就地石蜡镶嵌成人珊瑚样品的杂交技术

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Summary

本议定书的目的是对已嵌入石蜡切片的成人珊瑚样品进行原位杂交, 并将其切片到玻璃滑梯上。这是一种定性的方法, 用于可视化的 RNA 反感探针在石蜡嵌入组织的空间表达。

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Traylor-Knowles, N. In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples. J. Vis. Exp. (138), e57853, doi:10.3791/57853 (2018).

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Abstract

珊瑚是重要的海洋无脊椎动物, 对整个海洋健康和人类健康至关重要。然而, 由于海洋温度上升和海洋酸化等人类影响, 珊瑚越来越受到威胁。为了应对这些挑战, 细胞和分子生物学的进步已经证明对诊断珊瑚的健康至关重要。修改人类医学常用的一些技术可以大大提高研究人员治疗和拯救珊瑚的能力。为了解决这一问题, 现已将一种主要用于人类医学和进化发育生物学的原位杂交协议用于在压力下的成年珊瑚中使用。

该方法的目的是可视化的 RNA 探针在成人珊瑚组织, 已嵌入石蜡和切片到玻璃幻灯片的空间表达。该方法的重点是去除样品的石蜡和补液, 对样品进行预处理, 以保证样品的渗透性, 预杂交孵化, rna 探针的杂交, rna 探针的可视化。这是一个强有力的方法, 当使用非模型有机体发现特定基因的表达, 并且协议可以很容易地适应其他非模型有机体。然而, 该方法是有限的, 因为它主要是定性的, 因为表达强度可能会因在可视化步骤中使用的时间量和探针的浓度而异。此外, 需要有耐心, 因为这个协议可能需要5天 (而且在许多情况下, 更长的时间) 取决于所使用的探头。最后, 非特异背景染色是常见的, 但这一限制可以克服。

Introduction

珊瑚是重要的生态系统建设者和重要的生物多样性的海洋和人类健康1,2,3。由于气候变化和其他人为的压力, 它们受到威胁, 许多珊瑚物种被认为是严重濒危的。因此, 需要细胞和分子工具来诊断珊瑚在压力下。此外, 对于在成人珊瑚组织中表达基因的地方, 几乎没有什么了解, 因此对这些基因的功能了解甚少。为了解决这个问题, 我们已经修改了原位杂交协议, 通常用于人类医学和进化发育生物学, 用于在成人珊瑚的石蜡嵌入组织样本。这项技术是最强大的, 当用于成年珊瑚已经经历了紧张的事件, 如接触热应力。然而, 这种技术可用于珊瑚的广泛的组织和生命阶段, 并不仅限于热应激珊瑚4,6,7。此外, 这种技术可以用于任何后生的组织或细胞只要有 cDNA 序列信息可用。

这种方法的目的是在成年珊瑚组织中可视化 RNA 探针, 这些细胞已经保存并嵌入石蜡切片并切片到幻灯片上。这种方法是一个强大的诊断工具, 允许在成人珊瑚组织中的核酸可视化。最初这种方法是为医疗诊断而开发的, 此后它已成为发展生物学和进化发育生物学8,9,10等领域的流行工具。当基因组和 transcriptomic 序列数据可用, 但空间基因表达模式未知时, 它也是一种关键方法, 特别是在非模型系统中。对于非模型系统的诊断工作, 这种技术是强大的, 因为它可以表明哪些细胞和组织表达感兴趣的基因, 并可以导致更有针对性的治疗方法8,9,10, 11,12。最后, 该技术在与定量基因表达数据配对时, 质量和功能更强11

本文概述的方法将感兴趣的研究人员已经设计了辛 (挖) 标记的 RNA 探针 (这两种感觉和反义探针), 现在准备进行原位杂交探针到一个样本。为了执行这种方法, 每一个正在测试的探针都需要两个连续切片的石蜡珊瑚组织。一节将用于感官探针, 另一个用于反义探针。感官探测器将是指示非特定绑定的控件。如果在感官探针中观察到染色, 则反义探针并不特定于感兴趣的 RNA。探针可以为任何表达的基因设计。在本议定书中, 以前发现在珊瑚热应激期间表达的几个例子: FBJ 小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源 b (Fos b), 激活蛋白 (AP1), 肿瘤坏死因子受体 41 (TNFR 41)11。使用挖掘标记的 RNA 探针比使用放射性探针更可取, 因为它们的处理更安全10。此外, 这项技术是高度敏感的, 可以执行广泛的组织和胚胎以外的热应力成人珊瑚13,14,15,16

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Protocol

1. 石蜡的去除

注意: 在通风罩下执行以下步骤。

  1. 脱蜡100% 二甲苯下的薄切片石蜡嵌入的幻灯片在玻璃 Coplin 罐子里10分钟。不要使用塑料 Coplin 罐子, 因为二甲苯熔化塑料。使用前, 在高压釜中消毒 Coplin 罐。
  2. 准备四无菌玻璃 Coplin 罐与以下: 100% 乙醇, 80% 乙醇, 70% 乙醇和60% 乙醇。用无 RNase 的水稀释乙醇。
    1. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 用100% 乙醇浸泡10分钟。10分钟后, 清空玻璃 Coplin 罐, 替换为新的100% 乙醇。再次浸泡10分钟的幻灯片。
    2. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 80% 乙醇为1分钟。
    3. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 70% 乙醇为1分钟。
    4. 将幻灯片转移到无菌玻璃 Coplin 罐中, 60% 乙醇为1分钟。

2. 制备 RNA 探针杂交的幻灯片前处理

  1. 在室温下进行以下洗涤, 除非另有规定。以低速速度在轨道振动筛上进行室温清洗。使用无菌幻灯片邮寄与房间多达五张幻灯片洗涤幻灯片。
  2. 将幻灯片转移到无菌幻灯片邮件, 18 毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。室温下洗5分钟。
  3. 倒入 1x PBS, 并立即用蛋白酶 K 处理幻灯片上的组织, 以使探针穿透组织。添加大约18毫升蛋白酶 K 溶液的幻灯片邮件 (见表 1的工作溶液浓度)。孵育37°c 15 分钟。不要动摇。
    1. 当幻灯片正在孵化时, 准备 prehybridization 缓冲区 (Prehybe 缓冲区)。将 Prehybe 缓冲液放在沸水浴中10分钟, 然后在冰浴上冷却5分钟。有关 Prehybe 缓冲区的食谱, 请参见表 1
    2. 通过浇注蛋白酶 k 溶液停止消化蛋白酶 k 反应, 并立即将18毫升0.2% 甘氨酸 PBS 溶液添加到滑动邮件中。让幻灯片邮件在室温下坐5分钟。
    3. 倒出0.2% 甘氨酸 PBS 解决方案, 并添加18毫升的2x 盐水柠檬酸钠 (SSC) 解决方案, 每个幻灯片邮件。在室温下将 2x SSC 中的幻灯片洗净10分钟, 以100-150 转每分钟的抖动为中心。

3. Prehybridization 在 RNA 探针杂交制备中的研究进展

  1. 当幻灯片使用 2x SSC 进行清洗时, 获取新的无菌幻灯片邮件, 并将大约18毫升的 Prehybe 缓冲区放入幻灯片邮件中。在杂交温度下将滑动邮件放入杂交烤箱。
    注: 杂交温度将取决于所使用的探针, 但通常范围从50-60 °c。
  2. 一旦 2x ssc 清洗完成, 倒出 2x SSC, 并把幻灯片在 Prehybe 缓冲区中的幻灯片邮件在杂交烤箱1小时。

4. RNA 探针的杂交

  1. 在杂交烤箱中用 Prehybe 缓冲器孵化时, 准备杂交探针溶液。
    1. 稀释每个探针在杂交缓冲 (0.5 µL 探针与24.5 µL 的杂交缓冲)。
      注: 杂交缓冲配方在表 1中找到。在特雷勒中可以找到探针的制备和浓度的例子. 11
    2. 将稀释探针放在86-90 摄氏度的散热块上12分钟, 然后在冰上冷却1分钟。
  2. 从杂交烤箱中取出幻灯片邮件, 然后使用无菌镊子从幻灯片邮件中单独删除幻灯片。将幻灯片平放在纸巾上, 仔细擦拭组织样本周围多余的 Prehybe 缓冲。小心不要接触样品, 并迅速工作, 以防止干燥的组织样本。
  3. 用 PAP 笔包围组织。应用25µL 稀释探针溶液与吸管和覆盖样品与塑料盖玻片。
    1. 将样品放在滑水室中, 用 4x SSC + 50% 甲酰胺溶液在会议厅底部放置。
    2. 一旦探头被添加到所有的幻灯片, 将滑动水分室放入杂交烤箱至少24小时在杂交温度为50-60 摄氏度。潜伏期可以根据探针的浓度而变化, 但至少要24小时。
  4. 在用稀释后的探针过夜孵化后, 从杂交烤箱中取出滑水室。
    1. 从每张幻灯片中取出盖玻片, 小心不要取代组织。在1000µL 吸管, 添加1000µL 的 2x SSC 解决方案, 并轻轻地清洗滑动。
    2. 将幻灯片放在无菌幻灯片邮件中, 18 毫升 2x SSC 解决方案, 室温5分钟。倒出解决方案, 并用18毫升新鲜的 2x SSC 取代它。在室温下再重复孵化5分钟, 轻轻摇动。
    3. 倒出 2x SSC 解决方案。添加18毫升的 1x SSC 溶液, 并在室温下清洗5分钟。倒出 1x ssc 解决方案, 并用18毫升的新鲜 1x ssc 替换它。在室温下, 重复5分钟的孵化, 轻轻摇动。
    4. 倒出 1x SSC。添加18毫升的 0.5x SSC 和洗涤10分钟, 在42摄氏度不摇晃。倒入 0.5x ssc, 并用18毫升的新鲜 0.5x ssc 替换它。再洗10分钟, 在42摄氏度不摇晃。

5. RNA 探针的可视化

注: 对于可视化探头, BM 紫色将在开发过程中使用。然而, 在这一步之前, 需要几个洗涤来准备样品染色。

  1. 用18毫升碱性磷酸酶缓冲液 (AP 缓冲器) 冲洗幻灯片, 不氯化镁2 1 分钟. 倒出 AP 缓冲器, 不氯化镁2, 并添加18毫升1x 勃林格-曼海姆堵塞缓冲剂稀释与马来酸缓冲。在一张滑动的邮件中, 以柔和的震动, 在室温下孵化至少1小时。
    注: 勃林格-曼海姆阻塞缓冲液和马来酸缓冲器是预制和购买在挖洗和块缓冲集 (可利用商业)。
    1. 另外, 可以在4摄氏度的一夜之间进行孵化。较长的阻塞期将减少非特定绑定的外观。
  2. 准备20毫升稀释挖抗辛-AP 的碎片 (抗挖抗体 = 2 µL 抗挖抗体 + 20 毫升1x 勃林格-曼海姆阻断缓冲)。这足够在1塑料幻灯片邮件中使用。如果要使用多个幻灯片邮件, 则必须准备更多此解决方案。
  3. 将抗挖抗体添加到新的无菌幻灯片邮件, 并将幻灯片传送到带有反挖抗体解决方案的幻灯片邮件。在室温下孵育3小时, 轻轻摇动。
  4. 孵化后, 倒出抗挖抗体, 用18毫升的 AP 缓冲器清洗幻灯片邮件中的幻灯片, 而不氯化镁2 5 分钟的柔和震动。
  5. 在没有氯化镁2的情况下,倒出 ap 缓冲器, 并添加18毫升的 ap 缓冲器。用柔和的震动洗5分钟。5分钟孵化后, 将 ap 缓冲液倒掉, 用18毫升新鲜的 ap 缓冲液代替, 用柔和的震动冲洗5分钟。
  6. 在黑暗中, 倒出 AP 缓冲区, 并添加18毫升的 BM 紫色的幻灯片邮件。在室温下在黑暗中孵化幻灯片, 检查紫色的颜色发展每½ h. 可视化的反应时间将根据正在开发的探针而变化。
    注意: 用 5-溴-4-氯-3-哚磷酸 (BCIP) 和硝基蓝四氮唑 (NBT) 来代替 BM 紫可视化开发解决方案。有关说明, 请参见表 1
  7. 通过将幻灯片转移到新的无菌滑动邮件收发器, 在室温下, 在黑暗中, 以18毫升的三 EDTA (TE) 缓冲器为5分钟, 停止颜色开发。
  8. 倒出 TE 缓冲器, 并添加18毫升的 RNase 免费水的幻灯片邮件和洗涤1分钟, 在黑暗中。
  9. 将幻灯片从水中取出, 在组织的边缘周围晾干。加入甘油安装培养基, 放置盖玻片。将幻灯片存储在4摄氏度, 直到图片准备就绪。

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Representative Results

完成该协议后, 将会对表达 RNA 探针的细胞和组织进行识别。该协议的代表性结果为 AP-1、FosB 和 TNFR41。这些结果, 以前发表的特雷勒-诺里斯11、在暴露于热应激的成人珊瑚上显示 RNA 探针的空间表达。图 1给出了两种不同染色类型的例子。图 1A是一种弥漫性组织染色的例子。染色是在整个组织中发现的, 不仅在特定的细胞中。在这里, 抗感 AP-1 的表达是在整个表皮和口腔 gastrodermis11 (图 1A) 中发现的。染色是弥漫的, 而不是隔离到一个特定的细胞类型。对于这种类型的染色, 这是特别重要的是运行一个感官控制的同时, 因为一些结果可能是由于非特异染色。

第二种类型的染色是细胞特异性的, 在其中染色只在特定的细胞类型中找到。两个 FosB (图 1B) 和 TNFR41 (图 1C) 显示这种类型的染色。这两种探针都被用于成人珊瑚的组织样本中, 暴露在热应激11。在反感面板中, 观察到紫色染色。TNFR41 是用不同类型的 cnidocytes 表达的, 这是一种仅在刺胞动物中找到的单元类型的系列 (图 1)。具体地说, 它玷污了产生 spirocytes 的 microbasic mastigophore 细胞器 (nematocysts) 和 spirocysts 的 nematocytes, 这些都是在珊瑚组织表皮内发现的。Nematocytes 也发现在其他组织层的珊瑚, 如 calicodermis;但是, 由于对此特定示例执行的切片, 无法收集这些信息。FosB 也染色了 cnidocytes, 是 spirocytes 和 nematocytes 特有的。对于这两种探头, 感官控制均无染色, 表明反感探针的染色确实是具体的。这只是两种类型的代表性结果 (弥漫性组织染色和细胞特异染色) 的染色技术, 可能存在不同类型的探针。由于这种变异, 使用感官控制来确定非特异染色是至关重要的。

Figure 1
图 1: 染色特定细胞的具有代表性的结果.(A) 在第一个面板中, AP-1 探头的感测控制表明, 在幻灯片中存在少量染色。在第二个面板中, AP-1 的抗感探针显示, 这个探针的染色在整个组织中是弥漫的。染色是特定于口腔 gastrodermis 和表皮。有了这种类型的染色, 运行感官控制是至关重要的, 以确保所观察到的染色是具体的。(B) 在第一个面板中对 FosB 探头的感官控制显示, 目前没有什么染色。在第二个面板中, FosB 的抗感探针显示 spirocytes 和 nematocytes 特有的染色, 整个表皮和口腔 gastrodermis 弥漫性染色。(C) 在第一个面板中, TNFR 41 探针的感官控制表明, 幻灯片上存在少量染色。在第二个面板中, TNFR 41 的反感探针显示了 spirocytes、nematocytes 和 microblastic mastigophores 中的特定染色。缩写: spirocytes (SP), symbiodium (SY), nematocyte (NE), microbasic mastigophores (毫米), 共生含 gastrodermal 细胞 (SU)。这一数字转载于许可11请单击此处查看此图的较大版本.

注:所有的稀释都应该用蒸压玻璃器皿中的无菌、RNase 的水来完成。
Prehybe 缓冲器 (50 毫升) 添加
甲 酰 胺 25毫升
20X SSC (pH 值 4.5) 12.5 毫升
20毫克/毫升肝素 0.1 毫升
50X Denhardts 5毫升
20% Tween-20 0.5 毫升
20% SDS 0.5 毫升
10毫克/毫升鲑鱼精子 DNA (变性前添加) 2毫升
RNase 免费水 4.4 毫升
注:溶液可在一次性50毫升管中进行。在加入溶液之前, 应在热块上煮沸5分钟, 将鲑鱼精子变性。
杂交缓冲 (47 毫升) 添加
甲 酰 胺 25毫升
20X SSC (pH 值 4.5) 12.5 毫升
20毫克/毫升肝素 0.1 毫升
50X Denhardts 5毫升
20% Tween-20 0.5 毫升
20% SDS 0.5 毫升
10毫克/毫升鲑鱼精子 DNA (变性前添加) 2毫升
RNase 免费水 1毫升
注:溶液可在一次性50毫升管中进行。在加入溶液之前, 应在热块上煮沸5分钟, 将鲑鱼精子变性。
10X PBS (1.0 升) 添加
18.6 mM NaH2PO4 2.56 克
84.1 毫米 Na2HPO4 11.94 克
1750毫米氯化钠 102.2 克
备注:将磷酸盐混合在大约800毫升的水中, 用于1.0 升容积。检查 pH 值。应该是 7.4, 0.4。否则, 用盐酸氢氧化钠将 pH 值调整为 7.4. 加入 NaCl 和其他水。经过 pH 值调整后的高压釜。
20X SSC (1.0 升) 添加
3 M 氯化钠 175.3 克
0.3 米柠檬酸盐 88.2 克
备注:混合在大约800毫升的 RNase 免费水带来1.0 升量。将 pH 值调整为4.5 和高压釜。
碱性磷酸酶 (AP) 缓冲器, 氯化镁2 (50 毫升) 添加
1 M 氯化钠 5.0 毫升
1米三, pH 值9。5 5.0 毫升
20% Tween-20 1.25 毫升
RNase 免费水 38.75 毫升
备注:准备前使用50毫升管。
碱性磷酸酶 (AP) 缓冲器 (100 毫升) 添加
1 M 氯化钠 10.0 毫升
1 M 氯化镁2 5毫升
1米三, pH 值9。5 10毫升
20% Tween-20 2.5 毫升
RNase 免费水 72.5 毫升
: 准备前使用50毫升管。解决方案将在几个小时后变得多云, 不再为酶反应工作。
AP 基板解决方案 添加
AP 缓冲区 25毫升
Nbt 82.5 uL
BCIP 82.5 uL
: 这可以代替 BM 紫色。准备前使用50毫升管。把这个解决方案在黑暗中, 覆盖管在箔, 并准备在低光。
蛋白酶 K 库存溶液 (10 毫克/毫升) 添加
蛋白酶 K 10毫克
RNase 免费水 10毫升
备注:整除和存储在-20 摄氏度。
蛋白酶 K 工作液 添加
蛋白酶 K 库存液 90 ul
1X PBS 18毫升
备注:在使用前先做最好的结果。
0.2% 甘氨酸 PBS 溶液 添加
10X PBS 45毫升
RNase 免费水 405毫升
甘 氨 酸 1克
: 准备蒸压玻璃容器。将室温混合在 stirer 板上, 直到甘氨酸完全溶解为止。
勃林格-曼海姆阻挡缓冲器 (30 毫升) (部分的挖掘洗涤和块缓冲集) 添加
10x 阻塞解决方案 3毫升
1x 马来酸缓冲液 27毫升
备注: 在使用前先作最佳效果。采用 "挖洗和块缓冲集" 的方法, 对库存堵塞溶液和马来酸缓冲液进行了应用。
4X SSC—50%formamide (30 毫升) 添加
20X SSC 6毫升
50% 甲酰胺 24毫升
备注:准备前使用50毫升管。在实验室罩下准备。
甘油安装介质 添加
50毫米三, pH 值8。4 80µL
甘油 20µL

表 1: 用于执行的库存解决方案就地杂交.该表列出了此协议所需的不同库存解决方案。估计总金额约为2张幻灯片邮寄人的性能。建议根据正在处理的幻灯片数量调整总金额。

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Discussion

本协议中描述的方法已从以前在医学和进化发展研究89101217中的工作中进行了修改。该协议的重点是在原位杂交的细微差别与挖掘标记 RNA 反意识探针的成年珊瑚, 已保存和嵌入石蜡。这种方法可以很容易地转移到生物样本以外的珊瑚, 也已石蜡嵌入。最后, 这种方法可以在珊瑚的不同生命阶段 (幼虫) 或细胞培养过程中进行, 但确切的协议可能不同, 因为这些类型的样品并不总是石蜡嵌入5,6.

该协议中有几个关键步骤, 包括蛋白酶 K 处理、探针杂交和探针的颜色发展。在蛋白酶 K 治疗过程中, 时间是非常重要的。如果治疗比建议的长, 组织可能变得退化和损坏。此外, 蛋白酶 K 反应的停止应在指定的全时间点执行。保持样品在恒定的杂交温度下也是非常重要的, 因为温度的降低会导致探针的非特异结合, 并使结果复杂化。清洗探头时, 重要的是每次从杂交烤箱中取出每张幻灯片, 而不是一次一次, 以确保在低温下, 这些幻灯片不会与探针杂交。此外, 在探针杂交后彻底清洗幻灯片将有助于防止非特定绑定。最后, 探针的颜色开发是这一过程中最关键而又主观的步骤之一。颜色的发展可以很容易过头或停止太快。这一步需要耐心和警惕, 以确保不发生对幻灯片的过度染色。

由于涉及的步骤数, 此协议的疑难解答可能是一个艰巨的过程。如果协议产生负面结果, 最好先检查探针以确保它是反感 (而不是感) 探针。此外, 如果解决方案是旧的, 它是值得改造或更换他们, 使他们是新鲜的, 当执行此协议。修改, 如杂交和阻断的长度, 可以实现增加探针杂交的机会或减少的背景和非特异染色的数量。由于该协议中的步骤数量很高, 因此可能会很容易丢失跟踪。因此, 保持组织并跟踪协议的哪些部分已经完成是很重要的。此外, 确保不跳过任何步骤, 并且在孵化和洗涤过程中不削减时间是至关重要的。一个好的经验法则是允许更长而不是更短的洗涤, 以确保所有的幻灯片被彻底清洗。

这种方法最大的局限性是结果不能量化。这是一种定性的方法, 与其他方法, 如组织学, 转录组学和蛋白质组学, 是非常丰富的信息。由于杂交时间的变化以及可视化过程中的主观时间, 对染色强度的量化是不易完成的。很诱人的说法是, 如果探针表现出更强的强度, 它的表达就会更高, 但是由于这个协议的变化 (例如颜色发展所允许的时间量), 基因表达量无法确定。

这种技术不是生物学的新方法;然而, 它是一个不经常执行的成人珊瑚。这种方法在成年珊瑚的使用是非常强大的, 因为它锚定基因表达数据的组织或细胞类型11。转录组学和基因组学已成为珊瑚生物学中流行和有力的工具;然而, 这些方法一般是在组织匀浆的整个动物身上进行的。这使得确定珊瑚的哪些部分表达了感兴趣的基因是很有挑战性的, 因此了解实际的机制更具挑战性。通过与基因表达数据的使用, 一个更全面的方法, 在哪里和在何种程度上表达基因是可以实现的。这将大大有助于理解的机制, 负责不同的压力反应路径的成人珊瑚。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作是由奖项资助的。OCE-1323652 通过国家科学基金会海洋科学博士后奖学金和1012629号奖, 来自宝来康威基金博士后浓缩计划。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Denhardt's solution Affymetrix 70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
Slide mailers Fisher 12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
50 mL Falcon tubes Fisher 14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Invitrogen AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
Slide white apex superior adhesive Leica Biosystems 3800080
PBS solution, pH 7.4 Life Technologies 10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL New England Biolabs P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker Promega 22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Roche 11093274910
BM Purple, 100 mL Roche 11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set Roche 11585762001
NBT/BCIP Roche 11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size Sigma-Aldrich 252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration Sigma-Aldrich S6639-1L
Acetic Anhydride Sigma-Aldrich 320102-100ML
Formamide Sigma-Aldrich 47670-250ML-F
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use VWR MK866806
Ethanol VWR EM-EX0276-4S
TE buffer VWR PAV6232
hybridization oven VWR 97005-252, 97005-254
Orbital shaker VWR 89032-088

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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