرية الرئيسية. الأنواع المسببة للأمراض المعروفة مثل بكتريا السلو بكتريا marinum المقرحة متفطره تنتمي إلى المجموعة فرعية النمو البطيء المتفطرة (SGM). وفي المقابل، الفريق الفرعي للنمو السريع المتفطرة (رجم) تتميز بقدرتها على تشكيل مستعمرات مرئية في أقل من 7 أيام في المتوسط أجار. وتضم المجموعة رجم الأنواع أكثر من 180، المتفطرة saprophytic غير ممرضة أساسا. الدراسات المتعلقة برجم التفاعلات مع مضيفيهم ركزت أساسا على بكتريا سميجماتيس وإثبات أن هذه البكتيريا قد أزيلت سريعاً بفعل جراثيم الضامة.

متفطره أبسسيسوس هو واحد من رجم النادرة التي المسببة للأمراض للبشر، ومسؤولة عن طائفة واسعة من الأمراض بدءاً بالجلد والتهابات الأنسجة الرخوة للالتهابات الرئوية ونشرها. ويعتبر أبسسيسوس م. ، جنبا إلى جنب مع بكتريا بالمتفطره، أن الممرض المتفطرات الرئيسي في مرضى التليف الكيسي1.

تشير مختلف الدراسات التي أجريت على أبسسيسوس م. أن هذا المتفطرة يسلك ممرض داخل الخلايا، قادرة على النجاة من جراثيم استجابة الضامة والليفية في الرئتين والجلد، والتي لا تحترم عادة في رجم 2 , 3 , 4-تحليل الجينوم أبسسيسوس م. وقد حددت المسارات الأيضية التي توجد عادة في الكائنات المجهرية البيئية على اتصال مع التربة، والنباتات والبيئات المائية، حيث غالباً ما تكون الزحارية الحرة الحالية5. قد أثبتت أيضا أن أبسسيسوس م. يتمتع بجينات الفوعة عدة لا توجد في رجم saprophytic وغير ممرضة، ربما حصل عليها نقل الجينات الأفقي في مكانة مواتية لتبادل الوراثية التي قد جمع البكتيريا المقاومة أميبا المختلفة.

تجريبيا، كان أحد نتائج ملفتة للنظر الأولى مراقبة النمو داخل الخلايا من أبسسيسوس م. في الضامة، وكذلك فيما يتعلق السل م.6. أبسسيسوس م. كما يقاوم التحمض يبلوع والمبرمج وأوتوفاجي، ثلاث آليات أساسية لمقاومة العدوى2الخلوية. بل ثبت أن أبسسيسوس م. يكون قادراً على إنشاء رسالة فورية بين يبلوع وسيتوسول، بيئة أكثر الغنية بالمغذيات التي قد تشجع على تكاثر البكتيريا2. جداً لا يعرف الكثير عن مزايا الجينوم أن أبسسيسوس م. تمتلك أو اكتسب للسماح بالبقاء على قيد الحياة في بيئة داخل الخلايا. كوكولتوري أميبا هو أسلوب فعال يسمح بعزل العديد من البكتيريا المقاومة أميبا جديدة بكتريا ماسيلينسي7،8. ولوحظ قدرة على ضرب داخل الزحارية، في نموذج هباء M. أبسسيسوس في الفئران، التي يمكن أن تضفي زيادة فوعة إلى أبسسيسوس م.4. فرضية واحدة هي أن أبسسيسوس م. وضعت الصفات الوراثية مصادفة في إطار هذه البيئة البقاء على قيد الحياة في خلايا متجولة، التي تختلف عن الأخرى رجم غير ممرضة. قد تفضل هذه المقتنيات قدرة على الانتشار وشدته في المضيف البشري.

ويصف هذا التقرير أدوات وأساليب لتسليط الضوء على مزايا الجينوم الممنوحة إلى أبسسيسوس م. البقاء على قيد الحياة في بيئة الزحارية. لهذا الغرض، فحص طفرات ينقول م. أبسسيسوس هو وصف لأول مرة، في سلالة نوع شوكميبة كاستيلاني ، مما يتيح تحديد معيبة للمسخ للنمو داخل الخلايا. ويقال أيضا لفحص ثان في الضامة، لتأكيد إذا كان هذا الخلل ما زال قائما في المضيف البشري. وثانيا، لفهم الآليات التي يتم تسخيره في أبسسيسوس م للتكيف مع الحياة في متجولة الخلايا وزيادة شدته في البلد المضيف الحيواني، وأسلوب مكيفة خصيصا أبسسيسوس م. وقد وضعت، بعد ثقافة المشارك حضور الزحارية الذي يسمح باستخراج الحمض النووي الريبي مجموع من البكتيريا داخل أمويبال. نتيجة لذلك، تم تطوير رؤية شاملة للجينات أبسسيسوس م. التي مطلوبة من أجل حياة داخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-مكتبة الفرز

  1. بناء المكتبة متحولة تينيسي
    1. الحصول على مكتبة ينقول.
      ملاحظة: هذه التجربة، حصل مكتبة ينقول متحولة من روبين اكساجولا، "مدرسة هارفارد للصحة العامة"، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية. المكتبة شيد من سلالة سريرية سلس (43S) أبسسيسوس م. مجمع (م. أبسسيسوس subsp. ماسيلينسي) مع فاجيميد أدخلت أبسسيسوس م. السماح بإدراج عشوائي وحيد Tn إلى دينوكليوتيدي تا (91,240 تا تسلسل جينوم م. أبسسيسوس ). لمزيد من التفاصيل انظر المرجع لروبين et al. 9 ولاينسينا et al. 10.
  2. معايرة المكتبة والمحافظة على طفرات أبسسيسوستن م في لوحات
    ملاحظة: هذا يستغرق أسبوعا واحداً.
    1. ذوبان الجليد في مكتبة على الجليد. تحديد تركيز البكتيريا عن طريق إجراء تخفيف المسلسل في 1 مل من الماء (10-1 إلى 10-15). لوحة قطره من كل تمييع على طبق بتري يحتوي على 7 ح 11 أجار المتوسطة مع كاناميسين 250 ملغ/مل. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
      ملاحظة: هنا، معايرة 1011 البكتيريا/مل تم انتشال.
    2. بعد تحديد تركيز المكتبة، تخفف من المكتبة إلى نهائي تركز البكتيريا مليلتر 3,000 في 10 مل ماء والغليسيرول 25%. قاسمة المكتبة في كريوتوبيس 10 مع 1 مل المكتبة في كل أنبوبة. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
    3. عندما تكون جاهزاً لاستخدام، ذوبان الجليد قاسمة واحد من مكتبة المخفف على الجليد وإضافة 100 ميليلتر من المكتبة إلى 10 لوحات أجار مولر هينتون (MH) مربعة (حجم 12 سم) لاسترداد المستعمرات الفردية 200 إلى 300 بعد 3 – 4 أيام حضانة عند 37 درجة مئوية.
    4. مع المسواك العقيمة، نقل المستعمرات الفردية (حوالي 6,000 المستعمرات في لوحات 60 × 96-جيدا) إلى لوحات 96-بئر مليئة ميليلتر 200 من ح 7 9 المتوسطة وتستكمل مع 0.2% والغليسيرول، 1% جلوكوز، 250 ملغ/مل من كاناميسين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام دون المصافحة.
    5. نقل 100 ميليلتر للثقافة (الخطوة 1.2.4) إلى لوحة 96-كذلك تحتوي على 100 ميليلتر من ح 7 9 المتوسطة مع والغليسيرول 40%. مخزن المكتبة المطلوبة في-80 درجة مئوية.
    6. كرر الخطوات 1.2.3. ل 1.2.5. مع بقية المكتبة حتى 10,000 استنساخ الفردية يتم استردادها (حول اللوحة 100 × 96-جيدا ولوحات MH 30).
  3. إعداد الزحارية
    1. الثقافة أميبا شوكميبة كاستيلاني (AC) في 75 سم2 قوارير زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 30 مل من PYG المتوسطة (الجدول 1) لتضخيم الخلية خط11.
      ملاحظة: النواشط ناضجة من خلايا لاصقة كبيرة مع العديد من فاكوليس الجهاز الهضمي تكون مرئية بوضوح في مجهر. ويقدر الخلية مضاعفة الوقت تكون خلايا 25 h. تم تضخيم كل 3 أيام بنشر ثلث الثقافة الأولية في 75 سم2 قوارير زراعة الأنسجة.
    2. إزالة المتوسطة PYG مع ماصة 25 مل. تغسل الخلايا مع 10 مل من المخزن المؤقت للتيار المتردد (الجدول 2)، التي لا تحتوي على مصادر الكربون أو النيتروجين أي12. تكرار الغسيل مرتين أكثر.
      ملاحظة: ميلان المخزن المؤقت الذي يحتوي على لا مصادر الكربون أو النيتروجين يتجنب نمو المتفطرة خارج الخلية. هذا متوسط الحد الأدنى يؤدي إلى انسيستمينت الزحارية. للحد من ذلك، أضيفت إبطال الحرارة كولاي اعتبارها ركيزة (الخطوة 1.4) إلى الزحارية وجرى الترويج مرات الثقافة قصير جداً (48 ح للمسخ الفحص) وثقافة 4 h أو 16 h للتجارب رناسيق. بدلاً من ذلك، استخدام هذه الوسيلة لكن التخصيب مع PYG المتوسطة (عادة 10%).
    3. فصل الاميبا من أسفل قارورة بهزة قوية واحدة من قارورة زراعة الأنسجة.
    4. حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير لضبط تركيز الخلية إلى 5 × 105 الزحارية/مل مخففة في المخزن المؤقت للتيار المتردد.
  4. إعداد إبطال الحرارة الإشريكيّة القولونية بكتيريا لإطعام أميبا بعد الإصابة
    1. تنمو سلالة كولاي عزل السريرية من مخزون والغليسيرول في 100 مل من مرق لوريا (رطل) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. حصاد البكتيريا بالطرد المركزي في س 1,835 ز لمدة 10 دقائق في أنابيب 50 مل. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه مع 10 مل ماء والغليسيرول 10%. تكرار الغسيل مرتين أكثر.
    3. ريسوسبيند بيليه مع 5 مل مياه والغليسيرول 10%. الكوة مل 0.5 إلى 1.5 مل أنابيب. تحديد كمية البكتيريا مليلتر بالمنفذ التسلسلي تخفيف وإضافة تخفيف على ألواح أجار رطل. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
    4. اليوم قبل الإصابة بالاميبا، ذوبان الجليد قاسمة واحد على الجليد والشروع في قتل الحرارة التي تفرخ الأنبوب عند 70 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: التحقق من المنظمة بطلاء 100 ميليلتر من البكتيريا المعطل على لوحات أجار رطل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. يجب أن تكون لا مستعمرات مرئية بعد ليلة واحدة من الثقافة.
    5. تضعف البكتيريا قتلت الحرارة إلى تركيز البكتيريا7 10 في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للتيار المتردد وتخزين البكتيريا المخفف عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد لا أكثر.
  5. ثقافة المشارك الزحارية-م. أبسسيسوس Tn متحولة: أولاً الشاشة
    ملاحظة: هذا يأخذ 3-4 أشهر لفحص طفرات 6,000.
    1. انتشار 5 × 104 الزحارية/بئر إلى لوحة 96-جيدا في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للتيار المتردد. احتضانها ح 1 عند 32 درجة مئوية دون المصافحة. يسمح الوقت trophozoïtes أميبا العائمة على التمسك بالآبار.
      1. حين تفرخ، ذوبان الجليد البكتيريا على الجليد ح 1.
    2. إضافة 5 ميليلتر من الثقافات البكتيريا المذابة مع ماصة متعددة القنوات إلكترونية. إصابة ل h. 1.5 شاشة حول 6,000 استنساخ فردية من لوحة 96-جيدا Tn طفرات الأسهم.
      ملاحظة: وزارة الداخلية غير معروف في هذه الخطوة من البروتوكول؛ ومع ذلك، كانت تزرع جميع لوحات 96-كذلك يتضمن طفرات Tn بالضبط بنفس الطريقة. هذه الشاشة الأولى يهدف إلى التعرف بسرعة داخل الخلية طفرات ناقصة، دون النظر الاختلافات في كثافة العدوى.
    3. بعد ح 1.5 من العدوى، عكس لوحة 96-جيدا على جاوزيس العقيمة التي توضع في علبة معدنية معقمة لإزالة المتوسطة AC تحت غطاء دخان. تعبئة مع 200 ميليلتر من المتوسطة AC. كرر هذا يغسل مرتين أكثر.
    4. إضافة 200 ميليلتر من الطازجة المتوسطة وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل اميكاسين للقضاء على البكتيريا خارج الخلية المتبقية.
    5. احتضانها ح 2 قبل المتابعة مع الغسالات إضافية 3 (كما هو موضح في الخطوة 1.5.3). بعد الغسيل، الحفاظ على الثقافات مع 50 ميكروغرام/مل اميكاسين في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للتيار المتردد.
    6. إضافة 5 × 107 إبطال الحرارة البكتيريا الإشريكيّة القولونية (من الخطوة 1، 4) في نهاية العدوى وكل 24 ساعة لمنع انسيستمينت الزحارية.
    7. بعد 48 ساعة ثقافة المشتركة، الخلايا بإضافة 10 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% (دوديسيل كبريتات الصوديوم) لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 32 درجة مئوية. المضي قدما في تمييع المسلسل وإضافة على لوحات أجار كولومبيا التي تحتوي على 5% الأغنام الدم (COS اللوحات) لتقييم عدد البكتيريا داخل الخلايا. ختم اللوحة مع بارافيلم واحتضان عند 37 درجة مئوية.
    8. عندما تظهر على لوحات أجار بعد 3-4 أيام، صورة اللوحة المستعمرات وتحديد طفرات إعاقة للنمو داخل الخلايا من خلال مراقبة الودائع مع أقل عدد من المستعمرات البكتيرية.
      ملاحظة: لا تمانع حول الشكل أو الطول أو الكثافة مستعمرة (الشكل 1أ). وتم تحديد طفرات 136/6000.
  6. ثقافة المشارك الزحارية-م. أبسسيسوستن متحولة: الشاشة الثانية من المسوخ التي تم تحديدها خلال الشاشة الأولى
    ملاحظة: هذا يستغرق أسبوعين. يجب أن يتم شاشة ثانية مع طفرات الموهنة 136 التي تم الحصول عليها بعد الشاشة الأولى لتقدير عدد البكتيريا تلقيح على وجه الدقة والعدد من البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا البكتيريا 2 يوما بعد الإصابة.
    1. نمت مستعمرة 1 لكل متحولة أثرت في 50 مل أنابيب مليئة 20 مل ح 7 9 المتوسطة وتستكمل مع والغليسيرول 0.2% والجلوكوز 1% 250 ملغ/مل من كاناميسين. تسمح للبكتيريا للوصول إلى المرحلة الأسية (0.6 < OD < 0.8).
    2. أغسل الثقافة بالطرد المركزي (1,835 س ز لمدة 10 دقائق) في المتوسط AC. تجاهل المادة طافية. تكرار هذا يغسل مرتين أكثر مع 20 مل ح 7 9 المتوسطة وتستكمل مع والغليسيرول 0.2% والجلوكوز 1% 250 ملغ/مل من كاناميسين.
    3. ريسوسبيند البكتيريا في 5 مل من المخزن المؤقت للتيار المتردد.
    4. تحديد مستعمرة تشكيل وحدة (زيمبابوي) تركيز طفرات. في لوحات 24-جيدا، وإضافة 1 مل من الماء للصفوف الأولى والثانية. إضافة 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية إلى البئر الأولى. مع ميكروبيبيتي، خلط ثلاث مرات. ثم نضح 100 ميليلتر والإيداع في الثانية أيضا.
    5. مع معلومات جديدة، كرر الخطوة 1.6.4 من البئر الثانية إلى الثلث، و ما إلى ذلك حتى الثانية عشرة تماما.
    6. نضح 30 ميليلتر لتمييع 10-12 وإضافته إلى لوحة كوس. كرر تخفيف الأخرى.
    7. التفاف لوحة كوس مع بارافيلم واحتضان لمدة 3 – 4 أيام في 37 درجة مئوية. تحديد التركيز قبل عد المستعمرات.
    8. إجراء فحوصات ثقافة المشاركة كما هو موضح أعلاه في ثلاث نسخ في صفيحة 24-جيدا مع 5 × 104 أميبا كل بئر في 1 مل من التيار المتردد المشارك الثقافة المتوسطة. تلقيح مع عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) من 10.
    9. بعد 48 ساعة ثقافة المشارك، المضي قدما في تحلل الخلية كما هو موضح في الخطوة 1.5.7. إجراء تخفيف المسلسل في الماء (10-1 إلى 10-6)، وإضافة 30 ميليلتر إلى لوحات كوس. احتضان اللوحات لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية قبل الشروع في فرز الأصوات في زيمبابوي.
      ملاحظة: بعد هذه الشاشة الثانية, قد حفظت 60 طفرات 136.
    10. تخزين طفرات أثر للبقاء على قيد الحياة داخل الخلايا. إضافة مستعمرة كريوتوبي التي تحتوي على المتوسط رطل مع الجلسرين (20% النهائي) أو في كريوتوبي التي تحتوي على الحل التجاري وميكروبيدس صالح حفظ الطويل الأجل وتسهيل تلقيح مستقبلا وثم تخزينها في-80 درجة مئوية.
    11. تقييم نمو المسخ في المختبر بقياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر كل يومين.
      1. ينمو 1 مستعمرة لكل متحولة أثرت في أنابيب 50 مل مليئة 20 مل ح 7 9 المتوسطة وتستكمل مع والغليسيرول 0.2% والجلوكوز 1% 250 ملغ/مل من كاناميسين. تسمح للبكتيريا للوصول إلى المرحلة الأسية (0.6 < OD < 0.8) قبل ضبط التوجيه التشغيلي إلى 0.01 للبدء الحركية.
      2. استبعاد طفرات مع في المختبر نمو عيب بالمقارنة مع سلالة WT من مجموعة طفرات ناقصة داخل الخلايا.
  7. ثقافة المشارك الضامة-م. أبسسيسوس Tn متحولة معيبة لحياة داخل-أميبا
    ملاحظة: يأخذ هذا الشهر 1.
    1. انتشار 5 × 104 J774.2 الضامة مورين كل بئر صفيحة 24-جيدا في 1 مل من الغنية المتوسطة، دميم وتستكمل مع 10 ٪ من مصل العجل الجنين (FCS). احتضان اللوحات عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 للسماح بانضمام بلعم. توفير 3 replicates.
    2. إجراء العدوى. تطعيم طفرات تينيسي ، مع موي 10، تضعف في دميم مع السفح 10% في حجم 100 ميليلتر.
    3. بعد 3 ساعات إصابة، أداء الغسالات الثلاث مع 1 مل دميم (يمكن استخدام مضخة فراغ). ثم علاج مع 250 ميكروغرام/مل اميكاسين (في دميم مع السفح 10 ٪) ح 1 للقضاء على البكتيريا خارج الخلية المتبقية.
      1. بعد 3 إضافية يغسل مع 1 مل دميم، الحفاظ على الثقافات في 250 ميكروغرام/مل اميكاسين (في دميم مع السفح 10 ٪) لوحدة تخزين نهائي 1 مل لمنع تكاثر المتفطرات خارج الخلية.
    4. إزالة المتوسط ح 72 بعد الثقافة المشتركة، والضامة بإضافة 1 مل ماء البارد. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    5. إجراء فحوصات زيمبابوي على لوحات كوس لتقييم العدد من البكتيريا داخل الخلايا.
      1. في صفيحة 24-حسنا، أضف 1 مل من الماء للصفوف الأولى والثانية. إضافة 100 ميليلتر من الخلية المشارك ليستي إلى البئر الأولى. مع ميكروبيبيتي، خلط ثلاث مرات. نضح 100 ميليلتر وإيداعها في الثانية أيضا.
      2. مع معلومات جديدة، كرر التخفيف من البئر الثانية إلى الثلث، و ما إلى ذلك حتى الثانية عشرة تماما. ثم نضح 30 ميليلتر لتمييع 10-12 وإضافته إلى لوحة كوس.
      3. كرر تخفيف الأخرى. التفاف لوحة كوس مع بارافيلم وانتظر 3-4 أيام لمراقبة وحساب المستعمرات.
  8. تحديد وترتيب الموقع للإدراج تينيسي في طفرات أبسسيسوس م.
    ملاحظة: هذا يستغرق أشهر 1.5 لطفرات 60.
    1. استخراج الجينوم تحديدهم طفرات أبسسيسوس م.
      1. تنمو طفرات في أنبوب 50 مل مع 20 مل ح 7 9 المتوسطة وتستكمل مع والغليسيرول 0.2% والجلوكوز 1% كاناميسين 250 ملغ/مل للمرحلة الأسية (OD600= 0.8).
      2. حصاد 10 مل الثقافات (2,396 س ز، 5 دقيقة). تجاهل المادة طافية. تعليق البكتيريا في 500 ميليلتر من الحل الأول (السكروز 25 ٪، 50 مم تريس pH 8، lysozyme 10 ملغ/مل، وال 40 ملم). نقل الحل إلى أنابيب 2 مل مع سداده ملولبة واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
      3. إضافة 500 ميليلتر للحل الثاني (السكروز 25 ٪، 50 مم تريس pH 8، 50 مم يدتا). بعد بيبيتينج أعلى وأسفل إضافة 5-10 مرات، الخرز الزركونيوم حتى حجم 500 ميليلتر في الأنبوب.
      4. المضي قدما في تحلل الخلية مع الخالطون (3 x 6,000 لفة في الدقيقة، 45 ثانية) مع حضانة 1 دقيقة على الجليد بين كل جولة.
      5. إضافة 5 ميليلتر من 20 ملغ/مل بروتيناز ك (100 ميكروغرام/مل النهائي) واحتضان العينات بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية.
      6. أضف 1 مل البرد في الكحول الفينول/كلوروفورم/إيسواميل (25:24:1) تحت غطاء دخان. خلط العينات التي فورتيكسينج قبل الشروع في استخدام الطرد المركزي في الرايت و 16,500 س ز لمدة 30 دقيقة.
      7. بعد الطرد المركزي، استعادة المرحلة المائية وإضافة وحدة تخزين مساوية للحل الباردة الفينول/كلوروفورم/إيسواميل الكحول تحت غطاء محرك السيارة. الطرد المركزي هذه العينات في س 16,500 ز مدة 30 دقيقة لاستعادة المرحلة المائية مرة أخرى.
      8. إضافة إلى حجم 0.7 من الايزوبروبانول RT إلى مرحلة تعافي مائي تحت غطاء دخان. عكس ببطء من الأنابيب للسماح لترسيب الحمض النووي واحتضان 5 دقيقة في الرايت ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في س 16,500 ز والرايت
      9. إزالة المادة طافية وتغسل بيليه مع 500 ميليلتر من الإيثانول 70% تحت غطاء محرك السيارة. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 16,500 س ز على RT قبل إزالة في الإيثانول. احتضان لمدة 10 دقيقة للسماح للتبخر الكحول المتبقية.
      10. وأخيراً، تعليق بيليه الحمض النووي في 100 ميليلتر من الدناز/رناسي المياه مجاناً. تحديد الحمض النووي DNA الغلة ونقاء مع جهاز المطياف الضوئي.
      11. إزالة 1 ميكروغرام المجينية الحمض النووي وهضم مع 10 يو قارتهم لليلة واحدة للاستنساخ الفرعي في موقع الإدراج تينيسي . استخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
        ملاحظة: القانون المدنيأنا إنزيم من إنزيمات تقييد الأكثر تمثيلاً في الجينوم أبسسيسوس م. (2,173 تقييد المواقع). القانون المدنيأنا الموقع القيد موجود أيضا في تسلسل Tn المنبع كاسيت المقاومة كاناميسين متحولة تينيسي. وهكذا، أنا توسطت سوبكلونينغ القانون المدنيتمكن من تحديد موقع الإدراج تينيسي.
    2. الاستنساخ الفرعي في بلازميد دنا الجينومي المتضمن في تينيسي
      ملاحظة: قبل المضي تينيسي-سوبكلونينغ في 2,686 بي بي pUC19 الأمبيسلّين المقاوم بلازميد، إضافة القانون المدنيأنا الموقع التقييد في موقع بلازميد متعددة الاستنساخ. يمكن العثور على تسلسل بلازميد pUC19 في هذا الرابط https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. تتبع الشركة المصنعة البروتوكول لهضم بلازميد pUC19 مع عكرالأول و هندالثالث، الذي تصدر جزء من 51 شركة بريتيش بتروليوم، وجزء من هناك 2635 تنقية ناقل هضمها مزدوجة مع مجموعة تنقية PCR تجارية القضاء 51 بي بي الإفراج عن جزء.
      2. ميكس 1 ميليلتر (تركيز 25 pmol/ميليلتر) من اثنين النوكليوتيد التكميلية (5 'أجكت تاتا أجاتكت تاتا أتكجات TATA3' و 5 'محكمة الاستئناف الإدارية ﻷعمالهم ﻷعمالهم TCG توري آتا أغا TCT تأت A3') من 28 شركة بريتيش بتروليوم تحتوي كل منها على القانون المدنيأنا الموقع قيد وفي نهايات هندالثالث و عكر أنا مواقع التقييد. الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم بارد بغية إلزام لهم.
      3. هضم الإشعال المقترنة عكرأنا و هندالثالث وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      4. اضطر 150 نانوغرام من عكرأنا/التحقق بلازميدهندpUC19 المقيدة-ثالثا مع تركيز مختلفة من إقران الإشعال (50 pmol/ميليلتر، 25 pmol/ميليلتر، 2.5 pmol/ميليلتر) عن ح 1 في الرايت مع ليجاسى يو دنا T4 1 في وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر. الاستنساخ بمختلف الهضم الأنزيمي.
      5. هضم بلازميد المعدلة القانون المدنيأنا ح 2 في 37 درجة مئوية.
      6. اضطر 50 نانوغرام من القانون المدنيمقيدة أنا pUC19بلازميد و 50 نانوغرام من الحمض النووي يهضم القانون المدنيأنا ح 1 في الرايت مع ليجاسى يو دنا T4 1 في 10 ميليلتر.
      7. انتقل إلى اليكتروكومبيتينت كولاي بكتيريا التحول مع 5-10 ميليلتر من الربط (2500 الخامس، 200 أوم، 25 µF). حدد المستنسخين على ألواح أجار رطل وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين لتحديد البكتيريا تحمل والبلازميدات مع أجزاء من تسلسلات تينيسي.
      8. تنمو استنساخ مقاومة بين عشية وضحاها في المتوسطة LB السائل باختيار المضادات الحيوية المناسبة (50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين).
      9. استخراج الحمض النووي بلازميد. تحقق من وجود الإدراج بتقييد الانزيمية وتسلسل 3 'نهاية تينيسي لتحديد الجينات تعطل مع اليغنوكليوتيد (تجاكجاجتكتكتجا 3' 5 ') المقابلة لأزواج قاعدة آخر 17 من كاناميسين تينيسي كاسيت المقاومة.
      10. محاذاة التسلسل ضد سلالة 06 انتقل م. أبسسيسوس بتنفيذ انفجار النوكليوتيدات (الانفجار-N).

2-الجيش الملكي النيبالي استخراج البكتيريا داخل الخلايا لتحليل رناسيق

ملاحظة: هذا يستغرق 4 أشهر للتجارب و 4 أشهر لتحليل رناسيق.

  1. ثقافة المشارك الزحارية-م. أبسسيسوس على دفعات
    ملاحظة: في التجربة التالية، يتم تنفيذ ثقافة المشارك في أنابيب 50 مل بالتحريض لصالح البكتيريا للاتصالات المحمولة.
    1. تنمو أبسسيسوس م في ح 7 9 المتوسطة وتستكمل مع والغليسيرول 0.2%، 1% جلوكوز إلى المرحلة منتصف أسي 120 لفة في الدقيقة.
    2. يغسل البكتيريا مرتين مع 10 مل من المخزن المؤقت للتيار المتردد.
    3. تقدير تركيز البكتيريا عن طريق قياس OD600nm (OD 1600= 4 × 108 mycobacteria). إضافة 8.5 × 108 mycobacteria إلى 8.5 × 106 الزحارية في 10 مل متوسطة AC.
    4. احتضانها ح 1 في 30 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف (حوالي 80 لفة في الدقيقة).
    5. حصاد الخلايا التي سينتريفوجينج في س 253 ز 12 دقيقة إزالة المادة طافية وتعليق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت للتيار المتردد. كرر هذا يغسل مرتين أكثر.
    6. ريسوسبيند الخلايا في 10 مل من التيار المتردد المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ميكروغرام/مل اميكاسين للقضاء على البكتيريا خارج الخلية واحتضانها ح 4 في 30 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف (80 لفة في الدقيقة). تغسل الخلايا مرتين مرة أخرى.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من داخل الخلايا أبسسيسوس م.
    ملاحظة: إجراء الخطوات 2.2.1–2.2.3 تحت غطاء الدخان الناجم عن استخدام المواد الكيميائية السامة.
    1. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الزحارية المصابة في 4 مل من محلول الباردة الثالث (الجدول 3) مع اكستيمبورانيوسلي 280 ميليلتر من β-mercaptoethanol لعرقلة الزحارية. وهذه هي الخطوة ثيوسيانات (GTC) جوانيدينيوم. الإبقاء على تعليق على الجليد لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي الخلية ليساتي عن 30 دقيقة في 2,396 س ز و 4 درجات مئوية بيليه البكتيريا داخل الخلايا المفرج عنهم.
    2. إزالة المادة طافية وتعليق بيليه البكتيرية في 1 مل من محلول الباردة الثالث. حصاد البكتيريا في 2396 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج ونقل إلى أنبوب المسمار 2 مل يحتوي على الخرز الزركونيوم (حتى تدرج 500 ميليلتر من الأنبوب). تخزين هذه الأنابيب لمالا يقل عن 24 ساعة في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: التخزين في الكاشف تحلل تراخيص المنظمة لحل رنسيس والخلية.
    3. عندما تكون جاهزاً للاستخدام، إذابة العينات في الثلج، ولهم مع الخالطون عن طريق إجراء جولتين في 6000 دورة في الدقيقة 25 ثانية، تليها جولة واحدة في 6000 دورة في الدقيقة 20 ثانية مع حضانة 1 دقيقة على الجليد بين كل جولة.
    4. يبرد العينة، احتضان لهم على الجليد لمدة 10 دقائق. قم بإضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم مخفف بالكحول إيسواميل. بعد فورتيكسينج عينات لمدة 1 دقيقة، الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 16,500 س ز و 4 درجة مئوية.
    5. إضافة 0.8 مل الكحول البارد إلى المرحلة المائية واحتضان هذه العينات ح 2 – 3 في 20 درجة مئوية. الطرد المركزي في نماذج لمدة 35 دقيقة في 16,500 س ز و 4 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية.
    6. أغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي بإضافة 500 ميليلتر من البرد 70% إيثانول (لا تخلط).
    7. الطرد المركزي هذه العينات في س 16,500 ز لمدة 10 دقيقة لإزالة في الإيثانول. نضح الحل وجاف في مركز الطرد مركزي.
    8. مرة واحدة المجففة، ريسوسبيند الكريات في 100 ميليلتر من الدناز/رناسي المياه مجاناً.
      ملاحظة: يجب أن تعامل العينات مرتين مع دناسيس إزالة الملوثات الحمض النووي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    9. تقييم نزاهة الجيش الملكي النيبالي على [اغروس] هلام والتأكد عن طريق قياس عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) ونسبة ريبوسومال مع أسلوب التفريد شعرية المستندة إلى شرائح.
      ملاحظة: يأخذ رين التتبع الغرواني الكهربي كاملة في الاعتبار. رين خوارزمية برنامج يسمح لتصنيف مجموع الجيش الملكي النيبالي، استناداً إلى نظام ترقيم من 1 إلى 10، مع 1 يجري الشخصية الأكثر المتدهورة و 10 يجري سليمة أكثر. للمضي قدما في إعداد مكتبة كدنا، يجب أن تكون رطبها أكثر من 8 ونسبة ريبوسومال [28/18S] على أعلى مستوى ممكن، قيمة مثالية 2، تبعاً للكائن الحي وخصائصه.
    10. تخزين عينات الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية حتى إعداد المكتبة كدنا للتسلسل.
  3. إعداد مكتبة كدنا
    1. للمضي قدما في إعداد مكتبة، استخدام أدوات توليف كدنا متاحة تجارياً (جدول المواد) باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    2. تحقق من المكتبة للتركيز والجودة على "رقاقة الحمض النووي".
      ملاحظة: يمكن تنفيذ أكثر دقة ودقة التقدير الكمي مع فحوصات كوانتيتيشن الحساسة على أساس الفلورسنت.
  4. مكتبة التسلسل
    1. تطبيع هذه العينات إلى 2 نانومتر، والمضي قدما للإرسال المتعدد وفقا لتنظيم تدفق الخلية.
    2. تؤذي العينات بتركيز 1 نانومتر باستخدام هيدروكسيد الصوديوم N 0.1 لمدة 5 دقائق في الرايت
    3. تمييع العينات في 10:00 م. تحميل كل عينة على الخلية تدفق الساعة 10:00 م.
    4. المضي قدما في التسلسل مع نظام تسلسل الفائق التي تمكن الجينوم واسعة النطاق. هنا تم التشغيل تشغيل إدارة المخاطرة الاستراتيجية (ريال: قراءة واحدة، PE: يقرأ نهاية الاقتران، م: متعدد عينات) دورات 51 مع 7 فهرس قواعد القراءة.
    5. تقييم جودة التسلسل مع برنامج فاستقك الخارجية13.
    6. بعد تشذيب تسلسل محول، المضي قدما في قراءة التحالفات ضد جينوم إشارة. قم بمحاذاة ضد جينوم خلية حقيقية النواة لتقييم التلوث بعينه، وإذا لزم الأمر، الشروع في اقتطاع يقرأ غير الجرثومي.
  5. التحليل الإحصائي
    1. استخدام عدة برامج البرمجيات المتاحة على الإنترنت لتعريف مجموعات من الجينات أعرب الأثران: برامج البحث والتطوير، والحزم بيوكوندوكتور بما في ذلك DESeq2 ومجموعة PF2tools (الإصدار 1.2.12) وضعت في المنهاج "الترنسكربيتوم et Epigénome" (باستور المعهد، باريس).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أبسسيسوس م. لديه القدرة على مقاومة والهروب من الردود جراثيم الضامة والبروتوزوا البيئية مثل الزحارية. أبسسيسوس م. وتعرب عن عوامل الفوعة عندما نمت على اتصال الزحارية، مما يجعلها أكثر شراسة في الفئران4. وكان الهدف الأول لهذه الأساليب لتحديد الجينات الموجودة في أبسسيسوس م. السماح بقاء وتكاثر داخل الزحارية.

لهذا، تم فحص مكتبة متحولة من أبسسيسوس م. subsp. ماسيلينسي، التي حصلت عليها Tn التسليم9، أثر الثقافة المشارك حضور الزحارية، تحديد طفرات النمو الموهنة في هذا داخل الخلايا البيئة (الشكل 1). تم أيضا تقييم سلوك طفرات نفس أثر الثقافة المشارك مع الضامة لتحليل ما إذا كان الحفاظ على هذا النمو التوهين في الفئران الضامة.

مكتبة ينقول الأعمى هذا الفحص النهج، أكدت النمط الظاهري النسخ متماثل معيبة ل 47 طفرات 6,000 التي كان البقاء على قيد الحياة بنسبة 50% أو أقل في الزحارية و/أو الضامة، مقارنة مع الضوابط10. لاستبعاد قيمت طفرات بالبقاء داخل الخلايا الموهنة التي قد تكون نتيجة عيوب نمو جوهري لبكتريا، النمو منحنيات كل المحدد تينيسي طفرات في وسيلة ثقافة سائل العالي التخصيب في المختبر (1% الجلوكوز-7 ح 9). ويرصد في المختبر نمو جميع طفرات عقب OD600 الثقافات كل يومين. طفرات مختلفة التي عرضها في المختبر نمو عيب مقارنة لسلالة البرية من نوع المقابلة استبعدت من الدراسة.

من المهم لهذا الاختبار الأعمى تكون تتكرر كل يوم باستخدام البروتوكول نفسه بالضبط. الحد من هذا الأسلوب في الفحص المرئي الأول، والتقطت صور فوتوغرافية لكل من زيمبابوي لتقديم صورة دقيقة للرجوع إليها. في هذه المجموعة من طفرات، حددت 12 م. أبسسيسوس طفرات (شملت التكرارات) ينقول إدراج جينات تابعة لموضع ESX-4 من نوع نظام إفراز السابع الذي يؤكد أهميته في داخل الخلايا نمو أبسسيسوس م.10.

حتى الآن، تحليل فوعة أبسسيسوس م. أساسا استند التحليل المقارن لجينوم أبسسيسوس م. مع أن م. كلوني، متفطره ينتمون إلى نفس المجموعة ولكنها تسبب التهابات فقط الجلد في البشر. وكان الهدف الحصول على قائمة بالجينات وأعرب خلال ظروف مختلفة ثقافة المشارك من أجل فهم أفضل للتكيف، ويحتمل أن تكون ضراوة الآليات المعنية خلال ثقافة المشارك حضور الفنية البيئية البالعات. تم إجراء تحليل لهذا زيادة ضراوة من خلال اتباع نهج شامل لتسلسل مجموع رسول الكشف من م. أبسسيسوس، من أجل كشف الكشف التي يسببها أو مكبوتة خلال الثقافات المشارك أميبا مقارنة بالكشف نسخها من تحت الشروط في المختبر . يمكن أن تمنح التعبير التفاضلية من الكشف هذه إلى أبسسيسوس م. تعزيز "فوعة" شرح استعمار الشعب الهوائية العليا في البشر.

هذه الثقافات المشتركة مرة أخرى نفذت في متوسط الحد أدنى (أي مصدر للكربون أو النيتروجين) كما هو موضح أعلاه، بغية الحيلولة دون نمو الخلية أبسسيسوس م. وأن تكون ممثلة للظروف البيئية التي تواجهها هذه المتفطرة وتحت الضغط اختيار المضادات الحيوية طوال فترة الثقافة المشتركة لتحديد البكتيريا داخل الخلايا.

ولذلك، تم تطوير تقنية لعزل الحمض النووي الريبي من البكتيريا داخل الخلايا. أن الصعوبة الرئيسية مع هذا الاستخلاص من المتفطرات الجيش الملكي النيبالي كان تجنب تلويث مع أمويبال الحمض النووي الريبي (نوع يوكاريوتي). لتجنب هذا الأمر، قد أنجز تحلل أميبا في أوقات مختلفة وظيفة الثقافة المشارك، باستخدام جوانيدينيوم ثيوسيانات (GTC)؛ فمقاومة البكتيريا داخل الخلايا. بعد هذه الخطوة، أجريت استخراج الكشف المتفطرات ميكانيكية استخدام خلية الخالطون حضور الخرز الزركونيوم. هذا الأسلوب يسمح لنا بالحصول على الحمض النووي الريبي المتفطرات من نوعية جيدة، مع عدد رين ذات جودة عالية، ضرورية لتحسين القدرة على إجراء تحليل كامل الترنسكربيتوم م. أبسسيسوس ، باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) تقنية (الشكل 2). وهذا ما لم يحدث قبل وقدم لنا رؤية أساسية لأسر الجين المستحث أو القمع، بتجميعها وفقا لدورها: رد أبسسيسوس م. على بيئة محدودة في مصدره من المواد الغذائية والمعادن، وإلى التاكسج أو البيئة الحمضية والمقاومة من م. أبسسيسوس للأكسدة و nitrosative الإجهاد وأخيراً التعبير عن ضراوة م. أبسسيسوس في أميبا البيئية.

Figure 1
الشكل 1 : أ-الشاشة المرئية الأولى من م. أبسسيسوس Tn طفرات في أميبا. شاشة Tn طفرات في الزحارية واسعة النطاق (A) يتم إجراؤها في لوحات 96-جيدا مع تعدد عشوائي من العدوى التعرف بسرعة على طفرات الموهن. (ب) تحديد طفرات Tn الموهنة تعطل الجينات. تم تجزئة الحمض النووي Tn طفرات مع القانون المدنيالأول لاستنساخ الموقع الإدراج تينيسي . م. أبسسيسوس الجينوم المرافئ 2500 القانون المدنيأنا تقييد المواقع التي تفضل الحصول على الحمض النووي قصيرة شظايا لكن خفض احتمال لاستنساخ الموقع الإدراج تينيسي (1/2500). ويتم اختيار المستنسخين مع كاناميسين، تحمل المقاومة قبل ينقول. يتم تعريف الجينات تعطل بالتسلسل مع تمهيدي داخل كاسيت المقاومة كاناميسين تينيسي (السهم الأسود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحليل لاستخراج الحمض النووي الريبي المتفطرات. (أ) الجيش الملكي النيبالي استخراج داخل الخلايا أبسسيسوس م. أثناء الزحارية-م. أبسسيسوس ثقافة المشارك. الزحارية الثقافات المشتركة مع أبسسيسوس م تتم في تعدد عالية من العدوى (أي، 100)، بكميات كبيرة، مع التحريض لطيف، لصالح خلية للاتصالات البكتيريا. بعد الثقافات المشتركة، وحصاد الخلايا وتفكيك مع مزيج من بليون طن من الكربون و ß-mercaptoethanol. البكتيريا المحتوية على ليساتي الخلية يتم التعامل مع بليون طن من الكربون مرة أخرى إلى إضعاف جدار الخلية البكتيريا لتسهيل تحلل البكتيريا ميكانيكي قبل استخراج الحمض النووي الريبي. (ب) الجيش الملكي النيبالي تقييم الجودة والسلامة مع بيواناليزير. وتعطي جل التفريد الذي لوحظ الرنا الريباسي (23S و 16S و 5S). يجب أن يكون رين أعلاه 8 المضي قدما في إعداد المكتبة للتسلسل والرنا الريباسي نسب (23S/16) على أعلى مستوى ممكن تبعاً للكائن الحي، والقيمة المثالية 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

سلوك أبسسيسوس م. يشبه أكثر بكثير لسلوك SGM المسببة للأمراض مثل السل م من أي المتفطرة أخرى تنتمي إلى رجم2. والعنصر الأساسي في الأمراض التي تسببها SGM هو قدرتها على البقاء على قيد الحياة أو حتى تتكاثر داخل خلايا مستضد-عرض، مثل الضامة، والخلايا الجذعية.

أبسسيسوس م. قد اكتسب بعض مزايا الجينوم كما يتضح من مجموع تسلسل الجينوم في14 من أجل البقاء على قيد الحياة داخل خلية حقيقية النواة متجولة. جينوم أبسسيسوس م. لقد ثبت لأن تتطور بسرعة والبلاستيك جداً، مع العديد من مؤخرا عرض سلاسل الإدراج مثل بروفاجيس و جينات جديدة15. على الرغم من أن هناك بيانات أقل في الفوعة العوامل في أبسسيسوس م. مقارنة السل م، أبسسيسوس م. يبدو أن تكون قادرة على أن تتطور بسرعة ونشاط نحو زيادة ضراوة. وحتى الآن، تحليل فوعة أبسسيسوس م. يستند أساسا إلى التحليل المقارن لجينوم أبسسيسوس م. مع أن م. كلوني، متفطره ينتمون إلى نفس المجموعة ولكنها تسبب التهابات محدودة إلى الجلد في البشر. بعض الجينات لا يقدم في كلوني م. ولكن موجودة في أبسسيسوس م.، مثل phospholipase C، جزئيا شرحت مقاومة أبسسيسوس م. بعد البلعمه الزحارية البيئية4.

تطوير أسلوب ثقافة المشارك أميبا تستكمل مع العينات البيئية أثبتت التفاعلات لا لبس فيه أميبا المتفطرات16،17. وهكذا، المتفطرة يمكن أن تكون معزولة من ليساتيس المشترك مثقف حضور الزحارية في محطة معالجة مياه18، و ماسيلينسي م. تم عزلها من البلغم من المريض بعد ثقافة المشارك مع الزحارية، بينما الثقافة وحدها لا السماح بعزل هذه البكتيريا8. وتعتبر الزحارية متزايدة كحاضنة لانموذجية4 وأكانثامويباسب. كمضيف بيئية طبيعية لكثير من غير السلية mycobacteria. ثقافة المشارك أميبا بالإضافة إلى البكتيريا متزايد يجري اقتراح نظم كنماذج بسيطة وسريعة لوصف العوامل المشاركة في النمو داخل الخلايا للبكتيريا19،،من2021، 22،،من2324.

في البيئة، وسيئة يتم توثيق التفاعل بين المتفطرة والزحاريه. المادة الأولى يصف دليل على اقتران بين البكتيريا الزحارية في الميدان خرج في عام 2014، وركزت هذه الدراسة على تحليل ل شبكة مياه الشرب25.

على حد علمنا، هذا هو الفرز الأولى ووصف خلال ثقافة المشارك مع الزحارية. هذه الدراسة سمح لنا بإثبات الدور الذي تؤديه البالعات البيئية في الحصول على ضراوة مسببات الأمراض الانتهازية التي تؤثر على البشر. بغية تسليط الضوء على تلك الجينات اللازمة لبقاء م. أبسسيسوسداخل الخلايا، أجرى شاشة مكتبة متحولة بالنقل من نوع فرعي من م. أبسسيسوس المعقدة وفي سلالة سريرية. تم فحص هذه المكتبة متحولة مع الزحارية، هذا آخر قد ثبت كأرض "تدريب" لزيادة ضراوة م. أبسسيسوس في الفئران4، لوحظ مشابهة لذلك مع بالمتفطره م.26. وكانت النتيجة الرئيسية الاكتشاف للمرة الأولى في أنموذجية للدور الأساسي لمحور ESX-4 ترميز نظام إفراز النوع السابع، والجد من محور ESX-1 يعتبر عنصرا أساسيا لضراوة والبقاء على قيد الحياة داخل الخلايا من السل م. بكتريا ميكروتي ومارينوم م.27،،من2829،30،31.

وكان الهدف الثاني للحصول على قائمة بالجينات وأعرب خلال ظروف مختلفة الثقافة المشتركة من أجل فهم أفضل للتكيف واحتمال الفوعة الآليات المعنية خلال ثقافة المشارك حضور البيئية البالعات المهنية. تم إجراء تحليل لهذا زيادة ضراوة من خلال اتباع نهج شامل لمجموع تسلسل الكشف رسول من م. أبسسيسوس، من أجل كشف الكشف التي يسببها أو مكبوتة خلال الثقافات المشارك أميبا مقارنة بالكشف نسخها من تحت الشروط في المختبر . يمكن أن تمنح التعبير التفاضلية من الكشف هذه إلى أبسسيسوس م. تعزيز "فوعة" شرح استعمار الشعب الهوائية العليا في البشر. بين الأنواع رجم، و أبسسيسوس م. استثناء من النمط الظاهري غير ممرضة جنبا إلى جنب مع م. كلوني. قدرة م. أبسسيسوس أن تسبب الأمراض مشابهة المتفطرة السلية يجعلها أكثر فريدة من نوعها. وأفادت الدراسات العديد من التكيفات داخل الخلايا م السل للحياة داخل الضامة32،33 ولكن بلا ركزت على أبسسيسوس م. التكييف في فيفو. كانت استجابة النسخي م. أبسسيسوس إلى نقص وصف34 على الرغم من تسليط الضوء على دور ميكوباكتينس وريجولون دوسر كما هو موضح في السل م. تحليل الترنسكربيتوم م. أبسسيسوس داخل الزحارية والضامة يعطي نظرة ثاقبة في أدابتيونس البكتيرية للحياة داخل الخلايا في حد ذاتها. مقارنة بين تلك ترانسكريبتوميس يسمح بتقييم دور الزحارية في تحريك الفوعة s M. أبسسيسوفي البشر، وفك تعديلات محددة لخلايا الثدييات متجولة. افتراض مفاده أن البيئة أمويبال قد تشكل أرضا 'تدريب' م. أبسسيسوس قبل نقلها إلى الخلايا البشرية، من أجل وصف فوعة أبسسيسوس م من حيث التكيف التطوري، يجعل هذا النهج الأصلي .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

نعترف روبين اكساجولا "العلاقات العامة" (مدرسة طب هارفرد، بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى حد كبير لهدية ثمينة للمسخ المكتبة، والدكتور مارشال بن (كلية الطب، جامعة ساوثهامبتون، المملكة المتحدة) لتصويبات المخطوطة. ونعترف "الرابطة الفرنسية المريض" كثيرا التليف الكيسي "Vaincre la Mucoviscidose" و "الرابطة غريغوري لومارشال" لدعمها المالي (RF20150501377). ونشكر أيضا الوكالة الوطنية للبحوث (ANR برنامج ديميفير (ANR-13-BSV3-0007-01))، والقارسة ضمور (Domaine د ' الاهتمام القاهرة علل إينفيكتيوسيس et اميرجينتيس) لتمويل زمالات ما بعد الدكتوراه إلى V.L-م. ل. ل. وزميل دكتوراه من "وزارة التعليم العالي et de la البحوث".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6, (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2, (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83, (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4, (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170, (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42, (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36, (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60, (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4, (6), 5660 (2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17, (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9, (1), 87834 (2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10, (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7, (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11, (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12, (7), 0181121 (2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8, (1), 3939 (2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48, (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65, (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198, (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14, (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9, (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76, (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198, (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76, (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17, (1), 553 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics