Alginate/जिलेटिन Hydrogel 3d इन विट्रो मॉडल सिस्टम प्रेरित सेल अंडाकार आकृति गठन

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Bioengineering

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Summary

हम एक विषम स्तन कैंसर अमर ट्यूमर और fibroblast कोशिकाओं को एक में एंबेडेड के साथ मिलकर मॉडल विकसित एक alginate/ मॉडल vivo ट्यूमर microenvironment में recapitulates और कोशिकीय ट्यूमर spheroids के गठन की सुविधा, tumorigenesis ड्राइविंग तंत्र में अंतर्दृष्टि उपज ।

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Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

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Abstract

सेलुलर, जैव रासायनिक, और देशी ट्यूमर microenvironment के भौतिक विविधता बढ़ती अमर कैंसर कोशिका लाइनों पारंपरिक दो आयामी (2d) सेल संस्कृति का उपयोग करके recapitulated नहीं है । इन चुनौतियों का उपयोग करने के लिए विषम तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर मॉडल जिससे कोशिकाओं के विभिंन प्रकार एंबेडेड है का निर्माण करने के लिए तकनीक का प्रयोग करके दूर किया जा सकता है । Alginate और जिलेटिन की दो सबसे आम उनके की वजह से उनकी असंगति, नकल, और यांत्रिक गुणों के कारण प्रिंटिंग में कार्यरत माल है । दो पॉलिमर के संयोजन से, हम एक देशी ट्यूमर स्ट्रोमा की सूक्ष्म वास्तुकला के लिए समानता के साथ एक विमुद्रित समग्र hydrogel हासिल की । हम rheology के माध्यम से समग्र hydrogel के मुद्रण का अध्ययन किया और इष्टतम मुद्रण खिड़की प्राप्त की । स्तन कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts hydrogels में एंबेडेड और एक 3 डी vivo microenvironment में नकल उतार मॉडल बनाने के लिए मुद्रित किया गया । विमुद्रित विषम मॉडल लंबी अवधि के सेल संस्कृति के लिए एक उच्च व्यवहार्यता प्राप्त (> 30 दिन) और कोशिकीय ट्यूमर spheroids (MCTS) में स्तन कैंसर की कोशिकाओं की आत्म विधानसभा को बढ़ावा देता है । हम इस मॉडल में MCTS के साथ प्रवास और कैंसर से जुड़े fibroblast कोशिकाओं (CAFs) की बातचीत मनाया । सह संस्कृति प्रणालियों के रूप में मुद्रित सेल संस्कृति प्लेटफार्मों का उपयोग करके, यह स्ट्रोमा संरचना पर tumorigenesis की निर्भरता का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है । इस तकनीक के एक उच्च प्रवाह, कम लागत, और उच्च reproducibility सुविधाएं, और यह भी पारंपरिक कोशिका monolayer संस्कृतियों और पशु ट्यूमर मॉडल के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करने के लिए कैंसर जीवविज्ञान का अध्ययन कर सकते हैं ।

Introduction

हालांकि 2d सेल संस्कृति व्यापक रूप से कैंसर अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, सीमाओं के रूप में कोशिकाओं को पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की एक समान एकाग्रता के साथ एक monolayer प्रारूप में हो रहे है मौजूद हैं । इन संस्कृतियों में महत्वपूर्ण कोशिका-कोशिका और कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत में मौजूद देशी ट्यूमर microenvironment (टीएमई) का अभाव है. नतीजतन, इन मॉडलों खराब दोहराऊंगा शारीरिक स्थितियों, ंयायपालिका सेल व्यवहार में जिसके परिणामस्वरूप, अप्राकृतिक morphologies सहित, अनियमित रिसेप्टर संगठन, झिल्ली ध्रुवीकरण, और असामांय जीन अभिव्यक्ति, अंय के अलावा अटी,,,. दूसरी ओर, 3d सेल संस्कृति, जहां कोशिकाओं समुच्चय, spheroids, या organoids के रूप में एक volumetric अंतरिक्ष में विस्तारित कर रहे हैं, एक वैकल्पिक तकनीक के लिए और अधिक सटीक बनाने के लिए इन विट्रो वातावरण में मौलिक कोशिका जीवविज्ञान और फिजियोलॉजी अध्ययन प्रदान करता है । 3d सेल कल्चर मॉडल्स भी सेल-ECM इंटरैक्शन को प्रोत्साहित कर सकते हैं जो कि इन विट्रो1,4,5में देशी टीएमई की महत्वपूर्ण शारीरिक विशेषताएँ हैं. उभरते 3d प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी विषम टीएमई की नकल करने वाले मॉडलों का निर्माण करने की संभावनाएं प्रदान करती है ।

3 डी प्रिंटिंग रैपिड प्रोटोटाइप से ली गई है और 3 डी microstructures के निर्माण के लिए सक्षम है कि जीवित ऊतक नमूने6,7की जटिलताओं के कुछ नकल उतारने में सक्षम हैं । वर्तमान inkjet, बाहर निकालना, और लेजर की सहायता से प्रिंटिंग8मुद्रण विधियों में शामिल हैं । उनमें से, बाहर निकालना विधि विविधता मुद्रित मैट्रिक्स के भीतर ठीक अलग प्रारंभिक स्थानों पर सामग्री के विभिंन प्रकार की स्थिति द्वारा नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसलिए, यह सबसे अच्छा तरीका है इन विट्रो कोशिकाओं या मैट्रिक्स के कई प्रकार के शामिल मॉडल में विषम बनाना है । बाहर निकालना auricular के आकार का पाड़9बनाने के लिए सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया है, संवहनी संरचनाओं10,11,12, और त्वचा के ऊतकों13, उच्च मुद्रण निष्ठा और सेल में जिसके परिणामस्वरूप व्यवहार्यता. प्रौद्योगिकी भी बहुमुखी सामग्री चयन सुविधाएं, एक ज्ञात घनत्व के साथ एंबेडेड कोशिकाओं के साथ सामग्री जमा करने की क्षमता, और उच्च reproducibility14,15,16,17 . प्राकृतिक और सिंथेटिक hydrogels अक्सर 3 डी उनके के लिए अपनी असंगति के कारण प्रिंटिंग के लिए स्याही के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, और उनके हाइड्रोफिलिक नेटवर्क है कि संरचनात्मक रूप से ECM7,18 के समान इंजीनियर जा सकता है ,19,20,21,22,23. Hydrogels भी लाभप्रद के बाद से वे कोशिकाओं के लिए चिपकने वाली साइटों, संरचनात्मक तत्वों, पोषक तत्वों और गैसों के लिए पारगम्यता शामिल कर सकते हैं, और उपयुक्त यांत्रिक गुण सेल विकास24को प्रोत्साहित करने के लिए कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, कोलेजन hydrogels प्रस्ताव integrin anchorage साइटों है कि कोशिकाओं का उपयोग कर सकते है मैट्रिक्स को देते हैं । जिलेटिन, विकृत कोलेजन, इसी तरह के सेल आसंजन साइटों को बरकरार रखे हुए है । इसके विपरीत, alginate निष्क्रिय है, लेकिन divalent आयनों25,26,27,28के साथ crosslinks बनाने के द्वारा यांत्रिक अखंडता प्रदान करता है ।

इस काम में, हम एक bioink के रूप में एक समग्र hydrogel विकसित की है, alginate और जिलेटिन के शामिल, एक देशी ट्यूमर स्ट्रोमा की सूक्ष्म वास्तुकला को समानता के साथ । स्तन कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts hydrogels में एंबेडेड और एक बाहर निकालना आधारित के माध्यम से मुद्रित किया गया एक 3 डी मॉडल है कि vivo microenvironment में नकल करता है बनाने के लिए । इंजीनियर 3 डी वातावरण कैंसर की कोशिकाओं को सेल संस्कृति की लंबी अवधि के लिए एक उच्च व्यवहार्यता के साथ कोशिकीय ट्यूमर spheroids (MCTS) फार्म की अनुमति देता है (> 30 दिन) । इस प्रोटोकॉल synthesizing समग्र hydrogels के तरीके को दर्शाता है, निस्र्पक सामग्री microstructure और मुद्रण, प्रिंटिंग सेलुलर विषम मॉडल, और MCTS के गठन देख । इन तरीकों को बाहर निकालना में अंय स्याही के रूप में अच्छी तरह के रूप में दवा स्क्रीनिंग, सेल प्रवास परख में संभावित अनुप्रयोगों के साथ विषम ऊतक मॉडल के विभिंन डिजाइनों के लिए लागू किया जा सकता है, और अध्ययन है कि मौलिक सेल पर ध्यान केंद्रित शारीरिक कार्य करता है ।

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Protocol

1. सामग्री, Hydrogel, और सेल संस्कृति सामग्री की तैयारी

  1. सामग्री और समाधान की तैयारी
    1. धो और सूखी २५० मिलीलीटर और १०० मिलीलीटर ग्लास यूरिन, चुंबकीय सरगर्मियों, spatulas, 10 मिलीलीटर कारतूस, 25 ग्राम बेलनाकार नलिका (०.५ की लंबाई के साथ और एक भीतरी व्यास २५० µm) । १२१ ° c/15 min/1 atm पर autoclaving करके सामग्री को निष्फल करें । उपयोग करने तक बाँझ शर्तों के तहत सामग्री रखें.
      नोट: विक्रेता जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    2. alginate के 3 जी वजन (3% डब्ल्यू/वी) और 7 जिलेटिन की जी (7% डब्ल्यू/वी) (चिह्नित के रूप में A3G7 के बाद) ।
    3. alginate और जिलेटिन पाउडर, आयल फिल्म, 5 सेमी2के एल्यूमीनियम पंनी टुकड़े, और 1 मिलीलीटर और 5 मिलीलीटर सीरिंज: कम से 4 एच के लिए यूवी प्रकाश के तहत निंनलिखित मदों निष्फल । अंत टोपियां, टिप टोपियां, और पिस्टन उंहें ७०% इथेनॉल में कम से 4 ज के लिए विसर्जित और उंहें निष्फल अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ 2x धोने के द्वारा निष्फल ।
      नोट: विक्रेता जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    4. अति शुद्ध पानी के साथ agarose के 4 जी भंग और autoclaving द्वारा यह निष्फल ।
      नोट: autoclaving प्रक्रिया के बाद agarose पूरी तरह से घुल गई है ।
    5. निर्जल कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) के एक १०० mM समाधान में निष्फल अल्ट्रा-शुद्ध पानी और एक बाँझ फिल्टर (०.२२ µm का एक ताकना आकार के साथ) का उपयोग करने से पहले तैयार करें ।
    6. agarose के लिए-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटें, एक माइक्रोवेव में बाँझ agarose पिघल एक तरल समाधान प्राप्त करने के लिए; फिर, एक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के तहत और एक 1 मिलीलीटर micropipette का उपयोग कर, अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर जोड़ें और यह अच्छी तरह से नीचे में एक समान परत बनाने के लिए धीरे से मिश्रण । छोड़ो ठंडा करने के लिए और तेल फिल्म के साथ अच्छी तरह से सील । यह कमरे के तापमान पर रखें (आरटी) उपयोग तक ।
  2. A3G7 hydrogel के प्रणेता की तैयारी
    1. एक बीएससी के भीतर २५० मिलीलीटर यूरिन में alginate और 7 ग्राम जिलेटिन पावडर के 3 ग्राम मिलाएं । एक चुंबकीय सरगर्मी और DPBS के १०० मिलीलीटर जोड़ें । संक्रमण से बचने के लिए बाँझ तेल फिल्म और एल्यूमीनियम पंनी (5 सेमी2) के साथ चोंच सील ।
    2. 1 एच के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर और आरटी पर एक अतिरिक्त 2 एच के लिए ६०० rpm के साथ एक चुंबकीय/गर्म थाली में एक निरंतर आंदोलन के तहत चूर्ण को भंग ।
    3. ३७ ° c पर सामग्री गर्मी जब तक जेल तरल राज्य के लिए एक चरण संक्रमण (स्टॉक जेल समाधान के १०० मिलीलीटर के लिए, यह लगभग ४५ मिनट लेता है) । समाधान बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों में स्थानांतरण, उन्हें सील, और सामग्री से किसी भी गैस बुलबुले को समाप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए ८३४ x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
    4. 10 एमएल सीरिंज में hydrogel के प्रणेता को महाप्राण । टोपियां और आयल फिल्म के साथ सीरिंज सील । उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक स्टोर ।
  3. सेल संस्कृति
    नोट: इस खंड में दिए चरणों बाँझ स्थितियों के अंतर्गत किया जाना चाहिए ।
    1. इस प्रकार के रूप में बेसल DMEM माध्यम तैयार (1 एल के लिए): एक बीएससी में, मिश्रण १०० भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 10 मिलीलीटर के साथ एक एंटीबायोटिक/antimycotic समाधान (एक 100x स्थिर समाधान) एक ताजा बाँझ कंटेनर में । मिश्रण को १,००० मिलीलीटर तक समायोजित करने के लिए DMEM मध्यम जोड़ें । कंटेनर को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
    2. एक पहले गर्म पानी स्नान में (३७ डिग्री सेल्सियस), एमडीए की 1 शीशी-एमबी-२३१-GFP (मानव स्तन कैंसर सेल लाइन GFP-लेबल, परमाणु स्थानीयकरण) और स्पैक्ट्रम की 1 शीशी-९०-mCherry (कैंसर से जुड़े fibroblast सेल लाइनों mCherry-लेबल, cytoplasmic स्थानीयकरण के साथ ) तरल नाइट्रोजन भंडारण से कोशिकाओं को उन्हें धीरे से पानी में ले जाने से. दोनों कक्ष रेखाएं, और GFP और mCherry लेबलिंग के लिए plasmids, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
    3. स्थानान्तरण १६० µ l/सेल समाधान (3 x 106 सेल/एमएल) के एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में और गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) बेसल DMEM मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c/5% सह2 पर थाली मशीन 24-48 एच के लिए जब तक कोशिकाओं ८०% संगम तक पहुंचने ।
    4. कोशिकाओं के संगम तक पहुँचने के बाद, मध्यम त्यागें और DPBS के साथ दो बार कोशिकाओं कुल्ला; trypsin के ५०० µ एल के साथ कोशिकाओं की मशीन-EDTA समाधान/(०.२५%, 1x, पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म) ३७ ° c पर 6 मिनट के लिए । फिर, FBS के ५०० µ l को जोड़कर trypsin को निष्क्रिय करें, सेल सॉल्यूशन को पुनर्प्राप्त करें और इसे टी-७५ कुप्पी में स्थानांतरित करें । उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर फिर से मशीन/5% सह2 जब तक कोशिकाओं ८०% संगम तक पहुंचने ।
      नोट: trypsin-EDTA समाधान की मात्रा कोशिका-वृद्धि पोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
    5. 3-4 बीतने पर कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए पिछले चरण को दोहराएँ के रूप में है कि जब कोशिकाओं को और अधिक चयापचय गतिविधि और स्थिरता है.
    6. कोशिकाओं की गिनती एक trypan नीले परख (०.४%) का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की प्रारंभिक एकाग्रता निर्धारित करने के लिए hydrogel के साथ मिलाया जाएगा ।

2. Hydrogels के Rheological गुणों की माप

  1. alginate/जिलेटिन hydrogel प्रणेता चरण १.२ में वर्णित के रूप में तैयार करें ।
    नोट: यांत्रिक परीक्षण और विश्लेषण के लिए जनरेट किए गए नमूनों के लिए बाँझ शर्तों की आवश्यकता नहीं है. सभी rheological परीक्षण तपसिल में किया जाता है ।
  2. hydrogel अग्रदूत के एक सिरिंज ले लो और यह गर्म एक ३७ ° c पानी में स्नान के लिए 1 एच.
  3. rheometer पर चालू करें और निम्न चरणों के अनुसार सिस्टम प्रारंभ करें ।
    1. हवा कंप्रेसर rheometer से जुड़े पर बारी है और हवा कंप्रेसर rheometer के लिए तापमान नियंत्रण बॉक्स पर स्विच 30 मिनट के लिए चलाने के लिए, rheometer पर ही स्विच, और rheometer से जुड़े कंप्यूटर पर स्विच करते हैं ।
    2. rheometer सॉफ़्टवेयर खोलें, नियंत्रण कक्ष पर प्रारंभ करेंक्लिक करें, और प्रारंभिक प्रक्रिया समाप्त करने दें । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मंच तापमान नियंत्रण कक्ष पर सेट करें ।
    3. मापने के सेट टैब पर क्लिक करें और प्रारंभ सेवा समारोहमें नेविगेट, ड्रॉप-डाउन मेनू में ड्राइवर जड़ता समायोजित करें का चयन करें, और पॉप-अप विंडो में समायोजन शुरू क्लिक.
    4. rheometer में एक समानांतर मापने उपकरण माउंट । सभी प्रयोगों यहां प्रदर्शन प्लेटों के बीच एक 1 मिमी अंतराल के साथ एक 25 मिमी व्यास की थाली का उपयोग करें ।
    5. नियंत्रण कक्ष पर शूंय-अंतराल सेट करें क्लिक करके समाप्त करने के लिए प्रक्रिया के लिए प्रतीक्षा । इस प्रक्रिया के दौरान सामांय बल पर ध्यान देना ।
      नोट: इस कार्यविधि के बाद, सामान्य बल 0 होना चाहिए ।
    6. मापने के सेट टैब पर क्लिक करें और प्रारंभ सेवा समारोहमें नेविगेट, ऊपरी मापने प्रणाली जड़ता समायोजितकरें, और पॉप अप विंडो में समायोजन शुरू क्लिक करें चुनें । एक बार किया, नियंत्रण कक्ष पर त्रिकोण बटन पर क्लिक करने के लिए मापने के उपकरण को स्थानांतरित करने की अनुमति ।
  4. एक आयाम झाडू आचरण ।
    1. प्रारंभक्लिक करें, फिर शीर्ष मेनू में डालें क्लिक करें, ड्रॉप-डाउन मेनू से प्रतीक्षा करें चुनें । सेटअप विंडो खींचो और 2 घंटे के लिए प्रतीक्षा समय निर्धारित करें ।
      नोट: यह परीक्षण से पहले एक प्रतीक्षा कदम जोड़ देगा ।
    2. प्रारंभक्लिक करें, फिर संमिलित करें बटन को फिर से क्लिक करे, और ड्रॉप-डाउन मेनू से, डिवाइसचुनें । सेटअप खिड़की खींचो, तापमानका चयन करें, और यह 25 ° c होने के लिए सेट । प्रतीक्षा के बॉक्स को अनचेक करें जब तक मान तक नहीं पहुंच जाता
    3. चरण मापपर क्लिक करें, फिर चर दोलन तनावक्लिक करें, सेटअप विंडो को खींच, रैंप लघुगणकहोने के लिए प्रोफ़ाइल सेट, और प्रारंभिक तनाव और अंतिम तनाव के रूप में ०.००१% और १००% करने के लिए मान बदलने के लिए, क्रमशः. ०.०१ हर्ट्ज पर आवृत्ति सेट करें.
    4. तापमान चर जोड़ने के लिए जोड़ें बटन क्लिक करें । चर तापमान पर क्लिक करें और यह 25 ° c होने के लिए सेट । पुल-अप विंडो में, कैलकुलेटरका विस्तार, 10 अंक के लिए बिंदु घनत्व सेट/
    5. पानी के स्नान से बाहर सिरिंज ले लो और rheometer मंच पर अग्रदूत के लगभग ०.५ मिलीलीटर बाहर निकालना ।
    6. नियंत्रण कक्ष पर नीचे की ओर त्रिभुज बटन क्लिक करें । मापने के उपकरण के लिए प्रतीक्षा करने के लिए छंटनी की स्थिति के नीचे ले जाने के लिए ।
    7. एक रंग का प्रयोग करें किसी भी अतिरिक्त अग्रदूतों कि मापने के उपकरण के किनारे पर बच ट्रिम कर दीजिए और अनावश्यक सामग्री त्यागें ।
    8. पिपेट मापने के उपकरण के किनारे पर खनिज तेल और रुको जब तक तेल पूरी तरह से सीमा जवानों ।
    9. नियंत्रण कक्ष पर जारी रखेंक्लिक करें । फिर स्टार्ट बटन (हरा त्रिभुज) क्लिक करें, इसके बाद नीचे स्क्रीन पर जारी बटन पर क्लिक करके ।
    10. परीक्षण किया जाता है, मापने उपकरण छोड़ें, और उसके बाद नियंत्रण कक्ष पर ऊपर की ओर त्रिकोण बटन क्लिक करें । मापने के उपकरण निकालें और यह ७०% इथेनॉल के साथ साफ है । ७०% इथेनॉल के साथ मंच साफ ।
    11. वर्तमान प्रोजेक्ट में, चरण माप क्लिक करें और सेटअप विंडो को खींच । अब, १०० हर्ट्ज के लिए आवृत्ति सेट. अन्य सभी मापदंडों अपरिवर्तित रखें.
    12. दोहराएँ चरण 2.4.5-2.4.10.
    13. आरेखक्लिक करें । जी के वक्र निरीक्षण ', जी " बनाम दोलन तनाव । दोनों आवृत्तियों (०.०१ हर्ट्ज और १०० हर्ट्ज) के लिए जी के विक्षेपन अंक मिल. दोनों झुकाव अंक के लिए इसी दोलन उपभेदों खोजें ।
    14. छोटे दोलन तनाव चुनें और इसके बाद आयोजित सभी दोलन परीक्षण के लिए इस तनाव का 1/10 का उपयोग करें ।
      नोट: जी झुकाव की शुरुआत अंतिम रैखिक लोचदार तनाव (ULES) है कि अनुवर्ती परीक्षण में पार नहीं किया जाना चाहिए माना जाता है । अनुपात 1/10 आमतौर पर सुरक्षा कारणों के लिए इंजीनियरिंग में प्रयोग किया जाता है । यह गणना तनाव जीसीके रूप में चिह्नित है ।
    15. परीक्षण किया जाता है के बाद, तालिकाक्लिक करें, सभी डेटा की प्रतिलिपि बनाएं, और इसे किसी पाठ फ़ाइल में चिपकाएं ।
  5. एक तापमान झाडू आचरण ।
    1. क्लिक करें मेरे क्षुधा और टेम्पलेट तापमान रैंप का चयन करें , थरथरानवाला कतरनी: जमाना.
    2. प्रोजेक्ट का नाम ।
    3. कार्यप्रवाह में चरण माप क्लिक करें । फिर चर तापमानक्लिक करें, सेटअप खिड़की खींच, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः होने के लिए प्रारंभिक और अंतिम तापमान निर्धारित किया है ।
    4. pull-up विंडो में, दोलन दबाव ०.१%, दोलन आवृत्ति 1Hz करने के लिए सेट करें । उसके बाद डेटा बिंदुओं की संख्या सेट करने के लिए ६१ हो । डेटा संग्रह आवृत्ति को 1 पॉइंट/मिनट पर क्लिक करें कैलकुलेटर और सेट बिंदु घनत्व ०.२ डिग्री सेल्सियस/
      नोट: यह ०.२ डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से तापमान में परिवर्तन करने की अनुमति देगा ।
    5. नमूना rheometer प्लेटफ़ॉर्म पर लोड और चरणों का पालन करके परीक्षण निष्पादित करें 2.4.5-2.4.10 ।
    6. आरेखक्लिक करें, तापमान बनाम जी ', जी ' का निरीक्षण । ' जी और जी ' का क्रॉसओवर पॉइंट लगाएं । अंतरराष्ट्रीय बिंदु पर तापमान का पता लगाएं ।
      नोट: यह hydrogel प्रणेता के सोल/जेल संक्रमण तापमान है ।
    7. दोहराएँ चरण 2.4.15.
  6. एक इज़ोटेर्माल समय झाडू आचरण ।
    1. क्लिक करें मेरे apps और खोजें और क्लिक करें इज़ोटेर्माल समय-तापमान परीक्षणटेंपलेट । कार्यप्रवाह में चरण माप क्लिक करें, और उसके बाद चर दोलन दबावक्लिक करें, सेटअप विंडो को पुल, दोलन दबाव ०.१% करने के लिए सेट, और 1 हर्ट्ज के लिए दोलन आवृत्ति सेट । pull-up विंडो में, डेटा बिंदुओं की संख्या १२० करने के लिए सेट करें । डेटा संग्रह आवृत्ति सेट करने के लिए 1 बिंदु/
      नोट: इस तनाव के मूल्य आयाम झाडू से परिणामों पर आधारित है ।
    2. तापमान चर जोड़ने के लिए बटन जोड़ें क्लिक करें । मध्य विंडो में चर तापमान पर क्लिक करें और इसे 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ।
      1. दायां क्लिक करें चरण डिवाइस को वर्कफ़्लो में पॉइंट मापने के लिए ले जाएं , हटाएंक्लिक करें । उसके बाद चरण डिवाइस सेट मानक्लिक करें, मान तक पहुँच गया है, और 25 ° c करने के लिए मान सेट तक प्रतीक्षा करें । निचली स्क्रीन पर चित्र, गपशप, बटंस क्लिक करें, बॉक्स को अनचेक करना जारी रखें। फिर चरण प्रारंभक्लिक करें, प्रोजेक्ट का नाम और इसे सहेजें ।
    3. नमूना rheometer प्लेटफ़ॉर्म पर लोड और चरणों का पालन करके परीक्षण प्रारंभ करें 2.4.5-2.4.10 ।
    4. ' जी, जी ' बनाम समय का निरीक्षण करें । ' जी और जी ' का क्रॉसओवर पॉइंट लगाएं । क्रॉसओवर प्वाइंट पर समय का पता लगाएं । परीक्षण किया जाता है के बाद, तालिकाक्लिक करें, सभी डेटा की प्रतिलिपि बनाएं, और इसे किसी पाठ फ़ाइल में चिपकाएं ।
      नोट: यह सोल/जेल संक्रमण समय 25 डिग्री सेल्सियस पर hydrogel अग्रदूत साबित होता है ।
  7. विभिन्न बीच बढ़िया तालमेल समय पर उपज शक्ति को मापने ।
    1. मेरे ऐप्स क्लिक करें और ढूँढें और टेम्पलेट उपज और प्रवाह तनाव, जेल की तरहक्लिक करें । प्रोजेक्ट का नाम । कार्यप्रवाह में चरण प्रारंभ पर क्लिक करें. शीर्ष मेनू में डालें क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू में, प्रतीक्षाकरें चुनें. सेटअप विंडो खींचो और 20 मिनट के लिए इंतज़ार कर समय निर्धारित किया है ।
      नोट: यह परीक्षण से पहले एक प्रतीक्षा कदम जोड़ देगा ।
    2. प्रारंभक्लिक करें , फिर फिर से डालें क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू में, डिवाइसचुनें. सेटअप खिड़की खींचो, तापमान चुना है , और यह 25 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट । अचयनित बॉक्स मूल्य तक पहुंच गया है रुको
    3. कार्यप्रवाह में चरण माप क्लिक करें, चर कतरनी तनावका चयन, सेटअप खिड़की खींच, और 0 और १०,००० Pa, क्रमशः के लिए प्रारंभिक और अंतिम कतरनी तनाव सेट ।  कैलकुलेटर क्लिक करें, ०.२ बिंदु के लिए बिंदु घनत्व निर्धारित/ बाईं ओर डेटा पॉइंट्स टैब में, 1 पॉइंट/
      नोट: यह 5 फिलीस्तीनी अथॉरिटी की दर रैंप पर तनाव में परिणाम होगा/
    4. पुल-अप विंडो के निचले भाग पर इवेंट नियंत्रण टैब क्लिक करें, और रोक मापदंड सेट: कतरनी दर > १०० s-1यदि माप रोकें ।
      नोट: यह स्वचालित रूप से अगर सामग्री की उपज है माप बंद हो जाएगा ।
    5. नमूना rheometer प्लेटफ़ॉर्म पर लोड और चरणों का पालन करके परीक्षण प्रारंभ करें 2.4.5-2.4.10 ।
    6. आरेखक्लिक करें । तनाव की अवस्था का निरीक्षण । तनाव और उसके इसी दबाव के विक्षेपन बिंदु खोजें । चरण 2.7.2-2.7.6 दोहराएँ, लेकिन प्रतीक्षा समय 30, ४०, और ५० मिनट के लिए प्रत्येक प्रतिकृति के लिए परिवर्तित करें; इससे अलग बीच बढ़िया तालमेल समय पर यील्ड स्ट्रेंथ में परिणाम आएगा ।
      नोट: यह तनाव स्पष्ट उपज शक्ति के रूप में माना जाता है ।
      नोट: सॉफ्टवेयर क्लिकों rheometer मॉडल और सॉफ्टवेयर संस्करणों के द्वारा अलग कर सकते हैं । हम पाठकों की सलाह के लिए परीक्षण मानकों हम प्रदान के संदर्भ लेने के लिए, जबकि व्यावहारिक उपयोग में विशिष्ट rheometer/
       

3. पाड़ डिजाइन, सेल लादेन Hydrogel, और 3 डी मुद्रण मॉडल

  1. पाड़ डिजाइन
    1. कागज पर मॉडल की तरह एक प्रोपेलर ड्रा ।
      नोट: प्रोपेलर की तरह मॉडल निंनलिखित बातों के आधार पर बनाया गया है: (क) यह vivo परिदृश्य में जहां कैंसर की कोशिकाओं CAFs से घिरे रहे है simulates; (ख) यह परिपत्र geometries के उपयोग के द्वारा तनाव की एकाग्रता को कम करता है; (ग) क्या यह लचीला है ताकि भविष्य में मौजूदा geometries को बदले बिना अधिक क्षेत्रों को मॉडल में जोड़ा जा सके; और (घ) यह पोषक तत्व प्रसार की सुविधा के लिए अपने कार्यक्षेत्र पैमाने में सपाट है ।
    2. प्रोपेलर के केंद्र मूल होना और प्रतीकों का उपयोग करें r0, r1, और आर2 भीतरी सर्कल के अधिक से अधिक त्रिज्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए, मध्य क्षेत्रों, और बाहरी क्षेत्रों, क्रमशः । आंतरिक आर्क्स की संख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रतीकों m और n का उपयोग करें और सेक्टर क्षेत्र के अंदर बात की है, क्रमशः ।
    3. प्रोपेलर की तरह मॉडल पर प्रत्येक नोड के निर्देशांक की गणना और उन्हें आर0, आर 1, आर2, एम, और एनके प्रतीकात्मक अभिव्यक्ति में लिखें.
    4. कोई प्रोग्राम स्क्रिप्ट प्रारंभ करें, r0, r1, r2, mऔर n चर के रूप में सेट करें, और प्रत्येक कुंजी नोड की सांकेतिक अभिव्यक्ति इनपुट ।
      नोट: किसी भी सॉफ्टवेयर जानकारी के लिए सामग्री की तालिका को देखें ।
    5. एक रास्ता है कि नोड्स जोड़ता है और भीतरी सर्कल के लिए एक कारतूस आवंटित की व्यवस्था, मध्यम क्षेत्रों, और बाहरी क्षेत्रों । परत मोटाई सेट करने के लिए १५० µm और परतों की संख्या 4 हो सकता है ।
    6. कार्यक्रम उत्पादन जी कोड प्रारूप में एक पाठ फ़ाइल है कि द्वारा पहचानने योग्य है चलो ।
    7. r0 = ३.८५, r1 = ६.८५, r2 = ८.६५, m = 2, और n = 5 सेट करें । स्क्रिप्ट चलाएं और जनरेटेड G-code फ़ाइल पुनर्प्राप्त करें । कॉपी और फाइल को पेस्ट करने के लिए ' s समर्पित जी-कोड फ़ोल्डर ।
    8. प्रिंटर और उसके नियंत्रण सॉफ्टवेयर को चालू करें । प्रिंटर प्रारंभ । जी कोड स्क्रिप्ट खोलें बस बनाया और शूंय करने के लिए सभी दबाव सेट । नियंत्रण सॉफ़्टवेयर पर लौटें, टैब पाड़ा जनरेटरपर क्लिक करें, और फिर दाएँ नीचे कोने पर चलाएँ बटन पर क्लिक करें. प्रिंटर के चलते पथ का निरीक्षण ।
      नोट: यह उत्पंन जी कोड की शुद्धता का परीक्षण करेगा । के लिए सामग्री की तालिका का उल्लेख करने के लिए संबंधित जानकारी के लिए प्रिंटर ।
    9. यह चरण वैकल्पिक है । कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर के माध्यम से ऊपर मापदंडों के आधार पर एक प्रदर्शन 3d मॉडल का निर्माण ।
      नोट: विक्रेता सॉफ़्टवेयर जानकारी के लिए सामग्री तालिका के लिए देखें ।
  2. एक सेल-लादेन A3G7 hydrogel प्रणेता बना
    नोट: इस खंड में दिए चरणों बाँझ स्थितियों के अंतर्गत किया जाना चाहिए । एक बीएससी के अंदर का प्रिंटर रखें ।
    1. ७०% इथेनॉल अच्छी तरह से छिड़काव और यह यूवी प्रकाश को रात भर के लिए उजागर द्वारा एक प्रिंटर निष्फल ।
    2. hydrogel अग्रदूत (4 डिग्री सेल्सियस पर) की एक सिरिंज बाहर ले जाओ और यह एक पानी में स्नान में गर्म ३७ ° c 1 एच के लिए ।
    3. टी लो कोशिकाओं के साथ कुप्पी (१.३ कदम देखें) सीओ2 मशीन से और यह एक बीएससी के अंदर जगह है । संस्कृति माध्यम को त्यागें और DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला करें । एक गर्म trypsin-EDTA समाधान (३.० एमएल) जोड़ें और 6 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं गर्मी FBS की एक ही मात्रा के साथ trypsin को निष्क्रिय । trypan ब्लू परख का उपयोग कोशिकाओं गिनती ।
    4. पानी के स्नान से hydrogel अग्रदूत के सिरिंज ले लो, यह साफ है, और यह ७०% इथेनॉल के साथ निष्फल । इस सिरिंज को बीएससी में डाल दें ।
    5. एक 10 मिलीलीटर मुद्रण कारतूस में hydrogel अग्रदूत के लगभग 3 मिलीलीटर बाहर निकालना । मिश्रण एमडीए के साथ अग्रदूत-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं पर 1 x 106 कोशिकाओं/धीरे से यह pipetting, बुलबुले के उत्पादन से परहेज । बाँझ अंत और शीर्ष टोपियां के साथ कारतूस को कवर और तेल फिल्म के साथ सील । 1 मिनट के लिए ८३४ x g पर यह केंद्रापसारक के लिए किसी भी गैस का उत्पादन किया बुलबुले को खत्म करने ।
    6. स्पैक्ट्रम-९०-mCherry सेल-लादेन के प्रणेता और कोशिका मुक्त प्रणेता के लिए चरण 3.2.3-3.2.5 दोहराएं ।
    7. ७०% इथेनॉल के साथ सभी 3 कारतूस निष्फल और फिर उंहें के चैंबर्स में प्रिंटर लोड । प्रिंटर के नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, 25 डिग्री सेल्सियस के लिए कारतूस तापमान निर्धारित किया है । मुद्रण योग्य शर्तों तक पहुंचने के लिए प्रणेता की अनुमति देने के लिए ३५ मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
      नोट: इस समय hydrogel में एंबेडेड कक्षों की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है ।
  3. 3d प्रिंटिंग मॉडल
    1. प्रिंटर के नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, प्रिंटर के नियंत्रण सॉफ्टवेयर में उपकरण सिर टैब का विस्तार, बाईं ओर ग्राफिक अंतरफलक पर 1 कारतूस पर क्लिक करें, और तब माप लघु बटन पर क्लिक करें नोजल टिप की स्थिति को मापने के लिए । अंय 2 कारतूस के लिए इस दोहराएं ।
    2. एक स्पष्ट polystyrene microplate रखें, जी कोड फ़ाइल खोलें, और सभी कारतूस के लिए २०० केपीए के लिए दबाव बदल जाते हैं । नियंत्रण सॉफ़्टवेयर पर लौटें, टैब सुपाड़ा जनरेटरपर क्लिक करें, मुद्रण प्रारंभ करने के लिए एक बिंदु चुनें, और फिर दाएँ नीचे कोने पर चलाएँ बटन पर क्लिक करें. 3 अधिक प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
    3. के बाद सभी प्रोपेलर मॉडल की प्रतिकृति मुद्रण, एक १०० mM CaCl2 समाधान जोड़ने के लिए पार-1 मिनट के लिए मॉडल लिंक और यह DPBS के साथ 2x कुल्ला करने के लिए Ca+ + आयनों की अतिरिक्त हटा दें ।
    4. ध्यान से एक रंग का उपयोग कर एक agarose-लेपित 6 अच्छी प्लेट पर मॉडल स्थानांतरण । एक अच्छी तरह से DMEM मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर एक मशीन में प्लेटें मशीन ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मॉडल कुएँ में तैरते हैं.
    5. सेल कल्चर मीडियम को हर 3 दिन ताजे मीडियम से बदलें, इसे कुल मिलाकर 30 दिनों के लिए कल्चर करें ।

4. व्यवहार्यता और Hydrogel डिस्क पर अंडाकार आकृति गठन प्रयोग ।

  1. Hydrogel डिस्क तैयार करना
    1. दोहराएँ चरण 3.2.1-3.2.6.
      नोट: यह एक छोटे से बाँझ कंटेनर के साथ कारतूस स्थानापन्न करने के लिए संभव है.
    2. एक बाँझ स्नातक की उपाधि प्राप्त 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें और सिरिंज में एक बड़ा छेद बनाने के लिए नोजल में कटौती (छेद सिरिंज ट्यूब के बाकी के रूप में एक ही व्यास है). यह ७०% इथेनॉल के साथ साफ है और इसे छोड़ जब तक यह शुष्क है ।
      नोट: यह एक बाँझ बीएससी में करते हैं ।
    3. एक अच्छी तरह से प्लेट ढक्कन का प्रयोग करें, १०० mM CaCl2 जोड़ने जब तक सतह कवर किया जाता है; फिर, सेल-लादेन hydrogel सिरिंज को भरने के लिए ले; बाहर निकालना १०० µ एल फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग कर । 1 मिनट के लिए hydrogel छोड़ दो और यह अत्यधिक DPBS के साथ कुल्ला । एक agarose-लेपित 6-well प्लेट पर hydrogel डिस्क स्थानांतरण, बेसल DMEM के 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और उंहें ३७ ° c और 5% सह 30 दिनों के लिए2 पर मशीन । मीडियम को हर 3 दिन रिफ्रेश करें ।
  2. सेल आणि अंडाकार आकृति व्यवहार्यता
    1. सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक MTS परख का उपयोग करें । DPBS के साथ प्रत्येक डिस्क धो लें और यह एक ठीक बाँझ ब्लेड के साथ 4 भागों में कटौती । पूरी डिस्क के भागों को इकट्ठा करने और उंहें एक ९६-अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण । फिर, जोड़ें १०० μL के DMEM प्लस 20 μL के लिए एक अच्छी तरह से और 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण गर्मी ।
    2. MTS प्रतिक्रिया के बाद, supernatant पुनर्प्राप्त करें और यह एक साफ ९६-well प्लेट करने के लिए स्थानांतरण । ४९० एनएम पर नमूनों के अवशोषण को मापने ।
  3. अंडाकार आकृति गठन
    1. 0, 7, 15, 21, और संस्कृति के 30 दिनों में मशीन से बाहर मशीन प्रोपेलर या डिस्क मॉडल ले लो और उंहें एक साफ 6 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरण ।
    2. spheroids कल्पना और कई पदों और जेड-पोट का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करने के लिए एक फोकल कताई डिस्क औंधा माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । छवि प्रत्येक प्रोपेलर, या डिस्क मॉडल, अपने क्षैतिज व्यास के साथ बाएं से दाएं एक ५०० µm अंतर के साथ और एक जेड प्राप्त एक क्षैतिज स्थिति में शीर्ष फोकल विमान के लिए नीचे से ढेर ।
      नोट: विक्रेता जानकारी के लिए सामग्री तालिका के लिए देखें ।
    3. एक अधिकतम ढेर अंकगणित उपकरण का उपयोग कर छवि का पुनर्निर्माण, कार्यक्रम ImageJ द्वारा प्रदान की, 2d एक अंडाकार आकृति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया छवियों को बनाने के लिए ।

5. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)

  1. alginate/जिलेटिन hydrogel चरण १.२ में वर्णित के रूप में तैयार करें ।
    नोट: बाँझ शर्तों की आवश्यकता नहीं है.
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन और paraformaldehyde खतरनाक है और देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  2. एक मोर्टार में hydrogel के 1 मिलीलीटर रखो, तरल नाइट्रोजन जोड़ने के लिए, और यह एक मूसल का उपयोग कर पीस । hydrogel को ठंढ से बचने के लिए लिक्विड नाइट्रोजन को जोड़ना जारी रखें । एक १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में पाउडर स्थानांतरण, यह मुहर, और यह दुकान पर-८० ° c 2 एच के लिए फ्रीज-24 घंटे के लिए नमूना सूखी ।
  3. अंडाकार आकृति इमेजिंग के लिए, DPBS 2x के साथ धीरे hydrogel धोने, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में विसर्जन से कोशिकाओं को ठीक, और फिर उंहें DPBS के साथ कुल्ला और उंहें तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज । अंत में, फ्रीज-24 एच के लिए नमूना सूखी ।
  4. hydrogel/अंडाकार आकृति संरचना और २५.० केवी पर एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के साथ आकृति विज्ञान का विश्लेषण, ७० फिलीस्तीनी अथॉरिटी (चैंबर दबाव) के तहत 40X का एक इज़ाफ़ा के साथ 5, 000X ।

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Representative Results

तापमान झाडू 25 डिग्री सेल्सियस और ३७ डिग्री सेल्सियस पर A3G7 अग्रदूत के एक अलग अंतर से पता चलता है । अग्रदूत साबित ३७ डिग्री सेल्सियस पर तरल है और १९३८.१ ± ८४.० mPa एक्स एस, जो एक बड़ा जी द्वारा मान्य है की एक जटिल चिपचिपापन है "ओवर g ' । तापमान कम हो जाता है के रूप में, एक त्रिकोणीय कुंडलित गठन29,30में जिलेटिन अणुओं की सहज शारीरिक उलझाव के कारण अग्रदूत साबित शारीरिक जमाना । दोनों जी ' और जी "वृद्धि और ३०.६ डिग्री सेल्सियस पर एकाग्र, एक सोल जेल संक्रमण का संकेत है । moduli में वृद्धि जारी है, कम तापमान के साथ, ४६८.५ ± ३४.२ pa g ' और g के १४०.७ ± ९.३ pa तक पहुंचने "25 ° c (आंकड़ा 1a) । तापमान झाडू के परिणामों के आधार पर, हम मुद्रण तापमान के रूप में 25 डिग्री सेल्सियस चुना है । जमाना कैनेटीक्स प्रयोग तापमान परिवर्तन है कि नमूना तैयारी और हैंडलिंग के दौरान होता है simulates (यानी, ३७ ° c पानी स्नान से नमूने को हटाने और यह 25 डिग्री सेल्सियस में रखने के लिए) । छ ', छ ", व | η * | कम तापमान पर समय के साथ वृद्धि, और सोल-जेल संक्रमण ~ पर 17 मिनट में होता है 25 ° c, जब g ' ≈ g "≈ ६४.३ Pa और हानि कारक 1 (आंकड़ा 1b और 1c) के बराबर होती है । अग्रदूत ठोस बनाना के लिए जारी है और ५० के बाद एक मुद्रण खिड़की तक पहुंचता है-जमाना के ९० मिनट । इस मुद्रण खिड़की के भीतर, प्रणेता सुचारू रूप से २०० केपीए के दबाव के साथ एक G25 बेलनाकार नोक का उपयोग कर बाहर निकाला जा सकता है । उपज तनाव का अस्तित्व एक ठोस सामग्री की तरह व्यवहार का तात्पर्य है और बाहर निकालना के बाद संरचनात्मक अखंडता उठाती अपने स्वयं के वजन31झेलने के लिए । तनाव रैंप जमाना के विभिंन समय में उपज तनाव को पहचानता है । परिणाम बताते है कि बढ़ती जमाना समय के साथ उपज तनाव बढ़ जाती है । जमाना के ५० मिनट में, उपज तनाव ३२५.९ फिलीस्तीनी अथॉरिटी तक पहुंचता है, आश्वस्त है कि मॉडल बाहर निकालना के बाद स्थिर है ।

मुद्रित प्रोपेलर मॉडल चित्र 2aमें दिखाया गया है । फोकल माइक्रोस्कोपी एमडीएस-एमबी-२३१-GFP और स्पैक्ट्रम-९०-mCherry कोशिकाओं (चित्रा बी) दोनों के प्रारंभिक बाहर निकालना स्थानों की पुष्टि करता है । एमडीएस-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं को संस्कृति अवधि में spheroids 15 दिनों के विकास के लिए शुरू, आकार और spheroids की संख्या में वृद्धि के बाद दिन तक 30 (चित्रा 2c 2f). स्पैक्ट्रम-९०-mCherry कोशिकाओं में से कुछ agglomerations (फिगर 2जी - 2j) भी बनाते हैं । ध्यान से, संस्कृति के 30 दिनों के बाद, स्पैक्ट्रम-९०-mCherry कोशिकाओं एमडीए-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं (चित्रा 2f) द्वारा शुरू में कब्जा क्षेत्र में मनाया जाता है, मॉडल में संभव प्रवास घटनाओं का अर्थ. इसी तरह, माइग्रेट एमडीए-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं को भी 30 दिन में स्पैक्ट्रम-९०-mCherry बहुल क्षेत्र में देखा जा सकता है (फिगर 2j).

डिस्क मॉडल चित्र 3ए में दिखाया गया है । फोकल माइक्रोस्कोप डिस्क (चित्र बी) के भीतर सजातीय सेल वितरण की पुष्टि करता है । एमडीए-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं डिस्क मॉडल में इसी तरह व्यवहार के रूप में वे जब एक प्रोपेलर मॉडल के रूप में छपी । प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3 सी- 3fमें प्रदर्शित कर रहे हैं । SEM इमेजिंग एक एमडीए-एमबी-२३१-GFP अंडाकार आकृति-लादेन hydrogel संस्कृति के 21 दिनों के बाद (चित्रा 4a) पता चलता है । पीढ़ी, और उपस्थिति, अंडाकार आकृति के सेल मुक्त hydrogels (चित्रा 4b) के साथ SEM छवियों की तुलना द्वारा मांय है ।

दोनों कक्ष प्रकारों की कक्ष व्यवहार्यता चित्रा 4cमें प्रदर्शित किया जाता है । एमडीए-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं स्पैक्ट्रम-९०-mCherry कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च कोशिका व्यवहार्यता व्यक्त करते हैं । दिलचस्प है, एमडीए-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं दिन के पहले व्यवहार्यता की एक वृद्धि की प्रवृत्ति का प्रदर्शन 15 दिन की तुलना में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का एक tripling के साथ, 0 । यह 21 दिन की कमी के बाद, 30 दिन पर फिर से उबरने से पहले है । इसके विपरीत, स्पैक्ट्रम-९०-mCherry कोशिकाओं के कल्चरल पीरियड की संपूर्णता के दौरान व्यवहार्यता में न्यूनतम उतार-चढ़ाव होता है । एमडीए-एमबी की व्यवहार्यता में घटते मूल्यों-२३१-GFP कोशिकाओं दिन 21 में एक बड़े MTCSs गठन है, जो गल कोर विकसित किया है के अनुरूप है ।

Figure 1
चित्रा 1: hydrogel अग्रदूत के Rheological लक्षण वर्णन । () एक तापमान झाडू ३०.६ डिग्री सेल्सियस पर सोल जेल संक्रमण से पता चलता है । (बी-सी) जमाना कैनेटीक्स के A3G7 के प्रणेता ' जी, जी ', और | η*की वृद्धि को दर्शाता है | जमाना के समय, और सोल-जेल संक्रमण 25 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 17 मिनट में होता है । () यह पैनल जमाना के समय बनाम प्रणेता के उपज तनाव को दिखाता है. उपज तनाव की वृद्धि एक लंबी बीच बढ़िया तालमेल समय के साथ मनाया जाता है । परिणाम अर्थ ± एसडी, एन≥ 3 में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक 3 डी के भीतर MCTS गठन में विमुद्रित इन विट्रो मॉडल से मिलकर स्पैक्ट्रम-९०-mCherry myofibroblast और एमडीएस-एमबी-२३१-GFP स्तन कैंसर की कोशिकाओं. () ये फोटोग्राफ्स इन विट्रो sample (left) और सीएडी मॉडल (right) में अंकित दिखाती हैं. () इस प्रतिनिधि फोकल समय चूक छवि एमडीए-एमबी-२३१-GFP (ग्रीन) और स्पैक्ट्रम-९०-mCherry (लाल) कोशिकाओं मॉडल के भीतर प्रिंट का पता चलता है । (सी - एफ) इन ज़ूम-इन्स एमडीए-एमबी-२३१-GFP सेल क्षेत्र (सफेद डॉटेड बक्से) दिखाएँ । (g - j) ये ज़ूम-इन स्पैक्ट्रम-९०-mCherry सेल क्षेत्र (येलो डॉटेड बॉक्स) दिखाते हैं । पैमाने सलाखों के पैनल 2aमें 2 मिमी, 1 मिमी पैनल में हैं , और ५०० पैनलों में µm 2c चयनित क्षेत्रों के लिए 2j , और आवर्धन 10x है । राजधानी "डी" छवियों में "संस्कृति के दिनों" का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक 3d एमडीए के भीतर MCTS गठन-एमबी-२३१-GFP-लादेन hydrogel डिस्क । () यह फोटोग्राफ एक hydrogel डिस्क दिखाता है । () इस प्रतिनिधि के फोकल छवि एमडीए-एमबी-२३१-GFP कोशिकाओं समग्र में एंबेडेड दिखाता है । (सी-एफ) इन जूम इन-ins एमडीए-एमबी-२३१-GFP सेल क्षेत्र (3 बीपैनल में सफेद बिंदीदार बॉक्स) शो (सी) 0, () 7, () 15, और () 21 संस्कृति के दिन । पैमाने सलाखों 3 ए पैनल में 2 मिमी , 3 बीपैनल में 1 मिमी है, और पैनलों में ५०० µm 3 सी-चयनित क्षेत्रों के लिए 3f , और आवर्धन 10x है । राजधानी "डी" छवियों में "संस्कृति के दिनों" का अर्थ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: MTCSs की आकृति विज्ञान और कोशिका व्यवहार्यता । () इस SEM छवि से पता चलता है एक एमडीए-एमबी-२३१-GFP MCTS जेल के भीतर संस्कृति के 21 दिनों के बाद, छोटे MCTS (तीर सूत्री) दिखा । () इस SEM छवि कोशिकाओं के बिना एक alginate/ आवर्धन 350X है । () इस पैनल hydrogel के भीतर संस्कृति के 30 दिनों के दौरान एमडीए-एमबी-२३१-GFP और स्पैक्ट्रम-९०-mCherry की कोशिका व्यवहार्यता को दर्शाता है । परिणाम मतलब ± एसडी के रूप में विश्लेषण और सांख्यिकीय एक दो तरह ANOVA और एक Bonferroni के बाद परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । p (*) < ०.०५, n ≥ 3. डेटा सेल घनत्व को सामान्यीकृत था 0 दिन पर नमूने बनाने के लिए इस्तेमाल किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रदूषित (जैविक या रासायनिक) प्रक्रिया में किसी भी बिंदु पर होता है, तो सेल से लदी संरचनाओं समझौता किया जा सकता है । आमतौर पर, जैविक संदूषण संस्कृति के दो या तीन दिनों के बाद संस्कृति मीडिया या प्रिंटेड संरचना में एक रंग परिवर्तन के रूप में देखा जाता है । इसलिए, नसबंदी (शारीरिक और रासायनिक संक्रमण) सभी सेल से संबंधित प्रक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । उल्लेखनीय, autoclaving जिलेटिन अपने बीच बढ़िया तालमेल गुण है, जो यह परीक्षण हम आयोजित में धीमी जेल बनाया परिवर्तन । इसलिए, हम यूवी जोखिम के माध्यम से alginate और जिलेटिन की शक्ति निष्फल । यूवी प्रकाश की बहुत सीमित प्रवेश क्षमता के कारण, एक बहुत पतली परत (< ०.५ mm) का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । alginate और जिलेटिन की एकाग्रता मनमाने ढंग से यांत्रिक और जैविक गुणों३२धुन बदल सकता है । वर्तमान काम में, हम A3G7 चुना है, क्योंकि यह अपनी मुद्रण खिड़की के दौरान वांछनीय मुद्रण की सुविधा प्रदान करता है, और crosslinked hydrogel 30 दिन के प्रयोग के माध्यम से एक उच्च स्थिरता प्रदान करता है । ६० ° c करने के लिए हीटिंग जबकि DPBS में पाउडर भंग जिलेटिन की liquefication को बढ़ाने में मदद करता है, जो सरगर्मी को आसान बनाता है । एक कम तापमान भी इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, एक लंबी सरगर्मी समय फिर आवश्यक हो जाएगा ।

rheological तापमान झाडू ३०.६ डिग्री सेल्सियस, जो अन्य प्रकाशनों३३के साथ संगत है पर एक सोल जेल बिंदु देता है । सैद्धांतिक रूप से, ३०.६ डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान किसी भी अग्रदूत दव्र बनाना कर सकते हैं । हम काम को सरल बनाने के लिए ३७ ° c चुना है, के रूप में सेल संस्कृति माध्यम एक ३७ ° c पानी स्नान में पूर्व गर्म है । जमाना कैनेटीक्स (अग्रदूत जैल से पहले) के आधार पर, वहाँ सेल मिश्रण के लिए लगभग 17 मिनट है; इस समय के बाद, कोशिकाओं को मिलाने और hydrogel अग्रदूत साबित वृद्धि हुई चिपचिपापन और moduli के कारण मुश्किल है, एक गैर सजातीय कोशिका से लदी bioink पैदा कर रही है । इसलिए, हम बीच बढ़िया तालमेल के पहले 10 मिनट के भीतर सेल-मिश्रण का काम संभालने का सुझाव देते हैं । उपज तनाव एक सामग्री विशेषता है कि हाल ही में३४तक मुद्रण की बात को प्रभावित नहीं माना जाता है; बावजूद, यह किया गया है बड़े पैमाने पर अतीत के एक मार्कर के रूप में बहुलक वैज्ञानिकों द्वारा मांयता प्राप्त/दानेदार द्रव31,३५,३६,३७। उपज तनाव के अस्तित्व के लिए एक संरचनात्मक अखंडता का निर्माण करने के लिए अपने स्वयं के वजन का सामना करने में मदद करता है । एक उच्च उपज तनाव भी बाहर निकालना में एक वृद्धि की स्टार्टअप दबाव की आवश्यकता हो सकती है; इस प्रकार, यह अत्यधिक कतरनी तनाव३२के कारण कोशिकाओं को नुकसान में परिणाम हो सकता है । बाहर निकालना प्रक्रिया इष्टतम मुद्रण विंडो के बाहर होती है, तो मॉडल निष्ठा समझौता किया जा सकता है । इस समस्या के आम संकेतक अंतिम प्रिंटेड संरचना में दिखाए जाते हैं: यह या तो बहुत मोटा या किनारों पर भी तरल होगा । A3G7 अग्रदूत साबित ५० के दौरान एक इष्टतम मुद्रण खिड़की-बीच बढ़िया तालमेल के ९० मिनट है कि दोनों संरचनात्मक स्थिरता और सेल अस्तित्व को संतुष्ट और मध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता विषम ट्यूमर मॉडल14

प्रोपेलर मॉडल की कुल ऊंचाई ६०० µm के रूप में यह चार स्तरित १५० µm रेशा से उत्पंन होता है । इस डिजाइन की अनुमति देता है पोषक तत्व और गैस एक्सचेंज के रूप में कोशिकाओं की सतह से सबसे ३०० µm में है मीडिया से संपर्क करने की मशीन के दौरान । उच्च मॉडल निर्माण में प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन hydrogel३८, जो कोर क्षेत्र में एक कम सेल अस्तित्व में परिणाम कर सकते है में पोषक तत्वों की सीमित प्रसार दूरी से अड़चने हैं ।

विभिंन रणनीतियों के लिए इस तरह की फांसी ड्रॉप, microfluidic चिप, विधानसभा, और३९का मुद्रण के रूप में इन विट्रो मेंMCTS फार्म विकसित किया गया है । हालांकि, इन तरीकों में से कुछ कोशिका शरीर विज्ञान और जैव रसायन बदल सकते हैं, अलग सेल व्यवहार है कि सामांय ट्यूमर ऊतक में उत्पंन पैदा । उदाहरण के लिए, हैंगिंग ड्रॉप विधि एकल कक्षों को भौतिक परिशोधन४०के माध्यम से कक्ष समुच्चय के रूप में रहने के लिए बाध्य करती है । इसके अलावा, एक पेप्टाइड अतिरिक्त द्वारा MCTS फार्म के लिए रासायनिक प्रेरण spheroids४१के जैव रसायन में परिवर्तन कर सकते हैं । यहां वर्णित hydrogel समग्र बाहरी तनाव के बिना एक biomimetic वातावरण बनाने के द्वारा एक MCTS गठन की अनुमति देता है । एक अच्छी तरह से फैलाया कोशिकाओं के रूप में बाहर शुरू, संस्कृतियों के 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं छोटे MCTS के रूप में पुनर्गठित (अधिक से अधिक 6 अंडाकार आकृति प्रति कोशिकाओं), संस्कृति के 30 दिनों के दौरान उनके आकार और मात्रा में वृद्धि.

इस शोध के परिणामों में, हमने पाया है कि एमडीए-एमबी-२३१-GFP spheroids 21 दिन में सेल व्यवहार्यता कम, बड़े spheroids के गठन के साथ इस घटना correlating । एक ठोस ट्यूमर तीन अलग परतों के शामिल है, जिससे बाहरी परत मध्यम परत की तुलना में एक उच्च प्रसार दर प्रस्तुत करता है और आंतरिक या अंडाकार आकृति18के वृद्ध होनेवाला कोर । यह परिणाम में व्यवहार्यता कमी समझा जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं है (1) bioink गतिशीलता और (2) कक्ष प्रकार संगतता । Bioink गतिशीलता जमाना प्रक्रिया के दौरान बदलती सामग्री गुणों को संदर्भित करता है, जिसके परिणामस्वरूप मुद्रित संरचना दोषपूर्ण है जो परे एक इष्टतम मुद्रण विंडो में है । कक्ष प्रकार संगतता कुछ कक्ष प्रकारों (कक्ष रेखा या प्राथमिक culture) की अक्षमता को संदर्भित करता है जिसमें vivo व्यवहार में कोई नेटिव प्रदर्शित किया जाता है ।

A3G7 hydrogel एक उच्च स्थिरता और कोशिका व्यवहार्यता प्राप्त है । 3 डी प्रिंटिंग उच्च प्रवाह, कम लागत, और पारंपरिक सेल संस्कृति और छोटे जानवर ट्यूमर मॉडल के लिए एक अधिक यथार्थवादी विकल्प के रूप में उच्च reproducibility के साथ 3 डी विषम रोग मॉडल का निर्माण किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

ताओ जियांग धंयवाद चीन छात्रवृत्ति परिषद (२०१४०३१७०३५४) और मैकगिल इंजीनियरिंग डॉक्टरेट पुरस्कार (९००२५) उनके छात्रवृत्ति वित्त पोषण के लिए । जोस जी Munguia-लोपेज धंयवाद CONACYT (२५०२७९, २९०९३६ और २९११६८) और उनके छात्रवृत्ति वित्त पोषण के लिए FRQNT (२५८४२१) । साल्वाडोर Flores-Torres धंयवाद CONACYT उनके छात्रवृत्ति वित्त पोषण के लिए (७५१५४०) । यूसुफ एम Kinsella धंयवाद राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, कनाडा नवाचार के लिए फाउंडेशन, Townshend-Lamarre परिवार फाउंडेशन, और उनके धन के लिए मैकगिल विश्वविद्यालय । हम हमें अपने फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए हमें अपने rheometer, दान Nicolau का उपयोग करने की अनुमति के लिए एलन Ehrlicher शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और Morag पार्क हमें फ्लोरोसेंट लेबल सेल लाइनों तक पहुंच प्रदान करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

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