貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

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Immunology and Infection

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Summary

ここでは、提案する食細胞-結核菌 abscessusの相互作用を調査する 2 つのプロトコル: 細菌の細胞内の欠乏と RNA から細菌細胞トランスクリプトームの決意をトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングシーケンス。両方のアプローチは、ゲノムの利点と細胞内細菌フィットネスを高めるトランスクリプトーム適応への洞察力を提供します。

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

ヒトのマクロファージによって貪食に抵抗する能力とそのような細胞内増殖する能力は他の腐生抗酸菌から結核菌 abscessusを区別するもの。これらの病原性の特徴は、特に嚢胞性線維症、気管支拡張症、結核などの基になる構造の肺疾患脆弱なホストで、病原性M. abscessusをレンダリングします。M. abscessusと感染になる患者は不明のまま。多くの抗酸菌とは異なりM. abscessus環境で発見されていないが、アメーバ、 M. abscessusの潜在的な貯留層を表す環境食細胞の内部に存在可能性があります。確かに、 M. abscessus amoebal 貪食に耐性があるし、内アメーバ生活の感染実験モデルにおけるM. abscessus病原性を高めるようです。しかし、少しM. abscessus病原性自体について知られています。M. abscessus細胞内生活に利点を付与する遺伝子を解読するには、 M. abscessusトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングが開発されました。並行して、アメーバとの共培養後抗酸菌の細胞からの RNA 抽出法が開発されました。このメソッドは検証され全体M. abscessusの順序を許可したセル内トランスクリプトーム初めて、 M. abscessus細胞内生活適応上のグローバル ビューを提供します。両方のアプローチは私たちヒトの気道を植民地化するM. abscessusを有効にするとm. abscessus病原因子に洞察力を与えます。

Introduction

属には菌には種無害な腐生生物から人間の主要な病原体に至るまでにはが含まれます。結核菌抗酸菌 marinum マイコバクテリウムの ulceransなどよく知られている病原性の種は、成長の遅いのサブグループに属する抗酸菌 (SGM)。対照的に、急速な成長のサブグループ抗酸菌 (ガンダム) は寒天培地で 7 日以内に目に見えるコロニーを形成する能力によって特徴付けられます。RGM グループは以上 180 種、主に非病原性の腐生抗酸菌で構成します。彼らのホストと RGM の相互作用に関する研究アラビノースイソメラーゼに主に焦点を当てているし、マクロファージの殺菌作用によって、これらの抗酸菌が急速に除去されることを示します。

結核菌 abscessusは人間に病原性のある珍しい RGM の一つです、感染症皮膚および軟部組織感染症から肺や播種性感染症に至るまでの広い範囲を担当。M. abscessusと見なされます、マイコバクテリウム ・ アビウム、とともに嚢胞性線維症患者1のメインの抗酸菌病原体。

M. abscessusに対して様々 な研究を示すこの結核菌が細胞内の病原体、肺および RGM で通常見られない皮膚線維芽細胞とマクロファージの殺菌の応答で生存可能なように動作します。2,3,4. M. abscessusゲノム解析が環境微生物土壌との接触で一般的に見られる代謝経路を発見、植物と水生環境、無料のアメーバが多い5を提示します。M. abscessusは腐生と非病原性の RGM は、おそらく集めるかもしれない遺伝的交流に有利なニッチ市場での遺伝子の水平伝達によって買収に見つかりませんいくつかの病原性遺伝子に恵まれていることをも示しています。様々 なアメーバ耐性菌。

実験的に、最初の顕著な結果の 1 つだったM. abscessus結核6としてもマクロファージの細胞内増殖の観察です。M. abscessusは、ファゴソーム、アポトーシス、オートファジー、感染2細胞の抵抗の 3 つの重要なメカニズムの酸性化も抵抗します。でも、 M. abscessusはファゴソームと細胞質、細菌の増殖2を好むかもしれないより栄養豊富な環境の間の直接通信を確立することが示されています。M. abscessusが所有するか、または細胞内の環境で生存できるように取得してゲノムの利点についてほとんど知られています。アメーバ共は、結核菌 massiliense7,8として多くの新しいアメーバ耐性菌の分離を許可する効率的な方法です。アメーバ内で増殖する能力は、 M. abscessusm. abscessus4に増加病原性を授けることができるマウスでエアロゾル化のモデルで観察されました。1 つの仮説は、 M. abscessusが他の非病原性 RGM とは異なる貪食細胞で生き残るためにこの環境内で発生した遺伝形質を開発していたことです。これらの買収は、感染する能力と人間のホストに対する病原性を好むかもしれない。

このレポートでは、ツールとアメーバの環境で生き残るためにm ・ abscessusに与えられるゲノムの利点を強調する方法について説明します。この目的のためM. abscessusトランスポゾン変異体のスクリーニングは、アカント アメーバ castellanii型株の細胞内増殖の突然変異体の欠陥の識別を可能にするに、まず説明します。マクロファージの二次検診も人間のホストでこの問題が解決しないかどうかを確認する報告されました。第二に、 M. abscessus貪食での生活に適応するために利用されているどのメカニズムを理解する細胞と動物のホスト、 M. abscessus用メソッドに対する病原性は増加開発,共培養後アメーバの存在下で amoebal 内の細菌からの総 RNA の抽出を許可しています。結果として、細胞内の生活に必要なM. abscessus遺伝子の包括的なビューが開発されました。

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Protocol

1. ライブラリのスクリーニング

  1. Tn変異ライブラリーの構築
    1. トランスポゾンのライブラリを取得します。
      注: この実験トランスポゾン変異ライブラリーは E.J. rubin 氏は、公衆衛生のハーバード学校、ボストン、米国から得られました。ライブラリは、 M. abscessus複雑な (M. abscessus病菌massiliense) のM. abscessusシングルテネシー州のランダムな挿入を許可に導入 phagemid と滑らかな臨床的ひずみ (43) から構築されました。TA 型 ( M. abscessusのゲノムの 91,240 シーケンス TA) に。詳細については、「ルービンのリファレンス」を参照してください。9 Laencina10
  2. ライブラリとプレートM. abscessusTn変異体の保全の滴定
    注: これは 1 週間かかります。
    1. 氷の上のライブラリを解凍します。1 mL の水 (10-1 10-15) のシリアル希薄を実行することによって、細菌の濃度を決定します。250 mg/mL カナマイシンと 7 H 11 寒天媒体を含んでいるシャーレに各希釈のドロップをプレートします。3-4 日間の 37 ° C で版を孵化させなさい。
      注: ここでは、1011細菌/mL の滴定が回収された.
    2. ライブラリの濃度を決定した後 25% グリセリン水 10 mL で 3,000 細菌/mL の最終的な集中にライブラリを希釈します。約数 10 cryotubes 1 ml の各チューブのライブラリのライブラリ。因数-80 ° C で保存します。
    3. 氷の上の希薄化後のライブラリの 1 つの因数を解凍し、37 ° c. で孵化の 3-4 日後に 200 から 300 の個々 のコロニーを回復する (サイズ 12 cm) 10 の正方形ミューラー ・ ヒントン (MH) の寒天にライブラリの 100 μ L を追加を使用する準備ができたら、
    4. 滅菌つまようじ、96 ウェルのプレートに個々 のコロニー (60 x 96 ウェル プレートで約 6,000 コロニー) 満ちて 7 H の 200 μ L 9 培 0.2% のグリセロール、1% ブドウ糖 250 mg/mL カナマイシンの転送。振ることがなく、5 日間の 37 ° C で孵化させなさい。
    5. 文化 (ステップ 1.2.4) の 100 μ L を 7 H 9 の 100 μ L を含む 96 ウェル プレートに転送中] 40% のグリセロールで。-80 ° C で順序付けられたライブラリを保存します。
    6. 1.2.3 のステップを繰り返します。1.2.5 を。10,000 の個々 のクローンまでライブラリの残りの部分 (約 100 x 96 ウェル プレート、30 MH 板) がリカバリされます。
  3. アメーバの準備
    1. セルの行11の増幅に PYG 媒体 (表 1) の 30 mL で室温 (RT) で 75 cm2培養フラスコでアメーバアカント castellanii (AC) の文化します。
      注: 多数の消化液胞と大型の接着細胞から成熟した栄養型、顕微鏡ではっきりと見える。75 cm2培養フラスコの初期文化の 3 分の 1 を広めることで 3 日おきが増幅された 25 h. 細胞細胞倍加時間は推定されます。
    2. 25 mL のピペットで PYG のメディアを削除します。10 mL の AC バッファー (表 2)、炭素や窒素源12が含まれていないセルを洗浄します。さらに 2 回の洗浄を繰り返します。
      注: 炭素または窒素ソースを含まない AC バッファーは、抗酸菌の細胞の成長を回避できます。この最小媒体はアメーバの胞子形成につながります。これを抑えるには、熱不活性大腸菌がアメーバには基板 (手順 1.4) として追加された、非常に短い培養時間が (突然変異体スクリーニングの 48 h) と RNAseq 実験のため 4 時間または 16 時間の文化を推進しました。また、PYG 媒体 (通常 10%) を富ませたが、この媒体を使用します。
    3. 組織培養用フラスコの 1 つ活発なシェイク フラスコの底からアメーバをデタッチします。
    4. 5 x 105アメーバ/mL に細胞濃度を調整する検定とセルを数える AC バッファーで希釈。
  4. 調製された大腸菌熱不活化細菌感染後アメーバをフィードするには
    1. 100 mL ルリア スープ (LB) の 37 ° C で一晩のグリセロール ストックからエシェリヒア属大腸菌の臨床分離株を成長します。
    2. 50 mL チューブで 10 分間 1,835 × gで遠心分離によって細菌を収穫します。上清を捨てます。10 ml の 10% グリセロール-水ペレットを再懸濁します。さらに 2 回の洗浄を繰り返します。
    3. 5 ml の 10% グリセロール-水ペレットを再懸濁します。1.5 mL チューブに分注 0.5 mL。シリアル希薄を実行する LB 寒天培地プレートに希釈液を追加することによって、細菌/mL の量を決定します。因数-80 ° C で保存します。
    4. アメーバ感染前に、の日は、氷の上の 1 つの因数を解凍し、60 分の 70 ° C でチューブの孵化によって熱殺害に進みます。
      メモ: は、37 ° C で一晩 LB 寒天培地プレート上不活化細菌の 100 μ L をめっきによって不活化を確認します。植民地べきである目に見える文化の 1 つの夜を過ごした後。
    5. AC バッファーの 50 μ L の 10 の7細菌の集中を熱殺された細菌を希釈し、1 週間以上 4 ° C で希薄化後の細菌を格納します。
  5. アメーバ -M. abscessus Tn変異体の培養: 最初の画面
    注: これは、6,000 の突然変異体のスクリーニングのための 3-4 ヶ月かかります。
    1. アメーバ/よく AC バッファーの 100 μ L の 96 ウェル プレートに 5 × 104を広めます。振ることがなく 32 ° C で 1 時間インキュベートします。井戸に準拠する浮動アメーバ trophozoïtes 時間を許可します。
      1. 抱卵中、1 h の氷の上の細菌を解凍します。
    2. 電子マルチ チャンネル ピペットと解凍細菌文化の 5 μ L を追加します。96 ウェル プレートTn変異株から 6,000 個別クローン周り 1.5 h. 画面のために感染します。
      注: MOI はプロトコルのこの段階で知られています。ただし、 Tnの変異体を含むすべての 96 ウェル プレートは、まったく同じ方法で栽培しました。この最初の画面は、すぐに菌密度変化を考慮することがなく細胞内変異を識別するために目指しています。
    3. 感染症の 1.5 h 後、ヒューム フードの下で AC 媒体を削除する滅菌金属製のトレイは、滅菌ガーゼの 96 ウェル プレートを反転します。AC 中の 200 μ L で補充します。この洗浄を 2 回以上を繰り返します。
    4. 残りの細胞外抗酸菌を排除するために 100 μ g/mL アミカシンと新鮮な培の 200 μ L を追加します。
    5. 3 追加洗浄前に、2 h (前述の手順 1.5.3 で) 孵化させなさい。洗浄後、AC バッファーの 200 μ L で 50 μ g/mL アミカシンと文化を維持します。
    6. 感染症およびアメーバの胞子形成を防ぐためにすべての 24 の時間の終わりに (手順 1.4) から 5 x 107熱不活化エシェリヒア属大腸菌細菌を追加します。
    7. 培養 48 時間後 10 %sds (ドデシル硫酸ナトリウム) の 10 μ L を各ウェルに追加することによって、細胞を溶解し、32 ° C で 30 分間インキュベートシリアル希釈で進み、細胞マイコ バクテリアの数を評価する 5% 羊血液 (COS 板) を含むコロンビア寒天プレート上に追加します。プレート、パラフィルムでシールし、37 ° c. で孵化させなさい
    8. 3-4 日、写真プレート後寒天プレートに表示に植民地と突然変異体の細胞内増殖細菌のコロニーの最小の番号を持つ堆積物を観察することによって障害を識別します。
      注: 図形、高さまたは植民地 (図 1A) の密度について気にしません。136/6000 変異が同定されました。
  6. アメーバ -M. abscessusTn変異体の培養: 最初の画面の中に識別される突然変異体の 2 番目の画面
    注: これは 2 週間かかります。2 番目の画面は、正確に接種した菌の数や細胞内生存細菌感染 2 日後の数を定量化する 136 弱毒変異最初の画面後に得られる実行する必要があります。
    1. 50 mL の影響を受ける各変異体 1 コロニーを成長してチューブの 7 H の 20 mL で 0.2% のグリセロール、1% のグルコース, カナマイシン 250 mg/mL 9 培をいっぱい。指数の段階に到達する細菌を許可 (0.6 < OD < 0.8)。
    2. AC 中 (1,835 x gで 10 分間遠心分離によって文化を洗います。上清を捨てます。9 培 0.2% グリセロール、1% のグルコース カナマイシン 250 mg/mL と 20 ml の 7 H の詳細を 2 回これ洗う手順を繰り返します。
    3. 5 mL の AC バッファー内の細菌を再懸濁します。
    4. コロニー形成単位 (CFU) 変異体の濃度を決定します。24 ウェル プレートの 2 つの最初の行に 1 mL の水を追加します。最初の細菌懸濁液 100 μ L を追加します。マイクロ ピペット、3 回をミックスします。その後、吸引 100 μ L と 2 番目の預金も。
    5. 新しいヒントよく十二まで 2 番目の井戸から3 つ目等、1.6.4 ステップを繰り返します。
    6. 10-12希釈の 30 μ L を吸引し、コス板にそれを追加します。その他の希釈について繰り返します。
    7. コス板パラフィルムをラップし、37 ° C で 3-4 日間インキュベートコロニーを数えることによって濃度を決定します。
    8. 上記 AC 共同培養液 1 mL によくあたり 5 × 104アメーバと 24 ウェル プレートで 3 通の共同培養の試金を実行します。10 の感染 (MOI) の多様性と接種します。
    9. 培養 48 時間後に、1.5.7 の手順で説明するようセル換散と進みます。水 (10-610-1 ) のシリアル希薄を実行し、コス板に 30 μ L を追加します。CFU のカウントを進める前に 37 ° C で 4 日間の版を孵化させなさい。
      注: この 2 つ目の画面の後 60 136 変異体の保存されていた。
    10. 細胞の中生き残りの影響を受けて変異体を格納します。植民地を含む LB 培地グリセロール (20%)、または商用ソリューションと長期的な保全を支持、今後接種を容易にし、-80 ° C で保存ビーズを含む cryotube で cryotube に追加します。
    11. 600 光学濃度 (OD) を測定することによって評価の in vitro変異成長 nm ごとに 2 日間。
      1. 1 を育てる 50 の mL の管に影響を受ける各変異体のコロニーに満ちて 7 H の 20 mL 0.2% グリセロール、1% のグルコース, カナマイシン 250 mg/mL 9 培。指数の段階に到達する細菌を許可 (0.6 < OD < 0.8) 反応を開始する 0.01 外径を調整する前に。
      2. 欠陥を有する体外成長細胞変異のセットから WT 株と比較すると突然変異を除外します。
  7. マクロファージ -M. abscessus Tn内アメーバ生活のため不良で変異体の培養
    注: これは 1 ヶ月かかります。
    1. 豊富な媒体、10% の胎児の子牛血清 (FCS) DMEM の 1 mL で 24 ウェル プレートのウェルあたり 5 × 104 J774.2 マウス マクロファージを広めます。マクロファージの接着を許可する CO2を 37 ° C、5% で 24 時間のプレートを孵化させなさい。3 複製を提供します。
    2. 感染症を実行します。100 μ L のボリュームで 10 %fcs を DMEM で希釈した 10 の MOI でTnの突然変異体を接種します。
    3. 感染症の 3 h 後 1 ml DMEM (真空ポンプを使用することができます) の 3 つの洗浄を実行します。その後残りの細胞外抗酸菌を排除するために 1 時間 (10 %fcs を DMEM) で 250 μ g/mL アミカシンを扱います。
      1. 3 追加は DMEM の 1 mL で洗浄後、細胞マイコ バクテリアの増殖を防ぐために 1 mL の最終的なボリュームに (10 %fcs を DMEM) で 250 μ g/mL アミカシンの文化を維持します。
    4. 共培養後 72 時間はメディアを取り出してし、冷たい水の 1 mL を追加することでマクロファージを溶解させます。4 ° C で 30 分間インキュベートします。
    5. 細胞内の細菌の数を評価する COS プレート CFU アッセイを実行します。
      1. 24 ウェル プレートの 2 つの最初の行に 1 mL の水を追加します。第 1 のウェルに共同細胞ライセートの 100 μ L を追加します。マイクロ ピペット、3 回をミックスします。100 μ L を吸引し、2 番目によく預金。
      2. 新しいヒントも十二まで3 つ目等に 2 番目の井戸からの希釈を繰り返します。10-12希釈の 30 μ L を吸引し、コス板にそれを追加します。
      3. その他の希釈について繰り返します。コス板パラフィルムをラップし、観察し、コロニーをカウントする 3-4 日を待ちます。
  8. 身分証明書とM. abscessus変異体でTnの挿入のサイトのシーケンス
    注: これは 60 変異体の 1.5 ヶ月かかります。
    1. 特定のゲノム抽出M. abscessus変異体
      1. 7 H 9 の 20 mL と 50 mL のチューブの突然変異体の成長指数段階に 250 mg/mL 0.2% グリセロール、1% のグルコース, カナマイシンを添加した培地 (外径600= 0.8)。
      2. 文化 (2,396 × g、5 分) 10 mL を収穫します。上清を捨てます。500 μ L のソリューションの中の細菌を中断 (25% ショ糖、50 mM Tris pH 8、10 mg/mL リゾチーム, チオ尿素 40 mM)。2 mL スクリュー キャップ チューブにソリューションを転送し、37 ° C で 2 時間インキュベート
      3. ソリューション II (25% ショ糖、50 mM Tris pH 8、50 ミリメートルの EDTA) 500 μ L を追加します。ピペッティング後アップし、ダウン 5-10 倍、チューブで 500 μ L のボリュームまでジルコニウム ビーズを追加します。
      4. ホモジナイザーを用いたセル換散を続行 (3 x 6,000 rpm、45 s) 1 分インキュベーション各ラウンド間氷の上で。
      5. (最終的な 100 μ g/mL) 20 mg/mL プロティナーゼ K の 5 μ L を追加し、55 ° C で一晩サンプルをインキュベート
      6. ヒューム フードの下でフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール (25:24:1) の寒さの 1 mL を追加します。RT と 30 分 16,500 × gで遠心分離を進める前にボルテックスによってサンプルをミックスします。
      7. 遠心分離の後水性相を回復し、フードの下で冷たいフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール溶液の等しいボリュームを追加します。再び水相を回復する 30 分 16,500 x gでサンプルを遠心します。
      8. ヒューム フードの下で回復した水相に RT イソプロパノールの 0.7 のボリュームを追加します。ゆっくりと DNA の沈殿物を許可し、右で 5 分間インキュベートするチューブを反転します。16,500 × gおよび RT で 10 分間遠心し、
      9. 上澄みを除去し、フードの下の 70% エタノール 500 μ l 添加の餌を洗浄します。エタノールを削除する前に RT で 16,500 x gで 10 分間のチューブを遠心します。残りのアルコールの蒸発を許可する 10 分間インキュベートします。
      10. 最後に、DNase/RNase 自由水の 100 μ L の DNA の餌を中断します。分光光度計で DNA の収量、純度の DNA を特定します。
      11. 補助的クローニングTn挿入部位、1 泊分の 10 U ClaIのゲノム DNA およびダイジェストの 1 μ g を削除します。製造元のプロトコルを使用します。
        注: Cla私 M. abscessus ゲノム (2,173 制限サイト) で表される最も高い制限酵素の酵素であります。Cla私制限サイトも Tn 変異体のカナマイシン耐性カセットの Tn シーケンスを上流で発見します。したがって、 Cla私を介した subcloning Tn 挿入部位を識別するために有効にします。
    2. 補助的 Tn を含んでいるゲノムの DNA のプラスミッドのクローニング
      注: Tnを実行する前に- Claを追加、2,686 bp pUC19 のアンピシリン耐性プラスミドで subcloning 私プラスミッドの多重クローニング サイトの制限サイト。PUC19 プラスミドのシーケンスは、このリンクの https://www.addgene.org/50005/sequences/ で見つけることが。
      1. 従ってメーカー ダイジェストEcoRpUC19 プラスミドにプロトコル 's 私とハインドIII、51 の断片を解放 bp と 2635 跪くのフラグメントを浄化、51 を排除するために商業 PCR 精製キット二重消化ベクトル bpフラグメントをリリースしました。
      2. ミックス 1 μ L (濃度 25 pmol/μ L) 28 の 2 つの相補的なオリゴヌクレオチド (5 'agct 2008 年 7 タタ AGATCT タタ ATCGAT TATA3' と 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') の bp Claを含む各私制限サイトとハインドIII の両端とEcoR私制限のサイト。100 ° C 10 分で保温し、それらをバインドするためにクールします。
      3. EcoRによって一対のプライマーのダイジェスト私とハインド製造元のプロトコルに従って III。
      4. 150 を縛るEcoRの ng 私/ハインドIII 制限 pUC19 プラスミド濃度 20 μ L の最終巻の 1 U の T4 DNA リガーゼと RT で 1 h の対のプライマー (50 pmol/μ L、25 pmol/μ L、2.5 pmol/μ L) の違いとチェック別クローン作成酵素の消化力。
      5. Claが付いている変更されたプラスミッドをダイジェスト私 37 ° C で 2 時間
      6. 50 を縛るCla私制限 pUC19 の ngプラスミッドおよび 50 Cla で ng の genomic DNA の消化10 μ L 1 U の T4 DNA リガーゼと RT で 1 h の私。
      7. 結紮 (2500 V、200 ω、25 μ F) の 5-10 μ L で大腸菌electrocompetent 細菌の変形に進みます。50 μ G/ml カナマイシン細菌 Tn シーケンスの部分でプラスミドを軸受を選択する 50 μ G/ml アンピシリンと補われた LB 寒天培地プレート上のクローンを選択します。
      8. 適切な抗生物質の選択 (50 μ G/ml カナマイシンと 50 μ G/ml アンピシリン) と LB 液体培地で一晩の抵抗性クローンを成長します。
      9. プラスミド DNA を抽出します。制限酵素による挿入の存在をチェックし、 Tnカナマイシンの最後 17 塩基対に対応するオリゴヌクレオチド (5' 3' TTGACGAGTTCTTCTGA) で破壊された遺伝子を識別するためにテネシー州の 3' 末端をシーケンス抵抗のカセット。
      10. ヌクレオチド blast (ブラスト N) を実行することによってm. abscessus行く 06 株に対するシーケンスを合わせます。

2. Rnaseq 分析のため細胞内の抗酸菌の RNA の抽出

注: これは実験のため 4 ヶ月 RNAseq 分析 4 ヶ月かかります。

  1. アメーバ -M. abscessusバッチでの共培養
    注: 次の実験では、細菌細胞の接触を支持する撹拌で 50 mL のチューブで共培養が行われます。
    1. 成長 7 h 9 M. abscessus 0.2% グリセロール、120 rpm で半ば指数段階に 1% グルコースを添加した培地。
    2. 10 mL の AC バッファーで 2 回細菌を洗浄します。
    3. 外径600 ナノメートルを測定することにより細菌濃度の推定 (1 OD600= 4 × 108抗酸菌)。AC 培地 10 mL に 10 の6アメーバ x 8.5 8.5 × 108抗酸菌に追加します。
    4. 穏やかな攪拌 (約 80 rpm) 30 ° C で 1 時間インキュベートします。
    5. 12 分削除上澄み 253 x gで遠心分離によってセルを収穫し、10 mL の AC バッファー内セルの中断します。この洗浄を 2 回以上を繰り返します。
    6. 10 mL の細胞外の細菌を除去し、穏やかな攪拌 (80 回転) 30 ° C で 4 時間インキュベートする 50 μ G/ml アミカシンを含む AC バッファーで細胞を再懸濁します。セルを 2 回もう一度洗います。
  2. 細胞内abscessus m.からの総 RNA の抽出
    注: は、有毒な試薬を使用するためヒューム フードの下の手順 2.2.1–2.2.3 を実行します。
    1. 最終洗浄後アメーバを妨害する β-メルカプトエタノールの即席 280 μ L で 4 mL の冷たい解決 III (表 3) に感染したアメーバを再懸濁します。これは、ためのチオシアン酸 (GTC) ステップです。リリースされた細胞内細菌をペレットに 2,396 x gで 30 分および 4 ° C の溶解の氷上で 10 分間遠心分離、細胞懸濁液を維持します。
    2. 上澄みを除去し、1 ml の冷溶液 III の細菌のペレットを中断します。4 ° C で 30 分間 2396 x gで細菌を収穫します。抽出バッファーと転送 (までチューブの 500 μ L グラデーション) ジルコニウム ビーズを含む 2 mL スクリュー管に 1 mL にペレットを再懸濁します。-80 ° C で 24 時間、少なくともチューブを格納します。
      注: 溶解試薬でストレージ RNases と細胞溶解の不活性化を許可します。
    3. 使用する準備ができたら、氷のサンプルを解凍し、25 の 6,000 rpm で 2 つのラウンドを実行することによってそれらを溶解ホモジナイザーを用いた 20 6,000 rpm で 1 ラウンドに続いて s s 1 分インキュベーション各ラウンド間氷の上で。
    4. サンプルを冷却するには、10 分間氷の上にそれらを孵化させなさい。イソアミル アルコールで希釈したクロロホルムの 200 μ L を追加します。ボルテックス後 1 分のサンプルは 16,500 x gと 4 ° C で 15 分間遠心します。
    5. 水相に冷たいイソプロパノール 0.8 mL を追加し、20 ° C で 2-3 h のサンプルをインキュベート遠心分離機の 16,500 x gと 4 ° C で 35 分のサンプル上清を捨てます。
    6. 冷たい 70% エタノール 500 μ L を追加することにより RNA の餌を洗う (混在させないでください)。
    7. 16,500 × gエタノールを削除する 10 分間のサンプルを遠心します。ソリューションを吸引・遠心濃縮器で乾燥します。
    8. 一度乾燥、DNase/RNase 自由水の 100 μ L にペレットを再懸濁します。
      注: サンプルは、メーカーの推奨事項に従って DNA 汚染物質を除去する Dnase で二回扱われなければなりません。
    9. Agarose のゲルの RNA の整合性を評価し、チップ ベース キャピラリー電気泳動法による RNA の整合性数 (鈴) とリボソームの比を測定することによって確認します。
      注: RIN は、全体の電気泳動のトレースを考慮します。RIN は総 RNA の分類ソフトウェア アルゴリズムは、最も低下したプロファイルをほとんどそのまま 10 1 10 1 から番号付けシステムに基づいています。CDNA ライブラリの準備を進める、厘必要があります 8 とリボソームの比 [28/18]、可能な限り高い理想値 2、生物とその特異性によっています。
    10. シーケンスの cDNA ライブラリーの作製まで-80 ° c の RNA のサンプルを格納します。
  3. CDNA ライブラリーの作製
    1. ライブラリの準備を続行するには、製造元のプロトコルを使用して、市販の cDNA 合成キット (資材表) を使用します。
    2. DNA チップの品質・濃度のライブラリを確認します。
      注: より精密で正確な定量化は、微量蛍光定量アッセイで実行できます。
  4. ライブラリ シーケンス
    1. 2 サンプルを正規化 nM 流れ細胞組織によると多重に進みます。
    2. サンプル 1 の濃度を変化させなさい nM 0.1 N NaOH を用いた室温 5 分
    3. 22 でサンプルを希釈します。22 時のフロー ・ セルの各サンプルを読み込みます。
    4. 高スループット シーケンス システムにより、大規模なゲノムをシーケンスを続行します。ここで実行された SRM 実行 (SR: シングル リード、PE: ペアエンド リード、m: 多重サンプル) 51 サイクルを読む 7 のインデックス ベースの。
    5. 外部 FastQC プログラム13とシーケンスの品質を評価します。
    6. アダプター シーケンスのトリミング後の参照ゲノムに対する読み取りのアラインメントと進みます。サンプルの汚染を査定し、必要に応じて、非細菌性読み取りのトリミングを続行する真核細胞のゲノムに対する位置を合わせます。
  5. 統計解析
    1. 特異的発現遺伝子のセットを定義に使用可能ないくつかのソフトウェア プログラムを使用: R ソフトウェア、DESeq2 およびプラットフォームで開発された PF2tools パッケージ (バージョン 1.2.12) を含む Bioconductor パッケージ「トランスクリプトーム et Epigénome」(パスツール研究所、パリ)。

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Representative Results

M. abscessusに抵抗し、殺菌反応マクロファージやアメーバなど環境原生動物の脱出機能があります。M. abscessusはなる劇毒性のマウス4病原因子、アメーバと接触して育てられたときを表しています。これらのメソッドの最初の目標は、 M. abscessusの生存とアメーバ内で増殖可能で現在の遺伝子を識別するためにだった。

この弱毒成長変異体を識別するために、アメーバの存在下で培養後上映されたM. abscessus病菌massilienseテネシー州配信9、によって得られるの変異ライブラリー、このため細胞内環境 (図 1)。同じ突然変異体の動作も次のこの成長減衰はマウスのマクロファージで維持されたかどうかを分析する大食細胞との共培養を行った。

スクリーニングのアプローチ、このブラインド トランスポゾン ライブラリ 50% 生存があった 6,000 の突然変異体の 47 の欠陥レプリケーション表現型を確認またはアメーバやマクロファージ、に比べて少ないコントロール10培養液濃縮培 (1% で評価した結核菌、成長の本質的な成長欠陥がすべて選択したテネシー州の突然変異体の曲線があります弱毒の細胞内生存の突然変異体を排除するにはグルコース-7 H 9)。すべての突然変異体のin vitro成長は次の文化の OD600 2 日おきで監視されました。対応する野生型株と比較して体外で成長欠陥を表示別の突然変異は研究から除外しました。

このブラインド テストが毎日まったく同じプロトコルを使用して再現するために極めて重要だった。この技法の制限一次視覚検診時、撮影された各 CFU の参照の正確な画像を提供します。トランスポゾンが遺伝子型の細胞内におけるその重要性に下線を引く VII 分泌システムの ESX 4 座に属するに挿入された突然変異体のこのグループで 12 m. abscessus変異体 (含まれている重複) が同定されました。M. abscessus10の成長。

今まで、 M. abscessus病原性の解析はM. abscessus M. chelonae、同じグループに属しているが、唯一の感染症の原因菌のゲノムの比較解析に基づくされて本質的に人間の皮膚。目的は、適応と潜在的環境専門家の存在下で培養中に関与する病原性のメカニズムを理解するために異なる培養条件で発現する遺伝子のカタログを取得するには食細胞。Rna が誘導やアメーバ共培養下で転写された Rna と比較して中に抑圧されたを検出するために合計シーケンスM. abscessus、メッセンジャー Rna の包括的なアプローチを通じてこの増加病原性の解析を行った培養条件。これらの Rna の発現は人間の上部の航空路の植民地化を説明する強化された「毒性」 M. abscessusを与えることができます。

これらの共培養再び実施された最小媒体 (炭素または窒素のソースはありません) M. abscessusの細胞の成長を防ぐために、これらが直面している環境を代表する、上記のよう抗酸菌培養細胞内の抗酸菌を選択する全期間にわたって、抗生物質の選択の重圧の下で。

したがって、抗酸菌の細胞からの RNA を隔離する技術が開発されました。この抗酸菌 RNA 抽出の主な困難は、amoebal RNA (真核生物型) の混入を避けていた。これを避けるためには、アメーバの換散のためチオシアン酸 (GTC); を使用して別の時間ポスト共培養で行われました。以来、耐性細胞内抗酸菌があります。この手順の後ジルコニウム ビーズの存在下で細胞ホモジナイザーを使用して抗酸菌の Rna の機械的抽出を行った。この手法では、良質、高品質、 M. abscessusトランスクリプトームの完全な分析を行う能力の向上を図るための鈴数抗酸菌の RNA メッセンジャー RNA 配列 (mRNA) を使用してを取得することができました技術 (図 2)。これは前に行われたことが、私たちに誘導や彼らの役割に従ってグループ化することによって、抑圧された遺伝子家族の基本的なビジョンを与えた: M. abscessusの栄養素やミネラル、低酸素の源の限られた環境への応答または酸性の環境とm. abscessusの酸化への抵抗 nitrosative ストレスや最後にM. abscessusの環境のアメーバの病原性発現。

Figure 1
図 1: M. abscessus アメーバのTnを突然変異体の A. 最初の視覚的画面。(A) アメーバのTnを突然変異体の大型スクリーンは弱毒変異株を迅速に識別するために感染症の多重度がランダム 96 ウェル プレートで実行されます。(B)テネシー州の弱毒変異株の識別は、遺伝子を中断しました。ClaTn変異株のゲノム DNA を断片化Tn挿入サイトのクローンを作成します。M. abscessus ゲノム港湾 2500 Cla私制限サイトどの好意フラグメントの短い DNA の取得が、 Tn挿入部位 (1/2500) を複製する確率を下げます。クローンは、カナマイシン、トランスポゾンによって抵抗クマと選択されます。破壊された遺伝子は、 Tnカナマイシン耐性カセット (黒矢印) の中のプライマーとシーケンスによって識別されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 抗酸菌の RNA 抽出の分析。アメーバ -M. abscessus共培養中に細胞内M. abscessusの (A) RNA 抽出。M. abscessusとアメーバ共培養は細菌の連絡先に細胞を支持する、穏やかな動揺と大量の (すなわち100)、感染症の高い多重度で行われます。共培養後、細胞は収穫され、GTC と β-メルカプトエタノールの組み合わせと分離します。細胞ライセートを含む細菌、細菌 RNA の抽出前にメカニックの溶解を容易にする細菌細胞壁を弱めるため再び GTC と扱われます。(B) RNA の品質と整合性評価、バイオアナライザー。RRNA は (23 秒、16 s と 5 s) を観察した電気泳動ゲルであります。鈴は、シーケンスと rRNA 比 (23/16) 有機体、理想的な値は 2 によって可能な限り高いライブラリの準備を続行する 8 以上でなければなりません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

M. abscessusの動作は、はるか RGM2に属する他のマイコ バクテリアよりも結核などの病原性の SGM の動作に似ています。SGM の病原性に重要な要素は、マクロファージなどの抗原提示細胞と樹状細胞内であっても乗算または存続する能力です。

M. abscessusは、真核生物の食細胞内で生き残るためにそのゲノム14の合計の順序によって示すように、ゲノムの特定の利点を取得しています。M. abscessusのゲノムが急速に進化して示されている、最近の多くの非常にプラスチック導入 prophages など新しい遺伝子15シーケンスを挿入。M. abscessusに比べて結核の病原性に関するデータが少ない要因は、 M. abscessusは迅速かつ積極的を増加病原性に向かって進化することができるようです。今までは、 M. abscessus病原性の解析は、 M. abscessus M. chelonae、同じグループに属しているに限られた感染症の原因菌のゲノムの比較解析に基づく本質的に人間の皮膚。いくつかの遺伝子M. chelonaeで現在、 m. abscessusホスホリパーゼ C など存在説明していない部分的に貪食後M. abscessusの耐環境アメーバ4で。

環境試料を添加したアメーバ培養技術の開発では、明確にアメーバ抗酸菌相互作用16,17を実証しています。したがって、抗酸菌は水処理植物18アメーバの存在下で培養した共同 lysates から隔離されかねないし、アメーバとの共培養後M. massilienseだった患者の喀痰から分離された文化だけはしなかったに対しこの抗酸菌8の分離を許可します。アメーバはますます抗酸菌4Acanthamoebaspのための定温器として考慮されます。として多くの非結核性抗酸菌の自然環境のホスト。アメーバ プラス抗酸菌培養システムますますとして提案されている簡易モデルを特徴付ける抗酸菌19,20,21、細胞内の増殖に関連の要因 22,23,24

境内のマイコ バクテリアとアメーバ間の相互作用が不完全に記載します。抗酸菌とフィールドのアメーバ間の連合の証拠を記述する最初の記事は、2014 年に出てきたし、本研究は飲料水ネットワーク25の分析に焦点を当てた。

私たちの知る限り、これはアメーバとの共培養に記載された最初のスクリーニングです。本研究では、人間に影響を与える日和見病原体の病原性の獲得における環境食細胞が果たす役割を実証することができました。M. abscessusの細胞の生存に必要な遺伝子を強調するために複雑なM. abscessusの亜種と臨床のひずみ、転位によって変異ライブラリーの画面も実施されました。この変異ライブラリー上映されたこの最後を持つ示されて「教育の場」としてマウス4 M. abscessusの病原性を高めるためアメーバ、 M. avium26と類似する観察。主要な結果は、エンコード タイプ VII の分泌システム、および病原性と結核の細胞の生存に必須な考え ESX 1 座の先祖 ESX 4 座の重要な役割の抗酸菌で初めて発見結核菌 microti M. marinum27,28,29,30,31

2 番目の目標は良い適応と環境の存在下で培養中に潜在的な病原性機構を理解するために異なる培養条件で発現する遺伝子のカタログを取得するにはプロの食。Rna 誘導やアメーバ共培養下で転写された Rna と比較して中に抑圧されたを検出するためにm. abscessus、メッセンジャー Rna の合計配列の包括的なアプローチを通じてこの増加病原性の解析を行った培養条件。これらの Rna の発現は人間の上部の航空路の植民地化を説明する強化された「毒性」 M. abscessusを与えることができます。ガンダム種、 M. abscessusM. chelonaeと共に非病原性表現型に例外です。M. abscessusの機能結核性抗酸菌に似たような病態を引き起こすことは、さらにユニークです。多くの研究は、細胞内 M.結核マクロファージ32,33中の生活に適応を報告しているが、 M. abscessus適応体内にどれも焦点を当てています。M. abscessusの低酸素の応答転写されている記載されている34にもかかわらず、mycobactins と結核の説明に従って dosR レギュロンの役割を強調します。アメーバとマクロファージ内M. abscessusトランスクリプトーム解析は、細胞内の生命それ自体に細菌の adaptions に洞察力を与えます。それらのトランスクリプトームの比較は、 M. abscessus 病原性人間および哺乳類の貪食細胞に特定の適応の解読をトリガーでアメーバの役割の評価を許可します。仮定した進化適応の面で M. abscessus 病原性を記述するために、人間の細胞への転送は、このアプローチをレンダリングされる前に amoebal の環境かもしれないM. abscessusの「訓練の場」を構成する、元.

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Acknowledgments

我々 は大きく変異の貴重な贈り物の広報 E.J. ルービン (ハーバード大学医学部、ボストン、米国) を認めるライブラリ、および原稿の修正のための博士ベン マーシャル (医学部、英国・ サウザンプトン大学)。我々 は大きく金融支援 (RF20150501377) 嚢胞性線維症」Vaincre ラ Mucoviscidose「と"でグレゴリー ・ Lemarchal」のフランス語の患者会を認めます。また地方イルド フランス (ANR プログラム DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) 総合庁感謝 (ドメーヌ水利 Majeur 病気 Infectieuses et 新興階級) V.L m 員を資金調達のため。L ・ L ですから博士研究員、「ミニステール期高等エ デ ラ凝った」。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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References

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