세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

Genetics

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Summary

우리가 활용 빈도, 얼마나 효율적으로 예측 하려면 높은 해상도에 차이 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 다양 한 세균성 conjugative DNA 요소 다른 조건 하에서 동작을 이해 하는 목표로, 기증자 박테리아 활용을 시작합니다.

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Shintani, M., Ohkuma, M., Kimbara, K. High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies. J. Vis. Exp. (143), e57812, doi:10.3791/57812 (2019).

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Abstract

세균성 활용 conjugative DNA 요소를 통해 항생제 저항 유전자의 수평 이동에 중요 한 단계는 이다. 다른 조건 하에서 활용 주파수의 심층 비교 자연에서 conjugative 요소를 확산 하는 방법 이해 해야 합니다. 그러나, 활용 빈도 비교 하기 위한 기존의 방법 않습니다 심층 비교에 대 한 적절 한 선택에 추가 활용 이벤트의 발생으로 인 한 높은 배경 때문에. 우리는 성공적으로 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 메서드와 선택적 액체 매체에서 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 도입 하 여 백그라운드를 감소. 또한, 우리 개발 종종 방법의 확률을 추정을 위한 프로토콜 기증자 세포 시작 활용 형광 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 하 여 받는 사람 풀으로 하나의 기증자 셀을 정렬 하 여. 두 개의 플라스 미드를 사용 하 여, 다른 교 반 속도로 액체 매체에서 pBP136 및 pCAR1, 슈 도모 나 스 putida 셀 활용 주파수에서 차이 검출 될 수 있습니다. 활용 개시의 주파수는 pCAR1에 대 한 보다 pBP136에 대 한 더 높았다. 이러한 결과 사용 하 여, 우리가 더 나은 이러한 두 plasmids의 활용 기능을 이해할 수 있다.

Introduction

세균성 활용 모바일 유전 요소, conjugative 플라스 미드, 그리고 통합 및 conjugative 요소 (얼린 다)의 유전 정보의 수평 확산에 대 한 중요 하다. 그것은 급속 한 세균성 발전 및 적응을 홍보 하 고 multidrug 저항 유전자1,2를 전송할 수 있습니다. 활용 빈도 단백질 DNA (폭도)와 짝짓기 쌍 형성 (MPF)의 동원에 대 한 conjugative 요소에 인코딩된 섹스 pili, 폭도 및 MPF 유형3,4에 따르면 분류 된다를 포함 하 여 영향을 받을 수합니다 있습니다. 5. 그것은 또한 기증자와 받는 사람 쌍6 와 셀7,8,9,10,,1112 (의 성장 조건에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 성장 율, 세포 밀도, 고체 표면 또는 액체 매체, 온도, 양분 가용성 및 양이온의 존재). Conjugative 요소 박테리아 사이에서 확산 하는 방법을 알아야 자세히 활용 주파수를 비교할 필요가 있다.

기증자와 짝짓기 후 받는 사람 쌍 사이 활용 주파수는 다음과 같이 기존의 방법으로 추정 일반적으로. (i) 먼저, 기증자와 받는 사람 식민지의 숫자 계산 됩니다; (ii) 다음, conjugative 요소 (= transconjugants)를 받은 받는 사람 식민지 세 어진다; (iii) 그리고 마지막으로, 활용 주파수 기증자 또는 받는 사람13그는 transconjugants의 단위 (CFU)를 형성 하는 식민지를 나누어 계산 됩니다. 그러나,이 메서드를 사용 하면 배경은 높은 셀 밀도 높은10때 transconjugants를 사용 하는 선택적 접시에도 발생할 수 있습니다 추가 활용 이벤트 때문 이다. 따라서, 주파수 (아래 사진 차이)에 작은 차이 감지 하기가 어렵습니다. 우리는 최근에 항생제의 높은 농도 포함 하는 액체 매체를 사용 하 여 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 방법을 소개 했다. 이 방법은 더 선택적 매체;에 활용을 억제 함으로써 배경 감소 따라서, 활용 빈도 높은 해상도와 추정 될 수 있습니다.

활용 3 단계로 분할 될 수 있다: (1) 기증 받는 첨부 파일 쌍의 conjugative 전송 개시 (2) 및 (3) 쌍14의 분리. 단계 (1) 및 (3), 하는 동안은 물리적 상호작용 기증자와 받는 사람 세포; 따라서, 셀 밀도 및 환경 조건 좌우할 수 있다이 단계, 비록 성 pili의 기능 또한 중요 하다. (2) 단계는 가능성이 플라스 미드, 기증자와 받는 사람의 다양 한 기능에 의해 영향을 받을 수 있는 외부 변화에 대응 활용에 관련 된 여러 유전자의 표현에 의해 규제 됩니다. 실제 첨부 파일 또는 기증자 받는 쌍의 분리 수학적으로 시뮬레이션할 수 입자로 셀의 추정을 사용 하 여, 비록 단계 (2)의 주파수는 실험적으로 측정 되어야 한다. 몇 가지 보고 방법의 직접 관찰에 종종 기증자 활용 [단계 (2)] 형광 현미경 검사 법15,16;를 사용 하 여 시작할 수 있습니다 되었습니다 그러나, 이러한 방법은 셀의 많은 수를 모니터링 해야 하기 때문에 높은 처리 되지 않습니다. 따라서, 우리는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 단계 (2)의 발생 가능성을 예측 하는 새로운 방법을 개발. 우리의 방법 활용에 대 한 필수적인 유전자의 id 없이 어떤 플라스 미드에 적용할 수 있습니다.

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Protocol

1. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 기증자의 준비-고 대 저항 유전자 태그 플라스 미드

  1. 대상 플라스 미드 pBP136에 마커 유전자의 소개
    참고: 이 프로토콜의 목표는 pBP136를 생성 하는::gfp. 세균성 긴장 및이 연구에 사용 된 플라스 미드는 표 1에 나열 됩니다.
    1. 은닉 pBP13617 살 균 Luria 국물 (파운드)과 대장균 S17-1λpir18 pJBA2819 은닉의 5 mL에 대장균 DH10B의 문화를 성장 [대 (Km)를 포함-저항 유전자와 gfp mut3 * 유전자 발기인과 미니-테네시5터미네이터] 50 μ g/mL 킬로미터 하룻밤 37 ° C에서 (O/N, 16-24 h) 200 분당 회전 (rpm)에 동요를 포함 하는 살 균 파운드의 5 ml에서.
    2. 수확 및 세척
      1. 각 문화권의 1 mL를 수확, 2 mL microtube 및 원심 분리기 (10000 × g, 실내 온도, 2 분) 그것을 넣습니다. 그리고 삭제는 상쾌한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)의 2 개 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
      2. 원심 분리기 다시 (10000 × g, 실내 온도, 2 분), 그리고 살 균 PBS의 500 μ에 resuspend.
    3. 짝짓기를 필터링합니다
      1. (1.6 %agar)와 살 균 파운드 플레이트를 준비 하 고 그것에 살 균 0.22 μ m 기 공 크기 멤브레인 필터를 배치. 믹스 500 pBP136와 자리 파운드 접시에 필터에 혼합물을 은닉과 DH10B 대장균 대장균 S17-1λpir 은닉 pJBA28의 μ. 플레이트 O/N 30 ° c.에 품 어 파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가.
        참고: pJBA28 수 Π 단백질, pir 유전자18, 의해 존재 및 DH10B S17-1λpir 에서 옮겨질 수 있다. pBP136 아무 표식 유전자17 고 S17-1λpirDH10B에서 옮겨질 수 있다. 따라서, S17-1λpir 이 단계에서 pBP136 및 DH10B 은닉 pBP136 (염색체 또는 pBP136에 transposed) 미니-테네시5 에서 pJBA28를 은닉 구분 하지 않을 수 있습니다. 다음, 우리는 후속 단계 (1.1.4.–1.1.5)에 기증자로 그들의 혼합물을 사용.
    4. 200 rpm와 슈 도모 나 스 putida KT2440의 문화에서 떨고 37 ° C에서 50 μ g/mL 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드에 위의 짝짓기 혼합물의 O/N 문화 성장 [Km-민감한 (Kms), 리 팜 피신-민감한 Rif (s), gentamicin 민감한 Gm (s), 및 항생물질 내성 (Tcr)] 200 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 12.5 μ g/mL Tc를 포함 하는 매체에서.
    5. 수확 후 단계 1.1.2로 세포 세척 (O/N, 30 ° C) 단계 1.1.3에서 짝짓기 하는 필터에 대 한 그들 (짝짓기 혼합물 및 KT2440)을 사용 합니다.
    6. 50 μ g/mL 킬로미터 및 12.5 μ g/mL Tc 포함 하는 살 균 파운드 플레이트를 준비 (LB + 킬로미터 + Tc 판).
    7. 살 균 PBS 가진 멤브레인 필터에 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 그리고 다음 확산 파운드 + 킬로미터 + Tc에 각 희석 플레이트와 플레이트 2-3 d 30 ° C에서 품 어.
    8. 격판덮개에서 식민지를 선택, 포함 된 킬로미터 및 Tc P살 균 파운드에 O/N 문화. resinovorans CA10dm4RG (Rifr 및 Gmr)6 Rif 포함 하는 살 균 파운드 (25 μ g/mL)와 Gm (30 μ g/mL) 30 ° C와 200 rpm에서.
      참고: 후판 (1.1.7.) 이전 메모, 파운드 + 킬로미터 + Tc에 식민지에 설명 된 대로 들고 있을 수 있습니다 KT2440 은닉 pBP136 미니-테네시5 와 KT2440 미니-테네시5, pJBA28 S17-1λpir 에서 직접 전송 될 수 있기 때문에 은닉 pBP136와 KT2440에 pJBA28입니다. 이 때문에 미니-테네시5 다음 단계에서 대상 pBP136를 얻을 하는 데 필요한 P. resinovorans CA10RG와 다른 짝짓기.
    9. 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.
    10. Rif, Gm, 및 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드 플레이트를 준비 (Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드 격판덮개).
    11. 필터에 혼합물을 resuspend 하 고 다음 101– 105희석-접어, Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드에 확산 판, 그리고 30 ° c.에 2-3 d에 대 한 번호판을 품 어
    12. 식민지를 선택 하 고 만약 그들이 플라스 미드에 대 한 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 pBP136 항구를 확인.
  2. 대상 플라스 미드 pCAR1에 선택적 마커 유전자의 소개
    참고:이 프로토콜의 목표 pCAR1를 생성 하는::gfp
    1. P. putida KT2440의 pCAR1를 은닉 한 O/N 문화 성장 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 rpm와 30 ° C 및 대장균 S17-1λpir18 살 균 파운드의 5 ml에서 pJBA28 은닉 200 rpm와 37 ° C에서 50 μ g/mL 킬로미터를 포함 하
    2. 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.
    3. 파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가.
    4. 살 균 PBS 가진 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 무 균 선택적 파운드 + Tc + 킬로미터에 희석된 혼합 확산 판.
      참고: pCAR1 대장균;에 복제 하지 않습니다 따라서, P. putida KT2440 미니-테네시5 은닉 pCAR1 파운드 + Tc + Km에서 선택할 수 있습니다 접시.
    5. 접시에서 식민지를 선택 하 고 킬로미터 및 Tc와 P의 문화를 포함 하는 살 균 파운드에 O/N 문화를 성장. resinovorans CA10dm4RG 리프와 Gm (200 rpm, 30 ° C)를 포함 하는 살 균 파운드에.
    6. 수확 후 단계 1.1.2에서 세척, 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기에 대 한 셀을 사용 하 여 단계 1.1.3에서.
    7. 필터에 혼합물을 resuspend 그것을 희석, 접시, Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드에 확산 하 고 2-3 d 30 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
    8. 식민지를 선택 하 고 만약 그들이 플라스 미드에 대 한 특정 한 뇌관으로 PCR에 의해 pCAR1 항구를 확인.
  3. 태그-플라스 미드의 양도 확인 하 고 단계에 대 한 기증자를 준비
    참고:이 프로토콜의 목표는 위의 생성 된 플라스 미드의 양도 확인 하 고 다음 단계에 대 한 기증자를 준비 하는.
    1. 은닉 pBP136 P. resinovorans CA10dm4RG의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI의 문화와 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드에gfp q는 Pa 1에서/O4/O3-gfpmut3*의 염색체 lacIq 유전자 때문에 표현 하지]21 파운드 포함 하는 Tc (200 rpm, 30 ° C)의 3 ml.
    2. 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.
    3. 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 필터를 배치 하 고 메 마른 PBS의 1 mL와 함께 resuspend. 살 균 PBS 가진 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 무 균 선택적 파운드 + Tc + 킬로미터에 희석된 혼합 확산 판.
    4. 식민지를 선택 하 고 그들은 각각 특정 한 뇌관으로 PCR에 의해 플라스 미드의 경우 항구 확인.
      참고: 플라스 미드 추출 후 직접 연속 미니-테네시5 의 삽입 위치 확인, 삽입은 플라스 미드의 전달 함수에는 영향을 미치지 않습니다 확인을 선택 사항입니다.

2. MPN 방법으로 활용 주파수의 계산

  1. 살 균 파운드 + 킬로미터와 파운드 + Gm 준비 접시.
  2. P. putida SMDBS pBP136 은닉의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: 문화와 P. putida KT2440RGD 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드의 3 mL에gfp (Gmr, Rifr) Gm (140 rpm, 30 ° C)를 포함 하는 파운드의 3 ml에서.
  3. 수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 단계 1.1.3에서 45 분 30 ° C에서 짝짓기 하는 필터에 대 한 그들을 사용 합니다.
  4. 순차적으로 희석 Gm (받는 사람) 형성 단위 (CFU) 식민지를 (3 중에서 각각) 플레이트 + 위의 기증자 및 받는 사람 (101 – 107) 문화와 파운드 + 킬로미터 (기증자) 또는 파운드에 그것을 확산. 2 d 30 ° C에서 번호판을 품 어.
  5. 살 균 파운드와 Gm를 포함 하는 필터에 혼합물을 resuspend 하 고 순차적으로 희석 (2에서1 224– 107.2) 96-잘 셀 문화 접시 (quadruplicate)을 사용 하 여.
  6. 적절 한 시간 (30 ° C에서 2 d)에 대 한 96 잘 접시를 품 어.
  7. 기증자 및 받는 사람 (2.4 단계.) 접시에의 CFU를 계산 하 고는 transconjugants 성장 하는 우물의 수를 계산.
  8. 자비스 개발한 MPN 계산 프로그램을 사용 하 여는 MPN 및 그것의 편차를 계산 합니다. 22, http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls에서 사용할 수 있습니다.
    1. (예, 2018/4/9) 실험, 테스트 시리즈, 수 및 최대의 날짜 (예, '테스트'), 실험의 이름을 입력 합니다. 아니요. Excel의 행 #7 '프로그램'의 시트에서 ('24' 입력) 희석의 파일 (이 하 ' MPN_ver5.xls').
    2. 입력 ' 2-1 (0.5 =) (= 5.96 × 10-8) 2-24 ' '희석 요인 d'열에 '' 'ml 또는 g w볼륨' 열과 ' 4 0.01'에서 ' 호 튜브 n의 ' 데이터' 입력된'의 자동으로 생성된 테이블에.
    3. 각 샘플 희석 (0-4)에 transconjugants 성장 하는 우물의 수를 입력 합니다.
    4. 오른쪽 상단 ' 계산 결과 ' 버튼을 눌러 하 고 (MPN/μ)에서 결과 및 그들의 95% 신뢰 한계 (하단과 상단).
  9. 기증자와 받는 사람 세포 (CFU/mL)의 숫자에 의해 transconjugants (MPN/mL)의 수를 나누어는 플라스 미드의 활용 빈도 계산 합니다.

3. 기증자 시작 활용의 확률의 추정에 대 한 준비

  1. P. putida SMDBS pBP136 은닉의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: 문화와 P. putida KT2440RGD 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드의 3 mL에gfp (Gmr, Rifr) Gm 300 mL를 사용 하 여 포함 된 살 균 파운드의 3 ml 플라스 크 (140 rpm, 30 ° C) precultures로.
  2. Km 또는 Gm 500 mL 플라스 크에 들어 있는 신선한 살 균 파운드의 200 mL에는 preculture의 200 μ를 전송 하 고 140 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 품 어.
  3. 600에서 탁도 측정 nm (OD600) 자리를 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 문화권의 문화, 파운드에 희석 (101– 108-배 희석), 킬로미터를 포함 하는 파운드 플레이트 또는 1-2 d 30 ° C에 Gm. 품이이 파운드 플레이트에 CFU 결정.
  4. OD600 가치와 기증자와 받는 사람의 성장 곡선을 생성 하 성장 시간 CFU 플롯.
  5. 성장 곡선에 따라 중앙 로그 단계로 기증자와 받는 사람 긴장의 문화를 성장.
  6. 수확 후 세척 셀 101– 103 파운드 및 105– 107 파운드의 100 μ에 받는 사람의 CFU의 10 μ에 기증자의 CFU를 준비 합니다.
  7. 기증자와 받는 사람 문화 (3 중)에서 96 잘 접시에 다양 한 밀도에 100 μ의 믹스 10 μ. 예를 들어 혼합 101 CFU는 기증자 및 10의5 받는 사람의 CFU 96 웰 스와 믹스 101 기증자의 CFU의 각 10를 추가 하 고6 CFU의 또 다른 96 잘 접시에 받는 사람 등등.
  8. 45 분, 30 ° C에 혼합물을 품 어 고을 추가 활용을 억제 하기 위해 각 영역 (100 μ g/mL 킬로미터 및 60 μ g/mL Gm) 항생제의 높은 농도 추가 합니다.
  9. 2 d 30 ° C에서 접시를 품 어.
  10. Transconjugants 성장 하는 우물의 수를 계산 합니다.
  11. 위의 데이터를 (transconjugants 96 잘 접시의 적어도 1에 발견 한다)에 따라 기증자 시작 활용의 확률의 추정에 대 한 적절 한 받는 사람 밀도 선택 합니다.
    참고: 기증자와 받는 사람 세포의 밀도 높은 때 잘에서 발생 하는 하나 이상의 활용 Transconjugants 모든 우물에 성장할 것입니다. 반면, 아무 transconjugants 셀 밀도 너무 낮을 때 어떤 우물에서 찾을 수 것입니다. 다음 섹션에서 단일 기증자 세포는 잘으로 정렬 됩니다. 따라서 받는 사람 밀도 최대에 이어야 한다.

4. 기증자 시작 활용의 확률의 추정

  1. 기증자의 중간 로그 단계 문화의 200 mL P. putida SMDBS pBP136을 품고 준비::gfp 또는 pCAR1::gfpP. putida KT2440RGD, 3.6-3.7에서 설명한 대로 받는 사람.
  2. 장소 106 CFU 96 잘 접시의 각 음에 파운드의 100 μ에 수신자의.
  3. FACS 시스템 (교류 cytometry 및 셀 정렬 로봇 팔, 488 nm 아르곤 레이저와 70 μ m 노즐 오리 피스)을 설정 합니다. 앞으로 분산형 (FSC), 수집 트리거로 1% 임계값을 설정 합니다. H 이득 및 FSC의 이득 조정 및 부정적인 컨트롤로 PBS를 사용 하 여 거짓 긍정적인 신호를 제외할 수 있는 최대 감도에 측면 살포 (SSC). FSC 그리고 SSC 및 0.5 드롭 최대한 정렬 순도 대 한 정렬 모드에 따라 정렬 게이트를 설정 합니다.
  4. 정렬 파운드 플레이트 (384 다른 관광 명소), FACS에 의해 셀 단일 기증자 2 d, 그리고 얼마나 많은 식민지 정렬된 셀에서 접시에 나타나는 수 30 ° C에서 접시를 품 어.
    참고: 이 절차는 설정의 유효성 검사에 대 한. 접시에 384 식민지는, 100% 정렬 된 식민지를 형성 수 의미 합니다. 정렬의 평균 유효 항상 90-95% 이다.
  5. 받는 사람 (4.2)와 96 잘 접시의 각 음에 FACS에 의해 단일 기증자 셀을 정렬 합니다.
  6. 30 ° C에서 45 분 동안 접시를 품 어 고을 추가 활용을 방지 하기 위해 각 영역 (100 μ g/mL 킬로미터 및 60 μ g/mL Gm) 항생제의 높은 농도 추가 합니다.
  7. 2 d 30 ° C에서 접시를 품 어.
  8. Transconjugants로 증가 했다 우물의 수를 계산 하는 육안으로 검사 하 여 결정.
  9. 기증자 정렬 했다 웰 스의 총 수로 transconjugants와 우물의 수를 나누어 기증자 시작 활용의 확률을 계산 합니다.

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Representative Results

MPN 방법으로 활용 주파수의 비교

우리의 이전 보고서에서 우리는 pBP136의 활용 빈도 비교::gfp 와 pCAR1:: 125 mL 스피너 플라스 크10를 사용 하 여 45 분 짝짓기 후 다른 교 반 속도 3 배 희석된 파운드 (1/3 파운드) 액체 매체에서gfp . 우리 pBP136의 활용 주파수 비교::gfp 와 pCAR1:: 10gfp 6 다른 교 반 조건 하에서 기증자와 받는 사람 긴장의 CFU/mL (0-600 rpm). 두 plasmids의 활용 빈도 높은 교 반 속도로 증가 하 고 활용 주파수에 최대 차이점은 < 사진 pBP136에 대 한:: pCAR1의 동안 (0와 400 rpm) 사이gfp ::gfp 는 ~ 25-fold (0 사이 그리고 200 rpm; 그림 1)입니다.

기증자 시작 활용의 확률의 추정

기증자 시작 활용의 이전 예상된 확률 표 2에 표시 됩니다. 활용, 분석 실험을 짝짓기의 확률을 비교 하는 데 필요한 받는 사람 세포의 밀도 결정 하기 위해 기증자와 받는 사람의 서로 다른 밀도와 수행 했다. 표 2, pBP136::gfp transconjugants 10를 포함 하는 우물의 100% (96/96)에서 발견 된3 CFU 기증자 및 105-107 CFU의 받는 사람, 그리고 그 102 기증자 및 10의 CFU6-10-7 CFU의 받는 사람을 나타내는 셀 밀도 너무 높았다. 10 분석 짝짓기1 기증자 및 10 CFU6 또는 10 transconjugant 양수 우물의 감소 된 귀착되 었 다5 받는 사람의 CFU (66%와 2.1%, 각각, 표 2). 따라서, > 105 CFU 받는 사람의 단일 기증자 세포와 짝짓기에 필요한 예상 했다. 마찬가지로, 우리는 pCAR1와 짝짓기 분석 수행:: 기증자와 받는 사람 긴장의 서로 다른 밀도에gfp . Transconjugant 양수 우물의 비율 했다 pBP136의 그 보다 훨씬 낮은::gfp (표 2). 가정 하 고 기증자 및 받는 사람 셀에 연결할 수 있는 서로 유사 하 게, pCAR1 기증자에 대 한 활용 개시의 확률 pBP136 기증자에 대 한 보다 낮은 했다. 우리는 결정이 결과 바탕으로, 107 수신자의 CFU FACS에 의해 정렬 단일 기증자 셀 필요 했다.

다음, transconjugant 양성 우물의 숫자 계산 했다. PBP136에 대 한 transconjugant 양수 우물의 비율::gfp pCAR1 보다 더 큰 (1.9%) 했다::gfp (< 0.052%; 표 2)입니다. 따라서, 거기는이 두 개의 플라스 미드 사이 기증자 시작 활용의 가능성에 36-fold 차이 보다 더 많은.

Figure 1
그림 1입니다. PBP136의 활용 주파수의 비교::gfp 와 pCAR1:: 106 콜로 니 형성 단위 (CFU) mL-1 기증자 (슈 도모 나 스 putida SMDBS)의 다른 받는 사람 (P. putida KT2440RGD)gfp 교 반 속도 (0-600 rpm). 오차 막대는 MPN 방법 및 기증자와 받는 사람의 CFU의 표준 편차에 의해 95% 신뢰 한계에 따라 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

세균성 긴장 유전자 형 및 관련 표현 형 참조 또는 소스
대장균 DH10B F-, mcrA, Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ (아 라 레 우) 7697, galU, galK , Λ-, rpsL, endA1, nupG 온도
대장균 S17-1(λpir) Tmr, Smr, recA, , 프로, hsdR-M+, RP4: 2-Tc: Mu: Km 테네시7 λpir 18
Pseudomoans putida KT2440 K ms, Rifs, Gms, Tcr 25
Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) 은닉 pCAR1 KT2440 20
Pseudomoans putida KT2440RGD K ms, Rifr, Gmr, Tcr, miniTn7(Gm) PA1/O4/O3DsRedExpress는 염색체에서 inseted은 10
Pseudomoans putida SMDBS P. putida KT2440, dapB의 파생 스트레인-삭제, Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacIq 염색체에 삽입 21
P. resinovorans CA10RG K ms, Rifr, Gmr, Tcs 6
플라스 미드
pBP136 IncP-1, 폭도P, MPFT 플라스 미드 17
pBP136::gfp pBP136 Kmr Pa 1/04/03- 파라gfp 카세트를 들고 (26137 nt) 21
pCAR1 IncP-7, 폭도H, MPFF, carbazole degradative 플라스 미드 26, 27
pCAR1::gfp pCAR1 Kmr Pa 1/04/03-ORF171에서gfp 카세트를 들고 (182,625 nt) 21
pJBA28 Apr, Kmr, 미니-테네시5-Km-Pa 1/04/03-RBSII에 대 한 배달 플라스 미드-gfpmut3*-T0-T1 18

표 1입니다. 세균성 긴장 그리고 플라스 미드입니다.

플라스 미드 기증자 받는 사람 96 웰 스 당 transconjugants와 우물의 숫자 백분율
[CFUs 또는 셀] [CFUs] [%]
pBP136::gfp 103 107 96/96 100
106 96/96 100
105 96/96 100
102 107 96/96 100
106 96/96 100
105 54/96 56
101 107 71/96 74
106 63/96 66
105 2/96 2.1
1 107 23/1212 1.9
pCAR1::gfp 103 107 6/96 6.3
106 6/96 6.3
105 0/96 0
102 107 1/96 1
106 1/96 1
105 0/96 0
101 107 0/96 0
106 0/96 0
105 0/96 0
1 107 1/1920 < 0.052

표 2입니다. PBP136 사이 기증자 시작 활용의 가능성을 비교 하는 transconjugants를 포함 하는 다른 셀 밀도와 우물의 수::gfp 와 pCAR1::gfp.

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Discussion

여기, 우리 transconjugants의 수를 추정 하는 MPN 방법을 사용 하 여 다른 조건 하에서 활용 주파수 차이 탐지 하기 위한 고해상도 프로토콜 제시. 프로토콜의 한 중요 한 단계 아니 transconjugants 성장 때까지 짝짓기 후 기증자와 받는 사람의 혼합물을 diluting은. 또 다른 단계는 선택적 액체 매체 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 추가 하 고. 이 절차는 배경 선택적 매체에 더 활용으로 인 한 줄일 수 있습니다. 우리가 성공적으로 기증자와 받는 사람 사이의 짧은 짝짓기 기간 후에 차이 검출할 수 있었다. 이 프로토콜에 의해 계산 conjugative 주파수 기증자와 받는 사람 긴장의 성장 조건에서 작은 차이 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 조건은 신중 하 게 설계 되어야 한다.

또한, 우리는 단일 기증자 셀 정렬 FACS를 사용 하 여 두 번째 단계 활용의 추정을 위한 프로토콜을 제시. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 정렬 된 단일 기증자 세포에 대 한 받는 사람 세포의 적절 한 밀도 결정 하 고. 때 받는 사람 셀 단일 기증자 세포를 둘러싼 수 기증자와 받는 사람 사이의 큰 만큼, 신체 접촉은 확실 하다. 다음, 활용 주파수 얼마나 자주 기증자와 받는 셀 연락의 확률에 의해 아닙니다 그러나 기증자 시작 활용의 확률에 의해에, 좌우 될 수 있다. FACS에 의해 단일 기증자 셀을 정렬 하는 것은 어려운; 그러나, 96 웰 스 충분 하지 않습니다 항상 확률을 추정. 따라서, 10-100 접시를 준비 한다. 프로토콜의 한계 중 하나는 낮은 주파수 transmissibility와는 플라스 미드의 기증자 시작 활용의 가능성을 측정 하기 위한 적절 한는 것입니다.

이러한 방법 및 그들의 결과 바탕으로, 우리 최근 보고 두 플라스 미드 활용, 부착 및 분리의 첫 번째 및 세 번째 단계에 영향을 미칠 수는 교 반 속도 변경 하 여 액체 매체에서 다른 활용 주파수 보였다 기증 받는 쌍. 또한, 우리는 또한 두 번째 단계10의 확률에 차이가 발견. 이러한 결과 다른 조건 하에서 활용 주파수를 변경 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 특정의 유무에서 호 기성 또는 혐 기성 조건, 다른 기증자 받는 쌍, 다른 온도 나 pH를 포함 하 여 다양 한 조건 및 플라스 미드의 활용 기능을 비교 하는 데 유용 화학 물질, 양이온, 영양분, 항생제 등.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

우리는 제공 하는 pCAR1 pBP136 및 교수 박사 헤 노 지리 동경 (일본)의 제공을 위한 닥터 K. 아마의 국립 연구소의 전염병 (일본) 감사 합니다. 우리는 또한 제공 하는 pJBA28에 대 한 덴마크의 기술적인 대학의 교수, 박사 Molin Sølen에 감사입니다. 이 작품은 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (부여 번호 15 H 05618와 15KK0278) 석사 (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo XDP Beckman-Coulter ML99030 FACS
IsoFlow Beckman-Coulter 8599600 Sheath solution
Fluorospheres (10 μm) Beckman-Coulter 6605359 beads to set up the FACS
Incubator Yamato Scientific Co. Ltd 211197-IC802
UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 SIMADZU Corporation UV-1800
96-well plates NIPPON Genetics Co, Ltd TR5003
microplate type Petri dish AXEL 1-9668-01 for validation of sorting
membrane filter ADVANTEC C045A025A for filter mating
pippettes Nichiryo CO. Ltd 00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
multi-channel pippetes Nichiryo CO. Ltd 00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP
0.5-10 μL, 20-200 μL
Tryptone BD Difco 211705
Yeast extract BD Difco 212750
NaCl Sigma S-5886
Agar Nakarai tesque 01162-15
rifampicin Wako 185-01003
gentamicin Wako 077-02974
kanamycin Wako 115-00342
Petri dish AXEL 3-1491-51 JPND90-15
microtubes Fukaekasei 131-815C
500 mL disposable spinner flask Corning CLS3578

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References

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