Высоким разрешением сравнение частот бактериальных спряжение

Genetics

GE Global Research must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

С целью понять поведение различных бактериальных сопряженных ДНК элементов в различных условиях, мы описать протокол для выявления различий в частоте спряжение, с высоким разрешением, чтобы оценить, насколько эффективно бактерия доноров инициирует спряжение.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shintani, M., Ohkuma, M., Kimbara, K. High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies. J. Vis. Exp. (143), e57812, doi:10.3791/57812 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Бактериальные спряжение является важным шагом в горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности через элемент сопряженных ДНК. Углубленное сопоставление спряжение частоты в различных условиях требуется понять, как сопряженных элемент распространяется в природе. Однако обычные методы для сравнения частоты спряжение не подходят для углубленного сравнения из-за высокой фон, вызванные возникновение дополнительных спряжение событий на пластину выборочной. Мы успешно снизили фона путем внедрения наиболее вероятный метод чисел (MPN) и более высокую концентрацию антибиотиков для предотвращения дальнейшего сопряжения в селективной жидкой среде. Кроме того мы разработали протокол для оценки вероятности как часто доноров клеток инициировать спряжение сортировки одного донора клеток в получателей пулов активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS). С помощью двух плазмид, pBP136 и pCAR1, различия в спряжение частоты в Pseudomonas putida клетки могут быть обнаружены в жидкой среде с разной скоростью перемешивания. Частоты спряжение посвящения были выше, чем pBP136 для pCAR1. Используя эти результаты, мы можем лучше понять функции сопряжения этих двух плазмид.

Introduction

Бактериальные спряжение мобильных генетических элементов, сопряженных плазмидов и интегративной и сопряженных элементов (ИКЕС) имеет важное значение для горизонтального распространения генетической информации. Это может способствовать быстрой бактериальных эволюции и адаптации и передавать гены множественной лекарственной устойчивости1,2. Спряжение частоты могут быть затронуты белков, закодированных на сопряженных элементы для мобилизации ДНК (MOB) и брачные пары формирования (MPF), включая секс пили, которые классифицируются в зависимости от толпы и МПФ тип3,4, 5. Он может также быть затронуты доноров и получателей помощи пара6 и условий роста (12 )11,10,9,клетки7,8, темпы роста, плотность ячеек, твердую поверхность или жидкой среды, температуры, наличия питательных веществ и присутствие катионов). Чтобы понять, как сопряженных элементы распространения среди бактерий, необходимых для сравнения частоты конъюгации в деталях.

Спряжение частоты между донорами и получателями помощи пар после спаривания обычно оцениваются обычными методами следующим. (i) во-первых учитываются числа доноров и получателей колоний; (ii) затем учитываются получателя колоний, которые получили сопряженных элементы (= трансконъюгантов); (iii) и наконец, спряжение частота рассчитывается путем деления тех доноров и/или получатель13колонии, формирование единиц (CFU) трансконъюгантов. Однако при использовании этого метода, фон высока из-за дополнительных спряжение события, которые также может возникать на избирательное пластин, используемых для получения трансконъюгантов, плотность клеток при высокой10. Таким образом трудно обнаружить небольшие различия в частоте (ниже десятикратного разница). Мы недавно представил наиболее вероятное число (MPN) метод, с помощью жидкой среды, содержащие высокую концентрацию антибиотиков. Этот метод уменьшена фон запрещая дальнейшие конъюгации в селективной среде; Таким образом частота сопряжения можно было бы оценить с более высоким разрешением.

Спряжение можно разделить на три этапа: (1) вложение донор получатель пары (2) начало сопряженных передачи и (3) диссоциации пара14. Во время действия (1) и (3) есть физического взаимодействия между донорами и получателями клетки; Таким образом плотность клеток и условия окружающей среды могут влиять эти шаги, хотя характеристики секса пили также важны. Шаг (2) регулируется скорее всего экспрессию нескольких генов, участвующих в конъюгации в ответ на внешние изменения, которые могут быть затронуты различные черты плазмида, доноров и получателей. Хотя физические вложений или отряд пар донор получатель можно математически моделировать с использованием оценки клеток как частицы, частота шага (2) должна измеряться экспериментально. Там было несколько докладов о прямых наблюдений, как часто доноры могут инициировать спряжение [шаг (2)] с помощью флуоресцентной микроскопии15,16; Однако эти методы не являются высокой пропускной способности, потому что большое количество клеток должны контролироваться. Таким образом мы разработали новый метод для оценки вероятности возникновения шаг (2) с помощью клеток активированных флуоресцированием сортируя (FACS). Наш метод может применяться к любой плазмиды, без идентификации важно генов для сопряжения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка донора с зеленого флуоресцентного белка (ГФП)- и плазмид ген тегами канамицин сопротивления

  1. Введение маркерных генов в целевой плазмида pBP136
    Примечание: Цель настоящего Протокола заключается в генерации pBP136::gfp. Штаммы бактерий и плазмиды, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 1.
    1. Расти культур DH10B Escherichia coli укрывательство pBP13617 в 5 мл стерильной бульоне Лурия (LB) и E. coli S17-1λПир18 укрывательство pJBA2819 [содержащие канамицин (км)-гена и gfp сопротивления mut3 * гена с его промоутер и Терминатор в мини Tn5] в 5 мл стерильной LB, содержащих 50 мкг/мл км при 37 ° C ночь (O/N, 16 – 24 h) с встряхивания на 200 оборотов в минуту (об/мин).
    2. Уборки и мойки
      1. Урожай 1 мл каждой культуры, поместите его в 2 мл микропробирок и центрифуги (10 000 × g, комнатной температуре, 2 мин). Затем удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл стерильного фосфатный буфер (PBS).
      2. Центрифуга снова (10 000 × g, комнатной температуре, 2 мин) и Ресуспензируйте в 500 мкл стерильных ФСБ.
    3. Фильтр спаривания
      1. Подготовить стерильных пластин фунтов (с 1,6% агар) и место на нем мембранный фильтр размер поры стерильные 0,22 мкм. Смесь 500 мкл E. coli S17-1λПир укрывательстве pJBA28 с E. coli DH10B укрывательство pBP136 и spot смесь на фильтр на пластину фунтов. Инкубировать пластину O/N на 30 ° C. Удалить фильтр из панели LB, поместить его в 50 мл стерильного пластиковую трубку и добавить 1 мл стерильного PBS.
        Примечание: pJBA28 можно реплицировать в присутствии Π белков, кодируемых геном Пир 18и может быть передана от S17-1λПир DH10B. pBP136 несет ген не маркер17 и может быть передана от DH10B S17-1λПир. Таким образом мы не могли отличить S17-1λПир укрывательство pBP136 и pJBA28 от DH10B pBP136 и укрывательстве и мини Tn5 (инкорпорирована в хромосомы или pBP136) на этой стадии. Затем мы использовали смеси из них в качестве доноров в последующих шагах (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Расти O/N культура выше спаривания смеси в стерильных LB, содержащие 50 мкг/мл км при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин и культуры Pseudomonas putida KT2440 [км чувствительных (кмs), рифампицин чувствительных (рифs), Гентамицин чувствительных (Gm-s) и тетрациклин устойчивостью (Tcr)] в среде, содержащей 12,5 мкг/мл ТС при 30 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
    5. После уборки и мытья клетки как шаг 1.1.2, используйте их (спаривания смесь и KT2440) для фильтра, спаривания (O/N, 30 ° C) как в шаге 1.1.3.
    6. Подготовить стерильных пластин LB, содержащие 50 мкг/мл км и 12,5 мкг/мл Tc (LB + км + Tc пластины).
    7. Разбавить ресуспензированы смесь на мембранный фильтр с стерильных PBS (101– 105-раза), а затем распространилась каждого разведения на LB + км + Tc плиты и инкубировать пластины при 30 ° C для 2-3 d.
    8. Выберите колоний от пластин, расти в стерильных LB, содержащие км и ТК, а также PO/N культуры. resinovorans CA10dm4RG (рифr и Gmr)6 в стерильных LB, содержащие риф (25 мкг/мл) и Gm (30 мкг/мл) при 30 ° C и 200 об/мин.
      Примечание: Как описано в предыдущей записке, колоний на LB + км + Tc пластины (от 1.1.7.) может быть укрывательстве pBP136 KT2440 проведение мини Tn5 и KT2440 с мини Tn5, потому что pJBA28 может передаваться непосредственно от S17-1λПир укрывательство pBP136 и pJBA28 к KT2440. Вот почему другой спаривания с P. resinovorans CA10RG требуется для получения целевого pBP136 с мини Tn5 в следующих шагах.
    9. После уборки и мытья клетки как шаг 1.1.2, используйте их для фильтра, спаривания (O/N, 30 ° C) как в шаге 1.1.3.
    10. Подготовить стерильных пластин LB, содержащие риф, Gm и км (LB + риф + км + ГМ пластины).
    11. Ресуспензируйте смесь на фильтр и затем разбавить его 101– 105-раз, распространение на LB + риф + км + ГМ плиты и инкубировать пластины для 2-3 d при 30 ° C.
    12. Выберите колоний и проверить, если они гавань pBP136 методом ПЦР с использованием конкретных Праймеры для плазмида.
  2. Введение селективного маркер гена в целевой плазмида pCAR1
    Примечание: Цель настоящего Протокола заключается в генерации pCAR1::gfp
    1. Расти O/N культуры KT2440 P. putida укрывательство pCAR1 (кмs, Gms,sриф, ТКr)20 200 об/мин и 30 ° C и E. coli S17-1λПир18 укрывательство pJBA28 в 5 мл стерильной LB содержит 50 мкг/мл км 200 об/мин и 37 ° C.
    2. После уборки и мытья клетки как шаг 1.1.2, используйте их для фильтра, спаривания (O/N, 30 ° C) как в шаге 1.1.3.
    3. Удалить фильтр из панели LB, поместить его в 50 мл стерильного пластиковую трубку и добавить 1 мл стерильного PBS.
    4. Разбавить ресуспензированы смесь с стерильных PBS (101– 105-фолд) и распространения разбавленной смеси на стерильной выборочное LB + ТК + км пластины.
      Примечание: pCAR1 не реплицировать в E. coli; Таким образом, KT2440 P. putida , укрывательстве pCAR1 с мини Tn5 могут быть выбраны на LB + ТК + км пластины.
    5. Выберите колонии от плиты и расти в стерильных LB, содержащих км и ТК и культуры PO/N культуры. resinovorans CA10dm4RG в стерильных LB, содержащие риф и Gm (200 об/мин, 30 ° C).
    6. После уборки и мытья как шаг 1.1.2, используйте клетки для фильтра, спаривания (O/N, 30 ° C) как в шаге 1.1.3.
    7. Ресуспензируйте смесь на фильтр и затем разбавить его, спред на LB + риф + км + ГМ пластины и инкубировать пластины для 2-3 d при 30 ° C.
    8. Выберите колоний и проверить, если они гавань pCAR1 методом ПЦР с конкретными праймерами для плазмида.
  3. Подтвердить передаваемости меткой плазмидов и подготовить доноров для последующих шагов
    Примечание: Цель настоящего Протокола состоит в подтверждении передаваемости выше сконструированный плазмидов и подготовить доноров для последующих шагов.
    1. Расти O/N культуры P. resinovorans CA10dm4RG укрывательство pBP136::gfp или pCAR1::gfp в стерильных LB, содержащие км и культуру P. putida SMDBS [кмs, Gms, рифr, ТКr, ЗСБН q, в котором PA1/О4/О3-gfpmut3* выражается не из-за его ген хромосомных ЗСБНq ]21 в 3 мл LB, содержащих Tc (200 об/мин, 30 ° C).
    2. После уборки и мытья клетки как шаг 1.1.2, используйте их для фильтра, спаривания (O/N, 30 ° C) как в шаге 1.1.3.
    3. Установите фильтр в стерильных 50 мл пластиковую трубку и Ресуспензируйте с 1 мл стерильного PBS. Разбавить ресуспензированы смесь с стерильных PBS (101– 105-фолд), распространения разбавленной смеси на стерильной выборочное LB + ТК + км пластины.
    4. Выберите колоний и проверить, если они гавань каждый плазмид методом ПЦР с конкретными грунтовки.
      Примечание: Подтверждение позиции вставки мини Tn5 сразу sequencing после извлечения плазмида необязательно подтвердить, что вставки не влияет на функцию передачи плазмид.

2. расчет частоты спряжение методом MPN

  1. Подготовить стерильные LB + км и LB + ГМ пластины.
  2. Расти O/N культуры SMDBS P. putida , укрывательство pBP136::gfp или pCAR1::gfp в 3 мл стерильного LB, содержащих км и культуру P. putida KT2440RGD (Gmr, рифr) в 3 мл LB, содержащих Gm (140 об/мин, 30 ° C).
  3. После уборки и мытья клетки как шаг 1.1.2, их необходимо используйте для фильтра, спаривания на 30 ° C по 45 мин как шаг 1.1.3.
  4. Серийно разбавляют выше доноров и получателей культура (101 – 107) и распространение его на LB + км (донор) или фунтов + ГМ (получателя) плиты (каждый в трех экземплярах) для подсчета колонии, образуя единиц (CFU). Инкубируйте пластины при 30 ° C для 2 d.
  5. Ресуспензируйте смесь на фильтр в стерильных LB, содержащие км и ГМ и последовательно разбавлять (от 21 224– 107.2) с использованием культуры плиту 96-луночных клеток (в составленном).
  6. Инкубируйте пластину 96-луночных соответствующее время (2 d при 30 ° C).
  7. Граф CFU доноров и получателей на тарелках (шаг 2.4.) и подсчитать количество скважин, в которых растут трансконъюгантов.
  8. Вычислить MPN и его отклонение с помощью программы расчета MPN, разработанная Джарвис и др. 22, который доступен на http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
    1. Введите имя эксперимента (напр., «проверить»), дату эксперимент (напр., 2018/4/9), количество серии испытаний и Макс. Нет. разведений (введите '24') в строке #7 «Программы» лист Excel файла («MPN_ver5.xls»).
    2. Введите ' 2-1 (= 0,5) для 2-24 (= 5.96 × 10-8)» в столбце «разбавления фактор d», «0.01' в колонке «объем в мл или g w» и ' 4' в ' № из трубы n' в таблице автоматически производится «входных данных».
    3. Введите количество скважин, в которых трансконъюгантов растут на каждом образце разрежения (0 – 4).
    4. Нажмите на верхнюю правую кнопку «Вычислить результаты», а затем получить результаты (в MPN/мкл) и их 95% доверительные интервалы (Нижняя и верхняя).
  9. Рассчитайте спряжение частота плазмиды путем деления числа трансконъюгантов (MPN/мл), числа доноров и получателей клетки (кое/мл).

3. подготовка для оценки вероятности по инициативе доноров спряжение

  1. Расти O/N культуры SMDBS P. putida , укрывательство pBP136::gfp или pCAR1::gfp в 3 мл стерильного LB, содержащих км и культуру P. putida KT2440RGD (Gmr, рифr) в 3 мл стерильного LB, содержащие Gm с использованием 300 мл Фляги (140 об/мин, 30 ° C) как precultures.
  2. Перевести 200 мкл preculture в 200 мл свежих стерильные LB, содержащие км или Gm в 500 мл флаконы и Инкубируйте на 30 ° C с встряхивания на 140 об/мин.
  3. Измерения мутности в 600 Нм (600OD) культуры, используя Спектрофотометр UV-VIS и месте культуры, разбавленных в фунтов (101– 108-сложите разведений), на плиты LB, содержащие км или мирабели инкубировать эти фунтов пластин при 30 ° C для 1 – 2 d и определить кое.
  4. Участок значения600 ОД и кое время роста для создания кривых роста стран-доноров и получателей.
  5. Расти культур штамм доноров и получателей в середине журнала этап, основанный на кривой роста.
  6. После уборки и мытья клетки, подготовьте 101– 103 CFU донора в 10 мкл LB и 105– 107 кое получателя в 100 мкл фунтов.
  7. Смесь 10 мкл донора и 100 мкл получателя культур при различных плотностях в 96-луночных пластин (в трех экземплярах). Например, микс 101 кое донора и 105 кое получателя и добавьте его в каждой из 96 скважин и смесь 101 кое донора и 106 CFU получателя в другой 96-луночных пластины, и так далее.
  8. Инкубировать смеси на 30 ° C в течение 45 минут, а затем добавьте высоких концентраций антибиотиков (км 100 мкг/мл и Gm 60 мкг/мл) для каждой скважины, чтобы препятствовать дальнейшей спряжение.
  9. Инкубируйте пластину на 30 ° C для 2 d.
  10. Подсчитать количество скважин, в которых растут трансконъюгантов.
  11. Выберите получателя плотности, которая подходит для оценки вероятности по инициативе доноров сопряжения на основе выше данных (трансконъюгантов должно быть найдено в по крайней мере 1 хорошо 96-луночных плиты).
    Примечание: Трансконъюгантов будет расти на всех скважинах при плотности клеток доноров и получателей помощи являются высокими, и более чем одного сопряжения происходит в колодец. В отличие от этого не трансконъюгантов будет находиться в любых скважин, когда плотность ячеек слишком низка. В следующем разделе одного донора клеток сортируется в колодец. Таким образом получателей плотность должна быть максимальной.

4. Оценка вероятности по инициативе доноров спряжение

  1. Подготовка 200 мл культуры середины журнала фазы доноров SMDBS P. putida , укрывательство pBP136::gfp или pCAR1::gfp и что получателя P. putida KT2440RGD, как описано в 3,6 – 3,7.
  2. Место 106 CFU получателя в 100 мкл фунтов в каждой скважине 96-луночных плиты.
  3. Настройка системы СУИМ (поток цитометрии и клеток сортировщик с робот-манипулятор, 488 нм Аргонового лазера и сопла 70 мкм). Установите вперед точечной (FSC), с 1% порог как приобретение триггера. Настройка H прибыль и прирост FSC и стороны точечной (SSC) в максимальной чувствительности, который можно исключить ложные положительные сигналы, используя PBS как отрицательный контроль. Установите ворота сортировки, основанный на FSC и ККК и 0,5 падение режима сортировки для максимальной сортировки чистоты.
  4. Сортировка одного донора клеток по СУИМ на плите фунтов (384 различные пятна), инкубировать пластину на 30 ° C для 2 d, а затем количество, сколько колонии появляются на пластину из отсортированных клеток.
    Примечание: Эта процедура используется для проверки набора ворот. Если есть 384 колоний на тарелке, это означает, что 100% сортировки клеток может стать колоний. Средний срок действия сортировки всегда является 90-95%.
  5. Сортировка одного донора клеток по СУИМ в каждой скважине 96-луночных плиты с получателем (4.2).
  6. Инкубировать пластину для 45 мин при 30 ° C, а затем добавьте высоких концентраций антибиотиков (км 100 мкг/мл и Gm 60 мкг/мл) для каждой скважины для предотвращения дальнейшего сопряжения.
  7. Инкубируйте пластину на 30 ° C для 2 d.
  8. Подсчитать количество скважин, в которых трансконъюгантов рос как определяется путем визуального осмотра невооруженным глазом.
  9. Рассчитайте вероятность по инициативе доноров спряжение, разделив количество скважин с трансконъюгантов на общее количество скважин, в которых был отсортирован доноров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сравнение частоты спряжение методом MPN

В нашем предыдущем докладе, мы сравнили спряжение частоты pBP136::gfp и pCAR1::gfp в триединое разреженных фунтов (1/3 LB) жидкой среде с разной скоростью перемешивания после 45 мин спаривания с помощью счетчика 125 мл флакон10. Мы сравнили спряжение частоты pBP136::gfp и pCAR1::gfp с 106 кое/мл штаммов доноров и получателей в различных условиях перемешивания (0-600 об/мин). Спряжение обоих плазмид чаще по более высоким ставкам, помешивая, и максимальная разница в частоте спряжение < десятикратного для pBP136::gfp (от 0 до 400 об/мин), а в pCAR1::gfp был ~ 25-fold (от 0 и 200 об/мин; Рис. 1).

Оценки вероятности по инициативе доноров спряжение

В таблице 2показано ранее предполагаемой вероятности по инициативе доноров спряжение. Для определения плотности получателей клеток, необходимых для сравнения вероятность спряжение, спаривания анализов были выполнены с разной плотностью доноров и получателей. Как показано в таблице 2, pBP136::gfp трансконъюгантов были обнаружены в 100% (96/96) скважин, содержащих 103 CFU доноров и 105-107 кое получателя и те с 102 CFU доноров и 106-107 Кое получателю, указав, что плотность клеток была слишком высока. Спаривания анализов с 101 кое доноров и 106 или 105 кое получателя привело к уменьшенное количество скважин transconjugant позитивные (66% и 2,1%, соответственно, Таблица 2). Таким образом > 105 кое получателя было предсказано требовались для спаривания с одного донора клеток. Аналогичным образом, мы провели спаривания анализов с pCAR1::ГФП при различных плотностях штаммов доноров и получателей помощи. Проценты transconjugant положительных скважин были намного ниже, чем у pBP136::gfp (Таблица 2). Предполагая, что донор и реципиент клетки можно подключить друг к другу аналогичным образом, вероятность начала сопряжения для pCAR1 доноров был ниже, чем для pBP136 доноров. На основе этих результатов, мы определили, что 107 кое получателя была необходима для одного донора клеток, отсортированных по СУИМ.

Затем количество скважин transconjugant позитивные были подсчитаны. Процент transconjugant позитивных скважин на pBP136::gfp был больше (1,9%), чем для pCAR1::gfp (< 0.052%; Таблица 2). Таким образом, там было больше, чем 36-fold разница в вероятности по инициативе доноров сопряжения между этими двумя плазмид.

Figure 1
Рисунок 1. Сравнение спряжение частот pBP136::gfp и pCAR1::gfp с 106 колонии формируя единиц (CFU) мл-1 (Pseudomonas putida SMDBS) стран-доноров и получателей (P. putida KT2440RGD) на различных уровнях перемешивание ставки (0-600 об/мин). Планки погрешностей были рассчитаны на основе на 95% доверительные пределы метод MPN и стандартное отклонение CFU доноров и получателей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Штаммы бактерий Генотип и соответствующую фенотип Ссылка или источник
Кишечная палочка DH10B F, mcrA, Δ (МРР-hsdRMS-mcrBC), Φ80dlacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ ( леиАра ) 7697, Галу, galK , Λ, rpsL, endA1, nupG Термо
E. coli S17-1(λpir) ТМr, Smr, recA, Тхи, pro, hsdRМ+, RP4: 2-Tc: Mu:7 км Tn λpir 18
Pseudomoans putida KT2440 Кмs, рифs, Gms, ТКr 25
Pseudomoans putida KT2440(pCAR1) Укрывательстве pCAR1 KT2440 20
Pseudomoans putida KT2440RGD Кмs, рифr, Gmr,r, ТК miniTn7(Gm) PO4/A1/O3DsRedExpress а это inseted в хромосоме 10
Pseudomoans putida SMDBS Производные штамм P. putida KT2440, dapB-удалены, кмs, Gms, рифr,rTc ЗСБНq вставляется в хромосоме 21
P. resinovorans CA10RG Кмs, рифr, Gmr,s Tc 6
Плазмиды
pBP136 Плазмиды IncP-1, мобP, MPFT 17
pBP136::gfp pBP136 кмр и PA1/04/03-gfp кассету в пункт (26137 nt) 21
pCAR1 IncP-7, мобH, MPFF, Карбазол деструктивные плазмиды 26, 27
pCAR1::gfp pCAR1 кмр и PA1/04/03-gfp кассету в ORF171 (182,625 nt) 21
pJBA28 APr, кмr, плазмида доставки для мини Tn5-км-PA1/04/03- RBSII-gfpmut3*-T0-T1 18

Таблица 1. Штаммы бактерий и плазмид.

Плазмиды Доноры Получатель Количество скважин с трансконъюгантов на 96 Уэллс Процент
[CFUs или ячейки] [CFUs] [%]
pBP136::gfp 103 107 96/96 100
106 96/96 100
105 96/96 100
102 107 96/96 100
106 96/96 100
105 54/96 56
101 107 71/96 74
106 63/96 66
105 2/96 2.1
1 107 23/1212 1.9
pCAR1::gfp 103 107 6/96 6.3
106 6/96 6.3
105 0/96 0
102 107 1/96 1
106 1/96 1
105 0/96 0
101 107 0/96 0
106 0/96 0
105 0/96 0
1 107 1/1920 < 0.052

Таблица 2. Количество скважин, с плотностью различных клеток, содержащих трансконъюгантов для сравнения вероятность по инициативе доноров сопряжения между pBP136::gfp и pCAR1::gfp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем разрешением протокол для выявления различий в частоте спряжения глаголов в различных условиях, с помощью метода MPN оценить количество трансконъюгантов. Один важный шаг в протоколе разбавления смеси доноров и получателей после спаривания до тех пор, пока не трансконъюгантов расти. Еще одним шагом является добавление высоких концентраций антибиотиков селективного жидкой среды для предотвращения дальнейшего сопряжения. Эти процедуры могут снизить фон, вызванные дальнейшего сопряжения в селективной среде. Мы могли бы успешно обнаружить различия, даже после короткой продолжительности спаривания между донором и реципиентом. Сопряженных частоты рассчитан этот протокол может быть изменена на небольшие различия в условиях роста штаммов доноров и получателей помощи. Таким образом эти условия должны быть тщательно разработаны.

Кроме того мы представляем собой протокол для оценки второй шаг спряжения глаголов с помощью СУИМ для сортировки клеток одного донора. Наиболее важным шагом в этом протоколе является определение соответствующей плотности получателя ячейки для сортировки одного донора клеток. Когда количество получателей клеток, окружающих одного донора клеток является достаточно большим, физический контакт между донором и реципиентом является определенным. Затем могут зависеть частота спряжение, не вероятность как часто доноров и получателей клетки связаться друг с другом, но вероятность по инициативе доноров спряжение. Сортировка одного донора клеток, СУИМ не сложно; Однако 96 скважин не всегда достаточно, чтобы оценить вероятность. Таким образом 10-100 плит должны быть готовы. Одним из ограничений протокола является, что он не подходит для оценки вероятности по инициативе доноров спряжение плазмида с низкой частоты трансмиссивности.

Основываясь на эти методы и их результаты, мы недавно сообщили два плазмид показали различные спряжение частоты в жидких средах, изменив перемешивания ставки, которые могут повлиять на первый и третий шаги спряжение, привязанности и отряд донор реципиент пар. Кроме того мы также нашли различий в вероятность второй шаг10. Эти результаты показывают, как частота спряжение изменяет в различных условиях. Эти протоколы являются полезными для сравнения функций сопряжения плазмид в различных условиях, в том числе аэробных и анаэробных условиях, разных пар донор реципиент, различные температуры или рН и наличие или отсутствие конкретных химические вещества, например катионов, питательных веществ и антибиотики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р K. Kamachi из Национального института инфекционных болезней (Япония) за предоставление pBP136 и профессор д-р H. Нодзири университета Токио (Япония) для обеспечения pCAR1. Мы признательны также профессор доктор Molin Sølen технического университета Дании за предоставление pJBA28. Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI (номера грантов 15H 05618 и 15KK0278) к MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo XDP Beckman-Coulter ML99030 FACS
IsoFlow Beckman-Coulter 8599600 Sheath solution
Fluorospheres (10 μm) Beckman-Coulter 6605359 beads to set up the FACS
Incubator Yamato Scientific Co. Ltd 211197-IC802
UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 SIMADZU Corporation UV-1800
96-well plates NIPPON Genetics Co, Ltd TR5003
microplate type Petri dish AXEL 1-9668-01 for validation of sorting
membrane filter ADVANTEC C045A025A for filter mating
pippettes Nichiryo CO. Ltd 00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
multi-channel pippetes Nichiryo CO. Ltd 00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP
0.5-10 μL, 20-200 μL
Tryptone BD Difco 211705
Yeast extract BD Difco 212750
NaCl Sigma S-5886
Agar Nakarai tesque 01162-15
rifampicin Wako 185-01003
gentamicin Wako 077-02974
kanamycin Wako 115-00342
Petri dish AXEL 3-1491-51 JPND90-15
microtubes Fukaekasei 131-815C
500 mL disposable spinner flask Corning CLS3578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39, (1), 81-95 (2015).
  2. Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
  3. Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35, (5), 936-956 (2011).
  4. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, (3), 434-452 (2010).
  5. Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33, (3), 657-687 (2009).
  6. Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27, (23-24), 1847-1853 (2005).
  7. Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80, (5), 1020-1023 (2016).
  8. Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
  9. Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143, (3), 1466-1470 (1980).
  10. Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12, (10), e0186248 (2017).
  11. Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102, (1-6), 5-20 (2002).
  12. Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164, (1), 20-27 (2018).
  13. Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41, (4), 959-966 (1981).
  14. Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262, (4), 711-719 (2010).
  15. Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
  16. Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (52), 20792-20797 (2008).
  17. Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152, (12), 3477-3484 (2006).
  18. Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1, (9), 784-791 (1983).
  19. Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64, (6), 2240-2246 (1998).
  20. Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72, (5), 3206-3216 (2006).
  21. Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80, (1), 138-145 (2014).
  22. Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109, (5), 1660-1667 (2010).
  23. Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42, (2), 261-268 (2002).
  24. Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, (11), 6557-6567 (1990).
  25. Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16, (1-3), 237-247 (1981).
  26. Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326, (1), 21-33 (2003).
  27. Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73, (3), 744-746 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics