Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Белки, связывающие специфических последовательностей РНК играют решающую роль в экспрессии генов. Подробная характеристика этих сайтов связывания имеет решающее значение для нашего понимания регуляции генов. Здесь описан пошагово подход для насыщения мутагенеза сайтов связывания белков в РНК. Этот подход является актуальной для всех сайтов связывания белков в РНК.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Регулирование ген играет важную роль в развитии. Многочисленные дна и RNA-связывая протеинов привязать их последовательности с высокой точностью контролировать экспрессию генов. Эти регуляторные белки контроль экспрессии генов на уровне ДНК (транскрипция) или на уровне РНК (сплайсинга пре мРНК, сплайсингу, транспорт мРНК, распад и перевод). Определение нормативных последовательностей помогает понять не только как ген включен или выключен, но также какие гены течению регулируются определенной регламентационный протеин. Здесь мы описываем одноэтапный подход, который позволяет мутагенеза насыщенность сайта связывания белков в РНК. Она включает в себя допинг ДНК шаблон с одичал тип нуклеотидов в пределах привязки сайта, синтез отдельных молекул РНК с каждой фосфоротиоат нуклеотидов и изоляции связанной фракции после инкубации с белком. Помехи от дикого типа нуклеотидов приводит к их преференциальных исключение из фракции белков прыгните. Это контролируется электрофорез геля после выборочного химического расщепления с йодом Фосфодиэфирная облигаций, содержащих кислота (фосфоротиоат мутагенеза или PTM). Этот единый этапа насыщения мутагенеза подход применим к характеристике любого сайта связывания белков в РНК.

Introduction

Регулирование ген играет важную роль в биологии. Гены могут регулироваться на уровне транскрипции сплайсинга пре мРНК, 3' конца формирования, РНК, перевод, локализация мРНК, распад, столб-поступательные изменения/стабильности, экспорт и т.д. , которые оба дна и RNA-связывая протеинов играют ключевую роль в ген регулирование. В то время как молекулярные генетические анализы выявили многочисленные регуляторные белки, лишь немногие из них характеризовались полностью их клеточных функций или привязки сайтов в естественных условиях. Филогенетические последовательность анализа и мутагенез предлагают взаимодополняющие подходы к характеризуют ДНК или РНК белковых взаимодействий.

RNA-связывая протеинов важны в процессы развития, включая половой дифференцировки. Дрозофилы белка, секс смертельное (SXL) или мастер секс переключатель белков отсутствует в мужчины, но присутствует в женщин. Она признает уридина богатых последовательностей или пиримидин участки прилегающие к конкретным соединитель сайтов в нижнем пре мРНК цели (трансформатора, секс смертоносноеи специфичные для мужчин lethal2) в соматические клетки1,2 ,3,4. Кроме того он регулирует сплайсингу сайт переключение путем привязки к уридина богатые сплайсингу усилитель последовательностей в усилитель элементарный (e(r)) Стенограмма5,6. SXL вероятно регулирует дополнительных целей в женской микрофлорой, которые предстоит определить1,,78,9,10,11, 12 , 13.

Как правило характеристика привязки сайта включает мутагенеза, например, путем удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов. Каждый сайт мутант привязки, относительно одичал тип РНК последовательности, затем анализируются с помощью ряда концентрации белка для определения его сродство (Kd или равновесия диссоциации постоянная) для протеина интереса; K-d является концентрация белка, необходимого для получения 50% РНК привязки. Этот трудоемкий процесс подробных мутагенеза включает поколения и анализ многочисленных мутантов — трех нуклеотидов дикого типа для каждой позиции в привязки сайта. Таким образом существует необходимость альтернативного подхода для быстрый, простой и недорогой насыщения мутагенеза сайтов связывания белков в РНК.

Здесь мы описываем одноэтапный подход, который позволяет мутагенеза насыщенность сайта связывания белков в РНК. Она включает в себя допинг ДНК шаблон с одичал тип нуклеотидов в пределах привязки сайта, синтез отдельных молекул РНК с каждой фосфоротиоат нуклеотидов и изоляции связанной фракции после инкубации с белком. Помехи от дикого типа нуклеотидов приводит к их преференциальных исключение из фракции белков прыгните. Это контролируется электрофорез геля после выборочного химического расщепления с йодом Фосфодиэфирная облигаций, содержащих кислота (фосфоротиоат мутагенеза или PTM). Этот единый этапа насыщения мутагенеза подход применим к характеристике любого сайта связывания белков в РНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: На рисунке 1 обзор фосфоротиоат мутагенеза и обобщаются основные шаги в процессе.

1. Генерация библиотеки мутантов — допинг ДНК шаблон с дикого типа нуклеотидов

  1. Синтезировать T7 грунт (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') путем химического синтеза на синтезатор ДНК.
  2. Синтезировать легированных олигонуклеотида (дополнительные пряди) путем химического синтеза на соответствующий сайт связывания белка синтезатор ДНК. Используйте соответствующую смесь Фосфорамидиты во время химического синтеза для каждого сайта допинг (X ниже) при соотношении 90% A как одичал тип нуклеотидов и 10% T как дикого типа нуклеотидов (см. Представитель результаты более подробно на этот коэффициент).
    Примечание: Здесь, последовательность легированных олигонуклеотида, 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. Подчеркнутые последовательности является обратный дополнением SXL сайт связывания белков, плюс дополнительные нуклеотидов вне привязки сайта, которые предоставляют полезные элементы, подтверждающий, что не каждое изменение в РНК влияет на обязательную силу, а также загрузки элементов управления для Сравнение и нормализации нуклеотидов в пределах привязки сайта. SXL-привязки узла последовательности UUUUUGUUGUUUUUUUU, который присутствует в трансформатор пре мРНК14,,1516,17, был использован для разработки предлагаемой методологии. Последовательность в курсив дополняет последовательность праймера T7 и промоутер T7 для в vitro транскрипция.

2. синтез РНК

  1. Синтезировать RNA в 20 мкл транскрипции реакции, как описано18.
    1. Буфер транскрипции Mix T7 и 1 мкм T7 олигонуклеотида, 1 мкм легированных олигонуклеотида, 10 мм Дитиотреитол (DTT), 2 мм ГТФ, 1 мм АТФ, CTP и UTP (гуанозина, аденозин, Цитидин и уридина трифосфат) и 2 U/мкл T7 РНК-полимеразы.
    2. Добавить в двух отдельных microcentrifuge трубы, 0,167 мм α-Тио АТФ или 0,05 мм α-Тио UTP для включения кислота (см. схема на рис. 2) в РНК.
      Примечание: Для альтернативных протоколов, добавьте 0,2 мм α-Тио CTP или 0,2 мм α-Тио GTP реакция соответствующей транскрипции, содержащие легированных олигонуклеотида для тестирования двух оставшихся замен нуклеотидных.
    3. Инкубировать смесь реакции синтеза РНК втечение 2 ч при 37 ° C.
  2. Добавьте 2.5 мкл тепло лабильного щелочной фосфатазы и 2,5 мкл 10xphosphatase буфер образца РНК. Инкубируйте этого 25 мкл реакции на 10 – 30 минут при 37 ° C для удаления 5' фосфатов.
  3. Инактивирует фермент щелочной фосфатазы путем нагревания при 80 ° C для 2-5 мин.
  4. Radiolabel к 5' концу dephosphorylated РНК (5 pmole) с использованием 1 мкл T4 полинуклеотид киназы и 1 мкл γ -32P АТФ в объеме 10 мкл реакции. Инкубировать смесь реакции на 30-60 минут при 37 ° C.
  5. Инактивирует фермент киназы полинуклеотид T4 путем нагрева при 65 ° C для 20-30 мин.
  6. Гель для очистки РНК электрофорезом в 10% Денатурирующий гель полиакриламида. Найдите РНК на геле радиоавтографией. Акцизный ломтик гель, содержащий radiolabeled РНК, раздавить в пробки microcentrifuge нажимая против стены с кончиком пипетки и замочить в протеиназы K (PK) буфера (100 мм трис, pH 7.5, 12,5 мм ЭДТА, 150 NaCl, лаурилсульфат натрия 1%). Поворот трубы при комнатной температуре от 2 h для ночевки.
  7. Центрифуга для суспензии геля, отказаться от геля и собирать буферного раствора.
  8. Извлечь решение дважды с равным объемом фенол хлороформ и один раз с хлороформом и собирать водной фазе.
  9. Добавить в водной фазе 0,1 объема 3M ацетат натрия, рН 5.2, перевозчик tRNA или гликогена и 2,5 объем этанола. Держите образец-80 ° C в течение 1 ч.
  10. Центрифугуйте образцы для 5 – 10 мин в высокой скорости microcentrifuge на 16,873 x g. Осторожно извлеките буфер/этанола раствор не нарушая Пелле РНК.
  11. Помыть лепешка с 70% этанола и центрифуги для этанола удалить 2 – 5 мин тщательно. Сухие гранулы в воздухе.
  12. Ресуспензируйте гранулы в 20 – 50 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды. Хранить при температуре от-20 ° C до использования.
    Примечание: Все действия с radiolabeled РНК, с использованием надлежащих мер предосторожности и оргстекла щита для защиты от радиации. В настоящее время спина столбцы являются более часто используемых и более удобным для удаления неинкорпорированных радиоактивности, как альтернатива очищение геля РНК.

3. белки обязательную силу реакции и разделение связанных РНК

  1. Экспресс рекомбинантных белков в и очищают от кишечной палочки.
  2. Оценки концентрации рекомбинантных белков методом спектрофотометрии или путем разделения в геле полиакриламида SDS рядом известных белков стандарт, бычий сывороточный альбумин (BSA). Визуализируйте протеина интереса и BSA стандарта путем пятнать геля с Кумасси синим R-250. Quantitate белка по сравнению с известные количества BSA разведений на же гель.
    Примечание: Хранить рекомбинантных белков на - 80 ° C до использования и разбавленных в 20 мм 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) пиперазина-1-ethanesulfonic кислота (HEPES), рН 8,0, 1 мм Дитиотреитол (DTT), 0,2 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 0,05% NP-40, 20% глицерина. Использование 0,5-1,0 мм протеазы ингибитор phenylmethane сульфонилфторид (PMSF) является необязательным.
  3. Выполнять RNA-связывая реакции (20-100 мкл) в 10 мм трис-HCl, pH 7.5, 1 мм DTT, 50 мм KCl, 0.5 АБС битор РНКазы единиц/мкл, 0,09 µг/мкл ацетилированные альбумина bovine сыворотки, 1 мм ЭДТА, 0,15 мкг/мкл tRNA, 5'-конце radiolabeled РНК и соответствующей концентрации (6 мкл концентрация на котором ~ 50% РНК связывается с белком) белка.
    Примечание: Этот буфер привязка работает три RNA-связывая протеинов (SXL, U2AF65и ПТБ), но должны быть стандартизированы для протеина интереса. Оценить концентрацию белка эмпирически, с использованием различных разведениях для подготовки данного белка, который необходим для получения примерно 50% РНК привязки. Это условие или Kd представляет наиболее чувствительной частью RNA-связывая кривой.
  4. Инкубируйте реакции связывания белка для 20-30 мин при температуре 25 ° C (или на льду).
  5. Отделите белок прыгните РНК дроби от несвязанных дроби, используя один из двух подходов:
    1. Нитроцеллюлоза фильтр привязки
      1. Применять привязки реакции (20-100 мкл) нитроцеллюлоза фильтр подключен к вакуумный коллектор при комнатной температуре.
        Примечание: Только комплекс РНК белок сохраняется на фильтр и несвязанные РНК потоков через фильтр. Фильтр привязки подход позволяет выше восстановления связанных РНК и быстрее и проще, по сравнению с assay гель подвижности. Размещая открытое мембраны под нитроцеллюлоза фильтр также можно собирать несвязанных фракция РНК или бесплатные РНК для сравнения с привязанного дроби.
      2. Вырезать часть нитроцеллюлоза фильтр, содержащий сохраненных радиоактивных РНК на более мелкие куски вписываются в пробки microcentrifuge, Замочите в достаточно буфера PK (300 – 500 мкл содержащий 10 – 20 мкг PK) погружать части фильтра и элюировать РНК из фильтра для 2-3 часа или на ночь.
      3. Извлечение с фенол хлороформ, хлороформ и собирать водной фазе. Добавить ацетат натрия и этанола и после инкубации в морозильник, центрифуги, мыть, сухой и Ресуспензируйте РНК в DEPC-лечение водой. Выполните следующие шаги, как описано в шагах 2.10 в 2.14 выше.
    2. Перенос удобоподвижности геля
      1. Подготовить и полимеризоваться родной полиакриламидный гель 5% (60: 1 Acrylamide:bis-акриламида) в 0,5 x TBE (Стандартный буфер Tris-Борат-ЭДТА) перед началом привязки реакции, как альтернатива метод привязки фильтра.
      2. Предварительно запустите гель для 15 мин 250 V в холодной комнате (4 ° C).
      3. Загрузка каждой привязки реакции (см. выше) в отдельных скважинах выше предварительного хода геля.
        Примечание: Буфер хранения белка обеспечивает достаточную глицерин для загрузки образца в скважинах.
      4. Отделить белок прыгните РНК электрофорезом геля в холодной комнате 250 V для 1-2 ч, в зависимости от размера РНК и специфического протеина.
      5. Найдите положение РНК белок комплекса на геле радиоавтографией. Акцизный ломтик гель, содержащий комплекс РНК белок. Элюировать РНК от геля фрагмента путем дробления среза геля и замачивания в буфере PK.
      6. Извлечение с фенол хлороформ, хлороформ и собирать водной фазе. Добавить ацетат натрия и этанола, после инкубации в морозильник, центрифуги, мыть, сухой, воздуха и Ресуспензируйте РНК в DEPC-лечение водой. Выполните следующие шаги, как описано в шагах 2.10 в 2.14 выше.

4. анализ йода расщепляется фосфоротиоат продуктов для обнаружения мутант нуклеотидной позиции

  1. Добавить 1 мм йода в 20 мкл DEPC-лечение водой, содержащей до 10 мкг перевозчик tRNA прилепится РНК (связанными и общая RNAs) на участках фосфоротиоат инкорпорации. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    Примечание: Более подробную информацию о йода расщепления с немного различных условий — 7% (v/v) iodoethanol, Отопление на 95 ° C 3 мин — можно найти в Gish & Eckstein 1988-19.
  2. Преципитат расщепляется РНК путем добавления натрия ацетат/этанола, как описано выше. Ресуспензируйте загрузки красителем для денатурации гели. Тепло и загрузки образца в отдельные фрагменты РНК путем электрофореза в геле полиакриламида денатурируя 15 – 20%.
  3. Разоблачить полиакриламидный гель для рентгеновской пленки.
  4. Обнаружить полосы в связанной фракции против общего пула с помощью авторадиографии.
    Примечание: Все действия с йода в вытяжкой. Для разделения РНК, показанный здесь применяется гель, клиновидные, которая достигается путем удвоения толщина обе распорки в нижней части пластины гелем, вставляя дополнительный дюйм длиной разделитель в нижней части геля. Эта форма позволяет более единообразной или ближе расстояние между короткие фрагменты РНК. Кроме того phosphorimager может использоваться вместо рентгеновской пленки для обнаружения и количественный радиоактивности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Принцип работы насыщения мутагенеза, используя допинг:

Для соответствующей молярное соотношение одичал типа и других нуклеотидов используйте равные смесь всех четырех нуклеотидов если только одну позицию для анализа. Однако, если несколько позиций анализируются одновременно, должны быть скорректированы соотношение дикого типа чтобы одичал тип нуклеотидов, т.е. сократить. В противном случае помимо одной замены, которые желательно, также будет шаблоны с несколькими дикого типа нуклеотидов в молекуле, исключающие анализ влияния единого нуклеотидом замен. Таким образом как правило, используйте соотношение дикого типа чтобы одичал тип нуклеотидов 1/n, где n — количество позиций для анализа. Здесь, мы проанализировали 10 позиций одновременно и используется смесь, содержащая 90% одичал тип нуклеотидов и 10% дикого типа нуклеотида для легирования шаблон ДНК. Сделали отдельные транскрипции реакций, в которой каждый транскрипции реакция производится с одним из четырех кислота. Таким образом каждая реакция контролирует конкретные нуклеотидов в легированных позициях.

Принцип разделения из-за вмешательства:

Представленный здесь подход мутагенеза РНК у в среднем менее одного фосфоротиоат остатков на молекулу. Во время процесса привязки, раздела молекул РНК между фракция белков прыгните и несвязанных дроби. Поскольку особое нуклеотидов связан с фосфоротиоат связь, расщепление фосфоротиоат магистральной связи является индикация наличия конкретных нуклеотидов в этой позиции. Ожидается, что в любом месте, когда изменяется нуклеотидов он может либо не оказывают влияния на привязки или она может препятствовать привязки, частично или полностью. Если наличие конкретных нуклеотидов имеет никакого влияния на привязки он будет раздел поровну между белка связанные и несвязанные фракций. Однако если конкретные нуклеотидов в заданной позиции вмешивается связывания белков он будет преференциально исключен из фракции белков прыгните. Степень вмешательства может контролироваться количественно для каждой позиции в том же реакции после электрофореза геля. Эта концепция проиллюстрирована в схеме (рис. 3). В целом РНК фракции (пер. Т) Группа интенсивности примерно равные для всех позиций легированный (группы 1, 3 – 7). В белок прыгните РНК фракции (пер. Б), на позиции 1, 4 и 7 нуклеотидов не влияет на привязку. Однако в позициях 3 и 6, он мешает с привязкой и таким образом, исключается из связанной фракции. В положении 5 вмешательство является частичной. Таким образом сравнение четырех парных полос, T и B для каждой нуклеотидов, позволяют для анализа всех четырех нуклеотидов. Следует отметить что одичал тип нуклеотида для заданной позиции отражает эффект, если таковые имеются, серы в РНК позвоночника на связывания белков.

Сопровождающие авторадиография (рис. 4) показывает две пары (α-Тио A и α-Тио U) полос от денатурируя гель (T для общего пула) и B для связанной фракции. Некоторые замечания могут быть сделаны сравнение интенсивностей полос на каждой позиции между каждой парой полос (T и B). Во-первых большинство сигнала находится в верхней части геля, то есть, uncleaved продукт, для обоих α-Тио Лейн и α-Тио U Лейн. Во-вторых для α-Тио A пара полос, несколько полос (продукты расщепления йода) идентичны между границей и общая РНК дроби например, полосы выше 1; соответствующие полосы в пределах привязки сайта для α-Тио Лейн нумеруются для справки. В-третьих, полосы на нижней части гель более близко расположенных (например, группы ниже 6), чем обычно для секвенирования геля. В-четвертых несколько групп, присутствующих в общей доли РНК, но отсутствует или значительно сокращена в связанном РНК дроби (например, группы 1, 2, 3 и 5). В-пятых для α-Тио U Лейн пары, хотя большинство групп сопоставимы между общей и связанными полос, некоторые группы относительно менее интенсивным в связанном дроби (например, группы 7 и 8).

Эти наблюдения позволяют доказательств для успешного развития этого нового метода и приводят к следующим выводам: во-первых, для α-Тио A пара полос и α-Тио U пару полос, потому что большая часть РНК uncleaved, он обеспечивает доказательства, что только небольшая часть РНК содержит изменения или фосфоротиоат остатков. Это важно, потому что он убедится, что молекулы РНК, которые содержат не более одного фосфоротиоат остатков. Второй, идентичные или похожие интенсивности для нескольких групп вне привязки сайта между двумя полосами, α-Тио A и α-Тио U, показывают, что загрузка сопоставимых для обеих полос, позволяя легко сравнение между полос. В-третьих, более близко расположенных полос достигаются, α-Тио A и α-Тио U, клин-форма геля (тоньше в верхней и толще в нижней части), таким образом позволяя анализ дольше последовательности чтения и предлагая более высоким разрешением. Как правило короткие фрагменты более широко расположены в виде геля с равномерной толщины. В-четвертых исчезновение или уменьшение интенсивности некоторых полос в связанной фракции указывает, что одичал тип нуклеотидов преференциально исключены из привязанного дроби (α-Тио A). Относительных интенсивностей различных групп в рамках привязанного Лейн также предлагают количественную информацию о масштабах вмешательства от дикого типа остатков в разных местах. Другими словами мутанта или дикого типа нуклеотидов в определенных позициях вмешиваться связывания белков. Наконец тестирование эффект замещения серы позвоночника (фосфоротиоат) в одном из не преодоление кислороды (α-Тио U), показывает, что три должности показывают незначительные эффекты от позвоночника Сер (например, 6, 7 и 7 ниже). Наши объединенные результаты показывают, что несколько позиций в пределах привязки сайта Показать преференциальных исчезновения или снижение интенсивности конкретных групп в связанной фракции. Это объясняется база, вместо того, чтобы позвоночник замещения, указывающее взаимодействий протеина с конкретными базами привязки сайта (α-Тио A). Тем временем включение α-Тио C показывает интерференционной картины сопоставимы с α-Тио а. Только 3-4 α-Тио G замен показать небольшой однако, обнаруживаемыми вмешательства вокруг, например, позиции пронумерованы 2 и 3 (данные не показаны). Этот метод был использован выявить различия в как сплайсинга репрессор SXL и общего сплайсинга snRNP фактор U2 вспомогательный фактор (65U2AF) привязки к последовательности одинаковых пре мРНК сплайсинга сигнала (polypyrimidine тракта) образом собственный15 .

Figure 1
Рисунок 1: схема ключевых шагов в фосфоротиоат мутагенез (ПТМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема фосфоротиоат связь между двумя нуклеотидов, которые могут быть химически расщепляется иодом. Сера заменяет один из кислороды фосфат-преодоление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: принцип разделения из-за вмешательства. Гипотетические РНК содержит представитель α-Тио нуклеотидов на шесть должностей, включая сайт связывания белков. После связывания белков, РНК расщепляется на участках фосфоротиоат инкорпорации йодом. Позиции 1 – 7 в пределах и вокруг сайт связывания произвольно нумеруются для ссылки в тексте. Положение 2 или отсутствует группа не представляет фосфоротиоат включение или не легированный нуклеотидов. Лейн T является общая РНК и Лейн B является белок прыгните РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: фосфоротиоат мутагенез (ПТМ) подход позволяет мутагенеза насыщения polypyrimidine урочище/3 ' сращивания сайт присутствует в трансформатор пре мРНК. Лейн T является общая РНК и Лейн B является белок прыгните РНК. Α-Тио представляет РНК синтезируется в присутствии АТФ α-Тио и идентифицирует легированных позиции в последовательности с α-Тио adenosines. Три сильных полосы соответствуют adenosines в последовательности на этих позициях. Α-Тио U представляет РНК синтезируется в присутствии α-Тио UTP и идентифицирует все uridines, в том числе легированных позиции в последовательности. Вертикальная линия слева знаменует SXL привязки сайта. Позиции 1 – 8 в пределах привязки сайта нумеруются для справочных целей и для удобства описания в разделе результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мутагенез уже давно используется для характеристики сайтов связывания белков. Во-первых ряд мутантов можно построены и индивидуально испытаны в обязательных анализов для анализа их воздействия на обязательную силу сходства. В то время как стандартный мутагенеза подход предлагает способ для анализа нескольких последовательностей, несколько шагов участвует в стандартный подход, например строительство мутантов и выполнение ряда обязательных реакций для каждого мутант, является трудоемким и требует много времени и не может разрешить насыщения мутагенеза, особенно для более последовательностей. Во-вторых последовательность может быть случайным и бассейн используется для нескольких циклов привязки и полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации. Эти последовательности, которые связывают белок должны быть клонированы и виртуализации для выявления и проверки привязки сайта из последовательности консенсуса. Тем не менее этот итеративный привязки и усиления вариант включает в себя несколько шагов и трудоемкий в выявлении остатков, которые важны в пределах привязки сайта. Кроме того повторяющиеся последовательности амплификаций присущие ПЦР может ввести последовательность предвзятости. В-третьих последовательности, выбранных из случайных пула можно упорядочивать с помощью быстрее возможность виртуализации высокой пропускной способности, хотя это довольно дорого. Таким образом, чтобы преодолеть эти ограничения нескольких шагов, кропотливого и/или дорогих методов, мы разработали более быстрый, недорогой и самое главное одношаговый метод, описанный здесь, для достижения мутагенеза насыщения привязки сайта (ПТМ).

Основные шаги в рамках этого подхода включают в себя идентификации или мечение одичал типа nucleotide(s). Мы использовали фосфоротиоат нуклеотидов, в которой один кислороды в фосфат позвоночника замещается серы, как описано (рис. 2). Преимуществом является, что йод может использоваться для химически прилепится костяк фосфоротиоат нуклеотидов. Таким образом йода расщепления субстрата РНК, содержащие фосфоротиоат позвоночника генерирует последовательность тип лестнице, где на сайте расщепления прокси или тег для присутствия одного из четырех баз в этой позиции. Сравнение несвязанных и общая фракций определяет остатков, которые преимущественно исключаются из связанной фракции и таким образом имеют важное значение для связывания белков. В отличие от остатков, которые не важны для привязки остаются одинаково распределенные между двумя фракциями. Этот подход может использоваться для определения привязки сайтов для любого RNA-связывая протеинов.

В целом этот одношаговый насыщения мутагенеза подход, сочетая допинг, кислота и йод расщепления, предлагает мощные средства для определения характеристик любого привязки сайта в РНК. Однако этот подход требует, что сайт связывания уже известна до мутагенеза. Кроме того необходимо оптимизирован для каждого белка связывания белков – условия. Следующие меры предосторожности необходимо подчеркнуть. Меры предосторожности для обработки РНК должна осуществляться, такие, как носить перчатки, подготовку решений и буферов в DEPC-лечение водой, автоклавирования наконечники и трубки и выделение оборудования для РНК используется только для того, чтобы избежать полиадениновый. Аналогичным образом необходимы уход с участием радиоактивных Шилдс, радиоактивные, мониторинг с использованием радиоактивных материалов имеет важное значение и использование вытяжного зонта при использовании опасных химических веществ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор объявляет без финансовых интересов.

Acknowledgments

Автор благодарит национальные институты здравоохранения для финансирования последних и спасибо Майкл р. Грин для синтеза олигонуклеотидов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127, (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14, (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7, (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25, (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2, (6), e520 (2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14, (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21, (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81, (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124, (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253, (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182, (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268, (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6, (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22, (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14, (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240, (4858), 1520-1522 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics