Один Sensillum записей для саранчи Palp членистоногих Basiconica

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот документ описывает подробный и очень эффективный протокол для записи одного sensillum из сенсилл basiconica на щупальцы насекомых ротовые органы.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, H., You, Y., Zhang, L. Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica. J. Vis. Exp. (136), e57863, doi:10.3791/57863 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Щупальцы саранчи ротовые, считаются обычными вкусовые органов, которые играют важную роль в выборе пищи саранчи, особенно для обнаружения энергонезависимой химические сигналы через членистоногих chaetica (ранее именовавшаяся терминала членистоногих или Хохлатый сенсилл). Есть теперь больше свидетельств того, что эти щупальцы также имеют функцию обоняния. Одорант рецептор (LmigOR2) и одоранта связывающий белок (LmigOBP1) локализованных версий в нейроны и аксессуаров клетки, соответственно, в сенсилл basiconica щупальцы. Один sensillum запись (ССР) используется для записи ответов нейронов рецепторов одоранта, который является эффективным методом для отбора активных лигандов на конкретных одоранта рецепторы. ССР используется в функциональных исследований одоранта рецепторов в palp членистоногих. Структура сенсилл basiconica, расположенный на купол щупальцы несколько отличается от структуры на антенн. Таким образом при выполнении ССР, вызвал отдушки, некоторые конкретные советы могут быть полезны для получения оптимальных результатов. В этом документе представил подробный и очень эффективный протокол для ССР от насекомых palp членистоногих basiconica.

Introduction

Животные эволюционировали широкий спектр влагалище органов, которые чувствуют экзогенных химических сигналов. У насекомых наиболее важным влагалище органы являются усики и щупальцы. На эти органы несколько видов влагалище волосы, называется влагалище членистоногих, иннервируются влагалище нейронов (ДНС) в пределах волоски. ДНС в влагалище членистоногих признать конкретные химические сигналы через сигнала от химических раздражителей электрические потенциалы, которые затем передаются до центральной нервной системы,12,3 .

ДНС выразить различные влагалище рецепторов [например, одорант рецепторов (СПР)], ИОНОТРОПНЫХ рецепторы (IRs) и вкусовые рецепторы (гр) на их мембраны, которые кодируют экзогенных химические сигналы, связанные с различными типами chemosensation 45,,6. Характеристика ДНС является ключом к прояснению молекулярных и клеточных механизмов насекомых chemoreception. Теперь один sensillum запись (ССР) является широко используется техника для характеристика насекомых ДНС в усиков членистоногих многих насекомых, включая мух7,8месяцев, жуки9, тли10,11саранчи, и Муравьи12. Однако, несколько исследований применили ССР насекомых щупальцы13,14,,1516,17, потому что сделать конкретные структуры их членистоногих Электрофизиологические запись трудно18.

Стаи саранчи (прямокрылые) часто вызывают серьезные урожая ущерба и экономических потерь19. Считается, что щупальцы играть важную роль в выборе пищи саранчи20,21,,2223,24. Два типа влагалище членистоногих расследуются сканирующего электронного микроскопа (SEM). Обычно на каждом купол саранчи щупальцы18наблюдаются 350 сенсилл chaetica и 7-8 сенсилл basiconica. Сенсилл chaetica являются вкусовые членистоногих, которые чувствуют энергонезависимой химические сигналы, тогда как сенсилл basiconica имеют функцию обоняния, зондирования летучие химические сигналы.

На саранчи щупальцы, диаметры разъемам волос сенсилл basiconica (ОК. 12 мкм), гораздо больше, чем те из сенсилл chaetica (ОК. 8 мкм)18,25. Кутикулярного стена сенсилл basiconica на щупальцы гораздо толще, чем усиков членистоногих18. Кроме того купол palp имеет жидкости содержимое в пределах очень гибкий кутикулы. Эти характеристики означают, что проникновение с микроэлектродные и приобретения хороших электрофизиологических сигналов является более сложным, чем для усиков членистоногих. В этом документе представлен подробный и очень эффективный протокол ССР для саранчи palp членистоногих basiconica с видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка документов и насекомых

  1. Подготовка Вольфрам электроды и стимулы решения
    1. Исправить новый Вольфрамные проволоки (0,125 мм, длина 75 мм) в микроманипулятор и заточить его в 10% (w/v) натрия нитрита (NaNO2) раствор в шприц 10 V предусмотрено около 1 мин под стереомикроскопом (40 кратном) от источника питания.
    2. Падение заостренный Вольфрамные проволоки неоднократно в 10% раствор NaNO2 , около 4 мм в 5 V в < 1 мин (рис. 1A).
    3. Изучите диаметр затачиваемых вольфрама кончика часто под стереомикроскопом, до тех пор, пока это нормально проникнуть кутикулы саранчи palp обонятельных sensillum (рис. 1B).
    4. Подготовка решений стимул. Развести каждого вещества химические стимулы в минеральном масле. Разбавьте 1-nonanol и Пеларгоновая кислота в разведениях 10%. Разбавьте E-2-гексенала и гексенала на 10-2, 10-3, 10-4и 10-5.
    5. Подготовить Пастер трубы, перевозящих раздражители: вставьте трубки Пастер полоски фильтровальной бумаги (длиной 2 см, ширина 0,5 см), добавить решения разреженных стимул (каждый 10 мкл) полоски фильтровальной бумаги, а затем подключите Пастер трубки с наконечники (1 мл).
  2. Подготовить насекомых
    1. Задние саранчи (салат migratoria) с свежий пшеничный саженцев в переполненном условиях при относительной влажности воздуха 60% и температуре 28-30 ° C фотопериода 18:6 h (свет: темный). Выберите 1 - 3-дневных 5й Инстар саранчи нимф и удалить антенн с хорошо ножницы избежание какого-либо вмешательства при записи.
  3. Подготовка держателя верхнечелюстной palp саранчи
    1. Используйте на стеклянное скольжение (25 мм x 75 мм) в качестве базы верхнечелюстной palp держателя (MPH). Придаем угол стекла слайда с двухсторонний скотч пластиковые кусок (1 мм в высоту, 10 мм в ширину, 35 мм в длину) и наконец исправить покровным стеклом (18 x 18 мм) на вершине пластиковые кусок с двухсторонний скотч. Место небольшой кусочек Красного резиновые ленты на обложке стекло как слой не скольжению. Пластиковые кусок и Стекло покровное представляют собой платформу для palp саранчи. Высота платформы составляет около 1,5 мм.
    2. Установите Вольфрамные проволоки (0,125 мм, длина 36 мм) на расстоянии 1,5 мм параллельно внутри края платформы. Прикрепите два концы проволоки на платформу с двухсторонний скотч.

2. Подготовка верхнечелюстной щупальцы саранчи

  1. Пополам пластиковых пробирок (1,5 мл) вертикально и отрезать дно. Место саранчи в подготовленных трубку. Оставьте вентральной региона и руководитель саранчой подвергается. Исправьте Ассамблея на стекло слайд с двухсторонний скотч (рис. 2A).
  2. Тяните правой верхнечелюстной palp на платформу.
  3. Положите Вольфрамные проволоки на четвертом этапе palp. Место клеевой шпаклевки на каждой стороне вольфрамовой проволоки, около 2 мм от верхнечелюстной palp (рисунок 2A и 2B).

3. единый Sensillum записи

  1. Место подготовки верхнечелюстной palp саранчи под микроскопом на малое увеличение (100 X). Отрегулируйте положение подготовки до тех пор, пока palp перпендикулярной записи электрода (рис. 3A).
  2. Вставьте ссылку электрода (вольфрамовым электродом) в глаз саранчи, с помощью микроманипулятор. Переместите запись электрода (вольфрамовым электродом) близко к верхнечелюстной palp с микроманипулятор (рисунок 3B и 3 C).
  3. Настройка устройства доставки запах около 1 см от верхнечелюстной palp (рис. 3B).
  4. Откройте программное обеспечение для записи 32 Спайк Auto. Задайте параметры записи следующим: запись шкалы на 500 мкВ; высокая среза фильтра на 300 Гц, низкого среза на 200 Гц; и pretrigger на 10 s.
  5. Подключиться электродом записи 10 x универсальные AC/DC усилитель.
  6. Переключатель микроскоп для большого увеличения (500 X). Вставьте основание basiconic sensillum на верхнечелюстной palp записи электрода и деликатно настроить запись электрода для получения хорошего спонтанное шипы (рис. 3D).
  7. Откройте стимул контроллер доставить непрерывного воздушного потока в 20 мл/s. установить время стимуляции 1 s. запись сигналов для 10 s, начиная с 10 s до наступления стимул импульса.
  8. Используйте 10 x универсальные AC/DC усилитель для усиления сигналов. Подавать сигналы в IDAC 4. Анализировать сигналы с программным обеспечением Auto Спайк 32. Переменного тока сигналы являются фильтруемый полосовые между 200 до 300 Гц. использование Auto Спайк 32 различать пик корыто амплитуды шумов. Вычисление спонтанной частоты ответов нейронов как увеличение частоты потенциал действия (шипы в секунду). Выполните статистический анализ с использованием GraphPad Призма 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Два подтипа членистоногих (pb1 и pb2) на верхнечелюстной palp саранчи определяются на основании динамики различных ответ к химической отдушки (1-nonanol 10% и 10% Пеларгоновая кислота). Нейронов в pb1 производят значительно больше шипов в 1-nonanol чем Пеларгоновая кислота при нейронов в pb2 являются значительно менее активируются 1-nonanol, по сравнению с Пеларгоновая кислота (рис. 4). Гексенала и E-2-гексенала может вызвать саранчи palp открытие ответ (POR)26. Гексенала обильные хост завод зеленый лист летучих который может способствовать дальнейшее подтверждение источника питания26. Шипы, вызвало в нейронах pb1 последний дольше, чем те pb2 простимулировано E-2-гексенала (рис. 4). Нейронов в pb1 и pb2 экспонат аналогично надежные ответы на гексенала (рис. 4). Сравнивая средние изменения все шипы между периодами 5 s до и 5 s после стимуляции указывает, что ответ на 1-nonanol значительно выше, чем для Пеларгоновая кислота pb1, но противоположно в pb2 (рис. 5). Нейронов в этих двух подтипов сенсилл доза зависим реагировать на E-2-гексенала и гексенала, и их ответ шаблоны для этих двух альдегиды отличаются (рис. 6A и 6B).

Figure 1
Рисунок 1. Подготовка электрода. (A) Эта группа показывает общий просмотр аппарата заточки электродов. Шприц, содержащие 10% NaNO2 (слева) используется для точить электрода (справа). (B) Эта группа показывает закрыть представление электрода (a: подходит; b: непригодны). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Саранча верхнечелюстной palp держатель (MPH). (A) MPH и саранча монтируются на стеклянное скольжение перед позиционирования его под микроскопом. (B) этой панели отображается крупным планом верхнечелюстной palp саранчи, установленные Вольфрамные проволоки на платформе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Одноместный sensillum записей. (A) Эта панель показывает вид установки электрофизиологии. (B) Эта группа показывает закрыть представление подготовки саранчи, монтируется на микроскопе. (C) это изображение показывает верхнечелюстной palp саранчи на 100 крат. (D) это изображение показывает palp 500 кратном. Стрелка указывает basiconic sensillum. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Следы ответ одного sensillum записей верхнечелюстной palp саранчи. В этой панели pb1 стоит для подтипа 1 palp членистоногих basiconica; PB2 стенды для подтипа 2 basiconica palp членистоногих. Полосы выше следы указывают продолжительность стимул (1 s). Для этих записей все запахи используются в разведениях 10% за исключением E-2-гексенала и гексенала, которые разводят в 1%. Этот показатель был изменен с Чжан и др. 26. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Сравнение средних чисел спайков в нейронах pb1 и pb2 стимулируется Пеларгоновая кислота и 1-nonanol. Среднее количество шипов рассчитываются в периоды 5 s до и после стимуляции. В pb1, значительно выше, чем те, шипы в нейронах, отвечая на Пеларгоновая кислота увеличить среднее число шипов в нейронах, отвечая на 1-nonanol (n = 11 щупальцы; Дисперсионный анализ с должности специального t тесты; p < 0.0001), в отличие от pb2 (n = 10 щупальцы; Дисперсионный анализ с должности специального t тесты; p = 0.0110). В баре ошибка представляет SEM. Этот показатель был изменен с Чжан и др. 26. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Шаблоны нейронов в pb1 и pb2 отвечая доза зависим в E-2-гексенала и гексенала. (A) Эта группа показывает закономерности нейронов в pb1 (± SEM; n = 12 щупальцы). (B) Эта группа показывает закономерности нейронов в pb2 (± SEM; n = 10 щупальцы). Этот показатель был изменен с Чжан и др. 26. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Насекомых полагаются на щупальцы обнаружить запахи пищи, и считается, что их щупальцы играть важную роль в видообразования13,27. Щупальцы являются простые органы обоняния и получают все большее внимание как привлекательная модель для изучения neuromolecular сетей основной chemosensation28.

Насекомое labellar и palp SSRs были успешно выполнены на Drosophila melanogaster, Anopheles gambiaeи Culex quinquefasciatus13,14,,1516 , 17 , но редко сообщалось в форме видео-презентацию16,29. В отличие от видео данные о усиков SSRs доступны для дрозофилы, пупок orangeworm моли (Amyeloistransitella), Schistocerca Американаи кровать ошибка (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.

Саранча palp членистоногих basiconica имеют особую структуру, которая отличается от саранчи усиков членистоногих и многих других членистоногих насекомых. Используя метод, описанный здесь, потенциалы действия, порожденных саранчи palp членистоногих basiconica подтипы pb1 и pb2 могут быть записаны и дискриминации (рис. 4 и 5).

Важным шагом является проникновение записи электрода. Запись электрод следует вставляется в базу sensillum и расширенный до приобретения хорошие сигналы. Кроме того важно предотвратить свертывание когда электрод запись вставляется в базу sensillum купол palp. Для достижения этой цели, мы ставим платформы, включая специальные саранчи верхнечелюстной palp держатель (MPH) и используется для сжатия четвертый сегмент palp Вольфрамные проволоки. Многие повторений этой процедуры показывают, что это эффективно. Основываясь на модели реагирования нейронов в сенсилл для нескольких отдушки, мы в первый раз, определили два подтипа членистоногих basiconica на верхнечелюстной palp саранчи, а именно pb1 и pb2.

Ограничением методики, изложенные в настоящей публикации является, что он может использоваться для записи больших насекомых (например, бабочки, жуки и саранчи) время не для записи мелких насекомых (например, мух и комаров), которые имеют свои собственные платформы и методы,1314,,1516,17. Эта техника является дополнением к существующим методам.

В заключение очень эффективный протокол ССР от basiconica членистоногих насекомых palp подробно описан в. Этот протокол может обеспечить исследователей с полезным методом в исследовании молекулярных и клеточных механизмов насекомых обоняние на mouthpart. Этот метод связан с газовой хроматографии могут использоваться для выявления природных electrophysiologically активные лигандов в экстрактах благоприятные продовольственных ресурсов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке гранта от Фонда национального естественных наук Китая (No.31472037). Любое упоминание о торговых наименований или коммерческих продуктов в этой статье исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tungsten wire ADVENT W559504 Used for making the electrode and fixing the palp
NaNO2 Sigma-aldrich 563218-25G Used for sharpening the tungsten wire
AC Power Supply Syntech A2-70 Providing the voltage in sharpening the tungsten wire
Stereoscope Motic SMZ-163 Used for observing the sharpening of tungsten wire
Microscope Olympus W-51 Used for observing the sensilla on locust maxillary palp
Intelligent Data Acquisition Controller Syntech IDAC-4 Real-time on screen display of all signals before and during recording
Stimulus controller Syntech CS-55 Used for controlling the stimulus application
Electronic micromanipulator C.M.D.T CFT-8301D Used for minor movement of the recording electrode
Micromanipulator Narishige MN-151 Used for minor movement of the reference electrode
Speaker EDIFIER R101T06 Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal
Magnetic base PDOK PD-101 Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube
Vibration Isolation Table TianHe HAP-100-1208 Used for isolating the vibration from the equipment
Glass slide CITOGLAS ZBP-407 Used for making the base for the MPH
Blu-tack Bostik Blu-tack-45g Fixing the tungsten wire
Pasteur tube YARE WITEG Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (32), 12987-12995 (2011).
  2. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
  3. Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
  4. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, (5), 725-736 (1999).
  5. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136, (1), 149-162 (2009).
  6. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  7. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  8. Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, (21), 7585-7589 (1987).
  9. Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47, (9), 1065-1076 (2001).
  10. Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27, (1), 55-61 (2017).
  11. Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77, (2), 45-57 (2011).
  12. Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12, (8), 1261-1271 (2015).
  13. de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19, (11), 4520-4532 (1999).
  14. Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32, (8), 727-738 (2007).
  15. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17, (18), 1533-1544 (2007).
  16. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725 (2010).
  17. Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177, (4), 389-396 (1995).
  18. Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184, (3), 397-409 (1977).
  19. Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
  20. Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
  21. Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
  22. Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
  23. Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
  24. Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
  25. Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35, (1), 47-56 (2006).
  26. Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13, (6), 759-771 (2017).
  27. Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925 (2016).
  28. Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
  29. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355 (2014).
  30. Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147 (2017).
  31. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489 (2011).
  32. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139 (2013).
  33. Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics