蝗虫下颚触角 Basiconica 单触角记录

Neuroscience

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Summary

本文介绍了触角 basiconica 瓣昆虫口器的单触角记录的一种详细、高效的协议。

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Li, H., You, Y., Zhang, L. Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica. J. Vis. Exp. (136), e57863, doi:10.3791/57863 (2018).

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Abstract

蝗虫口器的瓣被认为是传统的味觉器官, 在蝗虫的食物选择中起着重要作用, 特别是通过触角 chaetica 检测非挥发性化学线索 (以前命名的终端触角或冠触角)。现在越来越多的证据表明, 这些瓣也有嗅觉功能。气味受体 (LmigOR2) 和气味结合蛋白 (LmigOBP1) 已分别在神经元和附属细胞, 在触角 basiconica 的瓣。单触角记录 (SSR) 用于记录气味受体神经元的反应, 是筛选特异气味受体活性配体的有效方法。SSR 用于下颚触角气味受体的功能研究。位于瓣圆顶上的触角 basiconica 的结构与天线上的结构有一定的不同。因此, 当执行气味引起的 SSR 时, 一些特定的建议可能有助于获得最佳结果。本文介绍了一种针对昆虫下颚触角 basiconica 的 SSR 的详细、高效的协议。

Introduction

动物已经进化出一系列的化学感受器官来感知外源化学线索。在昆虫中, 最重要的化学感受器官是触角和瓣。在这些器官, 几种类型的化学感受毛, 称为化学感受触角, 是支配的化学感受神经元 (国别战略说明) 在头发。国别战略说明在化学感受触角识别特定的化学线索, 通过信号转导从化学刺激到电位, 随后转移到中枢神经系统1,2,3.

国别战略说明表达各种化学感受受体 [例如, 气味受体 (口服)], 离子型受体 (IRs) 和味觉受体 (GRs) 在他们的细胞膜上, 编码外源化学线索相关的不同类型的 chemosensation4,5,6。国别战略说明的特性是阐明昆虫 chemoreception 细胞和分子机制的关键。现在单触角记录 (SSR) 是一种广泛使用的技术, 用于国别战略说明昆虫的触角触角的特征, 包括蝇7、蛾8、甲虫9、蚜虫10、蝗虫11和蚂蚁12。然而, 很少有研究将 SSR 应用于昆虫瓣1314151617, 因为它们的触角的特殊结构使电生理记录困难18

成群的蝗虫 (直翅目) 经常造成严重的农作物损害和经济损失19。瓣被认为在蝗虫2021222324的食物选择中起着重要作用。采用扫描电镜 (SEM) 对两种化学感受触角进行了研究。通常, 350 触角 chaetica 和 7-8 触角 basiconica 在蝗虫的每个圆顶瓣18被观察。触角 chaetica 是味觉触角, 感觉非挥发性化学线索, 而触角 basiconica 有嗅觉功能, 感知挥发性化学线索。

在蝗虫瓣, 触角 basiconica (约12µm) 的毛插座直径比触角 chaetica (8 µm)18,25大得多。瓣上触角 basiconica 的表皮壁比触角触角18厚得多。另外, 下颚的圆顶在高度灵活的角质层之内有液体内容。这些特征意味着, 微电极的穿透和良好的电生理信号的获得比触角触角更困难。本文提出了一种用于蝗虫下颚触角 basiconica 的详细、高效的 SSR 协议。

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Protocol

1. 仪器和昆虫的制备

  1. 制备钨电极和刺激溶液
    1. 固定一个新的钨线 (直径为0.125 毫米, 长度为75毫米) 成一个机器人, 并锐化它在 10% (瓦特/v) 亚硝酸钠 (纳米2) 溶液中的一个注射器在 10 v 在一个显微镜 (40X 放大倍数) 的电源提供约1分钟。
    2. 将锐钨丝反复浸入10% 纳米2溶液中, 约4毫米, 5 V < 1 分钟 (图 1A)。
    3. 在显微镜下经常检查削尖钨尖的直径, 直到它足够细, 才能穿透蝗虫下颚嗅触角的角质层 (图 1B)。
    4. 准备刺激方案。稀释矿物油中的化学刺激物质。稀释 1-壬醇和壬酸在10% 稀释。稀释 E-2-hexenal 和己醛在 10-2, 10-3, 10-4和 10-5
    5. 准备带刺激的巴斯德管: 将滤纸条 (长度2厘米, 宽度0.5 厘米) 插入巴斯德管, 将稀释后的刺激方案 (每10µl) 添加到滤纸条上, 然后用吸管尖 (1 毫升) 塞巴斯德管。
  2. 准备昆虫
    1. 后蝗虫 (飞蝗) 与新鲜小麦幼苗在拥挤的条件下, 在相对湿度 60%, 温度为 28-30 摄氏度, 和光周期 18:6 h (光线: 暗)。选择1至3天龄的蝗虫若虫,用细剪刀取下天线, 以避免记录时出现干扰。
  3. 蝗虫上颌下颚支架的研制
    1. 使用玻璃滑块 (25 毫米 x 75 毫米) 作为上颌下颚支架 (英里) 的基础。将塑料件 (高度为1毫米, 宽度为10毫米, 长度35毫米) 到玻璃滑轨的一角, 用双面胶带, 最后用双面胶带固定在塑料件顶部的盖玻璃 (18 毫米 x 18 毫米)。将一小块红色橡胶胶带放到盖玻璃上作为防滑层。塑料件和盖玻璃构成蝗虫下颚的平台。平台的高度大约是1.5 毫米。
    2. 安装一根钨线 (直径为0.125 毫米, 长度为36毫米), 其距离与平台内边缘平行1.5 毫米。用双面胶带将导线两端固定在平台上。

2. 蝗虫上颌瓣的制备

  1. 将离心管 (1.5 毫升) 垂直切成两半, 并切断底部。把蝗虫放进准备好的管子里。离开腹侧区域和蝗虫头暴露。用双面胶带将组件固定在玻璃滑轨上 (图 2A)。
  2. 把右上颌下颚到平台上。
  3. 把钨线放在下颚的第四段。将胶粘剂腻子放在钨线的两侧, 大约2毫米从上颌下颚 (图 2A2B)。

3. 单触角录音

  1. 在显微镜下用低倍率 (100X) 将蝗虫上颌下颚准备。调整准备位置, 直到下颚垂直于记录电极 (图 3A)。
  2. 使用机器人将参考电极 (钨电极) 插入蝗虫眼中。将记录电极 (钨电极) 移动到与上颌下颚接近的机器人 (图 3B3C)。
  3. 将气味传递装置调整至上颌下颚约1厘米 (图 3B)。
  4. 打开录音软件自动钉32。设置记录参数, 如下所示: 500 µV 的记录刻度;过滤器的高截止度在300赫兹, 低截止在200赫兹;和 pretrigger 在十年代。
  5. 将录音电极连接至10x 通用交流/直流放大器。
  6. 将显微镜切换到高放大倍数 (500X)。将录音电极插入上颌下颚上的 basiconic 触角的底部, 并微妙地调整记录电极以获得良好的自发峰值 (图 3D)。
  7. 打开刺激控制器, 以提供一个连续的气流在20毫升/秒. 将刺激时间设置为1秒, 在刺激脉冲启动前十年代开始, 记录信号为十年代。
  8. 使用10x 通用交流/直流放大器来放大信号。把信号送进 IDAC 4。用自动道钉32软件分析信号。交流信号是带通滤波在200到300赫兹之间. 使用自动尖峰32区分峰值与槽幅的噪声。计算神经元的响应, 作为动作电位频率 (峰值每秒) 在自发频率上的增加。使用 GraphPad 棱镜7进行统计分析。

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Representative Results

基于不同反应动力学的化学气味 (10% 1-壬醇和10% 壬酸), 确定了蝗虫上颌下颚的两个触角亚型 (pb1 和 pb2)。pb1 神经元的峰值比壬酸大 1-壬醇, 而 pb2 的神经元比壬醇酸显著降低1壬的活化 (图 4)。己醛和 E-2-Hexenal 能诱发蝗虫下颚26的开放反应。己醛是一个丰富的寄主植物绿叶挥发性, 这可能有助于进一步确认食品来源26。在 pb1 神经元中的峰值在 E-2-hexenal 刺激的时候比 pb2 的长, 而它们的持续时间也会延长 (图 4)。pb1 和 pb2 中的神经元对己醛的反应也同样强劲 (图 4)。在刺激后的 5 s 期间和5秒之间所有峰值的平均变化比较表明, 对 1-壬醇的反应明显高于 pb1 壬酸, 但在 pb2 (图 5) 中相反。触角的两种亚型神经元对 E-2-hexenal 和己醛反应剂量依赖性, 它们对这两种醛的反应模式不同 (图 6A6B)。

Figure 1
图1。电极制备.(A) 本面板显示电极锐化装置的一般观点。含有10% 纳米2 (左) 的注射器用于锐化电极 (右)。(b) 本小组对电极提示 (a: 适用; b: 不合适) 进行仔细查看。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。蝗虫上颌下颚保持架 (米/秒).(a) 在显微镜下将每小时和一只蝗虫安装在玻璃滑梯上。(B) 这个小组显示了在平台上用钨线固定的蝗虫上颌下颚的特写。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。单触角录音.(A) 本小组展示了电生理学设置的观点。(B) 本小组对在显微镜下安装的蝗虫制剂有密切的看法。(C) 该图像显示蝗虫上颌下颚的放大率为100X。(D) 此图像显示下颚的放大倍数为500X。箭头指示 basiconic 触角。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。蝗虫上颌下颚单触角记录的反应痕迹.在这个小组中, pb1 代表下颚触角 basiconica 的亚型 1;pb2 代表下颚触角 basiconica 的亚型2。痕迹上方的条形指示刺激持续时间 (1 秒)。对于这些录音, 所有气味在10% 稀释使用除了 E-2-hexenal 和己醛, 稀释到1%。这个数字已经从张上改了。26.请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 5
图5。壬酸和 1-壬醇刺激的 pb1 和 pb2 神经元中棘突的平均数比较.在刺激前后5秒内, 计算出峰值的平均数。在 pb1 中, 反应于 1-壬醇的神经元中峰值的平均值明显高于响应壬酸的神经元峰值 (n = 11 瓣;方差分析与验 t 检验;p < 0.0001), 与 pb2 (n = 10 瓣;方差分析与验 t 检验;p = 0.0110)。误差线代表 SEM。这个数字已经从张上改了。26.请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 6
图6。pb1 和 pb2 的神经元形态与 E-2-hexenal 和己醛反应剂量依赖性.(A) 本小组显示 pb1 神经元的模式 (SEM;n = 12 瓣)。(B) 本小组显示 pb2 神经元的模式 (SEM;n = 10 瓣)。这个数字已经从张上改了。26.请点击这里查看这个数字的更大版本.

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Discussion

昆虫依靠瓣来检测食物的气味, 他们的瓣被认为在物种13,27中扮演着重要的角色。瓣是一种简单的嗅觉器官, 越来越受到人们的重视, 作为探索 chemosensation28neuromolecular 网络的一个吸引人的模式。

昆虫 labellar 和下颚 SSRs 已成功地在果蝇按蚊按蚊淡色致倦13,14,15,16,17 , 但很少被报告的形式的视频演示16,29。相比之下, 触角 SSRs 的视频数据可用于果蝇、脐 orangeworm 蛾 (Amyeloistransitella)、蝗虫美洲和床虫 (Cimex 臭虫)16,30,31,32,33

蝗虫下颚触角 basiconica 有一个特殊的结构, 不同于蝗虫触角触角和许多其他昆虫触角。使用此处描述的方法, 可以记录和区分蝗虫下颚触角 basiconica 子类型 pb1 和 pb2 产生的动作电位 (图 4图 5)。

关键步骤是记录电极的穿透。记录电极应插入触角和先进的基础, 直到获得良好的信号。此外, 在将记录电极插入触角的底部时, 防止下颚的圆顶崩溃是很重要的。为了达到这一目的, 我们建立了一个平台, 包括一个特殊的蝗虫上颌下颚持有人 (英里), 并使用钨线压缩第四段的下颚。这一程序的许多重复表明, 这是有效的。根据触角神经元在几个气味中的反应模式, 首次在蝗虫上颌下颚上发现了触角 basiconica 的两种亚型, 即 pb1 和 pb2。

该出版物中概述的技术的局限性是, 它可以用来记录大昆虫 (蛾、甲虫和蝗虫), 而不是记录小昆虫 (苍蝇和蚊子), 它们有自己的平台和技术13,14,15,16,17。这种技术与现有方法相辅相成。

最后, 详细介绍了一种从昆虫下颚触角 basiconica 的 SSR 的高效协议。该协议可为研究人员在 mouthpart 昆虫嗅觉的分子和细胞机制方面提供有用的技术。该方法与气相色谱法相结合, 可用于确定有利食品资源提取物中天然 electrophysiologically 活性配体。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了中国国家自然科学基金 (31472037 号) 的资助。在本条中提及商号或商业产品, 纯粹是为了提供具体资料, 并不意味着建议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire ADVENT W559504 Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2 Sigma-aldrich 563218-25G Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply Syntech A2-70 Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope Motic SMZ-163 Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope Olympus W-51 Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator C.M.D.T CFT-8301D Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator Narishige MN-151 Used for minor movement of the reference electrode
Speaker EDIFIER R101T06 Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base PDOK PD-101 Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table TianHe HAP-100-1208 Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide CITOGLAS ZBP-407 Used for making the base for the MPH
Blu-tack Bostik Blu-tack-45g Fixing the tungsten wire
Pasteur tube YARE WITEG Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions

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References

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