Bioprintable calciumalginat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemer fremkalde celle klumpformet dannelse

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi udviklede en heterogen bryst kræft model bestående af udødeliggjort tumor og fibroblast celler indlejret i en bioprintable calciumalginat/gelatine bioink. Modellen sammenfatter i vivo tumor mikromiljø og letter dannelsen af flercellede tumor spheroids, giver indsigt i de mekanismer, der driver tumordannelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den cellulære, biokemiske og biofysiske heterogenitet af indfødte tumor mikromiljø er ikke sammenfattet af voksende udødeliggjort kræft cellelinjer ved hjælp af konventionelle todimensionale (2D) cellekultur. Disse udfordringer kan overvindes ved hjælp af bioprinting teknikker til at bygge heterogene tredimensionale (3D) tumor modeller hvor forskellige typer af celler er integreret. Calciumalginat og gelatine er to af de mest almindelige biomaterialer ansat i bioprinting på grund af deres biokompatibilitet, Biomimetik og mekaniske egenskaber. Ved at kombinere de to polymerer, opnåede vi en bioprintable sammensatte hydrogel med ligheder til den mikroskopiske arkitektur i en native tumor stroma. Vi studerede trykproces sammensatte hydrogel via reologi og opnået den optimale udskrivning vindue. Brystkræftceller og fibroblaster var indlejret i hydrogels og udskrives til at danne en 3D-model efterligne i vivo mikromiljø. Bioprinted heterogen model opnår en høj rentabilitet for langsigtet cellekultur (> 30 dage) og fremmer den samlesæt af brystkræftceller i flercellede tumor spheroids (MCTS). Vi observerede migration og interaktion af kræft-associerede fibroblastceller (cafïr) med MCTS i denne model. Ved hjælp af bioprinted celle kultur platforme som fælles kultur systemer, tilbyder det et unikt værktøj til at studere afhængighed af tumordannelse stroma sammensætning. Denne teknik har en høj overførselshastighed, lave omkostninger og høj reproducerbarhed, og det kan også give en alternativ model til konventionelle éncellelag cellekulturer og animalske tumor modeller at studere kræft biologi.

Introduction

Selvom 2D cellekultur er meget udbredt i kræftforskning, findes begrænsninger som celler dyrkes i et éncellelag format med en ensartet koncentrationen af næringsstoffer og ilt. Disse kulturer mangler vigtige celle-celle og celle-matrix interaktioner i native tumor mikromiljø (TME). Derfor, disse modeller dårligt sammenfatte fysiologiske forhold, hvilket resulterer i afvigende celle adfærd, herunder unaturlige morfologier, uregelmæssige receptor organisation, membran polarisering og unormale Gen-ekspression, blandt andet betingelser1,2,3,4. På den anden side tilbyder 3D cellekultur, hvor celler er udvidet i en målekolbe plads som aggregater, spheroids eller organoids, en alternativ teknik for at skabe mere præcise in vitro- miljøer for at studere grundlæggende cellebiologi og fysiologi. 3D celle kultur modeller kan også fremme celle-ECM interaktioner, der er kritiske fysiologiske egenskaber af indfødte TME in vitro-1,4,5. Den nye 3D bioprinting-teknologi giver muligheder for at bygge modeller, der efterligner den heterogene TME.

3D bioprinting er afledt af rapid prototyping og giver mulighed for fremstilling af 3D mikrostrukturer, der er i stand til at efterligne nogle af kompleksiteten af levende væv prøver6,7. De nuværende bioprinting metoder omfatter inkjet, ekstrudering og laser-assisteret udskrivning8. Blandt dem giver metoden ekstrudering heterogenitet skal kontrolleres inden for de trykte matricer af præcis positionering forskellige typer af materialer på forskellige oprindelige placeringer. Det er derfor, den bedste fremgangsmåde til at fabrikere heterogene in vitro- modeller som omfatter flere typer af celler eller matricer. Ekstrudering bioprinting har held været anvendt til at opbygge auricular formet stilladser9, vaskulære strukturer10,11,12, og huden væv13, hvilket resulterer i høje udskrivning troskab og celle levedygtighed. Teknologien er også udstyret med alsidigt materiale valg, evnen til at deponere materialer med celler indlejret med en kendt tæthed, og høj reproducerbarhed14,15,16,17 . Naturlige og syntetiske hydrogels er ofte brugt som bioinks for 3D bioprinting på grund af deres biokompatibilitet, bioactivity og deres hydrofile netværk, der kan blive manipuleret til at strukturelt ligner ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels er også fordelagtigt, da de kan indeholde klæbende websteder for celler, strukturelle elementer, permeabilitet for næringsstoffer og luftarter, og de relevante mekaniske egenskaber til at fremme celle udvikling24. For eksempel tilbyder kollagen hydrogels integrin anchorage websteder, at celler kan bruge til at knytte til matrixen. Gelatine, denatureret kollagen, bevarer lignende celle vedhæftning websteder. Derimod calciumalginat bioinert men giver mekaniske integritet ved at danne krydsbindinger med divalent ioner25,26,27,28.

I dette arbejde udviklet vi et komposit hydrogel som en bioink, bestående af natriumalginat og gelatine, med ligheder til den mikroskopiske arkitektur i en native tumor stroma. Brystkræftceller og fibroblaster var indlejret i hydrogels og udskrives via en ekstrudering-baserede bioprinter for at oprette en 3D-model, der efterligner i vivo mikromiljø. Manipuleret 3D miljø tillader kræftceller til at danne flercellede tumor spheroids (MCTS) med en høj rentabilitet i lange perioder af cellekultur (> 30 dage). Denne protokol viser metoder for syntese sammensatte hydrogels, kendetegner materialer mikrostruktur og trykproces, bioprinting cellular heterogene modeller, og observere dannelsen af MCTS. Disse metoder kan anvendes til andre bioinks i ekstrudering bioprinting samt om forskellige designs heterogent væv modeller med potentielle anvendelser i stof screening, celle migration assays og undersøgelser, der fokuserer på grundlæggende celle fysiologiske funktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af materialer, Hydrogel og celle kultur materialer

  1. Materiale og løsning forberedelse
    1. Vask og tør 250 mL og 100 mL glas bægre, magnetiske omrørere, spatler, 10 mL patroner, 25 G cylindrisk dyser med (en længde på 0,5 i) og en indre diameter på 250 µm. Sterilisere materialer ved autoklavering dem ved 121 ° C/15 min./1 atm. holde materialer under sterile forhold indtil brug.
      Bemærk: Henvise til Bordet af materialer til leverandøroplysninger.
    2. Vej 3 g af natriumalginat (3% w/v) og 7 g gelatine (7% w/v) (betegnet som A3G7 herefter).
    3. Sterilisere de følgende elementer under UV-lys for mindst 4 h: calciumalginat og gelatine pulver, paraffin film, aluminium foliestykker af 5 cm2, og 1 mL og 5 mL sprøjter. Sterilisere endestykker, tip caps og stempler ved at nedsænke dem i 70% ethanol i mindst 4 timer og vaske dem 2 x med steriliseret ultra rent vand.
      Bemærk: Henvise til Bordet af materialer til leverandøroplysninger.
    4. 4 g Agarosen med ultra-rene vand opløses og sterilisere det ved autoklavering.
      Bemærk: Agarosen er fuldstændigt opløst efter autoklavering proces.
    5. Forberede en 100 mM opløsning af vandfrit calciumchlorid (CaCl2) i steriliseret ultra rent vand og en steril filter (med en porestørrelse på 0,22 µm) inden brug.
    6. Agarosen-belagt 6-godt plader, smelte de sterile Agarosen i en mikrobølgeovn til at opnå en flydende løsning; derefter, under en biosikkerhed kabinet (BSC) og bruger en 1 mL mikropipette, tilsættes 2 mL pr. brønd og bland det forsigtigt for at skabe et ensartet lag i bunden af brønden. Lad den køle ned og forsegle godt med paraffin film. Holde det ved stuetemperatur (RT) indtil brug.
  2. Forberedelse af A3G7 hydrogel forløber
    1. Bland 3 g af natriumalginat og 7 g gelatine pulver i et 250 mL bægerglas inden for et BSC. Tilføje en magnetomrører og 100 mL DPBS. Forsegle bægerglasset med steril paraffin film og aluminium folie (5 cm2) at undgå kontaminering.
    2. Opløse pulvere under en konstant uro i en magnetisk/varme plade med 600 rpm ved 60 ° C i 1 time og på RT for en ekstra 2 h.
    3. Varme materiale ved 37 ° C, indtil gel gennemgår en fase overgang til den flydende tilstand (for 100 mL af stamopløsningen, dette tager ca 45 min). Opløsningen overføres til sterile 50 mL konisk centrifugeglas, forsegle dem og centrifugeres rør på 834 x g for 5 min at fjerne eventuelle gasbobler fra materialet.
    4. Opsug hydrogel forløber i 10 mL sprøjter. Seal sprøjter med hætter og paraffin film. Opbevar dem ved 4 ° C indtil brug.
  3. Cellekultur
    Bemærk: Trinnene i dette afsnit skal udføres under sterile forhold.
    1. Forberede den basale DMEM medium som følger (1 L): i et BSC, blandes 100 mL føtalt bovint serum (FBS) plus 10 mL af et antibiotikum/antimykotikum løsning (en 100 x stabiliseret løsning) i en frisk steril beholder. Tilføj DMEM medium for at justere blandingen op til 1000 mL. Forsegle beholderen og holder det ved 4 ° C.
    2. I en tidligere varmede vandbad (37 ° C), afrim 1 hætteglas af MDA-MB-231-normal god landbrugspraksis (menneskelige breast cancer cellelinie normal god landbrugspraksis-mærket, nukleare lokalisering) og 1 hætteglas med IMR-90-mCherry (kræft-associerede fibroblast cellelinier mCherry-mærket, med cytoplasmatisk lokalisering ) celler fra flydende kvælstof opbevaring ved at flytte dem forsigtigt i vandet. Både cellelinjer og plasmider for normal god landbrugspraksis og mCherry mærkning, er kommercielt tilgængelige.
    3. Overføre 160 µL/brønd af celle løsning (3 x 106 celler/mL) til en 6-godt plade og tilsættes 5 mL af varmede (37 ° C) basal DMEM medium. Inkuber plade på 37 °C/5% CO2 i 24-48 timer, indtil cellerne nå 80% sammenløb.
    4. Når cellerne kommer til sammenløbet, kassere medium og skyl celler to gange med DPBS; Inkuber celler med 500 µL af trypsin-EDTA løsning/brønd (0,25%, 1 x, tidligere varmede ved 37 ° C) ved 37 ° C i 6 min. Derefter, inaktivere trypsin ved at tilføje 500 µL af FBS, genoprette den celle løsning og overføre det til T-75 kolber. Inkuber dem igen på 37 °C/5% CO2 , indtil cellerne nå 80% sammenløb.
      Bemærk: Mængden af trypsin-EDTA-oploesning kan variere afhængigt af cellevækst fartøj.
    5. Gentag det forrige trin til at arbejde med celler på passage 3-4 som det er når celler har flere metaboliske aktivitet og stabilitet.
    6. Tælle celler ved hjælp af en trypan blå assay (0,4%) til at bestemme den oprindelige koncentration af celler til at blive blandet med hydrogel.

2. målinger af rheologiske egenskaber af Hydrogels

  1. Forberede calciumalginat/gelatine hydrogel forløber som beskrevet i trin 1.2.
    Bemærk: Sterile forhold er ikke påkrævet for prøver genereret for mekanisk afprøvning og analyse. Alle reologiske test udføres i tre eksemplarer.
  2. Tage en sprøjte af hydrogel forløber og varm det i et 37 ° C vandbad i 1 time.
  3. Tænd rheometer og initialisere system ifølge følgende trin.
    1. Tænde luftkompressor forbundet til rheometer og lad luftkompressor køre for 30 min. Switch på temperatur kontrolboks til rheometer, skifte på rheometer, sig selv, og tænd computeren tilsluttet rheometer.
    2. Åbne rheometer software, klik på Initialiser på kontrolpanelet, og lad initialiseringen er færdig. Indstil platform temperaturen til 37 ° C på kontrolpanelet.
    3. Klik på fanen måling sæt og navigere til den starte servicefunktion, Vælg Juster driver inerti i drop-down menuen, og klik på Start justering i pop-up-vinduet.
    4. Montere en parallel måling værktøj i rheometer. Alle de eksperimenter udført her bruge en 25 mm diameter plade med en 1 mm afstand mellem pladerne.
    5. Klik på Angiv nul-hul på kontrolpanelet og vent til proceduren til slut. Være opmærksom på den normale kraft under denne proces.
      Bemærk: Efter denne procedure, den normale kraft skal være 0.
    6. Klik på fanen måling sæt og navigere til den starte servicefunktion, Vælg Juster øverste måling system inerti, og klik på Start justering i pop-up-vinduet. Når det er gjort, skal du klikke på trekant-knappen på kontrolpanelet for at tillade den måling værktøj til at gå op.
  4. Gennemføre en amplitude feje.
    1. Klik på Start, derefter klikke på Indsæt i den øverste menu, Vælg vente fra drop-down menuen. Trække op opsætningsvinduet og angive ventetiden til 2 h.
      Bemærk: Dette vil tilføje et venter skridt før testene.
    2. Klik på Start, klik på Indsæt -knappen igen, og drop-down menuen, Vælg enhed. Trække op setup vinduet, vælge temperaturog indstille den til at være 25 ° C. Fjern markeringen af vente indtil værdi er nået.
    3. Klik på trin måling, så klik på variablen svingning stamme, trække op opsætningsvinduet, indstille profilen til at være rampe logaritmeog ændre værdien til 0,001% og 100% som den oprindelige stamme og endelige stamme, henholdsvis. Angive frekvensen på 0,01 Hz.
    4. Klik på knappen Tilføj for at tilføje variablen temperatur . Klik på den variabel temperatur og indstille den til at være 25 ° C. I vinduet pull-up udvide regnemaskine, angivet punkt tæthed til 10 point/årti.
    5. Tage sprøjte ud af vandbadet og presse ca. 0,5 mL forløber på rheometer platform.
    6. Klik på den nedadgående trekant-knappen på kontrolpanelet. Afvente den måling værktøj at flytte til trimning position.
    7. Brug en spatel til at trimme eventuelle overskydende prækursorer, der undslap på kanten af den måling værktøj og skille sig af med overflødigt materiale.
    8. Afpipetteres mineralsk olie på kanten af den måling værktøj og vente, indtil Olietætningsringe fuldt grænsen.
    9. Klik på Fortsæt på kontrolpanelet. Klik på knappen Start (grøn trekant), efterfulgt af at klikke på Fortsæt knappen på bunden skærmen.
    10. Når test er gjort, frigive den måling værktøj, og klik derefter på den opad trekant-knappen på kontrolpanelet. Fjerne den måling værktøj og rense det med 70% ethanol. Ren platform med 70% ethanol.
    11. I det aktuelle projekt, skal du klikke på step måling og trække op opsætningsvinduet. Nu, sæt frekvensen på 100 Hz. holde alle andre parametre uændret.
    12. Gentag trin 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Klik på diagrammet. Observere kurven for G', G " versus svingning stamme. Find punkterne afbøjning af G' for begge frekvenser (0,01 Hz og 100 Hz). Find de tilsvarende svingning stammer for både afbøjning point.
    14. Vælg den mindre svingning stamme og bruge 1/10 af denne stamme for alle svingning tests udført bagefter.
      Bemærk: Debut af G' afbøjning betragtes som den ultimative lineær elastisk-stamme (El), der ikke bør overskrides i opfølgende forsøg. Forholdet 1/10 bruges normalt i teknik af sikkerhedsmæssige årsager. Dette beregnede stamme er betegnet som gC.
    15. Når testen er færdig, skal du klikke på tabel, kopiere alle data og indsætte det i en tekstfil.
  5. Gennemføre en temperatur feje.
    1. Klik på mine apps og vælge skabelonen temperatur rampe, oscillerende shear: gellation.
    2. Navnet på projektet.
    3. Klik på trin måling i arbejdsprocessen. Klik derefter på variabel temperatur, trække op setup vinduet og Indstil indledende og afsluttende temperaturen til 37 ° C og 25 ° C, henholdsvis.
    4. I vinduet pull-up sæt svingning stamme til 0,1%, svingning frekvensen til 1Hz. Derefter indstille antallet af datapunkter at være 61. Indstil data indsamling frekvens til 1 point/min. Klik lommeregner og angivet punkt tæthed til 0,2 ° C/point.
      Bemærk: Dette vil give temperatur ændre med en hastighed på 0,2 ° C/min.
    5. Læg prøven på rheometer platform og udføre testen ved at følge trin 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klik på diagrammet, observere G', G " versus temperaturen. Find crossover-punkt G' og G ". Find temperaturen i crossover-punkt.
      Bemærk: Dette er sol/gel overgang temperatur hydrogel forløber.
    7. Gentag trin 2.4.15.
  6. Gennemføre en isotermisk tid feje.
    1. Min apps og find og klik på skabelonen isotermisk tid og temperatur test. Klik på trin måling i arbejdsprocessen, og klik derefter på variablen svingning stamme, trække op opsætningsvinduet, sat svingning stammen til 0,1%, og Indstil svingning frekvens til 1 Hz. I vinduet pull-up indstille antallet af datapunkter til 120. Indstil data indsamling frekvens til 1 point/min.
      Bemærk: Værdien af denne stamme er baseret på resultater fra amplitude feje.
    2. Klik på Tilføj for at tilføje variablen temperatur . Klik på variabel temperatur i den midterste rude og indstille den til 25 ° C.
      1. Højreklik på trin enheden flytte til målepunkt i arbejdsprocessen, klik på Slet. Klik derefter på trinnet enheden indstillet værdi, Fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Vent, indtil værdien er nået, og angiv værdien til 25 ° C. Klik på billedet, tittle, knapper på skærmen nederst, uncheck boksen Fortsæt. Derefter Klik på trinnet Start, navn projektet og gemme den.
    3. Læg prøven på rheometer platform og start testen ved at følge trin 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Observere G', G " versus tid. Find crossover-punkt G' og G ". Find tiden på crossover-punkt. Når testen er færdig, skal du klikke på tabel, kopiere alle data og indsætte det i en tekstfil.
      Bemærk: Dette er sol/gel overgangstid af hydrogel forløber på 25 ° C.
  7. Måle flydespænding på forskellige geldannende gange.
    1. Klik på mine apps og find og klik på skabelonen udbytte og flow stress, Gel-lignende. Navnet på projektet. Klik på trin starter i arbejdsprocessen. Klik på Indsæt i menuen øverst, og drop-down menuen, Vælg vent. Trække op opsætningsvinduet og angive ventetiden at være 20 min.
      Bemærk: Dette vil tilføje et venter skridt før testene.
    2. Klik på Start, derefter klikke på Indsæt igen og drop-down menuen, Vælg enhed. Trække op setup vinduet, valgte temperatur, og sæt den til 25 ° C. Fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Vent, indtil værdien er nået.
    3. Klik på trin måling i arbejdsprocessen, markere variablen Shear stress, trække op opsætningsvinduet og angivet de indledende og afsluttende shear stress til 0 og 10.000 Pa, henholdsvis.  Klik på Lommeregner, indstille punkt tæthed til 0,2 punkt/Pa. Sæt 1 point pr. sekund under fanen datamærker til venstre.
      Bemærk: Dette vil resultere i en stress ramping sats på 5 Pa/s.
    4. Klik på fanen hændelse kontrol i bunden af vinduet pull-up og angive kriteriet stop: stop måling, hvis shear Vurder > 100 s-1.
      Bemærk: Dette vil automatisk stoppe målingen, hvis materialet er givet.
    5. Læg prøven på rheometer platform og start testen ved at følge trin 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klik på diagrammet. Observere stamme-stress kurve. Finde punktet afbøjning af stammen og dens tilsvarende stress. Gentag trin 2.7.2 - 2.7.6, men ændre ventetiden til 30, 40 og 50 min for hver replikat; Dette vil resultere i flydespænding på forskellige geldannende gange.
      Bemærk: Denne stress er betragtet som den tilsyneladende flydespænding.
      Bemærk: software klik kan afvige rheometer modeller og software-versioner. Anbefaler vi læserne at tage henvisningen af parametrene test vi leverer, mens henvises til manualen om specifikke rheometer/software i praktisk brug.
       

3. stillads Design, celle-belæsset Hydrogel og 3D udskrivning modeller

  1. Stillads design
    1. Tegne en propel-lignende model på papir.
      Bemærk: Propel-lignende model er designet ud fra følgende betragtninger: (en) det simulerer i vivo scenario hvor kræftceller er omgivet af cafïr; (b) det minimerer koncentrationen af stress via brugen af cirkulære geometrier; c det er fleksible, således at flere sektorer kan føjes til modellen i fremtiden uden at ændre de eksisterende geometrier; og (d) det er fladt i sin vertikale skala at lette næringsstof diffusion.
    2. Lad center af propellen være oprindelse og bruge symbolerne R0, F1og F2 til at repræsentere den maksimal radius af inderkreds, midterste sektorer og ydre sektorer, henholdsvis. Brug symboler m og n til at repræsentere antallet af interne buer og eger inde området sektor henholdsvis.
    3. Beregne koordinaterne for hvert knudepunkt på propel-lignende model og skrive dem i de symbolske udtryk af R0, R1, Rasmussen2, mog n.
    4. Starte et program script, angive R0, R1, Rasmussen2, mog n som variabler og input det symbolske udtryk for hver centrale node.
      Bemærk: Henvise til Bordet af materialer for software-information.
    5. Arrangere en sti, der forbinder knudepunkter og tildele en patron til den inderste cirkel, de midterste sektorer og den ydre sektor. Indstille lagtykkelse at være 150 µm og antallet af lag, der skal være 4.
    6. Lad programmet output en tekstfil i G-code-format, der genkendes af bioprinter.
    7. Sæt R0 = 3,85, R1 = 6,85, Rasmussen2 = 8,65, m = 2 og n = 5. Kør scriptet og hente den genererede fil, G-code. Afskrift og opklæbe fil hen til den bioprinter dedikeret G-code mappe.
    8. Tænd for bioprinter og dens kontrol software. Initialisere printeren. Åben G-code scriptet netop skabt og indstille alle belastninger til nul. Retur til kontrol software, skal du klikke på fanen blomsterdekoratør generator, og klik derefter på knappen Kør på nederste højre hjørne. Observere bevægelige stien til printeren.
      Bemærk: Dette vil teste præcisionen af den genererede G-kode. Henvises til Tabel af materialer til oplysninger i forbindelse med bioprinter.
    9. Dette trin er valgfrit. Opbygge en demonstrativ 3D model baseret på parametrene over via computerstøttet design (CAD) programmel.
      Bemærk: Henvise til Bordet af materialer til software kreditoroplysninger.
  2. Gøre en celle-belæsset A3G7 hydrogel forløber
    Bemærk: Trinnene i dette afsnit skal udføres under sterile forhold. Holde bioprinter inde i et BSC.
    1. Sterilisere bioprinter ved sprøjtning 70% ethanol grundigt og udsætter det for UV-lys om natten.
    2. Tag en sprøjte af hydrogel forstadie (ved 4 ° C) og varm det i et vandbad ved 37 ° C i 1 time.
    3. Tage T-kolben med celler (Se trin 1.3) fra CO2 inkubator og placere den inde i et BSC. Kassér næringssubstratet og skyl celler med DPBS to gange. Tilføje en varmede trypsin-EDTA-oploesning (3,0 mL) og inkuberes celler ved 37 ° C i 6 min. Deaktiver trypsin med en samme volumen af FBS. Tælle celler benytter trypan blå assay.
    4. Tage sprøjten af hydrogel forløber fra vandbadet, rense den og sterilisere det med 70% ethanol. Sætte sprøjten i BSC.
    5. Presse ca. 3 mL hydrogel forløber i en 10 mL udskrivning patron. Bland forløberen med MDA-MB-231-NGL celler ved 1 x 106 celler/mL af langsomt pipettering det, at undgå produktion af bobler. Dækker patronen med steril ende og top hætter og forsegle det med paraffin film. Der centrifugeres ved 834 x g i 1 min til at fjerne eventuelle gasbobler produceret.
    6. Gentag trin 3.2.3 - 3.2.5 for IMR-90-mCherry celle-belæsset forløber og den celle-fri forløber.
    7. Sterilisere alle 3 patroner med 70% ethanol og derefter indlæse dem i kamre i bioprinter. I kontrol-printersoftwaren Indstil blækpatron temperaturen til 25 ° C. Vente 35 min til at tillade forstadiet til nå printable betingelser.
      Bemærk: Denne gang påvirker ikke levedygtigheden af de celler, der er indlejret i hydrogel.
  3. 3D udskrivning modeller
    1. I kontrol-printersoftwaren udvide fanen værktøj hoved i printersoftwaren kontrol, klik på 1 patron på den grafiske brugerflade i venstre side og derefter klikke på knappen foranstaltning kort for at måle placeringen af dyse tip. Gentag dette for de andre 2 patroner.
    2. Placer en klar polystyren mikrotiterplade, Åbn filen G-code og ændre trykket til 200 kPa for alle patroner. Retur til kontrol software, skal du klikke på fanen blomsterdekoratør generator, Vælg et punkt for at starte udskrivningen, og klik derefter på knappen Kør på nederste højre hjørne. Gentag dette trin for at få 3 flere replikater.
    3. Efter udskrivning alle replikater af propel modeller, tilføje en 100 mM CaCl2 løsning at krydse-link modeller i 1 min. og skyl det 2 x med DPBS at fjerne overskydende af Ca++ ioner.
    4. Omhyggeligt overføre modeller på en Agarosen-belagt 6-godt tallerken ved hjælp af en spatel. Tilsættes 5 mL af DMEM media til hver brønd. Inkuber plader i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
      Bemærk: Sørg for modellerne er flydende i brøndene.
    5. Erstatte cellekulturmedium med friske medium hver 3 dag, kultur det i 30 dage i alt.

4. levedygtighed og klumpformet dannelse eksperimenter på Hydrogel diske.

  1. Hydrogel disk forberedelse
    1. Gentag trin 3.2.1 - 3.2.6.
      Bemærk: Det er muligt at erstatte patronen med en lille steril beholder.
    2. Bruge en steril gradueret 1 mL sprøjte og skære dyse for at oprette et stort hul i sprøjten (hullet har samme diameter som resten af sprøjten tube). Rengør det med 70% ethanol og forlade det, indtil det er tørt.
      Bemærk: Gør dette i en steril BSC.
    3. Bruge en godt-plade låg, tilføje 100 mM CaCl2 , indtil overfladen er dækket; derefter tag den celle-belæsset hydrogel til at fylde sprøjten; presse 100 µL ved hjælp af hængende drop metode. Lad hydrogel i 1 min. og skyl det med overdreven DPBS. Overføre hydrogel diske på en Agarosen-belagt 6-godt tallerken, tilsættes 5 mL af basal DMEM og inkuberes dem ved 37 ° C og 5% CO2 i op til 30 dage. Opdater medium hver 3 dage.
  2. Celle og klumpformet levedygtighed
    1. Bruge en MTS analyse til at bestemme cellernes levedygtighed. Vask hver disk med DPBS og skæres i 4 dele med en fin sterile blade. Indsamle delene af hele disken og overføre dem til en 96-brønd plade. Derefter Tilsæt 100 μL af DMEM plus 20 μL MTS reagens til hver brønd og Inkuber blanding ved 37 ° C i 2 timer.
    2. Efter MTS reaktion, inddrive supernatanten og overføre det til en ren 96-brønd plade. Absorbansen af prøverne på 490 nm.
  3. Klumpformet dannelse
    1. Tag den rugede propel eller disk model fra rugemaskinen på dag 0, 7, 15, 21 og 30 af kultur og overføre dem til en ren 6-godt plade.
    2. Bruge en Konfokal spinning disk inverteret mikroskop til at visualisere spheroids og erhverve billeder ved hjælp af flere positioner og z-stakke. Billede hver propel eller disk model, langs dets vandrette diameter fra venstre mod højre med en 500 µm gap og erhverve en z-stak fra bunden til top brændplanet på hver vandret position.
      Bemærk: Henvise til Bordet af materialer til kreditoroplysningerne.
    3. Rekonstruere billedet med en maksimal stak aritmetiske værktøj, leveres af programmet ImageJ, for at skabe 2D-billeder bruges for en klumpformet analyse.

5. scanning elektronmikroskopi (SEM)

  1. Forberede calciumalginat/gelatine hydrogel som beskrevet i trin 1.2.
    Bemærk: Sterile forhold er ikke påkrævet.
    Forsigtig: Flydende kvælstof og PARAFORMALDEHYD er farlige og skal håndteres med omhu.
  2. Lagt 1 mL af hydrogel i en morter, tilføje flydende kvælstof, og male det med en pistil. Fortsæt med at tilføje flydende nitrogen for at undgå hydrogel fra afrimning. Overførsel af pulver i en 1,5 mL-centrifugerør og forsegle det opbevares ved-80 ° C for 2 h. frysetørre prøven for 24 timer.
  3. For klumpformet imaging, vaske hydrogel forsigtigt med DPBS 2 x, lave cellerne ved nedsænkning i 4% PARAFORMALDEHYD i 30 minutter ved 37 ° C, og derefter skylle dem med DPBS og fryse dem med flydende kvælstof. Endelig, frysetørre prøven for 24 timer.
  4. Analysere hydrogel/klumpformet struktur og morfologi med en scanning elektron mikroskop (SEM) på 25,0 kV, under 70 Pa (kammeret pres) med en forstørrelse på 40 X op til 5 000 X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temperatur feje viser en tydelig forskel på A3G7 forløber på 25 ° C og 37 ° C. Forstadiet er flydende ved 37 ° C og har en kompleks viskositet af 1938.1 ± 84,0 mPa x s, som er valideret af en større G "over G'. Da temperaturen falder, gennemgår forløberen fysiske gellation på grund af den spontane fysiske indvikling af gelatine molekyler i en tri-helix dannelse29,30. Begge G' og G "øge og konvergerer på 30.6 ° C, med angivelse af en sol-gel overgang. Moduli fortsætter med at stige med nedsat temperatur, nå 468.5 ± 34,2 Pa G' 140.7 ± 9.3 Pa G "ved 25 ° C (figur 1a). Baseret på resultaterne af temperatur feje, valgte vi 25 ° C som udskrivning temperaturen. Gellation kinetik eksperiment simulerer de temperaturforandringer, der opstår under forberedelse af prøver og håndtering (dvs., at fjerne prøven fra 37 ° C vand bad og placere det i 25 ° C bioprinter kammer). G ", G", og | η * | stige med tiden sænkes temperaturen, og sol-gel overgangen sker på ~ 17 min ved 25 ° C, når G' ≈ G "≈ 64,3 Pa og tab-faktor er lig med 1 (figur 1b og 1 c). Forløberen fortsætter med at stivne og når en udskrivning vindue efter 50-90 min for gellation. Inden for denne udskrivning vindue, man forløber, der kan være glat ekstruderet ved hjælp af et G25 cylindrisk mundstykke med et tryk på 200 kPa. Eksistensen af udbyttet stress indebærer en solid-lignende opførsel af materialet og rejser den strukturelle integritet efter ekstrudering til at modstå dens egen vægt31. Stress rampen genkender udbytte stress på forskellige tidspunkter af gellation. Resultaterne viser, at udbyttet stress stiger med stigende gellation tid. 50 min. for gellation, udbyttet stress når 325.9 Pa, sikre at modellen er stabil efter ekstrudering.

Den trykte propel model er vist i figur 2a. Konfokal mikroskopi bekræfter de indledende ekstrudering steder både MDA-MB-231-NGL og IMR-90-mCherry celler (figur 2b). MDA-MB-231-NGL celler begynder at udvikle spheroids 15 dage i perioden kultur, efterfulgt af øgede størrelse og antal spheroids indtil dag 30 (figur 2 c - 2f). Nogle af IMR-90-mCherry cellerne danner også bymæssige områder (figur 2 g - 2j). Mærkbart, efter 30 dage af kultur, er IMR-90-mCherry celler observeret i regionen i første omgang besat af MDA-MB-231-NGL celler (figur 2f), antyde mulig overflytning begivenheder i modellen. Ligeledes kan overflyttede MDA-MB-231-NGL celler også observeres i regionen IMR-90-mCherry dominerede på dag 30 (figur 2j).

Disk modellen er vist i figur 3a. Konfokal mikroskopi bekræfter homogen celle distribution på disken (figur 3b). MDA-MB-231-NGL celler opfører sig på samme måde i disk modellen, som de gjorde, da udskrives som en propel model. Repræsentative billeder vises i figur 3 c - 3f. SEM imaging afslører en MDA-MB-231-NGL klumpformet-laden hydrogel efter 21 dage af kulturen (figur 4a). Generation, og tilstedeværelsen af sfæroide er valideret ved at sammenligne SEM billederne med celle-gratis hydrogels (figur 4b).

Begge celletyper celle levedygtighed er blevet demonstreret i figur 4 c. MDA-MB-231-NGL celler udtrykker en højere cellernes levedygtighed i forhold til IMR-90-mCherry celler. Interessant, udviser MDA-MB-231-NGL celler en øget tendens til levedygtighed inden dag 15, med en tredobling af antallet af levedygtige celler i forhold til dag 0. Dette efterfølges af et fald på dag 21, før at inddrive igen på dag 30. Derimod har IMR-90-mCherry celler minimal udsving i levedygtighed under hele perioden kultur. De faldende værdier i levedygtighed MDA-MB-231-NGL celler i dag 21 svarer til en stor MTCSs formation, som har udviklet nekrotisk kerner.

Figure 1
Figur 1: rheologiske karakterisering af hydrogel forløber. (en) A temperatur feje viser sol-gel overgangen ved 30.6 ° C. (b-c) Gellation kinetik af A3G7 forløber viser en stigning på G', G ", og | η*| på tidspunktet for gellation og sol-gel sker overgangen på ca 17 min ved 25 ° C. (d) dette panel viser udbyttet stress af forløber versus tid af gellation. En stigning af udbyttet stress er observeret med en længere geldannende tid. Resultaterne er vist i gennemsnit ± SD, n≥ 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: MCTS dannelse i et 3D bioprinted in vitro model bestående af IMR-90-mCherry myofibroblast og MDA-MB-231-NGL brystkræftceller. (en) disse fotografier show bioprinted in vitro- proeven (venstre) og CAD-modellen (til højre). (b) denne repræsentative Konfokal time-lapse billede viser MDA-MB-231-normal god landbrugspraksis (grøn) og IMR-90-mCherry (rød) celler bioprinted inden for modellen. (c - f) Disse zoom-ins Vis regionerne MDA-MB-231-NGL celler (hvide stiplede bokse). (g - j) disse zoom-ins Vis IMR-90-mCherry celle regioner (gule stiplede bokse). Skala barer er 2 mm, bedømmelseskomite 2a, 1 mm i panelet 2bog 500 µm i paneler 2 c - 2j for udvalgte områder, og forstørrelsen er 10 X. Kapital "D" i billeder betyder "days of kultur". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: MCTS dannelse inden for et 3D MDA-MB-231-normal god landbrugspraksis-laden hydrogel disk. (en) Dette fotografi viser en hydrogel disk. (b) denne repræsentative Konfokal billede viser MDA-MB-231-NGL celler indlejret i sammensat. (c-f) Disse zoom-ins Vis MDA-MB-231-NGL celle regionen (hvide stiplede boks i panelet 3b) ved (c) 0, (d) 7, (e) 15, og (f) 21 dage af kultur. Skala barer er 2 mm, bedømmelseskomite 3a, 1 mm i panelet 3bog 500 µm i paneler 3 c - 3f for udvalgte områder, og forstørrelsen er 10 X. Kapital "D" i billeder betyder "days of kultur". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: morfologi og celle levedygtighed af MTCSs. (en) denne SEM billede viser en MDA-MB-231-NGL MCTS inden for gel efter 21 dage af kultur, viser små MCTS (pil-pegede). (b) denne SEM billede viser en calciumalginat/gelatine hydrogel uden celler. Forstørrelsen er 350 X. (c) dette panel viser cellernes levedygtighed af MDA-MB-231-NGL og IMR-90-mCherry i 30 dage af kultur inden for hydrogel. Resultaterne blev analyseret som den gennemsnit ± SD og analyseret statistisk ved hjælp af en to-vejs ANOVA og en Bonferroni post-test. Pedersen (*) < 0,05, n ≥ 3. Dataene blev normaliseret til celle tæthed bruges til at oprette prøverne på dag 0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Celle-belæsset strukturer kan blive kompromitteret, hvis forurening (biologiske eller kemiske) opstår på ethvert tidspunkt i processen. Normalt, biologisk forurening er set efter to eller tre dage af kulturen som en farve ændring i kultur medier eller bioprinted struktur. Derfor, sterilisation (fysisk og kemisk desinfektion) er et afgørende skridt for alle de celle-relaterede processer. Bemærkelsesværdigt, autoklavering gelatine ændrer sin geldannende egenskaber, som gjorde det gel langsommere i de forsøg, vi har udført. Derfor, vi steriliseret calciumalginat og gelatine magt via UV eksponering. På grund af den meget begrænsede udbredelse kapacitet af UV-lys, bør der anvendes et meget tyndt lag (< 0.5 mm). Koncentrationen af natriumalginat og gelatine kan ændres vilkårligt til at tune den mekaniske og biologiske egenskaber32. I det foreliggende arbejde valgte vi A3G7, fordi det giver ønskeligt trykproces under dets trykning vindue, og crosslinked hydrogel giver en høj stabilitet gennem 30-dages eksperiment. Opvarmning til 60 ° C, mens opløse pulveret i DPBS hjælper med at forbedre liquefication af gelatine, som letter omrøring. En lavere temperatur kan også bruges; dog vil en længere omrøring gang derefter være påkrævet.

Rheologiske temperatur sweep giver et sol-gel punkt på 30.6 ° C, som er kompatibel med andre publikationer33. Teoretisk, en temperatur højere end 30.6 ° C kan liquefy forløber. Vi valgte 37 ° C at forenkle arbejdet, som cellekulturmedium er pre varmet i et 37 ° C vandbad. Baseret på gellation kinetik (før forløber gel), er der ca. 17 min. for celle blanding; efter dette tidspunkt er blande cellerne og hydrogel forløber vanskelig på grund af den øgede viskositet og moduli, forårsager en uensartet celle-laden bioink. Vi foreslår derfor, håndtering af celle-blande arbejde inden for de første 10 min af geldannende. Udbytte stress er ikke anses for at være en væsentlig attribut, der påvirker trykproces indtil for nylig34; Uanset hvad, er det blevet grundigt anerkendt af polymer forskere som markør af pasty/prillet væske31,35,36,37. Eksistensen af udbyttet stress hjælper til at opbygge en strukturel integritet til at modstå sin egen vægt. En højtydende stress kan også kræve en øget opstart tryk i ekstrudering; således, dette kan resultere i skader på celler på grund af overdreven shear stress32. Model troskab kan blive kompromitteret, hvis ekstruderingsprocessen opstår uden for optimal udskrivning vindue. Fælles indikatorer for dette problem er vist i den endelige bioprinted struktur: det vil enten være for groft eller også flydende i kanterne. A3G7 forløber udstiller en optimal udskrivning vindue under 50-90 min. af geldannende, der tilfredsstiller både den strukturelle stabilitet og celle overlevelse og kan bruges som medium til at bygge heterogene tumor modeller14.

Den samlede højde på propel modellen er 600 µm som det er genereret fra fire lag 150 µm filamenter. Dette design giver mulighed for næringsstof og gas udveksling som celler er højst 300 µm fra overfladen at kontakte medierne under inkubation. Højere modeller er opnåeligt i fabrikation men er flaskehalsområder af begrænset diffusion afstand af næringsstoffer i den hydrogel38, hvilket kan resultere i en lav celle overlevelse i den centrale region.

Forskellige strategier er blevet udviklet til form MCTS i vitro, såsom hængende, drop mikrofluid chip, montage og bioprinting39. Dog kan nogle af disse metoder ændre den celle fysiologi og biokemi, generere forskellige celle handlinger, der forekommer i normal tumor væv. For eksempel, hængende drop metode styrker enkelt celler for at bo som celle aggregater gennem fysiske indeslutning40. Desuden kan den kemiske induktion til form MCTS ved et peptid ændre biokemi spheroids41. Hydrogel composite beskrevet her tillader en MCTS dannelse ved at skabe en biomimetiske miljø uden ydre stressorer. Starter ud som enkelt godt spredte celler, efter 7 dage af kulturer, celler omorganisere som små MCTS øge (mere end 6 celler pr. klumpformet), deres størrelse og mængde i løbet af 30 dage af kultur.

I resultaterne af denne forskning fandt vi at MDA-MB-231-NGL spheroids nedsætte cellers levedygtighed på dag 21, korrelerede dette fænomen med dannelsen af store spheroids. En solid tumor består af tre forskellige lag, hvorved det ydre lag præsenterer en høj spredning sats i forhold til det midterste lag og den interne nekrotiske eller senescent kerne af den sfæroide18. Dette kunne forklare levedygtighed nedgangen i resultaterne.

Denne begrænsninger i denne protokol er (1) bioink dynamik og (2) celle type kompatibilitet. Bioink dynamics refererer til de forskellige materialeegenskaber i løbet af gellation proces, hvilket resulterer i en optimal udskrivning vindue, over hvilket de udskrevne struktur er defekt. Celle type kompatibilitet refererer til uarbejdsdygtighed af visse celletyper (cellelinie eller primære kultur) til at udstille en indfødt i vivo -opførsel.

A3G7 hydrogel opnår en høj stabilitet og celle levedygtighed. 3D bioprinting kan bruges til at opbygge 3D heterogene sygdomsmodeller med høj overførselshastighed, lave omkostninger og høj reproducerbarhed som en mere realistisk alternativ til traditionelle cellekultur og små dyr tumor modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Tao Jiang tak Kina stipendium Rådet (201403170354) og McGill Engineering ph.d.-bedømmelse (90025) for deres stipendium midler. Jose G. Munguia-Lopez tak CONACYT (250279, 290936 og 291168) og FRQNT (258421) for deres stipendium midler. Salvador Flores-Torres tak CONACYT for deres stipendium midler (751540). Joseph M. Kinsella tak National Science og Engineering Research Council, den canadiske Foundation for Innovation, Townshend-Malene Stevnsbo Family Foundation og McGill University for deres finansiering. Vi vil gerne takke Allen Ehrlicher for at lade os bruge hans rheometer, Dan Nicolau for at lade os bruge hans Konfokal mikroskop, og Morag Park for at give os adgang til fluorescently mærket cellelinjer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433, (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7, (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15, (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244, (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116, (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25, (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34, (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20, (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7, (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33, (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4, (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34, (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6, (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1, (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32, (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32, (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33, (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35, (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13, (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49, (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49, (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8, (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32, (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8, (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42, (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53, (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33, (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18, (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506, (1-2), 148-157 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics