फ़ैगोसाइट में Intracellular प्रतिकृतिकरण के लिए माइकोबैक्टीरियम abscessus के डाह मार्करों की पहचान

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

यहां, हम Phagocyte-माइकोबैक्टीरियम abscessus बातचीत का अध्ययन करने के लिए दो प्रोटोकॉल पेश: बैक्टीरियल intracellular की कमी और आरएनए से बैक्टीरियल intracellular transcriptome के निर्धारण के लिए एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्क्रीनिंग Sequencing. दोनों दृष्टिकोण जीनोमिक लाभ और transcriptomic रूपांतरों intracellular बैक्टीरिया फिटनेस बढ़ाने में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

क्या दूसरे saprophytic आइसोलेटों से माइकोबैक्टीरियम abscessus अंतर मानव phagocytosis द्वारा मैक्रोफेज और ऐसी कोशिकाओं के अंदर गुणा करने की क्षमता का विरोध करने की क्षमता है । ये डाह लक्षण विशेष रूप से अंतर्निहित संरचनात्मक फेफड़ों की बीमारी, जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस, bronchiectasis या तपेदिक के साथ कमजोर मेजबान में, एम abscessus रोगजनक प्रदान करते हैं । कैसे रोगियों एम. abscessus के साथ संक्रमित हो जाता है अस्पष्ट बनी हुई है । कई आइसोलेटों के विपरीत, m. abscessus वातावरण में नहीं मिला है, लेकिन amoebae के अंदर रहते हैं, पर्यावरण फ़ैगोसाइट कि एम abscessusके लिए एक संभावित जलाशय का प्रतिनिधित्व हो सकता है । दरअसल, m. abscessus amoebal phagocytosis के लिए प्रतिरोधी है और इंट्रा अमीबा जीवन संक्रमण के एक प्रयोगात्मक मॉडल में एम abscessus डाह को बढ़ाने के लिए लगता है । हालांकि, लिटिल अपने आप में एम abscessus डाह के बारे में जाना जाता है । एम. abscessus intracellular जीवन, एक एम. abscessus transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय की स्क्रीनिंग के लिए एक लाभ प्रदान जीन समझने के लिए विकसित किया गया था । समानांतर में, amoebae के साथ सह संस्कृति के बाद intracellular आइसोलेटों से आरएनए निष्कर्षण का एक तरीका विकसित किया गया था । इस विधि को मांय किया गया था और कक्षों के अंदर पूरे M. abscessus transcriptomes के sequencing की अनुमति है; प्रदान, पहली बार के लिए, intracellular जीवन के लिए एम abscessus अनुकूलन पर एक वैश्विक दृष्टिकोण । दोनों दृष्टिकोण हमें एम. abscessus डाह कारकों में एक अंतर्दृष्टि दे कि एम. abscessus सक्षम करने के लिए मानव में एयरवेज उपनिवेश ।

Introduction

जीनस माइकोबैक्टीरियम प्रमुख मानव रोगजनकों के लिए हानिरहित saprophytic जीवों से लेकर प्रजातियों में शामिल हैं । माइकोबैक्टीरियम तपेदिक, माइकोबैक्टीरियम marinum और माइकोबैक्टीरियम ulcerans के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात रोगजनक प्रजातियों धीमी गति से बढ़ते आइसोलेटों (SGM) के उपसमूह के हैं । इसके विपरीत, तेजी से बढ़ते आइसोलेटों (RGM) के उपसमूह में आगर माध्यम पर 7 दिनों से भी कम समय में दिखाई देने वाली कॉलोनियों के रूप में उनकी क्षमता की विशेषता है । RGM समूह में १८० से अधिक प्रजातियों, मुख्यतः गैर रोगजनक saprophytic आइसोलेटों शामिल हैं । उनके मेजबानों के साथ RGM बातचीत पर अध्ययन मुख्य रूप से माइकोबैक्टीरियम smegmatis पर केंद्रित है और यह प्रदर्शित करता है कि इन आइसोलेटों तेजी से जीवाणुनाशक की मैक्रोफेज कार्रवाई से सफाया कर रहे हैं ।

माइकोबैक्टीरियम abscessus दुर्लभ RGM है कि मनुष्यों के लिए रोगजनक है और त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण से फेफड़े और प्रसार संक्रमण से लेकर संक्रमण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जिंमेदार है में से एक है । M. abscessus माना जाता है, माइकोबैक्टीरियम एवियमके साथ, सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों1में मुख्य माइक्रोबैक्टीरियल रोगज़नक़ हो ।

एम abscessus पर प्रदर्शन किया विभिंन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि इस माइकोबैक्टीरियम एक intracellular रोगज़नक़ की तरह व्यवहार करता है, मैक्रोफेज और फेफड़ों और त्वचा में fibroblasts, जो आम तौर पर RGM में नहीं मनाया जाता है की जीवाणुनाशक प्रतिक्रिया जीवित करने में सक्षम 2 , 3 , 4. M. abscessus जीनोम विश्लेषण आम तौर पर मिट्टी, पौधों और जलीय वातावरण, जहां मुक्त amoebae अक्सर5उपस्थित है के साथ संपर्क में पर्यावरण सूक्ष्मजीवों में पाया चयापचय रास्ते की पहचान की है । उंहोंने यह भी दिखा दिया है कि एम abscessus कई डाह saprophytic और गैर में पाया जीन नहीं रोगजनक RGM, शायद एक आनुवंशिक मुद्रा है कि इकट्ठा हो सकता है के लिए अनुकूल आला में क्षैतिज जीन हस्तांतरण द्वारा अधिग्रहीत के साथ संपंन है विभिन्न अमीबा प्रतिरोधी बैक्टीरिया ।

प्रायोगिक तौर पर, पहले हड़ताली परिणामों में से एक मैक्रोफेज में एम. abscessus के intracellular वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में एम तपेदिक6के लिए निरीक्षण किया गया । एम abscessus भी phagosome, apoptosis और autophagy,2संक्रमण के लिए सेलुलर प्रतिरोध के तीन आवश्यक तंत्र के अंलीकरण का विरोध करती है । यह भी दिखाया गया है कि एम abscessus phagosome और cytosol के बीच एक तत्काल संचार स्थापित करने में सक्षम है, एक अधिक पोषक तत्वों युक्त वातावरण है कि जीवाणु गुणन2एहसान हो सकता है । बहुत कम जीनोमिक फायदे के बारे में जाना जाता है कि एम abscessus के पास या एक intracellular वातावरण में अस्तित्व की अनुमति हासिल कर ली है । अमीबा coculture एक कुशल तरीका है कि माइकोबैक्टीरियम massiliense7,8के रूप में कई नए अमीबा प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अलगाव की अनुमति दी है । एक क्षमता amoebae भीतर गुणा करने के लिए देखा गया था, चूहों में एम abscessus के aerosolization के एक मॉडल में, जो एम abscessus4के लिए एक वृद्धि की डाह प्रदान कर सकते हैं. एक परिकल्पना है कि एम abscessus आनुवंशिक इस वातावरण के भीतर का सामना करना पड़ा phagocytic कोशिकाओं है, जो अंय गैर रोगजनक RGM से अलग है में जीवित लक्षण विकसित किया था । इन अधिग्रहणों और मानव की मेजबानी में अपनी डाह प्रसार करने की क्षमता एहसान हो सकता है ।

इस रिपोर्ट में amoebae वातावरण में जीवित रहने के लिए M. abscessus को प्रदत्त जीनोमिक लाभों को हाइलाइट करने के लिए उपकरण और विधियों का वर्णन किया गया है । इस प्रयोजन के लिए, एम abscessus transposon म्यूटेंट की स्क्रीनिंग पहले, Acanthamoeba castellanii प्रकार तनाव है, जो intracellular विकास के लिए है उत्परिवर्ती दोषपूर्ण की पहचान की अनुमति देता है पर वर्णित है । मैक्रोफेज में एक दूसरी स्क्रीनिंग भी बताया जाता है, की पुष्टि करने के लिए यदि यह दोष मानव की मेजबानी में बनी हुई है । दूसरे, समझने के लिए जो तंत्र abscessus में दोहन करने के लिए phagocytic कोशिकाओं में जीवन के लिए अनुकूल है और पशु मेजबान में अपनी डाह वृद्धि, एक विधि विशेष रूप से एम abscessus के लिए अनुकूल विकसित किया गया था, सह के बाद संस्कृति amoebae की उपस्थिति है कि इंट्रा amoebal बैक्टीरिया से कुल आरएनए के निष्कर्षण की अनुमति दी । एक परिणाम के रूप में, एम abscessus जीन है कि एक intracellular जीवन के लिए आवश्यक है की एक व्यापक दृष्टिकोण विकसित किया गया था ।

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Protocol

1. पुस्तकालय स्क्रीनिंग

  1. तमिलनाडु उत्परिवर्ती पुस्तकालय का निर्माण
    1. कोई transposon लायब्रेरी प्राप्त करें ।
      नोट: इस प्रयोग के लिए, एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय E.J. रुबिना, सार्वजनिक स्वास्थ्य, बोस्टन, संयुक्त राज्य अमेरिका के हार्वर्ड स्कूल से प्राप्त किया गया था । पुस्तकालय एम. abscessus परिसर (एम. abscessus subsp. massiliense) के एक चिकनी नैदानिक तनाव (43S) से एक एम phagemid में पेश abscessus के साथ एक एकल तमिलनाडु के यादृच्छिक प्रविष्टि की अनुमति का निर्माण किया गया था एक टा dinucleotide में ( एम. abscessus जीनोम में ९१,२४० टा अनुक्रम) । अधिक जानकारी के लिए रुबिना एट अल के संदर्भ देखें । 9 और Laencina एट अल. 10.
  2. अनुमापन के पुस्तकालय एवं संरक्षण के एम. abscessusTn म्यूटेंट प्लेटों में
    नोट: यह एक सप्ताह लेता है ।
    1. बर्फ पर पुस्तकालय गल । पानी की 1 मिलीलीटर में धारावाहिक कमजोर पड़ने के प्रदर्शन से बैक्टीरियल एकाग्रता का निर्धारण (10-1 से 10-15) । प्लेट प्रत्येक कमजोर पड़ने की एक पेट्री पर एक बूंद 7H11 आगार के साथ मध्यम से युक्त पकवान २५० मिलीग्राम/एमएल कनमीसिन । 3-4 दिनों के लिए ३७ ° c पर प्लेटों की मशीन ।
      नोट: यहां पर 1011 बैक्टीरिया/एमएल के एक अनुमापन बरामद किए गए ।
    2. पुस्तकालय की एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद, एक अंतिम एकाग्रता के लिए पुस्तकालय को पतला ३,००० बैक्टीरिया/एमएल के 10 मिलीलीटर में 25% ग्लिसरॉल-पानी । लाइब्रेरी को प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर के साथ 10 cryotubes में Aliquot । -८० ° c पर aliquots स्टोर ।
    3. जब उपयोग करने के लिए तैयार है, गल बर्फ पर पतला पुस्तकालय के एक aliquot और जोड़ें १०० µ पुस्तकालय के एल 10 स्क्वायर ंयूएलर-Hinton (MH) आगर प्लेटें (आकार 12 सेमी) करने के लिए २०० ३०० व्यक्तिगत कालोनियों को ठीक करने के लिए 3 के बाद-4 दिन की मशीन के ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. बाँझ toothpicks के साथ, व्यक्तिगत कालोनियों हस्तांतरण (६० एक्स ९६ में लगभग ६,००० कालोनियों-अच्छी तरह से प्लेटें) में ९६-अच्छी तरह से 7H9 मध्यम के २०० µ एल से भरा प्लेटें ०.२% ग्लिसरॉल, 1% ग्लूकोज के साथ पूरक, २५० मिलीग्राम/कनमीसिन के एमएल । मिलाते हुए बिना 5 दिनों के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    5. स्थानांतरण १०० µ l की संस्कृति (step 1.2.4) को ९६-well थाली से युक्त १०० µ l 7H9 मीडियम के साथ ४०% ग्लिसरॉल. -८० डिग्री सेल्सियस पर आदेश दिया पुस्तकालय स्टोर ।
    6. दोहराएँ चरण 1.2.3. ते 1.2.5. १०,००० व्यक्ति क्लोन तक पुस्तकालय के आराम के साथ (१०० x ९६ के आसपास अच्छी तरह से प्लेट और 30 MH प्लेटें) बरामद कर रहे हैं ।
  3. amoebae की तैयारी
    1. संस्कृति अमीबा Acanthamoeba castellanii (एसी) में ७५ सेमी2 ऊतक संस्कृति की कुप्पी में कमरे के तापमान (RT) में 30 एमएल के PYG मध्यम (तालिका 1) के प्रवर्धन के लिए सेल लाइन11.
      नोट: कई पाचन रिक्तिकाएं के साथ बड़े चिपकने वाला कोशिकाओं से परिपक्व ट्रोफोजोइट्स एक खुर्दबीन पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । सेल दोहरीकरण समय 25 एच होने का अनुमान है कोशिकाओं ७५ सेमी2 ऊतक संस्कृति की कुप्पी में प्रारंभिक संस्कृति के एक तिहाई फैल द्वारा हर 3 दिन परिलक्षित किया गया ।
    2. PYG मीडियम को 25 मिलीलीटर पिपेट से निकाल लें । एसी बफर (तालिका 2) है, जो किसी भी कार्बन या नाइट्रोजन स्रोत12शामिल नहीं है की 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । धो दो बार और अधिक दोहराएं ।
      नोट: AC बफ़र जिसमें कोई कार्बन या नाइट्रोजन स्रोत आइसोलेटों की extracellular वृद्धि से बचा जाता है । यह न्यूनतम माध्यम amoebae के encystment की ओर जाता है. इस सीमा के लिए, गर्मी निष्क्रिय ई कोलाई एक सब्सट्रेट (चरण १.४) amoebae और बहुत ही कम संस्कृति बार के रूप में जोड़ा गया (४८ उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग और 4 एच या 16 RNAseq प्रयोगों के लिए एच संस्कृति के लिए एच) पदोंनत किया गया । वैकल्पिक रूप से, इस माध्यम का उपयोग लेकिन PYG माध्यम से समृद्ध (आमतौर पर 10%) ।
    3. टिशू कल्चर कुप्पी के एक जोरदार शेक के साथ अमीबा को कुप्पी के नीचे से अलग कर दीजिये ।
    4. एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना करने के लिए सेल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 5 x 105 amoebae/मिलीलीटर एसी बफर में पतला ।
  4. गर्मी की तैयारी-निष्क्रिय ई कोलाई बैक्टीरिया संक्रमण के बाद अमीबा फ़ीड करने के लिए
    1. एक ग्लिसरॉल शेयर से Luria शोरबा (पौंड) के ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात १०० मिलीलीटर में ई. कोलाई नैदानिक अलग तनाव बढ़ता है ।
    2. फसल १,८३५ एक्स जी में ५० मिलीलीटर ट्यूबों में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा बैक्टीरिया । supernatant को त्यागें । 10% ग्लिसरॉल-पानी की 10 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend । दो बार और अधिक धोने दोहराएं ।
    3. 10% ग्लिसरॉल-पानी की 5 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend । Aliquot ०.५ मिलीलीटर में १.५ मिलीलीटर ट्यूबों । सीरियल कमजोर पड़ने के प्रदर्शन और पौंड आगर प्लेटों पर कमजोर पड़ने को जोड़ने के द्वारा बैक्टीरिया/एमएल की मात्रा निर्धारित करते हैं । -८० ° c पर aliquots स्टोर ।
    4. अमीबा संक्रमण के पहले दिन, गल एक बर्फ पर aliquot और ६० मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब मशीन द्वारा गर्मी की हत्या के लिए आगे बढ़ना ।
      नोट: £ आगर पर निष्क्रिय जीवाणुओं के १०० µ एल चढ़ाना द्वारा निष्क्रियता की जांच ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात । संस्कृति की एक रात के बाद कोई कालोनियां दिखाई नहीं देनी चाहिए ।
    5. एसी बफर के ५० µ एल में 107 बैक्टीरिया की एकाग्रता के लिए गर्मी मारे गए बैक्टीरिया को पतला और कोई अधिक से अधिक एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला बैक्टीरिया की दुकान ।
  5. सह amoebae की संस्कृति-M. abscessus तमिलनाडु उत्परिवर्ती: पहले स्क्रीन
    नोट: यह ६,००० म्यूटेंट की स्क्रीनिंग के लिए 3-4 महीने लगते हैं ।
    1. फैले 5 x 104 amoebae/खैर एसी बफर के १०० µ एल में एक ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए । मिलाते हुए बिना ३२ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन । अस्थाई अमीबा trophozoïtes समय कुओं का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      1. जबकि मशीनिंग, बर्फ पर गल बैक्टीरिया 1 एच के लिए ।
    2. एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट के साथ गल बैक्टीरिया संस्कृतियों के 5 µ एल जोड़ें । ९६-अच्छी तरह से प्लेट तमिलनाडु म्यूटेंट स्टॉक से ६,००० व्यक्तिगत क्लोन के आसपास १.५ एच स्क्रीन के लिए संक्रमित ।
      नोट: MOI प्रोटोकॉल के इस चरण में अज्ञात है; हालांकि, सभी ९६ अच्छी तरह से तमिलनाडु म्यूटेंट युक्त प्लेटें ठीक उसी तरह से खेती की गई । यह पहली स्क्रीन जल्दी intracellular की कमी म्यूटेंट की पहचान करने के लिए, इनोक्युलम घनत्व में बदलाव पर विचार किए बिना करना है ।
    3. संक्रमण के १.५ एच के बाद, एक धुएं हुड के तहत एसी माध्यम को दूर करने के लिए एक निष्फल धातु ट्रे में रखा बाँझ धुंध पर ९६ अच्छी तरह से प्लेट पलटना । एसी माध्यम के २०० µ एल के साथ रिफिल । इस धोने को दो बार और दोहराएं ।
    4. शेष extracellular आइसोलेटों को समाप्त करने के लिए १०० µ g/mL amikacin के साथ पूरक ताजा माध्यम के २०० µ l को जोड़ें ।
    5. 3 अतिरिक्त धोने के साथ आगे बढ़ने से पहले 2 एच के लिए मशीन (के रूप में कदम 1.5.3 में वर्णित) । धोने के बाद, ५० µ जी के साथ संस्कृतियों को बनाए रखने/एमएल amikacin एसी बफर के २०० µ एल में ।
    6. जोड़ें 5 x 107 हीट-निष्क्रिय ई कोलाई बैक्टीरिया (१.४ कदम से) संक्रमण के अंत में और हर 24 ज amoebae के encystment को रोकने के लिए ।
    7. सह संस्कृति के ४८ ज के बाद, लाइसे 10% एसडीएस (सोडियम dodecyl सल्फेट) के 10 µ एल जोड़कर कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से और ३२ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन । धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ आगे बढ़ना और intracellular आइसोलेटों की संख्या का मूल्यांकन करने के लिए 5% भेड़ रक्त (क्योंकि प्लेट) युक्त प्लेटों पर कोलंबिया आगर जोड़ें । parafilm के साथ प्लेट सील और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    8. जब कॉलोनियों 3-4 दिनों के बाद आगर प्लेट पर दिखाई देते हैं, तो फोटोग्राफ प्लेट और बैक्टीरियल कॉलोनियों की सबसे कम संख्या के साथ जमा देख कर intracellular वृद्धि के लिए म्यूटेंट बिगड़ा पहचान ।
      नोट: आकार, ऊंचाई या कॉलोनी के घनत्व के बारे में मन नहीं है (चित्रा 1A) । 136/6000 म्यूटेंट की पहचान की गई ।
  6. सह amoebae की संस्कृति-M. abscessusTn उत्परिवर्ती: पहली स्क्रीन के दौरान की पहचान की म्यूटेंट की दूसरी स्क्रीन
    नोट: यह 2 सप्ताह लगते हैं । एक दूसरे स्क्रीन १३६ तनु म्यूटेंट पहले स्क्रीन के बाद प्राप्त करने के लिए ठीक जीवाणुओं की संख्या inoculated और intracellular अस्तित्व जीवाणुओं की संख्या 2 दिनों के बाद संक्रमण के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    1. ५० मिलीलीटर में एक प्रभावित उत्परिवर्ती के 1 कॉलोनी हो 7H9 मध्यम के 20 मिलीलीटर से भरा ट्यूब ०.२% ग्लिसरॉल, 1% ग्लूकोज और २५० मिलीग्राम/एमएल कनमीसिन के साथ पूरक । जीवाणुओं को घातांकीय चरण (0.6 < OD < 0.8) तक पहुंचने की अनुमति दें ।
    2. एसी माध्यम में (10 मिनट के लिए १,८३५ एक्स जी ) केंद्रापसारक द्वारा संस्कृति धो लो । supernatant को त्यागें । दोहराएं इस धोने 7H9 मध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ और अधिक दो बार ०.२% ग्लिसरॉल, 1% ग्लूकोज और २५० मिलीग्राम/कनमीसिन के एमएल के साथ पूरक ।
    3. एसी बफर के 5 मिलीलीटर में बैक्टीरिया resuspend ।
    4. कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) म्यूटेंट की एकाग्रता का निर्धारण । 24 में अच्छी तरह से प्लेटें, दो पहली पंक्तियों के लिए पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें । पहले अच्छी तरह से बैक्टीरियल सस्पेंशन के १०० µ एल जोड़ें । एक micropipette के साथ, तीन बार मिलाएं । फिर, महाप्राण १०० µ एल और दूसरी अच्छी तरह से जमा करें ।
    5. एक नई टिप के साथ, दूसरी अच्छी तरह से तीसरी एक, आदि से बारहवीं अच्छी तरह से दोहराने कदम 1.6.4 ।
    6. महाप्राण 10-12 कमजोर पड़ने के 30 µ एल और यह एक क्योंकि थाली में जोड़ें । अंय कमजोर पड़ने के लिए दोहराएं ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3-4 दिनों के लिए parafilm और गर्मी के साथ क्योंकि प्लेट लपेटें । कालोनियों की गिनती कर एकाग्रता निर्धारित करें ।
    8. तपसिल में ऊपर वर्णित के रूप में सह संस्कृति परख प्रदर्शन 5 एक्स 104 अमीबा के साथ अच्छी तरह से थाली में 1 एसी सह संस्कृति माध्यम की मिलीलीटर । 10 के संक्रमण (MOI) की बहुलता के साथ Inoculate ।
    9. सह संस्कृति के ४८ ज के बाद, चरण 1.5.7 में बताए अनुसार कक्ष lysis के साथ आगे बढ़ें । पानी में सीरियल कमजोरियां प्रदर्शन (10-1 से 10-6) और µ प्लेट के लिए 30 एल जोड़ें । CFU गिनती के साथ आगे बढ़ने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए प्लेटें ।
      नोट: इस दूसरे स्क्रीन के बाद, १३६ म्यूटेंट के ६० संरक्षण किया गया ।
    10. स्टोर म्यूटेंट कोशिकाओं के अंदर अपने अस्तित्व के लिए प्रभावित । ग्लिसरॉल (20% अंतिम) या वाणिज्यिक समाधान और एक दीर्घकालिक संरक्षण पक्ष और भविष्य टीका की सुविधा के लिए और फिर-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए microbeads युक्त cryotube में एक साथ पौंड मध्यम युक्त cryotube के लिए एक कॉलोनी जोड़ें ।
    11. ६०० एनएम हर 2 दिन में ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को मापने के द्वारा इन विट्रो उत्परिवर्ती विकास का आकलन करें ।
      1. ५० मिलीलीटर में प्रत्येक प्रभावित उत्परिवर्ती के 1 कॉलोनी बढ़ो 7H9 मध्यम के 20 मिलीलीटर से भरा ट्यूब ०.२% ग्लिसरॉल के साथ पूरक, 1% ग्लूकोज और २५० मिलीग्राम/कनमीसिन के एमएल । कैनेटीक्स शुरू करने के लिए ०.०१ के लिए आयुध डिपो को समायोजित करने से पहले बैक्टीरिया को घातांकीय चरण (0.6 < OD < 0.8) तक पहुंचने की अनुमति दें ।
      2. जब intracellular कमी म्यूटेंट के सेट से WT तनाव के साथ तुलना में इन विट्रो वृद्धि दोष के साथ म्यूटेंट बाहर निकालें ।
  7. Co-संस्कृति मैक्रोफेज-M. abscessus तमिलनाडु उत्परिवर्ती दोषपूर्ण एक इंट्रा-अमीबा जीवन के लिए
    नोट: यह 1 महीने लगते हैं ।
    1. स्प्रेड 5 x 104 जे 774.2 murine मैक्रोफेज के प्रति अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली अमीर माध्यम के 1 मिलीलीटर में, DMEM भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के 10% के साथ पूरक । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 में मैक्रोफेज आसंजन की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए प्लेटें । 3 प्रतिकृति प्रदान करें ।
    2. संक्रमण को पूरा करें । Inoculate तमिलनाडु म्यूटेंट, 10 के एक MOI के साथ, DMEM में 10% FCS के साथ १०० की मात्रा में पतला µ एल
    3. संक्रमण के 3 ज के बाद, DMEM के 1 मिलीलीटर के साथ तीन धोने प्रदर्शन (एक वैक्यूम पंप इस्तेमाल किया जा सकता है) । फिर शेष extracellular आइसोलेटों को समाप्त करने के लिए 1 h के लिए २५० µ g/mL amikacin (10% FCS के साथ DMEM में) के साथ व्यवहार करें ।
      1. 1 मिलीलीटर DMEM के साथ 3 अतिरिक्त धोने के बाद, २५० µ जी में संस्कृतियों को बनाए रखने/एमएल amikacin (DMEM में 10% FCS के साथ) 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए extracellular माइक्रोबैक्टीरियल गुणा को रोकने के लिए ।
    4. ७२ ज सह-संस् कृति के बाद मध् यम को निकालें और लाइसे को 1 मिलीलीटर ठंडे पानी से जोड़कर मैक्रोफेज । 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    5. intracellular बैक्टीरिया की संख्या का मूल्यांकन करने के लिए क्योंकि प्लेटों पर CFU परख प्रदर्शन ।
      1. एक 24 अच्छी प्लेट में, दो पहली पंक्तियों के लिए पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें । पहले वेल तक सह-सेल lysate के १०० µ l को जोड़ें । एक micropipette के साथ, तीन बार मिलाएं । महाप्राण १०० µ एल और दूसरी अच्छी तरह से उन्हें जमा करें ।
      2. एक नई टिप के साथ, दूसरी अच्छी तरह से एक तिहाई, आदि बारहवें अच्छी तरह से जब तक कमजोर पड़ने को दोहराने । उसके बाद 10-12 कमजोर पड़ने के 30 µ एल महाप्राण और इसे एक कारण थाली में जोड़ें ।
      3. अंय कमजोर पड़ने के लिए दोहराएं । parafilm के साथ क्योंकि प्लेट लपेटें और निरीक्षण और कालोनियों की गणना करने के लिए 3-4 दिन प्रतीक्षा करें ।
  8. एम. abscessus म्यूटेंट में तमिलनाडु के सम्मिलन की साइट की पहचान और अनुक्रमण
    नोट: यह ६० म्यूटेंट के लिए १.५ महीने लगते हैं ।
    1. की पहचान की जीनोमिक निष्कर्षण M. abscessus म्यूटेंट
      1. म्यूटेंट एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 7H9 मध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ पूरक ०.२% ग्लिसरॉल, 1% ग्लूकोज और कनमीसिन २५० मिलीग्राम/एमएल के लिए घातीय चरण (आयुध डिपो६००= ०.८) ।
      2. फसल संस्कृतियों (२,३९६ x g, 5 मिनट) के 10 मिलीलीटर । supernatant को त्यागें । (25% सुक्रोज, ५० mm Tris पीएच 8, 10 मिलीग्राम/एमएल lysozyme, ४० mm thiourea) समाधान के ५०० µ एल में बैक्टीरिया सस्पेंड । 2 मिलीलीटर ट्यूब में पेंच टोपी और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए गर्मी के साथ समाधान स्थानांतरण ।
      3. समाधान द्वितीय के ५०० µ एल जोड़ें (25% सुक्रोज, ५० मिमी Tris पीएच 8, ५० मिमी EDTA). ऊपर और नीचे 5-10 बार pipetting के बाद, ट्यूब में ५०० µ एल की एक मात्रा तक zirconium मोती जोड़ें ।
      4. एक homogenizer के साथ सेल lysis के साथ आगे बढ़ें (3 x ६,००० rpm, ४५ एस) प्रत्येक दौर के बीच बर्फ पर एक 1 मिनट की मशीन के साथ ।
      5. 20 मिलीग्राम/एमएल Proteinase K (१०० µ g/एमएल) के 5 µ एल जोड़ें और ५५ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात नमूने मशीन ।
      6. एक धुएं डाकू के तहत phenol/क्लोरोफॉर्म/isoamyl शराब (25:24:1) की ठंड के 1 मिलीलीटर जोड़ें । RT और १६,५०० x g पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक के साथ आगे बढ़ने से पहले भंवर द्वारा नमूने मिश्रण ।
      7. केंद्रापसारक के बाद, जलीय चरण ठीक है और एक हुड के तहत ठंड phenol/क्लोरोफॉर्म/isoamyl शराब समाधान के एक बराबर मात्रा में जोड़ें । 30 मिनट के लिए १६,५०० x g पर नमूने के लिए जलीय चरण फिर से ठीक हो ।
      8. एक धुएं हूड के तहत बरामद जलीय चरण के लिए आर टी isopropanol के ०.७ खंड जोड़ें । उलटा धीरे ट्यूबों के लिए डीएनए वर्षा की अनुमति देने के लिए और आरटी में 5 मिनट की मशीन । फिर १६,५०० x g और RT पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक
      9. supernatant निकालें और एक डाकू के तहत ७०% इथेनॉल के ५०० µ एल के साथ गोली धो लो । 10 मिनट के लिए आरटी में १६,५०० x g पर इथेनॉल को हटाने से पहले ट्यूबों । 10 मिनट के लिए मशीन शेष शराब वाष्पीकरण की अनुमति है ।
      10. अंत में, DNase/RNase मुफ्त पानी की १०० µ एल में डीएनए गोली निलंबित । एक spectrophotometer के साथ डीएनए उपज और पवित्रता डीएनए का निर्धारण ।
      11. जीनोमिक डीएनए के 1 µ जी निकालें और उप के लिए एक रात के लिए ClaI के 10 यू के साथ डाइजेस्ट- तमिलनाडु प्रविष्टि साइट क्लोनिंग । निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
        नोट: सीएलएमैं एंजाइम एम. abscessus जीनोम में सबसे उच्च प्रतिनिधित्व प्रतिबंध एंजाइमों में से एक है (२,१७३ प्रतिबंध साइटों) । एक सीएलएमैं प्रतिबंध साइट भी तमिलनाडु उत्परिवर्ती के कनमीसिन प्रतिरोध कैसेट के नदी के नीचे अनुक्रम में पाया जाता है । इस प्रकार, सीएलएI-मध्यस्थता उपक्लोनिंग तमिलनाडु प्रविष्टि साइट की पहचान करने के लिए सक्षम बनाता है ।
    2. जीनोमिक डीएनए के एक प्लाज्मिड में उप क्लोनिंग तमिलनाडु से युक्त
      नोट: तमिलनाडु-२,६८६ बीपी pUC19 एम्पीसिलीन-प्रतिरोधी प्लाज्मिड में उपक्लोनिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले, प्लाज्मिड के एकाधिक क्लोनिंग साइट में एक सीएलएमैं प्रतिबंध साइट जोड़ें । pUC19 प्लाज्मिड के अनुक्रम इस लिंक https://www.addgene.org/50005/sequences/पर पाया जा सकता है ।
      1. EcoRI और हिंदIII के साथ pUC19 प्लाज्मिड को पचाने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें, जो ५१ bp का एक अंश और २६३५ bp का एक अंश जारी करता है । एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट के साथ डबल पचा वेक्टर शुद्ध ५१ बीपी को खत्म करने के लिए जारी किया गया अंश ।
      2. मिश्रण 1 µ l (एकाग्रता 25 pmol/µ l) के दो पूरक oligonucleotides (5 ' AGCT टाटा AGATCT टाटा ATCGAT TATA3 ' और 5 ' AAT ताा ताा TCG ATT अता आगा TCT ताट A3 ') के 28 बीपी प्रत्येक के साथ सीएलएमैं प्रतिबंध साइट और सिरों पर हिंदIII और EcoR थाहा प्रतिबन्ध करेल. 10 मिनट के लिए १०० ° c में गर्मी और फिर उंहें बांध के क्रम में ठंडा ।
      3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार EcoRI और हिंदIII द्वारा युग्मित प्राइमरों को पचा ।
      4. Ligate १५० EcoRI/हिंदIII के एनजी-युग्मित प्राइमरों के अलग एकाग्रता के साथ प्रतिबंधित pUC19 प्लाज्मिड (५० pmol/µ एल, 25 pmol/µ l, २.५ pmol/µ l) 1 ज के लिए आरटी में 1 टी-4 डीएनए ligase के अंतिम मात्रा में 20 µ एल के साथ एक अलग से क्लोनिंग की जांच करें एंजाइमी पाचन ।
      5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए सीएलएमैं के साथ संशोधित प्लाज्मिड डाइजेस्ट ।
      6. Ligate ५० सीएलएके एनजी मैं-प्रतिबंधित pUC19प्लाज्मिड और ५० जीनोमिक डीएनए के एनजी सीएलएमैं 1 एच के लिए 1 ज के साथ आरटी पर पचा डीएनए ligase में 10 µ एल के साथ
      7. बंधाव (२५०० वी, २०० Ohms, 25 µF) के 5-10 µ एल के साथ ई. कोलाई electrocompetent बैक्टीरिया परिवर्तन करने के लिए आगे बढ़ें । पौंड आगर पर क्लोन का चयन करें ५० µ g/एमएल कनमीसिन और ५० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक प्लेटें तमिलनाडु दृश्यों के भाग के साथ बैक्टीरिया असर plasmids का चयन करें ।
      8. उपयुक्त एंटीबायोटिक चयन (५० µ जी/एमएल कनमीसिन और ५० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन) के साथ पौंड तरल माध्यम में रातोंरात प्रतिरोधी क्लोनों को विकसित करें ।
      9. प्लाज्मिड डीएनए निकालें । एंजाइमी प्रतिबंध और अनुक्रम तमिलनाडु के 3 ' के अंत तक डालने की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक oligonucleotide (5 ' TTGACGAGTTCTTCTGA 3 ') के साथ बाधित जीन की पहचान तमिलनाडु कनमीसिन के पिछले 17 आधार जोड़े को इसी प्रतिरोध कैसेट ।
      10. एक न्यूक्लियोटाइड विस्फोट (ब्लास्ट-एन) प्रदर्शन करके एम. abscessus जाओ 06 तनाव के खिलाफ अनुक्रम संरेखित करें ।

2. आरएनए निष्कर्षण Rnaseq विश्लेषण के लिए Intracellular आइसोलेटों

नोट: इस प्रयोग के लिए 4 महीने लगते है और RNAseq विश्लेषण के लिए 4 महीने ।

  1. amoebae की सह-संस्कृति बैचों मेंएम. abscessus
    नोट: निंनलिखित प्रयोग में, सह संस्कृति आंदोलन के साथ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में किया जाता है करने के लिए सेल संपर्कों बैक्टीरिया एहसान ।
    1. 7H9 माध्यम में एम. abscessus बढ़ने ०.२% ग्लिसरॉल, १२० rpm पर मध्य घातीय चरण के लिए 1% ग्लूकोज के साथ पूरक ।
    2. दो बार एसी बफर के 10 मिलीलीटर के साथ बैक्टीरिया को धो लें ।
    3. आयुध डिपो600nm को मापने के द्वारा बैक्टीरिया एकाग्रता का अनुमान (1 आयुध डिपो६००= 4 x 108 आइसोलेटों) । एसी मीडियम के 10 एमएल में ८.५ x 108 आइसोलेटों को ८.५ x 106 amoebae से जोड़ें ।
    4. कोमल आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए मशीन (के बारे में ८० rpm) ।
    5. फसल 12 मिनट के लिए २५३ x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं supernatant निकालें और एसी बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित । इस धोने को दो बार और दोहराएं ।
    6. ५० µ जी/एमएल amikacin युक्त एसी बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को resuspend extracellular बैक्टीरिया को खत्म करने और कोमल आंदोलन (८० rpm) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 ज के लिए मशीन । कोशिकाओं को दो बार फिर से धोएं ।
  2. intracellular M. abscessus से कुल आरएनए का निष्कर्षण
    नोट: विषाक्त रिएजेंट के उपयोग के कारण धुएं हुड के तहत कदम 2.2.1-2.2.3 ।
    1. अंतिम धोने के बाद, ठंड समाधान III के 4 मिलीलीटर में संक्रमित amoebae resuspend (तालिका 3) extemporaneously २८० µ l के साथ β-mercaptoethanol के amoebae बाधित करने के लिए. यह guanidinium thiocyanate (गोरखा) कदम है । 10 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन बनाए रखें २,३९६ x g पर 30 मिनट के लिए सेल lysate और 4 डिग्री सेल्सियस जारी intracellular बैक्टीरिया गोली ।
    2. supernatant निकालें और शीत समाधान III के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरियल गोली निलंबित । २३९६ x g पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया फसल । निष्कर्षण बफर के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend और एक 2 मिलीलीटर पेंच zirconium मोती युक्त ट्यूब में स्थानांतरण (जब तक ट्यूब के ५०० µ एल उंनयन) । -८० ° c पर कम से 24 घंटे के लिए ट्यूबों की दुकान ।
      नोट: lysis एजेंट में संग्रहण RNases और कक्ष विघटन की निष्क्रियता को अनुमति देता है ।
    3. जब उपयोग के लिए तैयार है, बर्फ पर गल नमूने और उंहें ६,००० rpm पर 25 एस, के लिए ६,००० rpm पर एक दौर के बाद एक homogenizer के साथ लाइसे के साथ 20 एस के लिए एक दौर के बीच बर्फ पर एक 1 मिनट की मशीन के साथ ।
    4. नीचे नमूना शांत करने के लिए, 10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें गर्मी । फिर isoamyl अल्कोहल में क्लोरोफॉर्म पतला के २०० µ l को जोड़ें । 1 मिनट के लिए नमूने भंवर के बाद, १६,५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    5. जलीय चरण के लिए ठंड isopropanol के ०.८ मिलीलीटर जोड़ें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 ज के लिए नमूने की मशीन । १६,५०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५ मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    6. ठंड ७०% इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़कर आरएनए गोली धो (मिश्रण नहीं है) ।
    7. 10 मिनट के लिए १६,५०० x g पर नमूने के लिए इथेनॉल को दूर केंद्रापसारक । समाधान महाप्राण और एक केंद्रापसारक ध्यानी में सूखी ।
    8. एक बार सूख, DNase/RNase मुफ्त पानी की १०० µ एल में छर्रों resuspend ।
      नोट: नमूने निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डीएनए दूषित पदार्थों को निकालने के लिए DNases के साथ दो बार इलाज किया जाना चाहिए ।
    9. एक agarose जेल पर आरएनए अखंडता का आकलन करें और आरएनए अखंडता संख्या (रिण) और एक चिप आधारित केशिका ट्रो विधि के साथ राइबोसोमल अनुपात को मापने के द्वारा पुष्टि ।
      नोट: रिण खाते में पूरे electrophoretic ट्रेस लेता है. रिन सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म कुल आरएनए के वर्गीकरण के लिए अनुमति देता है, 1 से 10 के एक नंबरिंग सिस्टम पर आधारित है, 1 सबसे अपमानित प्रोफ़ाइल जा रहा है और 10 सबसे बरकरार होने के साथ । सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी के साथ आगे बढ़ने के लिए, कुल्ला 8 से अधिक होना चाहिए और राइबोसोमल अनुपात [28S/18S] के रूप में संभव के रूप में उच्च, आदर्श 2 जा रहा है, जीव और उसके विशिष्टताओं के आधार पर मूल्य ।
    10. sequencing के लिए सीडीएनए लाइब्रेरी की तैयारी जब तक-८० ° c में आरएनए नमूनों की दुकान.
  3. सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी
    1. लाइब्रेरी तैयारी के साथ आगे बढ़ने के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीडीएनए संश्लेषण किट (सामग्री तालिका) का उपयोग करें.
    2. एक डीएनए चिप पर एकाग्रता और गुणवत्ता के लिए पुस्तकालय की जांच करें ।
      नोट: अधिक सटीक और सटीक ठहराव संवेदनशील फ्लोरोसेंट आधारित quantitation परख के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  4. लाइब्रेरी अनुक्रमण
    1. 2 एनएम के लिए नमूनों को सामान्य और प्रवाह सेल संगठन के अनुसार division के लिए आगे बढ़ना.
    2. 1 एनएम का उपयोग ०.१ N NaOH के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए एक एकाग्रता पर नमूने स्वभाव
    3. 10 बजे नमूनों को पतला कर दीजिये । प्रत्येक नमूना फ्लो सेल पर 10 बजे लोड ।
    4. बड़े पैमाने पर जीनोमिक्स सक्षम बनाता है एक उच्च-प्रवाह sequencing सिस्टम के साथ sequencing के साथ आगे बढ़ें । यहां रन एक टेक्सटाइल्स रन था (SR: एकल पढ़ें, पीई: युग्मित-अंत पढ़ता है, एम: मल्टीप्लेक्स नमूने) के साथ ५१ चक्र के 7 सूचकांक कुर्सियां पढ़ें ।
    5. बाह्य FastQC कार्यक्रम13के साथ अनुक्रमण की गुणवत्ता का आकलन करें ।
    6. एडाप्टर अनुक्रम की ट्रिमिंग के बाद, एक संदर्भ जीनोम के खिलाफ पढ़ें संरेखण के साथ आगे बढ़ें । नमूना संदूषण का आकलन करने के लिए eukaryotic सेल जीनोम के खिलाफ संरेखित करें और, यदि आवश्यक हो, गैर बैक्टीरियल पढ़ता की ट्रिमिंग के साथ आगे बढ़ें ।
  5. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. कई सॉफ्टवेयर उपलब्ध प्रोग्राम का प्रयोग करें विभेदक व्यक्त जीन के सेट को परिभाषित करने के लिए: आर सॉफ्टवेयर, DESeq2 और PF2tools पैकेज (संस्करण 1.2.12) सहित कंडक्टर संकुल मंच पर विकसित "Transcriptome एट Epigénome" (पाश्चर संस्थान, पेरिस) ।

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Representative Results

M. abscessus प्रतिरोध करने के लिए और मैक्रोफेज और amoebae जैसे पर्यावरणीय प्रोटोजोआ के जीवाणुनाशक प्रतिक्रियाओं से बचने की क्षमता है । M. abscessus डाह कारकों को व्यक्त करता है जब amoebae के साथ संपर्क में हो, जो इसे और अधिक विषमय चूहों में बनाता है4. इन पद्धतियों का पहला उद्देश्य amoebae के भीतर अपने अस्तित्व और बहुलता की अनुमति देने वाले एम. abscessus में मौजूद जीन की पहचान करना था.

इस के लिए, एम. abscessus subsp. massiliense, तमिलनाडु प्रसव9द्वारा प्राप्त की एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय, amoebae की उपस्थिति में सह संस्कृति के बाद की जांच की थी, इस म्यूटेंट में तनु विकास के साथ intracellular की पहचान करने के लिए पर्यावरण (चित्रा १). एक ही म्यूटेंट के व्यवहार का भी मूल्यांकन किया गया था मैक्रोफेज के साथ सह-संस्कृति का विश्लेषण करने के लिए कि क्या इस विकास क्षीणन चूहों मैक्रोफेज में संरक्षित किया गया था.

इस ब्लाइंड transposon लाइब्रेरी स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, ४७ ६,००० म्यूटेंट के लिए एक दोषपूर्ण प्रतिकृति phenotype की पुष्टि की है कि एक अस्तित्व था ५०% या कम amoebae और/या मैक्रोफेज में,10नियंत्रण की तुलना में । माइकोबैक्टीरियम के एक आंतरिक विकास दोष के कारण हो सकता है कि तनु intracellular अस्तित्व के साथ बाहर म्यूटेंट शासन करने के लिए, सभी चयनित तमिलनाडु म्यूटेंट के विकास curves में एक इन विट्रो में मूल्यांकन किया गया था तरल संस्कृति समृद्ध मध्यम (1% ग्लूकोज-7H9) । इन विट्रो में सभी म्यूटेंट के विकास में हर 2 दिन संस्कृतियों के६०० आयुध डिपो द्वारा निगरानी की गई । विभिंन म्यूटेंट है कि एक इन विट्रो में इसी जंगली प्रकार तनाव की तुलना में वृद्धि दोष प्रदर्शित अध्ययन से बाहर रखा गया ।

यह इस अंधे परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण था हर दिन reproduced बिल्कुल एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर । इस तकनीक की सीमा के पहले दृश्य स्क्रीनिंग पर था, फोटो प्रत्येक CFU के लिया गया संदर्भ के लिए एक सटीक छवि प्रदान करते हैं । म्यूटेंट के इस समूह में १२ एम. abscessus म्यूटेंट (डुप्लीकेट शामिल) की पहचान की गई जिसमें transposon में ESX-४ लोकस के प्रकार के सप्तम स्राव प्रणाली से संबंधित जीन सम्मिलित किया गया जो intracellular में इसके महत्व को रेखांकित करता है एम. abscessus10की वृद्धि ।

अब तक, एम abscessus डाह का विश्लेषण अनिवार्य रूप से एम. chelonae, एक ही समूह से संबंधित माइकोबैक्टीरियम के साथ एम. abscessus के जीनोम के तुलनात्मक विश्लेषण के आधार पर किया गया है, लेकिन केवल संक्रमण के कारण मनुष्यों में त्वचा की. उद्देश्य के लिए विभिंन सह संस्कृति शर्तों के दौरान व्यक्त जीन की एक सूची प्राप्त करने के लिए बेहतर अनुकूलन और संभावित डाह पर्यावरण पेशेवर की उपस्थिति में सह संस्कृति के दौरान शामिल तंत्र को समझने के लिए गया था फ़ैगोसाइट. एम. abscessusके कुल अनुक्रमण दूत RNAs के एक व्यापक दृष्टिकोण के माध्यम से इस वृद्धि हुई डाह का विश्लेषण, आदेश में RNAs प्रेरित या अमीबा सह के दौरान दमित RNAs के तहत लिखित की तुलना में दमन का पता लगाने के लिए किया गया था इन विट्रो स्थितियों में । इन RNAs के अंतर अभिव्यक्ति एम. abscessus एक बढ़ाया "डाह" मानव में ऊपरी एयरवेज के औपनिवेशीकरण समझा प्रदान कर सकते हैं ।

इन सह संस्कृतियों फिर से एक ंयूनतम माध्यम में किया गया (कार्बन या नाइट्रोजन का कोई स्रोत) के रूप में ऊपर वर्णित है, ताकि एम abscessus के extracellular विकास को रोकने के लिए और पर्यावरण इन द्वारा सामना की स्थिति का प्रतिनिधि होना आइसोलेटों और एक एंटीबायोटिक के चयन के दबाव में सह की अवधि के दौरान संस्कृति intracellular आइसोलेटों का चयन करने के लिए ।

इसलिए intracellular आइसोलेटों से आरएनए को अलग करने के लिए एक तकनीक विकसित की गई । माइक्रोबैक्टीरियल आरएनए के इस निष्कर्षण के साथ मुख्य कठिनाई amoebal आरएनए (यूकेरियोट प्रकार) के साथ संदूषण से बचना था । इस से बचने के लिए, अमीबा के lysis विभिंन समय के बाद सह संस्कृति, guanidinium thiocyanate (गोरखा प्रशिक्षण केंद्र) का उपयोग किया गया; चूंकि intracellular आइसोलेटों प्रतिरोधी हैं । इस कदम के बाद, माइक्रोबैक्टीरियल RNAs के एक यांत्रिक निष्कर्षण zirconium मोतियों की उपस्थिति में एक सेल-homogenizer का उपयोग कर बाहर किया गया था । इस तकनीक ने हमें अच्छी गुणवत्ता की माइक्रोबैक्टीरियल आरएनए प्राप्त करने की अनुमति दी, उच्च गुणवत्ता के एक रिण संख्या के साथ, एम abscessus transcriptome का पूरा विश्लेषण करने की क्षमता में सुधार करने के लिए आवश्यक, दूत आरएनए अनुक्रमण का उपयोग (mRNA) तकनीक (चित्रा 2) । यह पहले कभी नहीं किया गया है और हमें प्रेरित जीन परिवारों की एक मौलिक दृष्टि दिया या दमित उंहें अपनी भूमिका के अनुसार समूह द्वारा: एम. abscessus की प्रतिक्रिया एक पर्यावरण पोषक तत्वों और खनिजों के अपने स्रोत में सीमित करने के लिए, एक hypoxic के लिए या अम्लीय पर्यावरण और ऑक्सीडेटिव और nitrosative तनाव और अंत में एम. abscessus के डाह के पर्यावरण अमीबा में अभिव्यक्ति के लिए एम abscessus के प्रतिरोध ।

Figure 1
चित्रा 1 : A. अमीबा में एम abscessus तमिलनाडु म्यूटेंट की पहली विजुअल स्क्रीन । () amoebae पर तमिलनाडु म्यूटेंट के बड़े पैमाने पर स्क्रीन ९६ में किया जाता है-अच्छी तरह से प्लेटें संक्रमण की एक यादृच्छिक बहुलता के साथ जल्दी से तनु म्यूटेंट की पहचान । () तनु तमिलनाडु म्यूटेंट बाधित जीन की पहचान । तमिलनाडु म्यूटेंट ' जीनोमिक डीएनए सीएलएके साथ खंडित मैं तमिलनाडु प्रविष्टि साइट क्लोन है । M. abscessus जीनोम बंदरगाह २५०० सीएलएमैं प्रतिबंध साइटों जो कम डीएनए टुकड़े की प्राप्त करने एहसान लेकिन संभावना को कम करने के लिए तमिलनाडु सम्मिलन साइट (1/2500) क्लोन । क्लोन कनमीसिन, transposon द्वारा प्रतिरोध भालू के साथ चुना जाता है । बाधित जीन तमिलनाडु कनमीसिन प्रतिरोध कैसेट (काला तीर) के अंदर एक प्राइमर के साथ अनुक्रमण द्वारा की पहचान की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : माइक्रोबैक्टीरियल आरएनए निष्कर्षण का विश्लेषण । () amoebae के दौरान intracellular एम. abscessus की आरएनए निष्कर्षण-एम. abscessus सह-संस्कृति. एम abscessus के साथ Amoebae सह संस्कृतियों संक्रमण के एक उच्च बहुलता पर प्रदर्शन कर रहे है (यानी, १००), बड़ी मात्रा में, कोमल आंदोलन के साथ, बैक्टीरिया संपर्कों को सेल एहसान । सह संस्कृतियों के बाद, कोशिकाओं को काटा और गोरखा प्रशिक्षण और ß-mercaptoethanol के संयोजन के साथ लीजड ड हैं । सेल lysate युक्त बैक्टीरिया फिर से गोरखा के साथ व्यवहार किया जाता है बैक्टीरिया सेल दीवार को कमजोर करने के लिए बैक्टीरिया मैकेनिक lysis से पहले आरएनए निष्कर्षण करने की सुविधा । () आरएनए गुणवत्ता और अखंडता एक विश्लेषक के साथ मूल्यांकन । एक ट्रो जेल दिया जाता है जिस पर rRNA (23S, 16S और 5 एस) मनाया जाता है । रिण 8 से ऊपर होना चाहिए अनुक्रमण और rRNA अनुपात के लिए पुस्तकालय की तैयारी के साथ आगे बढ़ना (23S/16S) जीव के आधार पर संभव के रूप में उच्च के रूप में, आदर्श मूल्य 2 जा रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एम. abscessus के व्यवहार अधिक है जैसे कि किसी भी अन्य आइसोलेटों से संबंधित RGM2के अलावा रोगजनक SGM के व्यवहार के समान है । SGM के pathogenicity में प्रमुख तत्व उनके जीवित रहने या भी प्रतिजन के भीतर गुणा-कोशिकाओं को पेश करने की क्षमता है, जैसे मैक्रोफेज और वृक्ष कोशिकाओं.

एम abscessus कुछ जीनोमिक लाभ के रूप में अपने जीनोम14 के कुल अनुक्रम द्वारा दिखाया गया है ताकि एक eukaryotic phagocytic सेल के भीतर जीवित रहने के लिए अधिग्रहण कर लिया है । एम abscessus का जीनोम तेजी से विकसित हो रहा है और बहुत प्लास्टिक दिखाया गया है, के साथ कई हाल ही में शुरू की प्रविष्टि ऐसे prophages और नए जीन15के रूप में अनुक्रम । यद्यपि एम. abscessus में डाह कारकों पर कम डेटा है, m. तपेदिककी तुलना में एम. abscessus तेजी से विकसित करने के लिए सक्षम होने लगता है और सक्रिय रूप से बढ़ डाह की ओर । अब तक, एम abscessus डाह का विश्लेषण अनिवार्य रूप से एम. chelonaeके साथ एम. abscessus के जीनोम के तुलनात्मक विश्लेषण पर आधारित था, एक माइकोबैक्टीरियम एक ही समूह से संबंधित है, लेकिन संक्रमण के कारण सीमित मनुष्यों में त्वचा. एम. chelonae में मौजूद कुछ जीन नहीं बल्कि एम. abscessusमें मौजूद phospholipase सी के रूप में, पर्यावरण phagocytosis4द्वारा amoebae के बाद एम. abscessus के प्रतिरोध को आंशिक रूप से समझाया है ।

एक अमीबा सह संस्कृति पर्यावरण नमूनों के साथ पूरक तकनीक का विकास स्पष्ट रूप से अमीबा-माइक्रोबैक्टीरियल16,17बातचीत का प्रदर्शन किया है । इस प्रकार, आइसोलेटों lysates सह से अलग किया जा सकता है amoebae की उपस्थिति में एक जल उपचार संयंत्र18में संस्कृति, और M. massiliense सह के बाद एक रोगी के थूक से पृथक किया गया था संस्कृति amoebae के साथ, जबकि अकेले संस्कृति नहीं था इस आइसोलेटों8के अलगाव की अनुमति दें । Amoebae तेजी से4 आइसोलेटों और Acanthamoebaspके लिए एक मशीन के रूप में माना जाता है । कई गैर तपेदिक आइसोलेटों के लिए एक प्राकृतिक पर्यावरण की मेजबानी के रूप में । अमीबा प्लस आइसोलेटों सह संस्कृति प्रणालियों तेजी से सरल और तेजी से मॉडल के रूप में प्रस्तावित किया जा रहा है आइसोलेटों19,20,21के intracellular विकास में शामिल कारकों की विशेषता है, 22,23,24.

वातावरण में, आइसोलेटों और amoebae के बीच बातचीत खराब प्रलेखित है । पहले क्षेत्र में आइसोलेटों और amoebae के बीच एक संघ के सबूत का वर्णन लेख २०१४ में बाहर आया था, और इस अध्ययन के एक पीने के पानी के नेटवर्क के एक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित25

हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली amoebae के साथ एक सह संस्कृति के दौरान वर्णित स्क्रीनिंग है । इस अध्ययन से हमें मानव को प्रभावित करने वाले एक अवसरवादी रोगज़नक़ के डाह के अधिग्रहण में पर्यावरणीय फ़ैगोसाइट द्वारा निभाई गई भूमिका को प्रदर्शित करने की अनुमति दी । आदेश में एम abscessus, स्थानांतरण द्वारा एक उत्परिवर्ती पुस्तकालय की एक स्क्रीन के intracellular अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन को उजागर करने के लिए एम. abscessus परिसर की एक उपप्रजाति में किया गया था और एक नैदानिक तनाव में । इस उत्परिवर्ती पुस्तकालय amoebae के साथ जांच की थी, यह पिछले एक "प्रशिक्षण जमीन" चूहों4में एम abscessus के डाह बढ़ाने के लिए के रूप में प्रदर्शन किया गया था, कि एम एवियम26के साथ मनाया । प्रमुख परिणाम ESX के आवश्यक भूमिका के आइसोलेटों में पहली बार खोज-4 लोकस एक प्रकार की सातवीं स्रावी प्रणाली एंकोडिंग था, और ESX के पूर्वज-1 लोकस और एम के डाह अस्तित्व के लिए आवश्यक माना जाता है तपेदिक माइकोबैक्टीरियम microti तथा एम. marinum२७,२८,२९,३०,३१.

दूसरा उद्देश्य के लिए विभिंन सह संस्कृति शर्तों के दौरान व्यक्त की जीन की एक सूची प्राप्त करने के लिए बेहतर अनुकूलन और संभावित डाह पर्यावरण की उपस्थिति में सह संस्कृति के दौरान शामिल तंत्र को समझने के लिए गया था व्यावसायिक फ़ैगोसाइट. एम abscessusके दूत RNAs के कुल sequencing के एक व्यापक दृष्टिकोण के माध्यम से इस वृद्धि हुई डाह का विश्लेषण, आदेश में RNAs प्रेरित या अमीबा सह के दौरान दमित RNAs के तहत लिखित की तुलना संस्कृतियों का पता लगाने के लिए किया गया था इन विट्रो स्थितियों में । इन RNAs के अंतर अभिव्यक्ति एम. abscessus एक बढ़ाया "डाह" मानव में ऊपरी एयरवेज के औपनिवेशीकरण समझा प्रदान कर सकते हैं । RGM प्रजातियों में, m. abscessus गैर-रोगजनक phenotype के साथ एम. chelonaeके लिए एक अपवाद है । एम. abscessus की क्षमता तपेदिक आइसोलेटों को इसी तरह विकृतियों के कारण यह और भी अनूठा बना देता है । कई अध्ययनों से मैक्रोफेज३२,३३ के अंदर जीवन के लिए m. तपेदिक के intracellular रूपांतरों की सूचना दी है लेकिन कोई भी vivo में m. abscessus रूपांतरों पर ध्यान केंद्रित किया है । एम abscessus हाइपोक्सिया के Transcriptional रिस्पांस३४ बताया गया है, हालांकि, mycobactins की भूमिका पर प्रकाश डाला और dosR regulon के रूप में एम. तपेदिकमें वर्णित है । amoebae और मैक्रोफेज के अंदर एम abscessus transcriptome के विश्लेषण के जीवाणु रूपांतरों में एक अंतर्दृष्टि देता है intracellular जीवन के प्रति एसई। उन transcriptomes की तुलना मनुष्यों में एम. abscessuएस डाह ट्रिगर में amoebae की भूमिका के आकलन परमिट और स्तनधारी phagocytic कोशिकाओं के लिए विशिष्ट रूपांतरों के गूढ़ करने के लिए । एक अनुमान बनाया गया था कि amoebal पर्यावरण के लिए मानव कोशिकाओं को हस्तांतरण से पहले एम. abscessus के लिए एक ' प्रशिक्षण जमीन ' का गठन हो सकता है, ताकि विकासवादी रूपांतरों के संदर्भ में एम abscessus डाह का वर्णन करने के लिए, इस दृष्टिकोण को रेंडर करता है मूल .

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Acknowledgements

हम बहुत पीआर E.J. रुबिना (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, संयुक्त राज्य अमेरिका) उत्परिवर्ती पुस्तकालय के कीमती उपहार के लिए स्वीकार करते हैं, और डॉ बेन मार्शल (चिकित्सा, साउथेंप्टन, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय के संकाय) पांडुलिपि के सुधार के लिए । हम बहुत सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए फ्रेंच रोगी एसोसिएशन स्वीकार "Vaincre ला Mucoviscidose" और "L'Association ग्रेगरी Lemarchal" उनके वित्तीय सहायता (RF20150501377) के लिए । हम नेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च (ANR प्रोग्राम DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), और वी. एल-एम को Région फेलोशिप की फंडिंग के लिए d'Intérêt इले-डे-फ्रांस (domaine Majeur विकृतियों Infectieuses postdoctoral एट आपाती) का भी शुक्रिया अदा करते हैं । एल. एल. "Ministère डे L'Enseignement Supérieur एट डे ला सभ्य" से डॉक्टरेट की फेलो हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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References

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