分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Immunology and Infection

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Summary

白とベージュの脂肪細胞脂肪組織血管前駆細胞からの分化は、肥満の代謝改善の可能性を負いません。CD31 cd34 陽性 + + 人間の脂肪から内皮細胞分離および後続の in vitro拡張と白とベージュの脂肪細胞への分化のプロトコルについて述べる。いくつかのダウン ストリーム アプリケーションを説明します。

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Haynes, B. A., Huyck, R. W., James, A. J., Carter, M. E., Gaafar, O. U., Day, M., Pinto, A., Dobrian, A. D. Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (137), e57804, doi:10.3791/57804 (2018).

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Abstract

肥満は脂肪細胞の肥大によって主に脂肪組織の大規模な改造を伴います。極端な脂肪細胞成長は、インスリン、ローカル低酸素症および炎症に悪い応答が返される前駆細胞から機能的な白い脂肪細胞の分化を刺激し、脂肪細胞の人口の根本的な肥大を防ぐことができるしの削減とともにその結果、脂肪代謝の健康を改善できます。炎症。また、ベージュ/ブラウンの脂肪細胞の分化を刺激しと、全身のエネルギー消費量を増やすことができる減量、その結果します。このアプローチは、肥満 2 型糖尿病と心血管疾患などの併存の開発を防ぐことができます。

本稿では、分離、拡張、および共同 CD31 と CD34 のマーカーを表現するひと脂肪組織の血管内皮細胞のサブセットから白とベージュの脂肪細胞の分化をについて説明します。メソッドは、比較的安価ですし、労働集約的ではないです。人間の脂肪組織へのアクセスを必要として皮下のデポはサンプリングに適しています。このプロトコルの新鮮な脂肪組織は、病的肥満者からサンプル [ボディマス指数 (BMI) > 35] 肥満手術の手順中に収集されます。間質血管の一部から順次 immunoseparation を使用して、十分な細胞は、脂肪の 2-3 g ほどから生成されます。これらの細胞文化 10-14 日間で拡大することがでくことができますが, 凍結保存、通路 5-6 まで継と、脂肪細胞のプロパティを保持します。細胞は、脂肪細胞の ppar γ アゴニスト ロシグリタゾンとヒトインスリンの組み合わせを使ってカクテルを 14 日間扱われます。

この方法は脂肪の血管内皮細胞、脂肪細胞応答を駆動する分子メカニズムに関する実験についての証明書を取得するため使用ことができますまたは、脂肪細胞を強化することができます新しい薬物をスクリーニングするため応答指示ホワイトのどちらかベージュ/ブラウン脂肪細胞分化。小さな皮下のバイオプシーを使用して、この手法を使用して肥満と併存の治療のためベージュ/茶色と白色脂肪細胞を刺激することを目的とする臨床試験のための非レスポンダー科目を画面できます。

Introduction

最近の証拠は、マウスとヒトでは、白またはベージュ/ブラウン脂肪1,2,3に脂肪組織の血管に存在するセルのサブセットを区別できますを示しています。このような細胞の表現型の中間表現型4,5,67のスペクトルや平滑筋/周皮細胞、血管内皮細胞を支持する証拠との論争の主題であります。この方法論の開発の範囲は、CD31 cd34 陽性 + + 肥満人間から別の脂肪質のターミナルから分離した内皮細胞の脂肪分化能をテストするためだった。文献の他の研究は、潜在的な合計の間質血管の分数または知られている脂肪細胞の前駆細胞の2,8,9の脂肪細胞に着目します。現在既存の技術は、薬配信10特に脂肪組織の血管内皮細胞をターゲットすることができますので、このような細胞の脂肪分化を受ける可能性を理解白またはベージュの脂肪細胞へ誘導重要です。将来の目標とされた療法。

別のグループは、ひと脂肪組織11,12,13から血管内皮細胞を分離するサロゲートとして CD31 と CD34 マーカーの組み合わせを報告しました。通常、2 つの連続した手順と磁気ビーズを用いた正の選択を使用して分離が実行されます。本報告では、CD31 プラスチック ビーズと組み合わせて CD34 陽性磁気ビーズを用いた immunoseparation に利用されました。典型的な石畳の内皮形態の保全に関して逐次磁気 immunoseparation に優れたこの手法がわかった。また、脂肪の 1-2 g ほどから始まって拡大と脂肪細胞の誘導に必要な十分な細胞を生成することができました。皮下脂肪の小さなサンプル生検は、下流用電池の必要な量を生成するのに十分です。この面は可能性のある重要な特に場合は、このメソッドは人間の脂肪分化誘導に対する反応性のスクリーニングに使用されます。

文献で報告された他のシステムとは異なり、この方法は CD31 cd34 陽性 + + 細胞の脂肪分化誘導のための 2 つの成分を利用: ppar γ アゴニスト-ロシグリタゾン — とヒトインスリンです。重要なは、インスリンの使用量は、人間14post-absorptive インスリンを循環通常/高の範囲内にあります。カクテルの誘導に対応する能力と、細胞の in vitro、Akt のリン酸化による測定のインスリンに対する反応性の程度は相関しなかった。興味深いことに、この誘導のカクテルや実験条件を使用して、白とベージュ/ブラウン細胞のミックスは、サイズと分子マーカーの発現と細胞内脂質液滴の数によって決定された得られました。(白ベージュ)、細胞の表現型の定量的評価と一緒にこの簡単かつコスト効果の高い誘導プロトコルは、差別化されたベージュのバランスを変更することができます潜在的エージェントのスクリーニング: 白色脂肪細胞です。

このメソッドは、ひと脂肪組織の血管内皮前駆細胞の脂肪細胞形成の基になるメカニズムを理解するためトランスレーショナル アプローチを提供します。この特定の分離/差別化手法を使用して、捜査官は様々 な経路の細く、肥満の人間の様々 な脂肪質のターミナルから血管内皮細胞のサブセットの脂肪細胞の形成を担当に問い合わせることができます。

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Protocol

東バージニア医学校制度のレビュー ボード委員会承認研究および研究で使用されるひと脂肪組織サンプルのコレクション。通知の書面による同意は、患者から採取しました。

1. バッファー、メディア、および計測器の準備

  1. Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered ソリューション (KRBBS) を準備: 塩化ナトリウム 135 ミリメートル、5 mM 塩化カリウム、硫酸マグネシウム 1 mM、0.4 mM カリウム リン酸水素、5.5 mM グルコース、1 mM アデノシン、0.01% 抗生物質/抗真菌薬ミックス (50 μ g/mL のペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンの 30 μ G/ml、アムホテリシン 15 ng/mL の 50 μ g/mL) 10 mm HEPES (pH 7.4 を =)。このソリューションは、組織の採取や消化をするたびに新鮮な準備されます。
  2. 新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製: KRBSS; で 1 mg/mL コラゲナーゼのタイプ 1、3 mL/g の脂肪を作る。事前組織消化前に水のお風呂で 37 ° C でコラゲナーゼの解決を温めます。
  3. Cd34 陽性細胞分離バッファーを準備: 2% ウシ胎児血清 (FBS)、1 mM EDTA 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。
  4. 脂肪細胞形成メディアの準備: DMEM/F12、5 %fbs、ペニシリン/ストレプトマイシン、ヒトインスリン (5 μ G/ml または 144 mU/mL) の 1.25 μ L/mL と 2.8 mM ロシグリタゾン (1 μ M) の 0.36 μ L/mL の 50 μ g/mL。
  5. 100 mL のイソプロパノールにオロの 0.3 g を溶解することにより 0.3% オイル赤い O (オロ) 原液 (重量/体積) を準備します。

2. 脂肪間質血管の一部分離

注: 研究は、病的肥満 2 型糖尿病 (T2D) と非糖尿病患者対象、18-65 歳以上センタラ代謝で減量外科センター (センタラ医療グループ、ノーフォーク、VA) 肥満症治療手術の断面のコホートを含まれています。1 型糖尿病は、慢性的な免疫抑制療法、抗炎症薬、thiazolinendiones、アクティブなタバコの使用、慢性や急性の感染症、または歴史を必要とする条件を含む自己免疫疾患が除外基準に含まれています。悪性腫瘍の最後の 12 ヶ月以内で処理。ダグラス T2D は、空腹時血糖 126 mg/dl 以上、200 ミリグラム/dL の以上 2 h 耐糖能をテストすると、血糖値や抗糖尿病薬の使用と定義しました。

  1. 肥満手術を受ける被験者からひと大網 (OM) と皮下 (SC) 脂肪 (AT) を収集します。
  2. 組織抽出後すぐに室温でペニシリン/ストレプトマイシンの 50 μ g/mL のハンクの緩衝塩液を含む別のバイアルに OM と SC AT をしてください。
  3. 慎重にきれいにし組織抽出後、ラボに到着すると、サンプル 70% エタノール採取はさみとピンセットを使用して、組織の線維化と焼灼のセクションを削除します。
  4. 脂肪組織を圧迫し、コラゲナーゼの消化力のためのそれを 5 g (または少ない) 因数を分割します。
  5. はさみの 2 つのペアを使用して室温でシンチレーション バイアルにコラゲナーゼ溶液の 5 mL で AT の 5 g を細かくみじん切り。
  6. コラゲナーゼの解決の追加 10 mL を 15 mL 合計でみじん切りにした組織に追加します。
  7. 連続振動で水浴中の 37 ° C で、1 h のサンプルを消化します。
  8. 鈍い端に 20 mL の注射器に先端を削減します。
  9. 250 μ m メッシュから 9 cm × 9 cm の正方形を切り取って鈍い端の注射器を使用して 50 mL の円錐管が途中で押し込みます。
  10. 鈍い端の 20 mL シリンジと未消化の組織から脂肪細胞と血管の間質細胞を分離する 50 mL の円錐管に 250 μ m ナイロン メッシュをフィルターにサンプルを注ぐ。
    注: 余分な線維化未消化材料によりメッシュが詰まって取得、50 mL コニカル チューブあたり 5 g 以上でを使用しないでください。
  11. KRBBS 10 mL でシンチレーションのバイアルを洗浄し、残留細胞を収集するフィルターを介して注ぐ。
  12. 室温で 5 分間フィルターが適用されたサンプルをインキュベートします。
    注: この手順は、フロート チューブの上部といくつか間質血管細胞の管の底に解決するために脂肪細胞を可能にすることが重要です。
  13. 20 mL シリンジと間質血管の一部のレイヤーを削除し、きれいな 50 mL の円錐管に転送分注針で 20 x 6 を利用します。
  14. KRBBS 10 mL を追加し、室温で 5 分間ベンチに座るにサンプルを許可します。
  15. 2.12-2.14 の手順を 2 回繰り返します。
    注: これらの手順が浮動の脂肪細胞と間質の血管細胞の汚染がないことを確認します。
  16. 以下の手順で説明するよう、両方の拠点、さらなる処理のため氷の上から間質血管の分数を維持します。
    注: セル実行可能性に影響を与える可能性があります、1 h 以上の氷の上のセルを残してはいけない。脂肪細胞は長期保存用液体窒素でフラッシュ凍結することができます。 または実験用新鮮です。

3. 脂肪組織の血管内皮細胞の分離

  1. 4 ° C で 5 分間 500 x gで間質血管の分数 (SVF) をスピンします。
  2. 遠心分離機からサンプルを外し、慎重に; 上澄みを離れて注ぐSVF セルを含むペレットを維持します。
  3. 軽く 5 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
    注: AT デポの 5 g 以上が複数の因数 (ステップ 2.4 参照) に処理された場合細胞ペレットを一緒に分かち合います。
  4. 4 ° C で 5 分間 500 x gでサンプルをスピンします。
  5. 上澄みを除去、1 mL の PBS、細胞を再懸濁します、セルをカウントします。
    注: ここでは、セルの自動カウンターは、セルカウントに使われました。アクリジン オレンジ/propidium ヨウ化 (AO/PI) ソリューションの 12 μ L で 12 μ L の細胞懸濁液を混合することによって得られたセル実行可能性 (材料の表を参照してください)。各デポの AT のグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 1.69 × 105 ± 4.51 × 104;(b) SC デポ: 105 ± 6.45 x 104× 1.24。両方の拠点から細胞の viability が > 90%。
  6. 4 ° C で 5 分間 500 x gでサンプルをペレットします。
    注: CD34 免疫選択プロトコルは手順 3.7 – 3.15 適応されました (材料の表を参照してください)。
  7. CD34 分離バッファーを 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。
    注: 総細胞数次の再懸濁液ボリュームを必要とする: (a) < 2 x 10 の7セル: 100 μ L; でペレットを再懸濁します(b) 108–5 × 108セル × 2: 1 mL にペレットを再懸濁します。3.9-3.16 の手順で使用する試薬の量だったため縮小 < 2 x 10 の7セル。
  8. CD34 カクテル 10 μ L を追加し、室温で 15 分間サンプルをインキュベートします。
  9. 磁気ビーズの 5 μ L を追加し、室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。
  10. 各サンプルに 2.5 mL の CD34 分離バッファーを追加し、室温で 5 分間、磁石にサンプルを配置します。
  11. 5 のための磁石を反転分離バッファーを注ぐ s。
  12. 磁石から、サンプルを削除、手順 3.10 と 3.11 の 4 倍を繰り返します。
  13. 磁石からチューブを削除し、2 mL の CD34 分離バッファーを追加します。
  14. 4 ° C で 5 分間 500 x gで細胞をペレットします。
  15. CD34 分離バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。
    注: ここでは、AT のグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 4.75 × 104 ± 3.36 × 104;(b) SC デポ: 104 9.53 × 10 ±3x 1.06。CD31 プラスチック immunobead プロトコル手順 3.16-3.34 (材料の表を参照してください) 適応されました。
  16. 500 x gで 5 分で細胞をペレットし、バッファー B 250 μ、250 μ L の洗浄バッファーでペレットを再懸濁します。
  17. ボルテックス チューブ CD31 ビーズを徹底的に再懸濁します。
  18. CD31 ビーズの 20 μ L を追加します。
    注: [集計] セルのためカウント > 1 × 106、ボリューム製造元の入力に応じて規模を縮小しました。
  19. 30 分間、室温のロッキング サンプルをインキュベートします。
  20. ストレーナーを滅菌 50 mL の円錐管に接続します。
    注: こし器の大きな開口部上にある必要があります。
  21. 細胞分離前にストレーナーを平衡に洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。[ステップ 3.16 ストレーナーに生成された混合物を適用します。
  22. 20 mL の容量の円運動で 5 mL の洗浄バッファーとストレーナーを洗浄します。コネクタを滅菌 50 mL の円錐管に接続し、ルアーロックを閉じます。
  23. ストレーナーをコネクタに取り付けます。こし器の壁に沿って洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。こし器の壁に沿ってアクティブ バッファー D の 1 mL を追加します。サンプルをゆっくり旋回し、室温で 10 分間インキュベートします。
  24. 洗浄バッファーの 1 つの mL を追加します。ビーズから 10 倍上下ピペッティングにより細胞を分離します。
    メモ: は、空気の泡を生成しないでください。
  25. ルアーロック-を開き、50 mL の円錐管に流入する剥離細胞を許可します。ストレーナー 10 を洗うたびに洗浄バッファーの 1 ml x。
  26. コネクタとストレーナーを破棄し、遠心分離機の 300 × g 10 分間、4 ° C でのサンプル文化の完全な EGM 2 メディアの 2 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
    注: この時点でのグラムあたりのセル数の平均値は: (a) OM デポ: 5.92 × 103 4.27 × 10 ±3;(b) SC デポ: 4.12 103 ± 2.1 x 103x。両方の拠点からの細胞の生存率は 90 パーセント以上だった。

4. 血管内皮細胞脂肪細胞形成の誘導

  1. 37 ° C、5% CO2インキュベーターで完全な EGM 2 メディアの 6 ウェル培養処理板の細胞を成長します。メディアを交換して、電池が 80-90% の合流点に達するまで 3-4 日おき。
    注: 人口倍増は 2-3 日です。
  2. 100 mm ペトリ皿上それらをメッキすることによって細胞を展開し、1:3 回セルを分割します。この段階でセルが 2 の一節にあります。
  3. 自動細胞を用いた細胞カウンター (材料の表を参照してください) の数。
  4. デポおよびそれらは 2 日間の EGM 2 メディアを完了で文化ごとに重複する井戸の確保 6 ウェル プレートに種子約 100-200,000 セルです。
  5. 任意の成長媒体を離れて吸い出しなさいし、2 ml の 5% を DMEM/f12 キーの交換 FBS ペニシリン/ストレプトマイシン コントロールのための 50 μ g/mL 細胞治療細胞の脂肪細胞形成メディア (手順 1.4 参照) 2 mL に置き換えると。
  6. 37 ° c 5% の加湿で細胞をインキュベート CO2インキュベーター 13 日間のそれぞれのメディアごと 3 〜 4 日の交換します。
    注: 細胞治療の 4 日後に脂質を蓄積する開始されます。
  7. オロとナイルレッド公開メソッド15-17によると染色を行います。
  8. RNA 抽出のためのセルを分離するには、6 よく誘導プレートからメディアを取り出し、1 mL の滅菌 PBS で洗浄します。
  9. Guanidium チオシアン酸-フェノール-クロロホルム溶液の 350 μ L を追加 (材料の表を参照) もそれぞれ、5-10 分間室温でインキュベートします。
  10. 細胞スクレーパーを使用してプレートから細胞をこすりし、セルを 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
    注: サンプルは、RNA の抽出、さらに後日処理-80 ° C のフリーザーで格納できます。
  11. 適応の RNA 抽出を用いたサンプルから mRNA を抽出プロトコル (材料の表を参照してください)。
  12. リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (RT-PCR) 次のプローブを用いた遺伝子発現を評価するを実行: アディポネクチン、UCP-1、および CIDEA (材料の表を参照してください)。
    注: ここでは、RT-PCR 法手続を実施した次の標準的なプロトコルを使用して: 変性 (95 ° C; 15 s)、アニーリング、および 40 のサイクルの拡張 (60 ° C; 1 分)。CTの値を持つ遺伝子を表すサンプル > 35 が検出されないと考えられていた。

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Representative Results

私達のプロトコルは CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織別拠点から血管細胞の脂肪分化能を決定するためアプローチを提供することを目的します。簡単なフローチャート図は、図 1 aに表示されます。CD34 の発現細胞の正の選択を使用して最初のステップ > 95 %cd34 陽性細胞新鮮単離細胞 (図 1 a) の人口で起因します。重要なは、このマーカーは、通路のカップルのため、セルは培養後失われます。CD34 は多様な造血と非造血前駆細胞の一般的なマーカーなので血管内皮前駆細胞の分離に必要な次のステップは CD31 陽性細胞 CD34 陽性細胞集団 (図 1 a) からの肯定的な選択です。CD31 は内皮細胞のマーカーが、造血細胞のサブセットでも見つけることが。フローサイトメトリーによる大網と皮下脂肪の両方からいくつかの製剤を分析して一貫して CD31 cd34 陽性 + + 細胞が CD45 マーカー (図 1 b、トップ パネル) を表明しないことを発見しました。通常、< セルの 1% 総セル人口のうち、CD45 陽性を示した。この結果は、我々 は可能性が高い造血前駆細胞の事実上無料準備を得られることを結論に私たちを率いてください。脂肪幹細胞マーカー CD24 セルを表現するには、大網と皮下のデポからの細胞を分析し、事実上細胞を示さなかった大網デポ (図 1 b、下部パネル) との 5% 未満で CD24 マーカーを発見セルは、(表示されていません) 皮下のデポでマーカーを表明しました。最後に、この分離方法を使用して行い CD34 + CD31 + CD45 CD24 セル肥満者の大網と皮下のデポから。

CD31 抗体の共役プラスチック製のビーズを使用して、表示 CD31 抗体の共役磁気ビーズを用いた細胞ではなく、初期の通路の中に石畳の内皮形態を表示するセルを用いて、紡錘形 (図 2 a) の分離後すぐに間葉系の表現。2 つの機能アッセイを行った CD31 cd34 陽性 + + 細胞の内皮のアイデンティティをさらに実証する: DiI Ac LDL の取り込みと (いう行列とここに至って) 基底膜マトリックス管形成体外。DiI Ac LDL の CD31 cd34 陽性 + + 細胞を培養、細胞の大部分は吸収 (図 1) 陽性。肯定的な制御として使用した市販されているひと脂肪組織血管内皮一次電池ライン (HAMVEC) (材料の表図 1を参照)。また、CD31 cd34 陽性 + + 細胞体外自発の血管のような構造、3 D マトリックスを形成する細胞の能力を決定することによって培養後の血管内皮機能を保持するかどうかをテストしました。後 3 通路、CD31 CD34 + + フォーム マトリックス HAMVEC プライマリひと血管内皮細胞ライン (図 1) に匹敵する管状血管のような構造物。

2-3 通路でセルの拡張後、5 %fbs、ロシグリタゾン (1 μ m) とインスリン (144 mU/mL) を添加した DMEM/F12 メディアに pro 血管新生増殖因子を含む EGM 2 完全なメディアから細胞を切り替えた。その脂肪細胞分化を削減 EGM 2 のセルはメディアを大幅に完了を維持します。また、デキサメタゾンと 3-isobuthyl-1-メチルキサンチン メディアに添加した速度を変更できません、脂質蓄積の程度やインドメタシン添加脂質蓄積 (データは示されていない) を大幅に削減します。これらの予備的な実験に基づいて、脂肪分化誘導のロシグリタゾンとインスリンを使用するだけにしました。脂肪メディア文化の 14 日後セルが固定されオイル赤 o 染色またはナイルの赤と核は DAPI (図 2 b) と counterstained いた。数字のペア皮下 (SC) (図 2 b、トップ パネル) と BMI が 37-45 kg/m2との間に 3 人の被験者の大網 (OM) (図 2 b、底面) 脂肪組織より分離した細胞の代表的な画像が表示されます。被験者間および同じ主題のデポ誘導への応答が広く異なりますのでご了承ください。図 2 b、一院制 (赤矢印) と多房性 (白い矢印) の混合された人口の蛍光画像で見られる脂質含有細胞と同様、脂質 (黄色の矢印) を蓄積する細胞通常存在しています。これらの細胞数の比率はまた高い被写体と起源のデポ変数です。脂質含有率の定量化 (核を DAPI 染色に基づいて) 合計のセルからセル (オイル赤い O 積極性に基づく) が個性的 SC デポから細胞で、同じの SC と OM の拠点間有意差を示し脂肪分化誘導 (図 2) に敏感に反応します。被験者と同じ主題のデポ間の応答に不均一性の説明は明確ではありません。ただし、隔離のプロトコルで体内表現型/環境の変動によらない指紋を運ぶ細胞集団の本質的な性質に関連している可能性が推測された.

13 日に比べて脂肪分化誘導後パン脂肪細胞マーカー アディポネクチンとブラウン/ベージュのマーカーは、UCP 1 および細胞内 CIDEA の遺伝子発現を測定した細胞が成熟脂肪細胞への分化を受けたことを確認するには非誘導制御の細胞。アディポネクチンの発現は、(図 2 D) コントロールと比較して分化した細胞で最大 10,000 折る増加しました。CIDEA および UCP1 遺伝子発現だった (図 2 D) 脂肪細胞刺激を次の細胞にのみ検出。特に、UCP 1 式だったホワイト: ブラウンの異なる比率を反映して、非常に可変/ベージュ細胞細胞集団内。ハウスキーピング遺伝子 RPL27 の発現は著しく CT値が 18-20 サイクル間範囲のサンプル間で一貫して、脂肪細胞分化を受けた細胞間差が見つかりませんでしたと、未処理のコントロール。またミトコンドリア局在 (図 2 e) を提案する punctated パターンにマルチ locular 表現型を表示セル UCP 1 蛋白発現を検出しました。UCP 1 蛋白質は検出不可能であった脂質を蓄積しなかったセルまたは複数のセルでは、完全にいない可能性がある非常に小さな液滴分化脂肪細胞 (図 2 e)。

私たちの観測、CD31 cd34 陽性 + + 細胞の脂肪分化能はデポ特定、高い別の科目の中で変数は BMI、年齢、HbA1c と潜在的な相関関係を求めて私たちを求め。28 試料の中で、我々 は潜在的な脂肪、年齢や BMI;、有意な相関が任意を見つけられませんでした。しかし、我々 は OM デポ (図 3 a) から細胞における HbA1c、脂質蓄積の間に負の相関を見つけるでした。この発見は慢性高血糖環境に潜在的なリンクを示し、将来の調査に値する。これはまた CD31 cd34 陽性 + + 可能性がある細胞が脂肪分化誘導に対応する能力を生体内で署名を運ぶことを提案します。またこれらの細胞が体外のインスリン刺激 Akt リン酸化の変数のレベルを表示することを示す (図 3 bトップ)。ただし、オイル赤 O 染色一致するサンプル (図 3 b下) の写真で示すように、脂肪細胞分化を受ける能力と応答のこの変動の相関しません。

Figure 1
図 1: 分離と CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織からの細胞のキャラクタリゼーション。このフローチャート図 (A) の分離と分化の主な手順を示しています。CD34 磁気ビーズを用いて正の淘汰後 > 2 番目の選択手順では、前に、新鮮単離細胞の 95% は CD34 陽性。(B)この代表フローサイトメトリーを示します前方散乱プロット ライブ セル人口のゲートFITC (BluFl2) チャネルの無染色サンプルCD45 染色上の代表的な大網サンプル。下部は、大網のサンプルから CD24 (Alexafluor 647 ラベル) 細胞、上に示すように、同じシーケンスを示しています。(C) これら代表的な顕微鏡は CD31 cd34 陽性 + + 細胞の in vitro培養 (上部パネル) の 4 h (赤) DiI Ac LDL の取り込みを表示します。同様の取り込みは、ひと脂肪組織微小血管内皮細胞の一次電池ライン (HAMVEC) (底板) で発見されました。核は、DAPI によって青色で示されます。(D) これらの代表的な顕微鏡 CD31 cd34 陽性 + + 3 D マトリックスで播種された細胞の培養管形成を示します。CD31 cd34 陽性 + + 細胞 (3 通路) FITC カルセインと染色の後で 24 ウェル プレートでシード、4 時間完全な内皮細胞培地で培養しました。倒立蛍光顕微鏡を用いた細胞をイメージしました。HAMVEC、同じ密度で播種が比較に使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 脂肪分化誘導と cd34 CD31 陽性細胞のマーカーです。これらの代表者 (A) 顕微鏡を CD31 cd34 陽性 + + セルの形態学上の違いは、CD31 + 磁気ビーズCD31 + プラスチック ビーズと正の選択を使用して分離します。セルを分離後通路 1 でイメージしました。使用倍率は 100 倍です。(B) これらのパネルは CD31 cd34 陽性 + + ペア皮下 (SC) と 3 別の科目の大網の内臓 (OM) サンプルから細胞を染色オイル赤 O の代表的な顕微鏡写真。セル 2-3 通路 EGM 2 完全なメディアでの培養、5 %dmem/F12 メディアとの切り替え FBS、メディア 3 日ごとに変更で 14 日間の治療をインスリン (144 mU/mL) とロシグリタゾン (1 μ M)。使用倍率は 100 倍です。代表的な蛍光イメージは、核染色 (青) 裏打ち赤脂質液滴 (緑) と DAPI を示します。単房性脂質 (赤矢印)、多房性脂質液滴 (白い矢印)、または脂質蓄積 (黄色の矢印) がないことを示すセルを含むセルのミックスを注意してください。使用倍率は 200 X、スケールバー = 50 μ m。 (C) このパネルを示しています脂肪の定量化潜在的なオイル赤い O (オロ) 合計 DAPI 染色の核に陽性細胞が正規化されたとして表されます。CD31 cd34 陽性 + + 同じ主題の OM と SC のデポから細胞脂肪細胞で有意差の可能性を示し一スチューデントの t 検定によって (n = 7)。(D) 成熟脂肪細胞の遺伝子発現マーカー (アディポネクチン、UCP-1、CIDEA) は、脂肪分化誘導の 14 日後のセルおよびコントロール細胞 RT-PCR 法により測定しました。データは、アディポネクチンの遺伝子発現のフォールドの変更として表されます。CIDEA と UCP 1 の式は、コントロールのサンプルで検出可能でした。ΔCt ハウスキーピング遺伝子として RPL27 に正規化された値を表します。RLP27 CTの値が解析に含まれているすべてのサンプルの 18-20 サイクル間 (n = 3-5 科目)。データは ± SD. を意味として表されます。一スチューデントの t 検定はデータの統計分析のために使用されました。p < 0.05 は帰無仮説を拒絶します。(E) このパネル + CD31 CD34 で UCP 1 の発現を示しています + 細胞のインスリンとロシグリタゾン誘導の 13 日後。人間 UCP 1 抗体を用いた免疫細胞化学は、マルチ locular 脂肪細胞で UCP 1 の選択式を示した。検出は、ローダミン標識二次抗体 (赤) および DAPI 染色核 (青) を使用して達成されました。左下の大規模な拡大は、細胞核 (N) を取り巻くさまざまなサイズの複数の脂肪滴 (LD) だけでなく、UCP 1 (赤矢印) に対応する punctated の赤い信号を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3:脂肪細胞分化、HbA1c と体外のインスリン シグナルの相関します。(A) スピアマン (ノンパラ) と OM と SC セルのピアソン (パラメトリック) 相関係数, HbA1c と脂質蓄積との相関を確認する使用された (n = 20)。帰無仮説は、 pが拒否された < 0.05。(B) 上部にある西部のしみリン酸化 Akt (緑) を示し、CD31 cd34 陽性 + + 細胞において合計 Akt (赤) 式刺激培養脂肪分化誘導の前に 30 分間 5 nM インスリン (n = 8)。下部には、次の 14 日間脂肪分化誘導の同じセルのオイル赤 O 染色されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

本稿の焦点は、分離、拡張および CD31 cd34 陽性 + + ひと脂肪組織内臓や皮下のデポから血管内皮細胞の脂肪分化誘導方法論を提供することです。

齧歯動物または CD31 抗体、蛍光ラベルまたは磁気ビーズ18,に結合を使用して主にテクニックを使って人間の様々 な血管ベッドから血管内皮細胞の隔離のための方法論が報告されています。19,20,21,22,23. これらの分離技術の普遍的な使用のための主要な課題は異なる血管ベッドで内皮細胞人口の不均一性と線維芽細胞や血管壁細胞の混入のリスクが高い。しかし、このような汚染を避けるために分離技術の改良は、報告された24をされています。これらのテクニックを使用すると、ほとんど成熟した血管内皮細胞は、組織から分離されます。脂肪組織は血管内皮前駆細胞25,26を含む幹細胞/前駆細胞の大規模な貯水池です。いくつかの報告には cd34 と CD31 +11,抗体の27の組み合わせを使用して人間の脂肪組織から血管内皮細胞の浄化。2 つのマーカーを発現する細胞は、成熟した血管内皮細胞と血管内皮前駆細胞11,28,29の混合された人口です。最近精液論文がいくつか報告する内皮細胞 (CD31 +) または脂肪の血管系の壁画 (PDGFRβ +) 細胞の小さなサブセットが脂肪前駆細胞5,30の豊富なソースであります。これらの血管細胞脂肪細胞電位で白またはブラウン/ベージュ脂肪細胞を作り出すことができるし、脂肪血管5アクティブな血管新生に関連付けられています。これらの知見は、肥満のメタボリックのパフォーマンスを向上させるおよび/または血管前駆細胞から白や熱発脂肪細胞を生成することによって減量を誘導するために新たな治療機会を提供可能性があります。それは、したがって、簡単、経済的孤立、拡張、およびひと脂肪組織から血管の内皮細胞の脂肪分化能の評価のための方法論を識別する興味のです。

CD31 cd34 陽性 + + 人体の皮下と大網の内臓脂肪組織の貯蔵庫から細胞が以前の特徴に基づいて彼らの新生の潜在性、炎症性メディエーターの生産、その老化マーカーや他の機能11,31します。 ただし、このような細胞の脂肪分化能の出版された証拠がないです。CD31 cd34 陽性 + + 磁気ビーズを用いた細胞分離以前の出版物は、11科目 (10 以上) の数が多いからプールのセルからデータに関するレポートします。本稿は、分離を成功させる CD31 cd34 陽性 + + 皮下と大網の貯蔵庫から単一の人間のドナーからの細胞の拡張のためのプロトコルを初めて報告します。我々 は分離され、わずか 2-3 g の脂肪組織から細胞を拡大します。CD31 cd34 陽性 + + セル合計 SVF 細胞の 3-5% を占めるし、表示 > 分離後 90% の生存率。これらの細胞は増殖性が高い, ロシグリタゾンとインスリンの in vitro刺激脂肪細胞分化に対する応答の広い範囲を示した.のみ、以前の研究では、脂肪幹細胞または合計ひと脂肪組織間質血管画分を使用して脂肪細胞応答4,32,33,34をテストします。1 つの最近の研究は、ひと脂肪組織の血管から単一細胞懸濁液を使用が、分化した脂肪細胞が壁画や自然3で内皮細胞かどうかは不明です。

CD31 cd34 陽性 + + フローサイトメトリーを用いた細胞の追加診療は、起源の彼らの倉庫にかかわらず CD45 と CD24 マーカーの欠如を示した。重要なは、我々 は 3 継代培養後、ことを示した CD31 CD34 + + 細胞アセチル化 LDL の蓄積と 3 D マトリックス培養管形成で示される、血管内皮機能を保持します。また、分化した脂肪細胞は、その形態と UCP 1 蛋白発現を含む分子マーカーの白とベージュ/ブラウン セルの混合された人口を表されます。マウスの前の調査を示した脂肪組織血管が両方白のソースにすることができ、褐色脂肪細胞5,30より最近のデータの白および機能的分化に関して同様の結果を示した人間の脂肪血管3から発熱ベージュ セルです。

前駆細胞の in vitroの範囲から脂肪細胞分化誘導のための複数の成分を含む脂肪カクテルを使用するほとんどの出版物とは異なりロシグリタゾンとインスリンが必要であり、脂肪細胞の十分なことがわかったCD31 cd34 陽性 + + 細胞の誘導。UCP 1 蛋白質を含む選択セルの式を確認成熟した我々 はそのロシグリタゾン単独では非脂肪細胞35, パン脂肪細胞およびブラウン/ベージュ脂肪細胞マーカーの分子シグネチャにおける脂質の蓄積を引き起こすことができる注意してください、脂肪細胞分化細胞のいくつかの表現型。カクテルの 2 成分の脂肪細胞は手続き型プロトコルを簡素化しより費用対効果になります。

重要な観察は、CD31 cd34 陽性 + + 細胞の脂肪分化応答がドナー対象と脂肪デポ高い変数ことだった。脂肪幹細胞または間質血管前駆細胞の応答がされている脂肪細胞でデポに固有な相違を報告32,34以前、このような応答の件名変動、新規観察です。20 ひと試料の分析、3 SC と 7 OM 細胞が脂肪分化誘導に応答しませんでした。最も堅牢な応答を示した > 90% の細胞からに応答できる 4 サンプルの誘導や SC からの 2 サンプル オブジェクト モデルの興味深いことに、我々 が見つかりました応答性 HbA1c と負の相関は、への応答と関連しないと体外未分化細胞におけるインスリン刺激。応答の違いは手法の再現性に乏しく原因ではないが、むしろ生体内反応を模倣した細胞の個々 の指紋を反映を議論する.さらに検証が必要ですこの差動応答性と体内脂肪細胞形成を刺激する目的と治療への応答のための比較的簡単なスクリーニング法を表す場合があります。潜在的な脂肪細胞の個々 の変動の原因をさらに理解するには、追加診療は特定の脂肪前駆細胞機能に耐える CD31 cd34 陽性 + + 人口内細胞の亜集団を識別するために必要です。

このプロトコルの制限のいくつかは不完全な細胞集団に特性を含める比較的長い拡大と分化回 (2 週間 + 2 週間);ひと試料と新鮮な収集の組織の即時処理の必要性にアクセスする潜在的な制限分化した細胞の機能データの現在の不足。この手法の再現性としない労働集約的なプロトコルを含むいくつかの利点があります。セル可能性があるままと自分の体内の表現; の指紋比較的低コストで組織の非常に少量からの細胞の拡大細胞を凍結し、次の再文化; 彼らの脂肪署名を保持する可能性将来のスクリーニングまたは他の目的のため使用することができますこれらの細胞のリポジトリを生成するオプション。

解明とスクリーニング目的のため、このプロトコルおよび CD31 cd34 陽性 + + 最終的な結果として得られる細胞を橋渡しプラットフォームとして使用できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者はベッキー マルケス、センタラ肥満センター、患者スクリーニングと同意のプロセスに彼女の援助のための医療コーディネーターを認識したいです。この研究は、Anca + Dobrian に R15HL114062 によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Large Equipment

Biosafety Cabinet

Nuaire

nu-425-400

Cell Culture Incubator

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Water Bath

Forma Scientific

2568

Reciprocal Shaker

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Electrophoresis Box

BIO-RAD

Mini PROTEAN 3 Cell

Transblot Box

BIO-RAD

Mini Trans-Blot Cell

Electrophoresis Power Supply

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA Reader

Molecular Devices

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Near Infrared

Refrigerated Centrifuge

Eppendorf

5810 R

Tabletop Centrifuge

Eppendorf

MiniSpin Plus

Fluorescent Microscope

Olympus

BX50

Inverted Microscope

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Sodium bicarbonate

Sigma-Aldrich

792519

Calcium chloride dihydrate

Sigma-Aldrich

C7902

Potassium phosphate monobasic

Sigma-Aldrich

P5655

Magnesium sulfate

Sigma-Aldrich

M2643

Sodium chloride

Sigma-Aldrich

746398

Sodium phosphate monobasic monohydrate

Sigma-Aldrich

S9638

Potassium chloride

Sigma-Aldrich

P9333

Glucose

Acros Organics

410950010

Adenosine

Acros Organics

164040250

Bovine Serum Albumin

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicillin/Streptomycin

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Tissue Digestion

20 mL Syringe

Global Medical

67-2020

Nylon Mesh, 250 µm

Sefar

03-250/50

Pipetting Needles

Popper

7934

Fine Scissors

Fine Science Tools

14058-11

Tissue Forceps

George Tiemann & Co

160-20

Collagenase, Type I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri Dishes, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC Treated

Eppendorf Tubes, 1.5 mL

USA Scientific

1615-5500

Conical Tubes, 15 mL

Nest Scientific

601052

Conical Tubes, 50 mL

Nalgene

3119-0050

Scintillation Vials

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Cell Isolation

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Cellometer Slides

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Cellometer Viability Stain

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Propidium Iodine

Anti-CD34 Magnetic Beads

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

Anti-CD31 Plastic Beads

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x Wash Buffer

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Connector Ring

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Strainer

pluriSelect USA

43-50030-03

Cell Culture

6-well Plates

USA Scientific

CC7682-7506

TC Treated

4-well chambered slides

Corning Life Sciences

354559

Fibronectin coated

4-well chambered slides

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Uncoated glass

Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)

Sciencell Research Laboratories

7200

Primary cell line

Endothelial Cell Media (ECM)

ScienCell Research Laboratories

1001

Complete Kit

DMEM/F12 Basal Media

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Fetal Bovine Serum (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulin

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Cell Analysis

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Prepared in isopropanol

96 well plates

USA Scientific

1837-9600

96 well PCR plates

Genesee Scientific

24-300

RNA Extraction

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synthesis

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart PCR Polymerase

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Hot start, with PCR Buffer N

Magnesium Chloride Solution

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM final in PCR reaction

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

BCA Assay

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Kit

Bis-acrylamide

BIO-RAD

1610146

40% stock solution

Ammonium Persulfate

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Bromophenol Blue

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrane

EMD Millipore

IPFL00010

Methanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

Anti-AKT antibody

Cell Signaling Technology

2920S

Mouse monoclonal

Anti-pAKT antibody

Cell Signaling Technology

9271S

Rabbit polyclonal

Anti-UCP1 antibody

Abcam

ab10983

Rabbit polyclonal

Anti-Mouse IgG antibody

LI-COR

926-68070

Goat Polyclonal, IRDye 680RD

Anti-Rabbit IgG antibody

LI-COR

926-32211

Goat Polyclonal, IRDye 800CW

Anti-Rabbit IgG antibody

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Goat Polyclonal, TRITC

Phosphate Buffer Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Formaldehyde Solution

Electron Microscopy Sciences

15686

4% solution for cell fixation

Normal Goat Serum

Vector Laboratories

S-1000

10% blocking solution

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0.1% permeabilization solution

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Cell fluorescent visualization

Matrigel Basement Membrane Matrix

Corning Life Sciences

356231

Growth factor reduced

DiI labeled Acetylated LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

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References

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