Regioselective O- glicosilação de nucleosídeos através o temporário 2', 3'-Diol proteção por um éster de Boronic para a síntese de dissacarídeo nucleosídeos

Chemistry

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Summary

Aqui, apresentamos os protocolos para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo pelo regioselective O- glicosilação de ribonucleosides através de uma protecção temporária de seus 2', 3'-diol partes utilizando um éster cíclico boronic. Este método aplica-se a diversos nucleosídeos desprotegidos como adenosina, guanosina, citidina, uridina, methyluridine-5 e 5-fluorouridine para dar o correspondente nucleosídeos dissacarídeo.

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Someya, H., Itoh, T., Kato, M., Aoki, S. Regioselective O-Glycosylation of Nucleosides via the Temporary 2',3'-Diol Protection by a Boronic Ester for the Synthesis of Disaccharide Nucleosides. J. Vis. Exp. (137), e57897, doi:10.3791/57897 (2018).

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Abstract

Nucleosídeos dissacarídeo, que consistem em metades dissacarídeo e base, foram sabidos como um valioso grupo de produtos naturais, tendo bioactivities variadas. Embora O- glicosilação química é uma estratégia comumente benéfica para sintetizar nucleosídeos dissacarídeo, preparação de substratos tais como glycosyl doadores e aceitadores requer manipulações de grupo protegendo tedioso e uma purificação na cada etapa sintética. Entretanto, diversos grupos de pesquisa relataram que boronic e ésteres de borinic servem como uma proteção ou ativando o grupo dos derivados de carboidratos para atingir a regio e / ou stereoselective de acilação, alquilação, sililação e glicosilação. Neste artigo, vamos demonstrar o procedimento para o regioselective O- glicosilação de desprotegida ribonucleosides utilizando ácido boronic. A esterificação de 2', 3'-diol de ribonucleosides com ácido boronic faz a protecção temporária de diol e, a seguir O- glicosilação com um doador glycosyl na presença de p- toluenesulfenyl licenças trifluormetanosulfonato, cloreto e prata a reação de regioselective do grupo 5'-hidroxila para pagar os nucleosídeos dissacarídeo. Esse método pode ser aplicado a diversos nucleosídeos, tais como a guanosina, adenosina, citidina, uridina, metyluridine-5 e 5-fluorouridine. Este artigo e o vídeo que acompanha representam informações úteis (visuais), para o O- glicosilação de nucleosídeos desprotegidos e seus análogos para a síntese de não só nucleosídeos dissacarídeo, mas também uma variedade de biologicamente relevantes derivados.

Introduction

Nucleosídeos dissacarídeo, que são conjugados de nucleosídeo e um grupo de carboidratos ligados através de um O-glicosídicas vínculo, constituem uma valiosa classe de naturalmente carboidratos derivados1,2 ,3,4,5,6,7. Por exemplo, são incorporados em macromoléculas biológicas, tais como o tRNA (ácido ribonucleico de transferência) e poly(ADP-ribose) (ADP = difosfato de adenosina), bem como em alguns agentes antibacterianos e outras substâncias biologicamente ativos (por exemplo, adenophostins, amicetins, ezomycin)5,6,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19. Daí, nucleosídeos dissacarídeo e seus derivados deverão ser compostos de chumbo para a pesquisa de descoberta de drogas. As metodologias para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo são classificadas em três categorias; enzimática Oglycosylation -20,21, químico N- glicosilação5,9,16,22,23, 24e química Oglycosylation -7,9,14,16,18,19,24, 25,26,,27,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37. Em particular, Oquímico - glicosilação seria um método eficiente para a síntese de stereoselective e síntese em larga escala de nucleosídeos dissacarídeo. Pesquisa anterior mostrou que o O- glicosilação de 2'-desoxirribonucleosídeo 2 com o thioglycosyl doador 1, utilizando a combinação de cloreto de p- toluenesulfenyl e prata trifluormetanosulfonato, proporciona a desejado dissacarídeo nucleosídeo 3 (Figura 1A; Ar = aril e PG = grupo protegendo)38.

Na sequência destes resultados, decidimos desenvolver o O- glicosilação de ribonucleosides aplicação do sistema de promotor trifluormetanosulfonato p- toluenesulfenyl/cloreto de prata. Enquanto vários exemplos do - glicosilação de ribonucleosides parcialmente protegidas têm sido demonstradas7,9,14,16,18,19 ,24,32,33,34,35,36,37, o uso de desprotegida ou temporariamente protegido ribonucleosides como um aceitador glycosyl para O- glicosilação insignificante relatou. Portanto, o desenvolvimento de regioselective O- glicosilação de desprotegida ou temporariamente protegido ribonucleosides forneceria um método sintético mais benéfico sem proteger manipulações de grupo de ribonucleosides. Para alcançar o regioselective O- glicosilação de ribonucleosides, enfocamos os compostos de boro, porque vários exemplos de alquilação, acilação regio e / ou stereoselective, sililação e glicosilação do hidrato de carbono derivados, assistido por boronic ou ácido borinic foram relatados39,40,41,42,,43,44,45 ,46,47,,48,,49,50. Neste artigo, vamos demonstrar o procedimento para a síntese de nucleosídeos dissacarídeo utilizando regioselective O- glicosilação no grupo 5'-hidroxila de ribonucleosides através de um éster boronic intermediário. Na estratégia apresentada aqui, éster boronic intermediário 6 ia ser proporcionadas da esterificação do ribonucleoside 4 com o boronic ácido 5, que permite que o regioselective O- glicosilação na Grupo 5'-hidroxila com thioglycosyl doador 7 para dar o dissacarídeo nucleosídeo 8 (Figura 1B)51. Também estudamos a interação de um ribonucleoside e ácido boronic por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), para observar a formação de um éster boronic. Esterificação, tornar-se um éster boronic e uma reação de glicosilação exigem condições anidras para evitar a hidrólise do éster boronic e o doador glycosyl. Neste artigo, vamos mostrar os procedimentos típicos para obter as condições anidras para reacções de glicosilação bem sucedido para pesquisadores e estudantes não somente em química, mas também em outros campos de pesquisa.

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Protocol

Nota: Todos os dados experimentais [NMR, espectroscopia de infravermelha (IR), espectroscopia de massa (MS), rotações ópticas e elemental analisa dados] dos compostos sintetizados foram relatados em um anterior papel51.

1. procedimento para O- glicosilação reações

  1. Síntese de compostos α/β-12 (12 entrada na tabela 1)
    Nota: 1-13 de entradas na tabela 1 foram realizadas usando um procedimento semelhante.
    1. Protecção temporária de 2', 3'-diol de ribonucleoside40
      1. Em 10 mL de um balão em forma de pera (frasco 1), dissolver mannosyl doador α -9 (28,4 mg, 0.0486 mmol)52, uridina 10 (7,9 mg, 0.0324 mmol) e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c (9,3 mg, 0.0490 mmol) em piridina anidra (0,40 mL).
        Nota: O uso de um balão de 10 mL forma de pera é recomendado porque, na etapa 1.1.3.1, a mistura de reação vai ser transferida para balão 2 (um 10 mL 2-pescoço balão de fundo redondo com um septo anexado a ele) contendo molecular peneiras de pó.
      2. Co evapore a mistura de reação (obtida na etapa 1.1.1.1.) com piridina anidra (0,40 mL, 3x) e anidro 1,4-dioxano (0,40 mL, 3x) à temperatura ambiente para ca. 40 ° C para remover toda a água.
      3. Dissolver o resíduo (obtido na etapa 1.1.1.2.) em anidro 1,4-dioxano (0,32 mL) e agitar a mistura de reação a sua temperatura de refluxo por 1h formar um éster boronic (a protecção temporária).
      4. Remova o solvente usando um evaporador rotativo, seguido por uma bomba de vácuo.
    2. Ativação de peneiras moleculares
      1. Num balão de fundo redondo 10 mL 2-pescoço com um septo anexado a ele (frasco 2), adicionar 4 Å pó de peneiras moleculares (64 mg).
        Nota: Peneiras moleculares apropriadas devem ser selecionadas de acordo com o solvente utilizado para a glicosilação (3 Å para acetonitrilo) e 4 Å para Propanonitrila, diclorometano e 1,4-dioxano.
      2. Aqueça no microondas sob pressão atmosférica, as peneiras moleculares e resfriá-los sob pressão reduzida evacuado por uma bomba de vácuo (3 x) e em seguida, seque-os com uma pistola de calor sob pressão reduzida enquanto substituindo o ar com gás argon várias vezes.
    3. Glicosilação
      1. Dissolva o resíduo da etapa 1.1.1.4. no frasco 1 Propanonitrila (0,64 mL) ou outros solventes e transferir esta solução para balão 2.
        Nota: Acetonitrilo, 1,4-dioxano, diclorometano e Propanonitrila foram usados para as entradas 1-7 e 9, 10 entrada, entrada 11 e entradas, 8, 12 e 13, respectivamente.
      2. Agitar a mistura de reação num balão 2 à temperatura ambiente para 0,5 h seguido de refrigerá-la a-40 ° C.
        Nota: A temperatura foi alterada de acordo com o solvente utilizado para a glicosilação (-40 ° C para diclorometano e Propanonitrila), temperatura de 1,4-dioxano e -20 ° C para acetonitrilo.
      3. Adicione prata trifluormetanosulfonato (49,9 mg, 0,194 mmol) e p -cloreto de toluenesulfenyl (12.8 µ l, 0.0968 mmol) a mistura de reacção à mesma temperatura como usado na etapa 1.1.3.2.
      4. Agite a mistura de reação à mesma temperatura para 1,5 h.
      5. Verificar a reação por cromatografia de camada fina (TLC) com acetato de etila/hexano [3/1 (v/v)] para verificar os doadores glycosyl [o fator de retenção (Rf) (doador α -9) = 0,63] e com clorofórmio/metanol [10/1 (v/v))] para verificar a glycosyl aceitadores e produtos [Rf (aceitador 10) = 0,03, Rf (produto desejado) = 0,50].
      6. Saciar a mistura de reação com bicarbonato de sódio aquosa saturada (1,0 mL), diluir com clorofórmio (2,0 mL), remover os materiais insolúveis com Celitee lavar cuidadosamente a Celite com clorofórmio (20 mL).
      7. Lave o filtrado (camada orgânica) com bicarbonato de sódio aquoso saturado (20 mL, 3x) e salmoura (20 mL), usando um funil de separação de 100ml.
      8. Seque a camada orgânica resultante com sulfato de sódio, filtrar os materiais insolúveis e concentrar o filtrado usando um evaporador rotativo.
      9. Aproximadamente, purificar o resíduo restante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 50/1 (v/v)] para pagar bruto 5'-O-(6"-O- acetil-2", 3", 4"- tri-O- benzil-α/β-ᴅ-mannopyranosyl) uridina contendo um pequena quantidade de subprodutos (15,2 mg, xarope incolor).
    4. Acetilação
      1. Em um frasco de 5 mL, dissolva o composto bruto resultante, preparado na etapa 1.1.3.9 em piridina anidra (0,20 mL).
      2. Adicionar N,N-dimetil-4-aminopiridina (uma quantidade catalítica) e anidrido acético (20,4 µ l, mmol 0.0216: 10 equivalentes baseiam o composto bruto) para a solução a 0 ° C.
      3. Agite a mistura de reação à mesma temperatura para 0,5 h seguido de um aquecimento para a temperatura ambiente.
      4. Após a agitação durante a noite, verificar a reação do TLC com clorofórmio/metanol [30/1 (v/v)] [Rf (α/β-12) = 0,45].
      5. Dilua a mistura reacional com clorofórmio (20 mL).
      6. Lave a camada orgânica com ácido clorídrico de 1 M (20 mL, 3x), saturada de bicarbonato de sódio aquoso (20 mL, 3x) e salmoura (20 mL), usando um funil de separação de 100ml.
      7. Seque a camada orgânica resultante com sulfato de sódio, filtrar os materiais insolúveis e concentrar o filtrado usando um evaporador rotativo.
      8. Purificar o resíduo restante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 90/1 (v/v)] dar α/β-12 (15,8 mg, 61%, α/β = 1/1.6, sólido incolor amorfo).
  2. Síntese de compostos β-22 a β-30 (tabela 2) e β-33 (tabela 3)
    Nota: A síntese de β-22-Β-30e β-33foi realizada usando um procedimento semelhante.
    1. Síntese de compostos β-22 (entrada 1 na tabela 2)
      1. Protecção temporária de 2', 3'-diol de ribonucleoside
        1. Em 10 mL de um balão em forma de pera (balão 3), dissolver adenosina 13 (20,4 mg, 0.0763 mmol), galactosyl doador β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol)53e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol) em anidro piridina (0,76 mL).
          Nota: O uso de um balão de 10 mL forma de pera é recomendado porque a mistura de reação vai ser transferida para o frasco n º 4 (um 10 mL 2-pescoço balão de fundo redondo com um septo anexado a ele) contendo molecular peneiras de pó na etapa 1.2.1.3.1.
        2. Co evapore a mistura de reação (obtida na etapa 1.2.1.1.1.) com piridina anidra (0,76 mL, 3x) e anidro 1,4-dioxano (0,76 mL, 3x) à temperatura ambiente para ca. 40 ° C para remover toda a água.
        3. Dissolver o resíduo (obtido na etapa 1.2.1.1.2.) em anidro 1,4-dioxano (0,76 mL) e agitar a mistura de reação a sua temperatura de refluxo por 1h formar um éster boronic (uma protecção temporária).
        4. Remova o solvente usando um evaporador rotativo, seguido por uma bomba de vácuo.
      2. Ativação de peneiras moleculares
        1. Num balão de fundo redondo 10 mL 2-pescoço com um septo anexado a ele (frasco n º 4), adicionar 4 Å pó de peneiras moleculares (150 mg).
        2. Aqueça no microondas sob pressão atmosférica, as peneiras moleculares e resfriá-los sob pressão reduzida evacuado por uma bomba de vácuo (3 x) e em seguida, seque-os com uma pistola de calor sob pressão reduzida enquanto substituindo o ar com gás argon várias vezes.
      3. Glicosilação
        1. Dissolva o resíduo da etapa 1.2.1.1.4. balão 3 em Propanonitrila (1,50 mL) e transferir essa solução para balão 4.
        2. Agitar a mistura de reação à temperatura ambiente para 0,5 h, seguido de resfriamento é-40 ° c.
        3. Adicione prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol) e cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol) a mistura de reacção à mesma temperatura, conforme mencionado na etapa 1.2.1.3.2.
        4. Agite a mistura de reação, na mesma temperatura para 1,5 h.
        5. Verificar a reação do TLC com acetato de etila/hexano [2/1 (v/v)] para verificar os doadores glycosyl [Rf (doador β -21) = 0,62] e com clorofórmio/metanol [10/1 (v/v)] para verificar os aceitadores glycosyl e produtos [Rf (aceitador 13 ) = 0,05, Rf (produto desejado) = 0.30].
        6. Saciar a mistura de reação com bicarbonato de sódio aquosa saturada (2,0 mL), diluir com clorofórmio (3,0 mL), remover os materiais insolúveis através de Celitee lavar cuidadosamente a Celite com clorofórmio (30 mL).
        7. Lave o filtrado (camada orgânica) com saturada de bicarbonato de sódio aquoso (30 mL, 3x) e salmoura (30 mL) usando um funil de separação de 100ml.
        8. Seque a camada orgânica resultante com sulfato de sódio, filtrar os materiais insolúveis e concentrar o filtrado usando um evaporador rotativo.
        9. Purificar o resíduo restante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 30/1 (v/v)] comprar β -22 (27,4 mg, 42%, sólido incolor).
    2. Síntese de compostos β-23 (entrada na tabela 2 de 2)
      1. Conduta a reação usando 14 (28,4 mg, 0.0765 mmol)54, β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,8 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 50/1 (v/v)] dar β23 (21,9 mg, 30%, sólido incolor). TLC: Rf (β -23) = 0,37 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    3. Síntese de compostos β-24 (entrada na tabela 2 de 3)
      1. Realizar a reação usando 15 (21,6 mg, 0.0763 mmol), β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 8/1 (v/v)] dar β -24 (8,1 mg, 12%, sólido incolor). TLC: Rf (β -24) = 0.20 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    4. Síntese de compostos β-25 (entrada na tabela 2 de 4)
      1. Conduta a reação usando 16 (27,0 mg, 0.0764 mmol)55, β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,8 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 20/1 (v/v)] dar β -25 (31,4 mg, 44%, sólido incolor). TLC: Rf (β -25) = 0,27 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    5. Síntese de compostos β-26 (entrada na tabela 2 de 5)
      1. Realizar a reação usando 10 (18,6 mg, 0.0762 mmol), β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol), 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 40/1 (v/v)] dar β -26 (26,1 mg, 42%, sólido incolor). TLC: Rf (β -26) = 0,45 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    6. Síntese de compostos β-27 (entrada na tabela 2 de 6)
      1. Realizar a reação usando 17 (19,7 mg, 0.0763 mmol), β -21 (80,5 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 40/1 (v/v)] dar β -27 (33,8 mg, 53%, sólido incolor). TLC: Rf (β -27) = 0,50 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    7. Síntese de compostos β-28 (entrada na tabela 2 de 7)
      1. Realizar a reação usando 18 (20,0 mg, 0.0763 mmol), β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol), 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio e acetato de etila/clorofórmio = 1/1 (v/v)] dar β28 (38,8 mg, 61%, sólido incolor). TLC: Rf (β -28) = 0,33 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    8. Síntese de compostos β-29 (entrada na tabela 2 de 8)
      1. Realizar a reação usando 19 (18,5 mg, 0.0761 mmol), β -21 (80,4 mg, 0.114 mmol), 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro (1,4-dioxano mL de 0,76), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 10/1 (v/v)] dar β -29 (34,1 mg, 55%, sólido incolor). TLC: Rf (β -29) = 0,25 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    9. Síntese de compostos β-30 (entrada 9 na tabela 2)
      1. Conduta a reação usando 20 (26,6 mg, 0.0766 mmol)56, β -21 (80,6 mg, 0.115 mmol), 11 c (21,8 mg, 0.115 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,8 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 50/1 (v/v)] dar β -30 (28,0 mg, 40%, sólido incolor). TLC: Rf (β -30) = 0,48 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].
    10. Síntese de compostos β-33 (1 de entrada na tabela 3)
      1. Conduta a reação usando 18 (20,0 mg, 0.0762 mmol), β -31 (80,4 mg, 0.114 mmol)57, 11 c (21,7 mg, 0.114 mmol), cloreto de p- toluenesulfenyl (µ l 30.3, 0.229 mmol), prata trifluormetanosulfonato (117,6 mg, 0.458 mmol), anidro 1,4-dioxano (0,76 mL), Propanonitrila anidra (1,50 mL) e 4 peneiras moleculares de Å (150 mg). Purificar o resíduo resultante por cromatografia em coluna [sílica gel, clorofórmio/metanol = 1/0 - 30/1 (v/v)] dar β -33 (34,5 mg, 54%, sólido incolor). TLC: Rf (β -33) = 0,33 [clorofórmio/metanol = 10/1 (v/v)].

2. a desproteção de β-28 (Figura 2)

  1. Em um frasco de 5 mL, adicione β -28 (25,2 mg, 0.0300 mmol) e 10m metilamina em metanol (2,0 mL)58.
  2. Agite a mistura de reação a 0 ° C, durante 2 h, seguido de aquecimento, a temperatura ambiente.
  3. Após agitação a mistura para 13h, verificar a reação do TLC com clorofórmio/metanol [10/1 (v/v)] [Rf (β -35) = 0,20].
  4. Concentre-se a mistura de reação usando um evaporador rotativo.
  5. Dissolver o resíduo em água (15 mL) e lave a fase aquosa com diclorometano (15 mL, 3 x) usando um funil de separação de 50ml.
  6. Concentre-se a fase aquosa usando um evaporador rotativo.
  7. Purificar o resíduo restante por cromatografia líquida preparativa de alto desempenho (HPLC) [coluna: ODS (octadecilsilano) coluna (20Φ x 250 mm), eluente: água (contém ácido trifluoroacético de 0.1% [v/v]), taxa de fluxo: 8,0 mL/min, a deteção: 266 nm, temperatura: 25 ° C, tempo de retenção: 20 min] para dar β -35 (7,9 mg, 62%, sólido incolor amorfo)59.

3. NMR estudos de éster Boronic cíclico (Figura 3 e 4)

  1. Preparação e medição de 36
    1. Balão em forma de pera de 10 mL, dissolver uridina 10 (34,3 mg, 0,140 mmol) e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c (40,0 mg, 0.211 mmol) em piridina anidra (1,00 mL).
    2. Co evapore a mistura reacional com piridina anidra (1,00 mL, 3x) e anidro 1,4-dioxano (1,00 mL, 3x) à temperatura ambiente para ca. 40 ° C para remover toda a água.
    3. Dissolver o resíduo em anidro 1,4-dioxano (1,40 mL) e agitar a mistura de reação a sua temperatura de refluxo por 1h formar um éster boronic (uma protecção temporária).
    4. Dispense a mistura de reação (0,14 mL) para um frasco de 5 mL.
    5. Remova o solvente do frasco 5ml usando um evaporador rotativo, seguido por uma bomba de vácuo.
    6. Dissolva o resíduo resultante 36 em acetonitrilo -d3 (0,64 mL).
    7. Medir 1H, 11B e espectroscopia NMR F de 19usando um tubo NMR de quartzo a 25 ° C.
  2. Preparação e medição de 38
    1. Preparar a mistura de reação 38 de 11 c (40,0 mg, 0.211 mmol) usando o procedimento similar como o do passo 3.1.

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Representative Results

Os resultados do - glicosilação de uridina 10 com thiomannoside α -9 estão resumidos na tabela 160,61. Na entrada 1, o O- glicosilação de 10 com α -9 na ausência de derivados do ácido boronic resultou na formação de uma mistura complicada. Na entrada 2, 10 e phenylboronic acid 11a foram misturados e co evaporados com piridina e 1,4-dioxano e, então, agitou-se em 1,4-dioxano, a sua temperatura de refluxo para formar a protecção temporária de 2', 3'-cis- diol, seguido por um adição de α -9 para conduzir a glicosilação.

Nas entradas 3-13, os O- glycosylations foram realizadas de acordo com o protocolo descrito aqui (etapa 1.1). O efeito dos substituintes sobre o ácido arylboronic foi investigado em entradas de 4 - 9. Elétron-deficientes arylboronic ácidos tais como 4-(trifluorometil) phenylboronic c 11 e 2,4-difluorophenylboronic ácido 11D resultou em maior rendimento químico de α/β-12 do que a do ácido 4-methoxyphenylboronic 11b , possivelmente devido à maior estabilidade do intermediário boronic éster preparada a partir de ácido de elétron-deficientes arylboronic62. No entanto, o uso de 4-nitrophenylboronic acid 11e, que também tem um grupo de elétron-retirando, resultou em um baixo rendimento químico de α/β-12 devido a baixa solubilidade do intermediário em acetonitrila boronic éster. Na entrada de 8, o O- glicosilação usando 4-hexylphenylboronic ácido 11f em Propanonitrila (para aumentar a solubilidade do éster boronic intermediária) não melhorar o rendimento químico. Na entrada 9, ácido alkylboronic (ácido cyclopentylboronic 11g) foi usado em vez de ácido arylboronic, que resultou em um menor rendimento químico de α/β-12 do que na de ácidos arylboronic.

O efeito do solvente para o rendimento químico e estereosseletividade do produto glicosilação foi estudado em entradas de 10-12. Em 10 de entrada, o uso de 1,4-dioxano como um solvente permitido uma α-stereoselective mais O- glicosilação que o uso de acetonitrilo fez63,64, enquanto o rendimento de α/β-12 foi insuficiente. Em 11 de entrada, o O- glicosilação em diclorometano deu uma quantidade irrisória de α/β-12 devido a baixa solubilidade do intermediário. 12. entrada, usar Propanonitrila como solvente resultou em um maior rendimento químico de α/β-12 do que quando usar outros solventes (entradas de 5, 10 e 11) com quase a mesma estereosseletividade em comparação com o uso de acetonitrilo (entrada 5). Em 13 de entrada, os equivalentes de cloreto de p- toluenesulfenyl e prata trifluormetanosulfonato foram reduzidos a 1,8 e 3,6 contra 10, respectivamente (nas entradas 1-12, 3,0 e 6,0 equivalentes de cloreto de p- toluenesulfenyl e prata trifluormetanosulfonato foram usado contra 10, respectivamente) a pagar α/β-12 no resultado semelhante.

Na tabela 2, o O- glycosylations de 10 e 13 - 20 , com o thiogalactoside β -21 foram realizadas sob as condições de reação otimizado estabelecidas na tabela 1 (entrada 12) (no presente documento, adenina, citosina, guanina, uracila, timina e 5-fluorouracil são abreviados como Ade, Gua, Cyt, Ura, Thy e 5-FUra, respectivamente, não como A, G, C, U, T e 5-FU, que são seus abbriviations geral para evitar mal entendido [por exemplo, C-nucleosídeos geralmente significa C (carbono)-glucosídicas]). No caso de adenosina, desprotegido 13 oferecidas o correspondente nucleosídeo dissacarídeo em um rendimento mais elevado do que o N- protegido 14 poderia, possivelmente devido a depurinação de 14 e/ou β -23 semelhante ao nosso anterior relatório (entradas 1 e 2)38. O O- glicosilação de N- guanosina protegido 16 fornecido β -25 em um rendimento melhor em comparação com o glycosylation desprotegido 15 devido a maior solubilidade do intermediário preparado a partir de 16 mais de 15 (entradas 3 e 4). Nas entradas de 5-7, foram examinados os O- glycosylations de uridina 10 e análogos, como 5-metyluridine 17 e 5-fluorouridine 18 . O uso de 10 oferecidas a β -26 (42% de rendimento) com uma reação de lado para dar um subproduto em que posição 5 do moiety uracil foi substituída com um p- tolylthio grupo (entrada 5)65. Por outro lado, 17 e 18, em que o 5-posição do moiety uracil é um grupo metil ou fluoro, deram o dissacarídeo correspondente nucleosídeos β - β -27 e28 em moderada produz, respectivamente (entradas de 6 e 7). Além disso, uma reação em larga escala usando 250 mg de 18 (0.95 mmol) e 1,01 g de β -21 (1,43 mmol) oferecidas β -28 em um rendimento de 58% (461,0 mg), que é quase o mesmo rendimento que a de uma reação de pequena escala (61% em entrada 7 de tabela 2 ). No caso de citidina, o O- glicosilação de desprotegido 19 deu β -29 em um rendimento um pouco melhor do que o uso de N- protegido 20 resultando em β -30 fez.

Vários doadores glycosyl, como glucosyl doador β -31, galactosyl doador β -21e mannosyl doador α -32, foram utilizados o O- glicosilação de 5-fluorouridine 18 (tabela 3)66. O resultado da entrada 2 é o mesmo do 7 de entrada de tabela 2 neste manuscrito. Nesses resultados, o uso de galactosyl doador β -21 proporcionada o correspondente produto β -28 em um rendimento elevado em comparação com o uso de β -31 e α -32. Em 3 de entrada, a reação usando α -32 deu uma mistura de α -34 com um subproduto não identificado, que possivelmente tem um peso molecular similar como o de 34 (presume-se que poderia ser uma regio - ou estereoisômero de 34), Porque estes compostos não poderiam ser separados por cromatografia de permeação de gel (GPC), que separa os compostos com diferentes pesos moleculares. Além disso, a mistura mostrou mudanças químicas semelhantes no espectro RMN F 19(164,0 e 165.2 ppm). A desproteção do glycosylation produto β -28 usando metilamina deu β -35 (62%) (Figura 2).

A mistura de reação 36 preparados a partir de 10 e 11 c de acordo com a etapa 3 do protocolo (Figura 3) foi observada por 1H, 11B e espectroscopia de RMN de F 19para investigar a formação de éster boronic intermediário 37 (Figura 4). A mistura de reação 38 também foi preparado de 11 c para comparação. Os resultados dos espectros de RMN H 1indicaram que o sinal de 2'-prótons de 3'-hidroxila desapareceram, e que de prótons 2' e 3' mudou dramaticamente upfield na presença de 11 c (figuras 4A e 4B). No espectro de RMN de B 11, supôs-se que os picos de éster boronic 37, 11 c e/ou boroxine 40 (que é um trímero cíclico gerado pela condensação de três ácidos boronic desidratação) e piridina boroxine complexa 39 (que é uma estrutura proposta, com base em dados relatados espectros dos complexos de piridina boroxine) foram observados em 32 ppm, 28 ppm e 21 ppm, respectivamente (figuras 4 - 4E)67,68, 69. No espectro de RMN de F 19, formulamos a hipótese que os picos de 37, 11 c e/ou 40e 39 correspondem-63,30 ppm,-63,20 ppm e-62,80 ppm, respectivamente (figuras 4F - 4 H).

Figure 1
Figura 1 : Trabalho anterior e este trabalho. (A) este painel mostra o O- glicosilação de 2 '-desoxirribonucleosídeo com um thioglycoside promovido pelo cloreto de p- toluenesulfenyl (p- TolSCl) e prata trifluormetanosulfonato (AgOTf). (B), este painel mostra o regioselective O- glicosilação de um ribonucleoside desprotegido utilizando um éster cíclico boronic como um grupo de proteção temporário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Desproteção de β-28. A clivagem dos grupos de benzoíla foi conduzida com metilamina (ines2) comprar β -35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Preparação das misturas reação 36 e 38. Misturas de 36 e 38 foram preparados a partir de uridina 10 e 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido c de 11 e de 11 c, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: estudo de NMR do éster cíclico boronic intermediário 37 preparados a partir de ácido de uridina 10 e 4-(trifluorometil) phenylboronic 11 c por 1H, 11B, e 19F NMR medições em acetonitrilo -d3 25 ° C. A 37, 39 e 40 foram estruturas propostas, veja a Figura 3. (A), este painel mostra 10 observada por 1H NMR. (B) este painel mostra mistura 36 observada por 1H NMR. (C) este painel mostra 11 c observada por 11B NMR. (D) este painel mostra mistura 38 observada por 11B NMR. (E) este painel mostra mistura 36 observada por 11B NMR. (F) este painel mostra 11 c observada por 19F NMR. (G) este painel mostra mistura 38 observada por 19F NMR. (H) este painel mostra mistura 36 observada por 19F NMR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure of Table 1

Entrada Boronic Acid b Solvente Condição Rendimento (para 3 etapas) c
1 um - MeCN −20 ° C, 1,5 h < % 16 (mistura complexa)
2 d PhB(OH)2 (11a) MeCN −20 ° C, 1,5 h 41% (Α/Β = 1.6/1)
3 um,e 11a MeCN −20 ° C, 1,5 h 45% (Α/Β = 1.6/1)
4 um,e 4-MeOC6H4B(OH)2 (11b) MeCN −20 ° C, 1,5 h 39% (Α/Β = 1/1.8)
5 um,e 4-CF3C6H4B(OH)2 (11 c) MeCN −20 ° C, 1,5 h 51% (Α/Β = 1/1.8)
6 um,e 2,4-F2C6H4B(OH)2 (11D) MeCN −20 ° C, 1,5 h 46% (Α/Β = 1/1.8)
7 um,e 4-n º2C6H4B(OH)2 (11e) MeCN −20 ° C, 1,5 h 24% (Α/Β = 1.6/1)
8 um,e 4-CH3(CH2)5C6H4B(OH)2 (11f) EtCN 40 ° C, 1,5 h 30% (Α/Β = 1.6/1)
9 um,e Ácido Cyclopentylboronic (11g) MeCN −20 ° C, 1,5 h 8% (Α/Β = 1/1.7)
10 um,e 11c 1,4-dioxano r.t., 1,5 h 27% (Α/Β = 1/3.3)
11 um,e 11c CH2Cl2 40 ° C, 1,5 h rastreamento
12 um,e 11c EtCN 40 ° C, 1,5 h 61% (Α/Β = 1.6/1)
13 e, f 11c EtCN 40 ° C, 1,5 h 57% (Α/Β = 1/1,5)

Tabela 1. Condições de reação de regioselective O- glicosilação de uridina 10 com thiomannoside α-9. um Glycosylations foram realizados utilizando 1,5 equivalentes de α -9, 3,0 equivalentes de cloreto de p- toluenesulfenyl e 6,0 equivalentes de prata trifluormetanosulfonato contra 10. Os produtos resultantes foram acetilados com ca. 10 equivalentes de anidrido acético (Ac2O), na presença de uma quantidade catalítica de N,N-dimetil-4-aminopiridina (DMAP). b ácido Boronic 11 foi 1,5 equivalentes contra 10. c a relação α/β α/β-12 foi verificada por 1H NMR. d uma mistura de 10 e 11a foi co evaporada com piridina e 1,4-dioxano e agitou-se então em 1,4-dioxano, a sua temperatura de refluxo, seguida pela adição de uma solução de α -9 em acetonitrila para conduzir o glicosilação. e uma mistura de α -9, 10e 11 foi co evaporada com piridina e 1,4-dioxano e agitou-se então em 1,4-dioxano, a sua temperatura de refluxo, seguida de um tratamento com cloreto de p- toluenesulfenyl e trifluormetanosulfonato de prata. f uma reação de glicosilação foi realizado utilizando 1,5 equivalentes de α -9, 1,8 equivalentes de cloreto de p- toluenesulfenyl e 3,6 equivalentes de prata trifluormetanosulfonato contra 10. Os produtos resultantes foram acetilados com ca. 10 equivalentes de anidrido acético na presença de uma quantidade catalítica de N,N-dimetil-4-aminopiridina. AC = acetil, Bn = benzil, Ph = fenil.

Figure of Table 2

Entrada um Aceitador Produto Rendimento (para 2 passos)
1 13 (base = Ade) Β -22 42%
2 14 (base = AdeBz) Β -23 30%
3 15 (base = Gua) Β -24 12%
4 16 (base = GuaeuBu) Β -25 44%
5 10 (base = Ura) Β -26 42% (ca. 15%: base = 5-STol-Ura)
6 17 (base = teu) Β -27 53%
7 18 (base = 5-FUra) Β -28 61%
8 19 (base = Cyt) Β -29 55%
9 20 (base = CytBz) Β -30 40%

Tabela 2. O -Glycosylations de nucleosídeos 10 e 13-20, com o thiogalactoside β-21 para a síntese de dissacarídeo nucleosídeos β-22-β-30. um Glycosylations foram realizados usando 1,5 equivalentes de β -21, 1,5 equivalentes de 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11C, 3,0 equivalentes de cloreto de p- toluenesulfenyl e 6,0 equivalentes de prata trifluormetanosulfonato contra o aceitador (10 e 13 - 20). Uma mistura de β -21, o aceitador (10 e 13 - 20) e 11 c foi co evaporada com piridina e 1,4-dioxano e agitou-se então em 1,4-dioxano, a sua temperatura de refluxo, seguida de um tratamento com p - toluenesulfenyl cloreto e prata trifluormetanosulfonato. BZ = benzoíla, euBu = isobutirilo, Tol = tolil, Ade = adenina, Gua = guanina, Ura = uracil, Thy = timina, FUra-5 = 5-fluorouracil, Cyt = citosina.

Figure of Table 3

Entrada um Dador Produto Rendimento (para 2 passos)
1 Β -31 (Glc) Β -33 54%
2 b Β -21 (Gal) Β -28 61%
3 Α -32 (homem) Α -34 < % de 39 (mistura)

Tabela 3. O -Glycosylations de glycosyl doadores β-21, 31-β e α-32 com 5-fluorouridine 18 para a síntese do dissacarídeo nucleosídeos β-28-33, β e α-34. um Glycosylations foram realizados usando 1,5 equivalentes de um doador (β -21, β -31 ou α -32), 1,5 equivalentes de 4-(trifluorometil) phenylboronic ácido 11 c, 3,0 equivalentes de p- toluenesulfenyl cloreto e 6,0 equivalentes de prata trifluormetanosulfonato contra 18. Uma mistura de um doador (β -21, β -31ou α -32), 18e 11 c foi co evaporada com piridina e 1,4-dioxano e agitou-se então em 1,4-dioxano, a sua temperatura de refluxo, seguida de um tratamento com p - toluenesulfenyl cloreto e prata trifluormetanosulfonato. b Este é o mesmo resultado como entrada 7 da tabela 2. GLC = glucósido, Gal = galactoside, cara = mannoside, 5-FUrd = 5-fluorouridine.

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Discussion

O objetivo deste manuscrito é mostrar um método conveniente e sintético para preparar nucleosídeos dissacarídeo usando ribonucleosides desprotegidos sem manipulações de grupo protegendo tedioso. Nós relatamos aqui sobre o regioselective O- glycosylations de nucleosídeos através o temporário 2', 3'-diol proteção por um éster cíclico boronic (Figura 1B)51.

A preparação do éster cíclico boronic intermediário é um dos passos importantes. Solventes anidros devem ser usados para a evaporação co da mistura reacional (etapas 1.1.1.2 e 1.2.1.1.2 do protocolo) e para a etapa de esterificação (etapas 1.1.1.3 e 1.2.1.1.3) porque os ésteres boronic preparados a partir de nucleósidos e ácido boronic pode ser facilmente hidrolisado. As reacções de glicosilação - Otambém exigem condições anidras para evitar a hidrólise dos doadores glycosyl. Portanto, as peneiras moleculares (etapas 1.1.2 e 1.2.1.2), o balão de fundo redondo de dois-pescoço e os solventes anidros (etapas 1.1.3.1 e 1.2.1.3.1) devem ser suficientemente secos antes da sua utilização para o O- glicosilação.

O p -toluenesulfenyl cloreto de-preparado de acordo com nosso papel anterior38 - devem ser armazenados no escuro a-20 ° C, para ser usado dentro de 3 meses. Se a prata trifluormetanosulfonato estiver molhada, deve ser secado sob vácuo antes de seu uso para o O- glicosilação.

Esse método pode ser aplicado a diversos nucleosídeos e doadores glycosyl (tabela 1, 2e 3). A síntese em larga escala de β -28 em grande parte conseguiu, com exceção de alguns exemplos, como a combinação de α -32 e 18 (tabela 3, entrada 3), em que o isolamento de nucleosídeo o dissacarídeo desejado não é fácil. Além disso, esse método é aplicado para a construção de um 1", 5'-glicosidic enlace de nucleosídeos dissacarídeo (a construção de um 1", 2'- e 1 ', 3'-glicosidic ligação ainda está para ser estudado).

O O- glicosilação utilizando nucleosídeos desprotegidos fornece nucleosídeos dissacarídeo em um processo mais curto do que métodos anteriores usando nucleosídeos protegidos.

O O- glicosilação de nucleosídeos desprotegidos utilizando a protecção temporária de um éster cíclico boronic poderia ser aplicada para a preparação de diversos nucleosídeos dissacarídeo biologicamente ativos e seus análogos. Especialmente, β -35 e seus análogos são esperados para ser os novos candidatos a fármacos, pois sabe-se que 5-fluorouridine e 5-fluorouracil têm atividades antibacteriana, anticancerígena e antivírus24,59, 70,,71,72,73,,74,75,76. Também acreditamos que a aplicação de uma protecção temporária de grupos hidroxila por um éster de boronic será útil para a síntese de uma variedade de compostos naturais e artificiais, bem como nucleosídeos dissacarídeo.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi financiada pela grants-in-aid do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão (n. º s 15 00408 K, 24659011, 24640156, 245900425 e 22390005 para Shin Aoki), uma subvenção a pesquisa bioquímica de Tóquio Fundação, Tóquio, Japão e pelo fundo para as áreas de investigação estratégica de TUS (Tokyo University of Science). Gostaríamos de agradecer as medições dos espectros NMR, Fukiko Hasegawa (Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Tokyo da ciência) para as medições da massa Noriko Sawabe (Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Tokyo da ciência) Espectros e Tomoko Matsuo (Instituto de pesquisa para a ciência e tecnologia, Universidade de Tokyo da ciência) para as medições das análises elementares.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silver trifluoromethanesulfonate Nacalai Tesque 34945-61
Phenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride) Tokyo Chemical Industry B0857
p-Methoxyphenylboronic acid Wako Pure Chemical Industries 321-69201
4-(Trifluoromethyl)phenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride) Tokyo Chemical Industry T1788
2,4-Difluorophenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride) Tokyo Chemical Industry D3391
Cyclopentylboronic acid (contains varying amounts of Anhydride) Tokyo Chemical Industry C2442
4-Nitrophenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride) Tokyo Chemical Industry N0812
4-Hexylphenylboronic acid (contains varying amounts of anhydride) Tokyo Chemical Industry H1489
Adenosine Merck KGaA 862.
Guanosine Acros Organics 411130050
Cytidine Tokyo Chemical Industry C0522
Uridine Tokyo Chemical Industry U0020
5-Fluorouridine Tokyo Chemical Industry F0636
5-Methyluridine Sigma M-9885
Methylamine (40% in Methanol, ca. 9.8mol/L) Tokyo Chemical Industry M1016
N,N-dimethyl-4-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries 044-19211
Acetic anhydride Nacalai Tesque 00226-15
Pyridine, Dehydrated Wako Pure Chemical Industries 161-18453
Acetonitrile Kanto Chemical 01031-96
1,4-Dioxane Nacalai Tesque 13622-73
Dichloromethane Wako Pure Chemical Industries 130-02457
Propionitrile Wako Pure Chemical Industries 164-04756
Molecular sieves 4A powder Nacalai Tesque 04168-65
Molecular sieves 3A powder Nacalai Tesque 04176-55
Celite 545RVS Nacalai Tesque 08034-85
Acetonitrile-D3 (D,99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-21-10
Trifluoroacetic acid Nacalai Tesque 34831-25
TLC Silica gel 60 F254 Merck KGaA 1.05715.0001
Chromatorex Fuji Silysia Chemical FL100D
Sodium hydrogen carbonate Wako Pure Chemical Industries 191-01305
Hydrochloric acid Wako Pure Chemical Industries 080-01061
Sodium sulfate Nacalai Tesque 31915-96
Chloroform Kanto Chemical 07278-81
Sodium chloride Wako Pure Chemical Industries 194-01677
Methanol Nacalai Tesque 21914-74
JEOL Always 300 JEOL Measurement of NMR
Lamda 400 JEOL Measurement of NMR
PerkinElmer Spectrum 100 FT-IR Spectrometer Perkin Elmer Measurement of IR
JEOL JMS-700 JEOL Measurement of MS
PerkinElmer CHN 2400 analyzer Perkin Elmer Measurement of elemental analysis
JASCO P-1030 digital polarimeter JASCO Measurement of optical rotation
JASCO PU-2089 Plus intelligent HPLC pump JASCO For HPLC
Jasco UV-2075 Plus Intelligent UV/Vis Detector JASCO For HPLC
Rheodyne Model 7125 Injector Sigma-Aldrich 58826 For HPLC
Chromatopac C-R8A Shimadzu For HPLC
Senshu Pak Pegasil ODS Senshu Scientific For HPLC
p-Toluenesulfenyl chloride Prepared  Ref. 38
Phenyl 6-O-acetyl-2,3,4-tri-O-benzyl-1-thio-a-D-mannopyranoside (a-9) Prepared  Ref. 52
4-Metylphenyl 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-1-thio-b-D-galactopyranoside (b-21) Prepared  Ref. 53
4-Metylphenyl 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-1-thio-b-D-glucopyranoside (b-31) Prepared  Ref. 57
4-Metylphenyl 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-1-thio-a-D-Mannopyranoside (a-32) Prepared  Ref. 67
6-N-Benzoyladenosine (14) Prepared  Ref. 54
2-N-Isobutyrylguanosine (16) Prepared  Ref. 55
4-N-Benzoylcytidine (20) Prepared  Ref. 56

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References

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