ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

Genetics

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Summary

特定の RNA シーケンスを結合するタンパク質は、遺伝子発現の重要な役割を果たします。これらの結合部位の詳細な特性解析は遺伝子の規則の私達の理解にとって重要です。ここでは、RNA タンパク質結合部位の飽和突然変異導入のシングル ステップ アプローチを説明しています。このアプローチは、RNA のすべての蛋白質の結合サイトに関するものです。

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Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

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Abstract

遺伝子の規則は開発の重要な役割を果たしています。多数の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の発現を制御する高い特異性とそのターゲット シーケンスをバインドします。これらの調節タンパク質 (転写) DNA のレベルでまたは RNA (mRNA スプライシング、起こる、mRNA の輸送、腐食および翻訳) のレベルでの遺伝子発現を制御します。制御配列の同定は、オンまたはオフの遺伝子への切り替えだけでなく、また下流遺伝子の特定規制蛋白質によって規制されているを理解するのに役立ちます。ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

Introduction

遺伝子は、生物学で重要な役割を果たしています。遺伝子の転写、mRNA のスプライシング、3' 端形成、RNA 輸出、翻訳、mRNA の局在、崩壊、翻訳後修飾/安定性など両方の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の重要な役割を再生レベルに調整できます。規制。一方、分子遺伝学的解析では、規制を多くの蛋白質を識別した、それらのごく一部のみが細胞機能の結合サイトの生体内完全に特徴づけられています。系統解析と突然変異は、DNA または RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるに補足のアプローチを提供しています。

RNA 結合蛋白質性分を含む発達のプロセスで重要です。セックス致死 (SXL)ショウジョウバエ蛋白質またはマスター セックス スイッチ蛋白質が存在しない、男性が女性にプレゼント。ウリジン豊富なシーケンスまたは体細胞1,2 の下流 mRNA ターゲット (トランスセックス致死男性固有の lethal2) で特定のスプライス部位に隣接するピリミジンの広大を認識します。 ,3,4。さらに、それは起こるサイトの初歩的な増強物(e(r)) 謄本5,6にウリジン リッチ起こるエンハンサー シーケンスに結合して切り替えを調整します。SXL 可能性が調節することを残る女性の生殖で追加のターゲット識別1,7,8,9,1011,12,13

通常、結合部位の特性変異原性, たとえば、削除や単一または複数のヌクレオチドの置換します。野生型 RNA 配列を基準にして各変異体の結合サイトが分析され、その結合親和性を決定するタンパク質濃度の一連を使用して (Kdまたは平衡解離定数); 興味の蛋白質のKdは 50 %rna 結合を取得するために必要な蛋白です。詳細な突然変異のこの労働集約的なプロセスを含む多数の突然変異体の生成・解析-3 つの野生型ヌクレオチド結合部位の各位置のため。従って、RNA に蛋白質の結合サイトの高速、簡単、安価な飽和突然変異導入の代替アプローチの必要性があります。

ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

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Protocol

注:図 1ホスホロチオエート変異の概要し、プロセスの主な手順の概要を示します。

1. 突然変異体のライブラリの生成 — 野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピング

  1. T7 プライマーを合成 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') DNA のシンセサイザーに化学合成によって。
  2. タンパク質の結合部位に対応する DNA シンセサイザーに化学合成によるドープしたオリゴヌクレオチド (相補鎖) を合成します。化学合成の中に野生型ヌクレオチド (この比率の詳細について代表的な結果を参照) としての比 90% は野生型ヌクレオチドと 10 %t のドーピング (以下 X) の各サイトの phosphoramidites の適切な混合物を使用します。
    注: ここでは、ドープされたオリゴヌクレオチドのシーケンスは 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'。下線付きのシーケンスは SXL タンパク質結合部位、プラスの荷重コントロールがあることと同様、バインド、RNA ではすべての変更に影響を与えることを確認する便利なコントロールを提供するヌクレオチド結合部位外の逆の補数ヌクレオチド結合部位内の正規化と比較。SXL バインド サイト シーケンストランスmRNA14,15,16,17に存在する UUUUUGUUGUUUUUUUU は、提案された方法論を考案する使用されました。イタリック体でシーケンスは T7 プライマー シーケンスに補足で、T7 プロモーターの in vitro転写に。

2. RNA の合成

  1. 上記18としての 20 μ L 転写反応に RNA を合成します。
    1. 1 μ M が 1 mM 10 mM ジチオトレイトール (DTT) 2 mM GTP、オリゴヌクレオチドをドープしたミックス T7 転写バッファーと 1 μ M T7 オリゴヌクレオチド、2 U/μ L T7 RNA ポリメラーゼと UTP (グアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジン三リン酸)、CTP、ATP。
    2. 追加には、2 つの独立した遠心管 0.167 mM α チオ ATP または 0.05 mM α-チオ UTP Rna にホスホロチオエート (図 2の回路図を参照してください) を組み込む。
      注: 代わりとなる議定書ドープしたオリゴヌクレオチド ヌクレオチド置換を残りの 2 つのテストを含む適切な転写反応に 0.2 mM α チオ CTP または 0.2 mM α チオ GTP を追加します。
    3. 37 ° C で 2 時間 RNA 合成反応混合物を孵化させなさい
  2. RNA のサンプルに 2.5 μ L, 易熱性アルカリフォスファターゼと 2.5 μ L 10xphosphatase バッファーを追加します。この 25 μ L 反応 5' 隣酸塩を削除する 37 ° C で 10-30 分間インキュベートします。
  3. 2-5 分で 80 ° C に加熱することによりアルカリフォスファターゼ酵素を不活性化します。
  4. 脱燐酸化された RNA の 5' 末端を特に (5 pmole) 1 μ L T4 ポリヌクレオチド キナーゼと 1 μ L γ-32P ATP 10 μ L 反応量を使用しています。37 ° C で 30-60 分のための反作用の組合せを孵化させなさい
  5. 20-30 分の 65 ° C で加熱による T4 ポリヌクレオチド キナーゼ酵素を不活性化します。
  6. ゲルは、10% 変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって RNA を浄化します。オートラジオグラフィーによるゲルで RNA を探します。標識 RNA を含むゲルのスライスを消費税、ピペット チップの壁に対して押すことによって微量遠心チューブにつぶす、プロテイナーゼ K (PK) バッファー (100 mM トリス、pH 7.5、12.5 ミリメートルの EDTA、150 mM 1% ドデシル硫酸ナトリウム, 塩化ナトリウム) に浸します。一晩に 2 h から室温でチューブを回転させます。
  7. 遠心分離機のゲル スラリー、ゲルを破棄し、緩衝液を収集します。
  8. フェノール-クロロホルムの等量で二回とクロロホルムのソリューションを展開し、水性相を収集します。
  9. 水相 0.1 容積 3 M 酢酸ナトリウム、pH が 5.2、キャリアに追加 tRNA またはグリコーゲンおよび 2.5 量のエタノール。-80 ° C 1 時間でサンプルをしてください。
  10. 16,873 x gで高速遠心機で 5-10 分のサンプルを遠心します。RNA の餌を乱すことがなくバッファー/エタノール溶液を慎重に削除します。
  11. 70% エタノールでペレットを洗浄し、慎重に 2-5 分削除エタノールの遠心分離機します。空気でペレットを乾燥させます。
  12. 20-50 μ L ジエチルエステル (DEPC) でペレットを再懸濁します-処理水。使用するまで-20 ° C で保存します。
    注: 放射能から保護するために適切な予防措置とプレキシ ガラスの盾を使用して標識 RNA をすべての手順を実行します。現在、スピン列は、RNA のゲルの浄化方法として一般的に使用される、削除するより便利な法人放射能です。

3. 蛋白反応と結合した RNA の分離を結合

  1. 組換え蛋白質の表現そしてエシェリヒア属大腸菌から浄化します。
  2. 吸光光度法または知られていた蛋白質標準、ウシ血清アルブミン (BSA) の横にある SDS ポリアクリルアミドのゲルの分離による組換え蛋白質濃度を推定します。Coomassie ブリリアント ブルー R-250 とゲルの汚損によって興味および標準の BSA の蛋白質を視覚化します。同じゲルで BSA 希釈の知られている量と比較してタンパク質量的に表わします。
    注: 保存組換え蛋白質 - 80 ° C まで使用と希釈で 20 mM の 4-(2-ヒドロキシエチル) ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES)、pH 8.0、1 mM ジチオトレイトール (DTT) 0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、0.05% 20% グリセロール、NP 40。使用 0.5-1.0 mM プロテアーゼ阻害剤 phenylmethane フッ素 (PMSF) は省略可能です。
  3. 10 mM トリス-HCl、pH 7.5 に RNA 結合反応 (20-100 μ L) を実行、ウシ血清アルブミン、1 mM EDTA、0.15 μ g/μ L に 0.09 μ g/μ L がアセチル化 50 mM 0.5 単位/μ L RNase 阻害剤、KCl は 1 mM DTT、tRNA、5' 末端標識 RNA および (適切な濃度の 6 μ LRNA の 〜 50% が蛋白質に結合する濃度) 蛋白質の。
    注: この結合バッファーは、3 つの RNA-結合蛋白質 (U2AF65SXL と PTB) が興味の蛋白質のために標準化する必要があります。約 50% を取得するために必要な特定の蛋白質の準備のため様々 な希薄を使用して経験的にタンパク質濃度を推定 RNA 結合。この条件またはKdは、RNA 結合曲線の最も敏感な部分を表します。
  4. 20-30 分 (または氷の上) 25 ° C での蛋白質の結合の反作用を孵化させなさい。
  5. 2 つの方法のいずれかを使用して非連結分数から蛋白結合 RNA 画分を分離します。
    1. 硝酸セルロース フィルター結合
      1. 結合の反作用 (20-100 μ L) を常温で真空マニホールドに接続されている硝酸セルロース フィルターに適用されます。
        注: RNA 蛋白質の複合体だけフィルターに保持され、フィルターを通して RNA フローを連結しました。フィルター結合アプローチ結合した RNA の高い回復できより速く、簡単に、ゲルの移動性シフト試金と比較しています。硝酸セルロース フィルターの下に DEAE 膜を置くことによってまた非連結の RNA の一部分を収集したり、無料の RNA 連結の割合との比較することが可能としてます。
      2. 剰余を含む硝酸セルロース フィルターの部分のカット微量遠心チューブに収まるように小さな断片に放射性 RNA フィルター部分を没頭する十分な PK バッファー (300-500 μ L 含む 10-20 μ g PK) に浸漬し、フィルターから RNA を溶出2-3 時間または一晩。
      3. フェノール-クロロホルム、クロロホルムで抽出し、水性相を収集します。酢酸ナトリウムとエタノールを追加、遠心分離機の冷凍庫に潜伏後、洗って、乾かし、DEPC 処理水に RNA を再懸濁します。この手順では、2.10 に 2.14 上記の手順で説明するようします。
    2. ゲルの移動性シフト
      1. 準備し、5% のネイティブ ポリアクリルアミドゲルの重合 (60: 1 Acrylamide:bis-アクリルアミド) 0.5 でフィルター結合法に代わるものとして結合の反作用を開始する前に x TBE (標準 Tris ホウ酸 EDTA バッファー)。
      2. 中古冷蔵室 (4 ° C) で 250 V で 15 分のためのゲルを実行します。
      3. 上記実行前ゲルの別の井戸に各結合の反作用 (上記) をロードします。
        注: タンパク質ストレージ バッファーは井戸にサンプル読み込みの十分なグリセロールを提供します。
      4. 蛋白結合 RNA を電気泳動に特定の蛋白質と RNA のサイズに応じて、1 ~ 2 時間 250 V で冷蔵室で区切ります。
      5. オートラジオグラフィーによるゲルの RNA 蛋白質の複合体の位置を探します。RNA 蛋白質の複合体を含むゲルのスライスを切除します。ゲルのスライスを粉砕し、PK バッファーに浸漬でゲルのスライスからの RNA を溶出します。
      6. フェノール-クロロホルム、クロロホルムで抽出し、水性相を収集します。酢酸ナトリウムとエタノールを追加、冷凍庫に潜伏後遠心分離、洗浄、乾燥、空気、DEPC 処理水に RNA を再懸濁します。この手順では、2.10 に 2.14 上記の手順で説明するようします。

4. 変異塩基位置の検出のためのヨウ素切断ホスホロチオエート製品の分析

  1. 1 mM ヨウ素を加えて 20 μ L の DEPC 処理水最大 10 μ g のキャリアを含む tRNA Rna (連結および総 Rna) ホスホロチオエート結合部位で切断します。5 分間室温でインキュベートします。
    注: ヨウ素をわずかに異なる条件詳細-7% (v/v) iodoethanol、3 分 95 ° C で加熱、ギッシュ ・ エクスタイン 198819で見つけることができます。
  2. 前述のようにナトリウム酢酸・ エタノールを追加することによって切断 RNA を沈殿させます。変性ゲルのローディングの染料に再懸濁します。15-20% の変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって RNA 断片を分離するサンプルを読み込むし、熱します。
  3. X 線フィルムに電気泳動法を公開します。
  4. オートラジオグラフィーを用いた総プールと連結の割合でバンドを検出します。
    注: は、排気フードにヨウ素すべて手順を実行します。ここに示す RNA 分離、くさび状のゲルを採用、ゲルの下部に余分なインチの長さのスペーサーを挿入することによりゲル板の下部に両方のスペーサーの厚さを倍増によって達成され。この図形より均一または近い間隔短い RNA フラグメントことができます。また、検出と放射能の定量分析のため、x 線フィルムではなく、phosphorimager を使用できます。

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Representative Results

ドーピングを使用して飽和突然変異導入の原理:

野生型および他のヌクレオチドの適切なモル比、1 つの位置だけの分析対象とする場合、すべての 4 つのヌクレオチドの等量混合物を使用します。ただし、同時に複数のポジションを分析、野生型のヌクレオチドに非野生型の比率が調整必要があります、すなわち、減少します。そうでなければが必要な単一の置換だけでなくがもあります単一ヌクレオチド置換の効果の解析を排除、分子に複数の野生型ヌクレオチドを含むテンプレート。したがって、親指のルールとして使用率 1/n の野生型ヌクレオチドに非野生型の n は分析する位置の数。ここでは、私たち 10 の位置も同時に解析し、野生型のヌクレオチドの 90% および野生型ヌクレオチド DNA のテンプレートをドーピングのための 10% を含む混合物を使用します。4 ホスホロチオエートのいずれかで各転写反応を実行する別の転写反応が行われます。したがって、各反応は、ドープした位置特定のヌクレオチドを監視します。

干渉による分割の原則:

ここで紹介した突然変異誘発アプローチ、Rna である平均分子あたり 1 つ未満のホスホロチオエート残渣バインディング、蛋白結合率と非連結分数間に RNA 分子のパーティションの過程。ホスホロチオエート結合する特定のヌクレオチドをリンクすると、ホスホロチオエート バックボーン リンケージの胸の谷間はその位置にある特定のヌクレオチドの存在の読み出し。見込まれること、任意の所定の位置にヌクレオチドが変更されたときそれがいずれもバインディングに影響あるかもしれない部分的または完全に、それは、バインディングを阻害する可能性が。特定塩基の存在にバインドの効果がない場合、タンパク質連結および非連結の分数の間同様にパーティション分割されます。ただし、特定の位置で特定のヌクレオチドに結合する蛋白質と干渉する場合優先的に蛋白結合率から除外されます。干渉の程度は、それぞれのゲルの電気泳動は、次同じ反応でポジションの定量的監視できます。概略図 (図 3) には、この概念を示します。総 RNA 画分 (車線 T)、バンドの強度はすべてのドープのポジション (1、3-7 のバンド) のためほぼ同じです。蛋白結合 RNA 画分 (レーン B)、1、4、および 7 の位置で、ヌクレオチドにはバインドの効果はありません。しかし、3 と 6 の位置でバインドに干渉する、従って連結の一部から除外されています。5 の位置には干渉がないです。したがって、すべての 4 つのヌクレオチドの分析、4 ペアの車線、T および B 各ヌクレオチドのための比較ができます。それはする必要がありますその野生型ヌクレオチドを指摘あれば、蛋白質の結合の RNA バックボーンにおける硫黄の与えられた位置効果を反映しています。

付属オートラジオグラフィー (図 4) では、レーン (総プールの T) とバインドされた分数 B 変化のゲルからの 2 つのペア (α チオ A と α チオ U) を示しています。各位置 (T および B) の車線の各ペアの間でバンドの強度を比較することによっていくつかの観測が可能です。まず、信号の大半はすなわち、分解されていない製品のため、両方の α-チオのゲルの上のレーンと α チオ U レーン。第二に、α チオ A ペア車線でいくつかバンド (ヨウ素開裂製品) は、バインドおよび総 RNA 画分たとえば、1 倍を超えるバンド間で同一α チオ レーンのバインディング サイト内で関連性の高いバンドは、参考のため番号が付けられます。第三に、ゲルの下にバンドはより密接に間隔 (例えば、 6 以下のバンド) の配列のゲルのために通常よりも。第四に、いくつかのバンドは、総 RNA 画分に存在が欠席またはバインドされた RNA 画分 (例えばバンド 1、2、3、および 5) に大幅に削減。第五に、α チオ U レーン ペアのほとんどのバンド合計とバインドされた車線の間に匹敵するいくつかのバンドはありません連結率 (例えばバンド 7 および 8) に比較的薄く。

これらの観察は、この新しいメソッドの次の結論につながる開発に成功の証拠を提供: 最初に、α チオ A ペア レーンと α チオ U RNA のほとんどが切断から車線をペアの提供して証拠のほんの一部だけRNA が含まれている変更またはホスホロチオエート残留。それを確認する RNA 分子が 2 つ以上ホスホロチオエート残基を含むために、これは重要です。Α チオ A と α チオ U のための 2 つの車線間の結合部位の外のいくつかのバンドの 2 番目、同一又は類似の強度は、読み込みが両方の車線、車線の間の簡単な比較を許可するために対等であることを示しています。Α チオ A と α チオ U (上部に薄く、下部に厚い) ゲルのウェッジ形状によってこうして長いシーケンス リードの分析を許可してより高い解像度を提供しているため、第三より密接に間隔をあけられたバンドを実現します。通常、短いフラグメントは均一な厚みを持つゲルの間隔より広く。第四に、消失またはバインドされた一部の特定のバンドの減らされた強度、非野生型ヌクレオチドは連結成分 (α-チオ A) から優先的に除外されることを示します。バインドされた車線内で別のバンドの相対的強度も異なる場所で野生型残基からの干渉の程度についての定量的な情報を提供しています。つまり、変異体または特定の位置からの野生型ヌクレオチドが蛋白質の結合を妨げます。最後に、バックボーン硫黄置換 (ホスホロチオエート) 効果をテスト非架橋酸素 (α チオ U) の一つで、3 つのポジションがバックボーン硫黄 (例えば6、7、7 以下) からのマイナーな効果を示すことを示します。私達の結合された結果を示す結合サイト内のいくつかの位置優遇の消失を示す減らしたり、バインドされている割合の特定のバンドの強度。バックボーンよりもむしろベースの置換、結合部位 (α チオ A) で特定の拠点を持つ蛋白質の相互作用を示すためです。一方、α チオ C 定款を示します干渉パターン α チオ A. に匹敵します。3-4 α チオ G 置換のみを示す小さなしかし、検出可能な干渉を中心としたたとえば、位置番号 2 と 3 (データは示されていない)。このメソッドは、明確な方法15 で SXL のスプライシングのリプレッサーと一般的なスプライシング因子 U2 snRNP 補助因子 (U2AF65) 同じ mRNA スプライシング シグナル シーケンス (polypyrimidine 道) にバインドする方法の違いを明らかにする使用されています.

Figure 1
図 1: キーのフローチャート手順ホスホロチオエート変異 (PTM).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: スケマティク ホスホロチオエート結合ヨウ素によって化学的に切断することができます 2 つのヌクレオチド間の。硫黄は、リン酸塩の非架橋酸素の 1 つを置き換えます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 干渉による分割の原則です。仮説的な RNA にはタンパク質結合部位を含む六つのポジションで代表的な α-チオ ヌクレオチドが含まれます。次の蛋白結合ヨウ素によって、RNA はホスホロチオエート結合部位で切断され。結合部位周囲の位置 1-7 任意のテキスト参照番号が付きます。位置 2 または不足しているバンドを表さないホスホロチオエート定款又は非ドープのヌクレオチド。レーン T は総 RNA とレーン B 蛋白結合 RNA であります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: ホスホロチオエート変異 (PTM) により飽和突然変異誘発 polypyrimidine 管/3 ' スプライス サイトトランスmRNA に存在。レーン T は総 RNA とレーン B 蛋白結合 RNA であります。Α-チオ表します RNA は α チオ ATP の存在下で合成し、シーケンスにおけるドープされた位置 α チオ adenosines とを識別します。3 つの強力なバンドは、それらの位置の順序で adenosines に対応します。Α チオ U は α チオ UTP の存在下で合成した RNA を表し、ドープされた位置、シーケンスを含むすべての uridines を識別します。左側の垂直線は、SXL の結合部位をマークします。結合部位内の位置 1-8 は、参照目的のため、結果のセクションでの説明の容易にするために番号が付けられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

変異は蛋白質の結合サイトを特徴付けるため長い間使用されています。まず、一連の変異型を構築し、結合の結合親和性に及ぼす影響を分析するアッセイで個別にテストできます。複数のステップ変異体を構築する一連の各変異体の反応をバインディングの実行など、標準的なアプローチに関連するかどうかは面倒で時間がかかるかどうか、およびことができない標準的な突然変異手法では、複数のシーケンスを分析する方法を提供しています、特に長いシーケンスのための飽和突然変異導入を許可します。第二に、シーケンスをランダム化できるし、プールにバインドおよびポリメラーゼの連鎖反応の複数のサイクル (pcr) 使用されます。蛋白質を結合するこれらのシーケンスでお越しの際にも複製し塩基配列を解読し、コンセンサス シーケンスから結合部位を検証します。それにもかかわらず、この反復バインディングと増幅オプションは複数のステップが含まれます、結合部位に重要な残基を識別するに骨の折れる。また、シーケンスの繰り返し増幅 PCR に固有シーケンス バイアスが生じる。第三に、ランダムのプールから選択されたシーケンスは、比較的高価だが高スループットがシーケンス処理の高速化オプションを使用して配置できます。したがって、複数のステップ、骨の折れるおよび/または高価な方法のこれらの制限を克服するために考案した高速、安価な最も重要なシングル ・ ステップ方法結合部位 (PTM) の飽和突然変異導入を達成するために、ここで説明します。

この方法ではキーの手順には、身分証明書または非野生型 nucleotide(s) のタグが含まれます。記載されている (図 2) ホスホロチオエート核酸、リン酸塩の酸素の 1 つのバックボーンは、硫黄に置き換えられますを使いました。利点は、ホスホロチオエート ヌクレオチドのバックボーンを化学的に分解するヨウ素が使えることです。したがって、ホスホロチオエート バックボーンを含む RNA 基板のヨウ素胸の谷間は、シーケンス型のはしご、胸の谷間のサイトがプロキシまたは 4 つの存在のためのタグはその位置にある拠点を生成します。非連結コントロールと総分数の比較は、連結部分から優先的に除外されます、したがってタンパク質結合に重要な残基を識別します。対照的に、バインディングの重要ではない残基のまま 2 つの分数の間に均等に分散。この方法は、任意の RNA 結合タンパク質の結合部位を定義する使用できます。

要約すると、彩度このワンステップ変異アプローチで、ドーピング、およびヨウ素胸の谷間を組み合わせることは、RNA の結合部位の特性評価のための強力な手段を提供しています。ただし、このアプローチは結合部位が変異する前にすでに知られていることが必要です。さらに、蛋白質の結合条件は各蛋白質のために最適化された必要があります。次の注意事項は強調する必要があります。手袋、ソリューションとオートクレーブ滅菌ピペット チップ、チューブ、DEPC 処理水のバッファーの準備と RNA のための機器を捧げてだけ RNAses を避けるために使用など、RNA の取り扱い上の注意を行使しなければなりません。同様に、放射性の盾、放射性放射性物質の使用が不可欠である中に、監視を含むと有害化学物質の使用中排気フードの使用が必要です。

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Disclosures

著者は、競合する金銭的な利益を宣言していません。

Acknowledgments

著者は過去の資金調達のための健康の国民の協会のおかげで、マイケル ・ r. グリーンのオリゴヌクレオチドを合成をありがちましょう。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

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References

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